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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Polymer-Screening.
Genauer gesagt, stellt die Erfindung ein besseres Verfahren zur
Herstellung einer Polymerbank bereit, die zur Identifikation eine
Polymersequenz verwendet werden kann, die komplementär zu einem
Rezeptor ist.
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Es
gibt viele Assays zur Messung der Bindungsaffinität von Rezeptoren
und Liganden, aber die Information, die aus diesen Experimenten
erhalten werden kann, ist oft durch die Anzahl und den Typ der verfügbaren Liganden
beschränkt.
Kleine Peptide sind ein beispielhaftes System zur Untersuchung der
Beziehung zwischen Struktur und Funktion in der Biologie. Werden
die zwanzig natürlich
vorkommenden Aminosäuren
zu Peptiden kondensiert, bilden sie ein breites Spektrum dreidimensionaler
Konfigurationen, die sich jeweils aus einer bestimmten Aminosäuresequenz
und Lösungsmittelbedingung
ergeben. Die Anzahl möglicher
Pentapeptide aus den 20 natürlich
vorkommenden Aminosäuren
beträgt
zum Beispiel 205 oder 3,2 Millionen verschiedene
Peptide. Die Wahrscheinlichkeit, dass Moleküle dieser Größe bei Rezeptorbindungsstudien
nützlich sein
können,
wird von Epitopanalysestudien unterstützt, die zeigen, dass einige
Antikörper
Sequenzen von nur wenigen Aminosäuren
mit hoher Spezifität
erkennen.
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Verfahren
des Standes der Technik zur Herstellung einer großen Zahl
verschiedener Oligomere waren unerträglich langsam, wenn sie in
einem Maßstab
verwendet wurden, der für
ein effizientes rationales oder zufallsgemäßes Screening ausreichte. Zum
Beispiel hat man das in Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press (1989),
beschriebene "Merrifield"-Verfahren, das hier
für alle
Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, zur Synthese von Peptiden
an einem festen Träger,
wie Nadeln oder Stäben,
verwendet. Die Peptide werden dann gescreent, und es wird bestimmt,
ob sie zu einem Rezeptor komplementär sind. Unter Verwendung des
Merrifield-Verfahrens ist das Screening von mehr als wenigen Peptiden
pro Tag nicht ökonomisch
durchführbar.
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Auf ähnliche
Probleme trifft man beim Screening anderer Polymere mit einem verschiedenartigen
Basissatz von Monomeren. Zum Beispiel weisen verschiedene Verfahren
zur Oligonukleotidsynthese, wie das Phosphittriester-Verfahren und
das Phosphotriester-Verfahren,
das in Gait, "Oligonucleotide
Synthesis", IRL Press
(1990), beschrieben und hier für
alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, ähnliche Beschränkungen
auf, möchte
man viele verschiedenartige Oligonukleotide für ein Screening synthetisieren.
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Für das Screening
einer größeren Zahl
von Polymersequenzen sind fortschrittlichere Techniken offenbart
worden. Zum Beispiel beschreiben Pirrung et al., WO 90/15070, das
hier für
alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, ein Verfahren zur
Synthese einer großen
Zahl von Polymersequenzen an einem festen Substrat unter Verwendung
lichtgesteuerter Verfahren. Dower et al., US-Anmeldung mit der laufenden
Nr. 07/762 522, das hier ebenfalls für alle Zwecke durch Bezugnahme
aufgenommen ist, beschreibt ein Verfahren zur Synthese einer Polymerbank
und ein Verfahren zu deren Verwendung. Die Polymere werden beispielsweise
auf Perlen synthetisiert. Ein erstes Monomer wird an einen Pool
von Perlen gebunden. Danach wird der Perlenpool geteilt, und ein
zweites Monomer wird gebunden. Das Verfahren wird wiederholt, bis
ein gewünschter
verschiedenartiger Satz von Polymeren synthetisiert worden ist.
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Andere
Verfahren zur Synthese und zum Screening von Polymeren sind ebenfalls
vorgeschlagen worden. Zum Beispiel erläutern Houghten et al., "Generation and Use
of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research
and Drug Discovery",
Nature (1991) 354:84–86,
ein Verfahren zur Herstellung von Peptidbanken, die zum Screening
der Peptide im Hinblick auf biologische Aktivität verwendet werden (siehe auch Houghton
et al., "The Use
of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for the Identification
of Bioactive Peptides",
Peptide Research (1992) 5:351–358).
Houghton synthetisierte eine kombinatorische Peptidbank (SPCL),
die aus einigen 34 × 106 Hexapeptiden bestand, und führte ein
Screening durch zur Identifikation von Antigendeterminanten, die
von einem monoklonalen Antikörper
erkannt werden. Furka et al., "General
Method for Rapid Synthesis of Multicomponent Peptide Mixtures", Int. J. Peptide
Protein Res. (1991) 37:487–493,
erläutern
ein Verfahren zur Synthese von Mehrkomponenten-Peptidgemischen. Furka schlug das Bilden
eines Pools als allgemeines Verfahren zur schnellen Synthese von
Mehrkomponenten-Peptidgemischen vor und veranschaulichte dessen
Anwendung durch Synthese eines Gemischs von 27 Tetrapeptiden und
180 Pentapeptiden. Lam et al., "A
new type of synthetic peptide library for identifying ligandbinding
activity", Nature (1991)
354:82–84,
verwendeten das Bilden eines Pools zur Erzeugung einer Pentapeptidbank
auf Perlen, die hinsichtlich der Bindung an einen monoklonalen Antikörper gescreent
wurde. Blake et al., "Evaluation
of Peptide Libraries: An Interative Strategy To Analyze the Reactivity
of Peptide Mixtures With Antibodies", Bioconjugate Chem. (1992) 3:510–513, erläutern das
Screening angenommener Gemische von 50625 Tetrapeptides und 16777216
Hexapeptiden zur Auswahl von Epitopen, die von spezifischen Antikörpern erkannt
werden.
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Die
synthetische Peptidbank von Lam besteht aus einer großen Zahl
Perlen, wobei jede Perle Peptidmoleküle einer Art enthält. Perlen,
die an ein Ziel (z.B. einen Antikörper oder Streptavidin) binden,
werden farbig oder fluoreszierend gemacht. Lam berichtet, dass mehrere
Millionen Perlen, verteilt in 10–15 Petrischalen, mit einem
Niederleistungs präpariermikroskop
an einem Nachmittag gescreent werden können. Positive Perlen werden
mit 8 M Guanidinhydrochlorid gewaschen, wodurch das Zielprotein
entfernt wird, und dann sequenziert. Die Perlen mit 10–200 μm Durchmesser
enthalten 50–200
pmol Peptid, also wahrscheinlich recht viel mehr als ihre 5-pmol-Empfindlichkeitsgrenze.
Drei Pentapeptid-Perlen wurden täglich
sequenziert. Das Wesentliche an Lams Verfahren ist, dass die Identität positiver
Perlen durch direktes Sequenzieren erhalten wird.
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Houghton
et al. verwenden einen anderen Ansatz zur Identifikation von Peptidsequenzen,
die von einem Antikörper
erkannt werden. Unter Verwendung der hier verwendeten Nomenklatur
haben Houghton et al. eine X6X5X4pX3pX2pX1p-Bank gescreent und gefunden, dass das
Gemisch DVX4pX3pX2pX1p in ihrem Inhibitionsassay
die größte Stärke aufweist.
Houghton synthetisierte dann eine DVX4pX3pX2pX1p-Bank
und identifizierte die stärkste
Aminosäure
in der dritten Position. Nach drei weiteren Annäherungen fanden sie, dass DVPDYA
an den Antikörper
mit einer Kd von 30 nM bindet. Das Wesentliche
an Houghtons Verfahren ist die rekursive Retrosynthese, bei der
die Anzahl gepoolter Positionen mit jeder Annäherung um eins abnimmt.
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Blake
et al. verwendeten eine "Falschmünzen-Strategie", um zu einer bevorzugten
Aminosäuresequenz
zu gelangen. Bei dieser Strategie wird zunächst ein Basissatz von Monomeren
(15 Aminosäuren)
in drei Gruppen unterteilt. Blake et al. wählten A, L, V, F, Y (Untergruppe α), G, S,
P, D, E (Untergruppe β)
und K, R, H, N, Q (Untergruppe γ).
Durch Einstellen der "Gewichtung
der Untergruppen in jeder Position in der Polymersequenz und anschließendes Testen
der Aktivität
des gewichteten Polymers gegen ein ungewichtetes Polymer wurde eine
Untergruppe für
jede Monomerposition in der Sequenz ausgewählt. Bei einem von Blake et
al. durchgeführten
Experiment wurde eine vollständige
Kollektion von Tetrameren X1P, X2P X3P X4P durch
4 Hemmexperimente auf α1 α2 γ3 α4 reduziert. Dann wurden die Untergruppen α und γ jeweils
weiter in drei Gruppen von Aminosäuren unterteilt, die zur Synthese
von vier weiteren Kollektionen gewichteter Polymere verwendet wurden.
Hemmstudien mit jeder dieser Kollektionen legten ein Epitop (F oder
Y)1(A oder L)2(K
oder R)3(F oder Y)4 nahe.
Eine weitere Annäherung
ergab das gewünschte
Epitop FLRF.
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Verfahren
des Standes der Technik haben zwar einige Erfolge erzielt, stießen aber
auch an bestimmte Beschränkungen.
Zum Beispiel möchte
man manchmal die Verwendung der Ausrüstung vermeiden, die zur Durchführung lichtgesteuerter
Techniken benötigt
wird. Zudem lieferten einige Verfahren des Standes der Technik nicht
das gewünschte
Ausmaß an
Diversität
mit der gewünschten
Effizienz.
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Aus
dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass ein besseres Verfahren zur
Synthese einer verschiedenartigen Kollektion chemischer Sequenzen
erwünscht
ist.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zur Herstellung einer Polymerbank nach Anspruch 1 bereitgestellt.
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Die
Erfindung führt
effizient zu Banken von Polymeren, die zur Identifikation der Monomersequenz
von Polymeren verwendet werden können,
die eine signifikante Bindung an einen Liganden aufweisen.
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Nach
einer Ausführungsform
der Erfindung wird eine Bank von Polymeren hergestellt unter Verwendung
von "Pool-" und "Nicht-Pool-" (oder "getrennten") Kupplungsschritten.
Bei den Pool-Schritten wird jedes Monomer aus einem Basissatz an
Monomeren an den Terminus einer wachsenden Kette von Monomeren an einer
Mehrzahl zuvor vermischter fester Substrate gekuppelt. Die gemischten
Substrate werden für
das Kuppeln jedes einzelnen Monomers in einem Basissatz aufgeteilt.
In getrennten Schritten werden die Substrate aus einem vorhergehenden
Kupplungsschritt nicht vermischt, und jedes Monomer in einem Basissatz
wird getrennt an den Terminus einer wachsenden Kette von Monomeren
an einer Mehrzahl der unvermischten Substrate gekuppelt.
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Nach
einer Ausführungsform
der Erfindung haben die Pool- und die Nicht-Pool-Schritte eine derartige Reihenfolge,
dass die Identifikation einer Monomersequenz, die an einen Rezeptor
bindet, aus der Bank leicht identifiziert werden kann. Zum Beispiel
stammen bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mehrere
Gruppen von Produkten aus den Syntheseschritten. Jede Gruppe wird
zur Identifikation des Monomers an einer spezifischen Position in
der Polymerkette verwendet.
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Nach
einer Ausführungsform
der Erfindung wird die Bank unter Verwendung einer geordneten Abfolge von
Kupplungsschritten konstruiert, bei denen die aus einem getrennten
Schritt hervorgehenden Produkte anschließend nur Pool-Kupplungsschritten
unterworfen werden. Aus einem Pool-Kupplungsschritt hervorgehende
Produkte, die vorher nicht einem Nicht-Pool-Schritt unterworfen
wurden, werden immer für
die Pool- und die Nicht-Pool-Kupplung aufgeteilt. Diese geordnete
Abfolge von Schritten führt
zu einer vergleichsweise kleinen Anzahl Kupplungsschritte, ermöglicht aber
immer noch die Identifikation der Monomersequenz eines Polymers,
das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist. Zum Beispiel wird eine
erste Gruppe von Produkten zur Identifikation des Monomers an einer
ersten Stelle in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor
komplementär
ist. Eine zweite Gruppe von Produkten wird zur Identifikation des
Mo nomers an einer zweiten Stelle in einem Polymer verwendet, das
zu einem Rezeptor komplementär
ist.
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Die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
bereitgestellte Polymerbank kann zur Bereitstellung eines Polymerbank-Screeningkits
verwendet werden. Das Kit enthält
Familien von Polymeren X3-X2p-X1p, X3p-X2-X1p und X3p-X2p-X1,
wobei X3p-X2p-X1 eine Kollektion von mindestens ersten und
zweiten Polymergemischen enthält,
wobei das erste Polymergemisch ein erstes Monomer in einer ersten
Position von Polymermolekülen
darin und andere Monomere in der zweiten und der dritten Position
der Polymermoleküle
darin besitzt und wobei das zweite Polymergemisch ein zweites Monomer
in der ersten Position von Polymermolekülen darin und andere Monomere
in der zweiten und der dritten Position der Polymermoleküle darin
besitzt; X3p-X2-X1p eine Kollektion von mindestens dritten
und vierten Polymergemischen enthält, wobei das dritte Polymergemisch
ein drittes Monomer in der zweiten Position und das vierte Polymergemisch
ein viertes Monomer in der zweiten Position besitzt, wobei das dritte
und das vierte Polymergemisch jeweils andere Monomere in der ersten
und der dritten Position besitzen; und X3-X2p-X1p eine Kollektion
von mindestens fünften
und sechsten Polymergemischen enthält, wobei das fünfte Polymergemisch
ein fünftes
Monomer in der dritten Position und das sechste Polymergemisch ein
sechstes Monomer in der dritten Position besitzt, wobei das fünfte und
das sechste Polymergemisch jeweils andere Monomere in der ersten
und der zweiten Position besitzen, wobei das erste, dritte und vierte
Monomer gleich oder verschieden sind und das zweite, vierte und
fünfte
Monomer gleich oder verschieden sind.
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Die
mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
bereitgestellte Polymerbank kann bei einem Verfahren zur Identifikation
eines ersten und eines zweiten Monomers in einem Polymer verwendet
werden, das zu einem Rezeptor komplementär ist. Das Verfahren zur Identifikation
enthält
die Schritte Kuppeln von ersten und zweiten Monomeren in einem ersten
Basissatz an einzelne Substrate und Mischen der Substrate unter
Erhalten eines Pools erster Produkte; Kuppeln der ersten und zweiten
Monomere aus dem ersten Basissatz an einzelne Substrate und Nicht-Mischen
der Substrate unter Erhalten von mindestens ersten und zweiten getrennten
Produkten; getrenntes Kuppeln von ersten und zweiten Monomeren aus
einem zweiten Basissatz an Substrate aus dem Pool erster Produkte
und Nicht-Mischen der Substrate unter Erhalt von mindestens dritten
und vierten getrennten Produkten, wobei der zweite Basissatz gleich
oder verschieden von dem ersten Basissatz ist; Kuppeln der ersten
und zweiten Monomere aus dem zweiten Basissatz an einzelne Substrate
aus den ersten getrennten Produkten und Mischen der Substrate unter
Erhalten eines Pools zweiter Produkte; Kuppeln der ersten und zweiten
Monomere aus dem zweiten Basissatz an einzelne Substrate aus den
zweiten getrennten Produkten unter Erhalten eines Pools dritter
Produkte; und Aussetzen von einem Rezeptor den dritten und vierten
getrennten Produkten zur Identifizierung von einem zweiten Monomer
in einem Polymer, das zu einem Rezeptor komplementär ist, und
Aussetzen des Pools zweiter und dritter Produkte dem Rezeptor zur
Identifikation von einem ersten Monomer in einem Polymer, das zu
einem Rezeptor komplementär
ist.
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Es
wird auch eine Polymer-Screening-Technik unter Verwendung von Faktorierung
offenbart.
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Ein
weitergehendes Verständnis
der Art und der Vorteile der Erfindungen kann anhand der verbleibenden
Teile der Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen erlangt werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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Es
zeigt/zeigen:
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1a und 1b schematisch spezifische Ausführungsformen
der Erfindung;
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2 ein
einfaches Reaktionsdiagramm;
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3 ein
Reaktionsdiagramm von einem Produktpool und getrennten Produkten;
-
4 ein
vereinfachtes Reaktionsdiagramm;
-
5a, 5b und 5c eine
Familie von Pool-Synthesen;
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6 ein
Reaktionsdiagramm zur Herstellung der Produkte X3pX2X1p;
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7 ein
Reaktionsdiagramm für
alle 64 Trinukleotide;
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8 die
Synthese von AAT, TGC, TGT, GTA, GTG und CCG;
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9 eine
alternative Darstellung der Erfindung;
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10a, 10b und 10c eine rekursive Retrosynthese-Ausführungsform
der Erfindung;
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11a, 11b und 11c eine erfindungsgemäße kombinatorische Synthesekammer
und
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12 eine
Polymerbank nach einer Ausführungsform
der Erfindung.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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INHALT
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- I. Terminologie
- II. Gesamtbeschreibung
- III. Auf das Screening angewendete polynomische Faktorierung
- IV. Zusammenfassung
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I. Terminologie
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Ligand:
Ein Ligand ist ein Molekül,
das von einem bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden,
die mit der Erfindung untersucht werden können, sind u.a., sind aber
nicht beschränkt
auf Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren, Toxinen
und Giften, Virusepitopen, Hormonen (z.B. Opiaten, Steroiden usw.),
Hormonrezeptoren, Peptiden, Enzymen, Enzymsubstraten, Cofaktoren,
Arzneistoffen, Lektinen, Zuckern, Oligonukleotiden, Nukleinsäuren, Oligosacchariden,
Proteinen und monoklonalen Antikörpern.
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Monomer:
Ein Element von dem Satz kleiner Moleküle, die miteinander verbunden
sind oder verbunden werden können
unter Erhalt eines Polymers. Der Satz von Monomeren beinhaltet zum
Beispiel, ist aber nicht beschränkt
auf den Satz üblicher
L-Aminosäuren,
den Satz von D-Aminosäuren,
den Satz synthetischer und/oder natürlicher Aminosäuren, den
Satz von Nukleotiden und den Satz von Pentosen und Hexosen sowie Untergruppen
davon. Die bestimmte Reihenfolge von Monomeren in einem Polymer
wird hier als "Sequenz" des Polymers bezeichnet.
Wie hier verwendet, bedeutet Monomer jedes Element von einem Basissatz
zur Synthese eines Polymers. Zum Beispiel bilden Dimere der 20 natürlich vorkommenden
L-Aminosäuren
einen Basissatz von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden.
Unterschiedliche Basissätze
von Monomeren können
in aufeinander folgenden Schritten bei der Synthese eines Polymers
eingesetzt werden. Zudem kann jeder der Sätze geschützte Elemente beinhalten, die
nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung wird hier hauptsächlich im
Hinblick auf die Herstellung von Molekülen beschrieben, die Sequenzen
von Monomeren, wie Aminosäuren,
enthalten, kann aber leicht auf die Herstellung anderer Polymer
angewendet werden. Zu diesen Polymeren gehören zum Beispiel lineare und
zyklische Polymere von Nukleinsäuren,
Polysacchariden, Phospholipiden und Peptiden mit α-, β- oder ω-Aminosäuren, Heteropolymere,
in denen ein bekannter Arzneistoff an eines der Vorstehenden kovalent
gebunden ist, Polynukleotide, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate,
Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethy lenimine, Polyarylensulfide,
Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate oder andere Polymere, die beim
Lesen dieser Offenbarung deutlich werden. Solche Polymere sind "verschiedenartig", wenn Polymere mit
unterschiedlichen Monomersequenzen an verschiedenen, zuvor festgelegten
Regionen eines Substrats hergestellt werden. Verfahren zur Zyklisierung
und zur Polymerumkehrung von Polymeren, die in Verbindung mit der
Erfindung verwendet werden können,
sind in der gleichzeitig eingereichten Anmeldung offenbart mit der
laufd. Nr. 796 727, eingereicht am 22. November 1991 mit dem Titel "POLYMER REVERSAL
ON SOLID SURFACES",
die hier für
alle zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die "Position" eines Monomers in
einem Polymer betrifft den Abstand, die Anzahl Monomere, von einem
Terminus oder einer anderen Referenzstelle auf einem Polymer.
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Peptid:
Ein Polymer, in dem die Monomere α-Aminosäuren sind
und über
Aminobindungen verbunden sind, ersatzweise auch als Polypeptid bezeichnet.
Im Kontext dieser Beschreibung sollte erkannt werden, dass die Aminosäuren das
optische L-Isomer oder das optische D-Isomer sein können. Peptide
sind oft zwei oder mehr Aminosäuremonomere
und oft mehr als 20 Aminosäuremonomere
lang. Standardabkürzungen
für Aminosäuren werden
verwendet (z.B. P für
Prolin). Diese Abkürzungen
sind in Stryer, Biochemistry, dritte Auflage 1988, enthalten, das
hier für
alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist.
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Rezeptor:
Ein Molekül
mit Affinität
zu einem gegebenen Liganden. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder künstlich
hergestellte Moleküle
sein. Sie können
zudem im unveränderten
Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies eingesetzt werden.
Rezeptoren können,
kovalent oder nicht-kovalent, direkt oder über eine spezielle Bindungssubstanz,
an ein Bindungselement gebunden werden. Beispiele für Rezeptoren,
die bei der Erfindung eingesetzt werden können, sind u.a., sind aber
nicht beschränkt
auf Antikörper, Zellmembranrezeptoren,
monoklonale Antikörper
und Antiseren, die mit spezifischen Antigendeterminanten (beispielsweise
auf Viren, Zellen oder anderen Substanzen) reaktionsfähig sind,
Arzneistoffe, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Cofaktoren,
Lektine, Zucker, Polysaccharide, Zellen, Zellmembranen und Organellen. Rezeptoren
werden im Stand der Technik manchmal als Anti-Liganden bezeichnet.
Da hier der Begriff Rezeptor verwendet wird, ist keine andere Bedeutung
beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptor-Paar" wird gebildet, wenn zwei
Makromoleküle
sich über
molekulare Erkennung unter Bildung eines Komplexes verbinden.
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Spezielle
Beispiele für
Rezeptoren, die mit der Erfindung untersucht werden können, sind
u.a., sind aber nicht beschränkt
auf:
- a) Mikroorganismen-Rezeptoren: Die Ermittlung
von Liganden, die an Rezeptoren binden, wie spezifische Transportproteine
oder Enzyme, die für
das Überleben
von Mikroorganismen wichtig sind, eignet sich für eine neue Klasse von Antibiotika.
Von besonderem Wert wären
Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozoen und Bakterien,
die gegen die zurzeit verwendeten Antibiotika resistent sind.
- b) Enzyme: Zum Beispiel die Bindungsstelle von Enzymen, wie
den für
die Spaltung von Neurotransmittern verantwortlichen Enzymen; die
Bestimmung von Liganden, die an bestimmte Rezeptoren binden und
die Wirkung von Enzymen modulieren, die die verschiedenen Neurotransmitter
spalten, ist zur Entwicklung von Arzneistoffen nützlich, die zur Behandlung
von Neutrotransmissionsstörungen
verwendet werden können.
- c) Antikörper:
Die Erfindung kann zum Beispiel zur Untersuchung der Ligandenbindungsstelle
auf dem Antikörpermolekül nützlich sein,
das sich mit dem Epitop eines Antigens von Interesse vereinigt;
Bestimmen einer Sequenz, die ein Antigenepitop nachahmt, kann zur
Entwicklung von Impfstoffen führen,
deren Immunogen auf einer oder mehr dieser Sequenzen basiert, oder
zur Entwicklung damit zusammenhängender
Diagnostika oder Verbindungen führen,
die sich für
therapeutische Behandlungen eignen, beispielsweise für Autoimmunerkrankungen
(z.B. durch Blockierung der Bindung der "Selbst"-Antikörper).
- d) Nukleinsäuren:
Sequenzen von Nukleinsäuren
können
zur Feststellung von DNA- oder
RNA-bindenden Sequenzen synthetisiert werden.
- e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide,
die eine chemische Reaktion vorantreiben können, die die Umwandlung von
einem oder mehr Reaktanten in ein oder mehr Produkte beinhaltet. Diese
Polypeptide enthalten gewöhnlich
eine Bindungsstelle, die für
mindestens einen Reaktanten oder ein Reaktionszwischenprodukt spezifisch
ist, und eine aktive Funktionalität in der Nähe der Bindungsstelle, die den
gebundenen Reaktanten chemisch modifizieren kann. Katalytische Polypeptide
und andere sind beispielsweise beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen
WO 90/05746, WO 90/05749 und WO 90/05785, die hier für alle Zwecke
durch Bezugnahme aufgenommen sind.
- f) Hormonrezeptoren: Zum Beispiel die Rezeptoren für Insulin
und Wachstumshormon. Die Ermittlung von Liganden, die mit hoher
Affinität
an einen Rezeptor binden, ist beispielsweise zur Entwicklung von
einem oralen Ersatz für
die täglichen
Injektionen nützlich,
die Diabetiker verwendet müssen,
um die Diabetessymptome zu lindern, und ande rerseits von einem oralen
Ersatz für
das seltene menschliche Wachstumshormon, das nur aus Leichen oder
durch DNA-Rekombinationstechno-logie gewonnen werden kann. Weitere
Beispiele sind die Rezeptoren für
Vasokonstriktionshormon; die Ermittlung von Liganden, die an einen Rezeptor
binden, kann zur Entwicklung von Arzneistoffen zur Regulation des
Blutdrucks führen.
- g) Opiatrezeptoren: Die Ermittlung von Liganden, die an die
Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich zur Entwicklung weniger
abhängig
machender Ersatzstoffe für
Morphin und verwandte Arzneistoffe.
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Substrat
oder fester Träger:
Ein Material mit einer Oberfläche,
das im Wesentlichen unlöslich
in einer Lösung
ist, die zum Kuppeln von Monomeren an eine wachsende Polymerkette
verwendet wird. Diese Materialien haben vorzugsweise die Form von
kleinen Perlen, Pellets, Scheiben oder andere geeignete Formen.
Es können
aber auch andere Formen verwendet werden. Eine etwa kugelförmige oder
eiförmige
Gestalt ist bevorzugt.
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Basissatz:
Eine Gruppe von Monomeren, die für
die direkte oder indirekte Bindung an ein festes Substrat bei einem
gegebenen Kupplungsschritt ausgewählt wird. Unterschiedliche
Basissätze
oder die gleichen Basissätze
können
bei einer Synthese von einem Kupplungsschritt zum nächsten verwendet
werden.
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Synthetisch:
Mit chemischer oder enzymatischer In-vitro-Synthese hergestellt.
Die erfindungsgemäßen synthetischen
Banken stehen beispielsweise den in Virus- oder Plasmidvektoren
konstruierten gegenüber, die
in bakteriellen, Hefe- oder anderen lebenden Wirten vermehrt werden
können.
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Symbole
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- xi
- steht für den Satz
von Monomereinheiten in Reaktionsrunde i.
- xij
- steht für die j.
Monomereinheit in Reaktionsrunde i; xij kann
Null (⌀)
sein.
- Si
- steht für die getrennten
Produkte nach Reaktionsrunde i.
- Pi
- steht für den Produktpool
der Runde i und aller vorhergehender Runden.
- Xip
- steht für den Pool
von Reaktanten aus nur der Runde i.
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Reaktionsdiagramme
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Ein
ausgefüllter
Kreis • steht
für ein
Reaktionsprodukt, das in einer bestimmten Monomereinheit xij endet. Der Satz von Reaktionsprodukten,
der in xi endet, ist durch einen Satz von
Kreisen auf derselben horizontalen Ebene dargestellt.
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Ausgefüllte Kreise,
die miteinander reagieren, sind durch Geraden verbunden. Das Bilden
von Pools ist durch Linien dargestellt, die sich darunter in einem
offenen Kreis treffen.
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Bei
einer faktorierbaren polynomischen Synthese wird jede Monomereinheit
einer Runde mit jedem Monomer der vorhergehenden Runde verbunden.
In einem Diagramm von einer solchen Synthese ist jeder ausgefüllte Kreis
auf einer Ebene mit jedem ausgefüllten
Kreis der Ebene darüber
verbunden. 7 zeigt zum Beispiel das Reaktionsdiagramm,
das einer faktorierbaren 3-Runden-Synthese mit
X1 =
X2 = X3 = (A,T,G,C)
entspricht,
die alle 64 Trinukleotide ergibt.
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Dagegen
fehlt bei einer unreduzierbaren (primären) polynomischen Synthese
mindestens eine Linie in dem Diagramm der entsprechenden faktorierbaren
polynomischen Synthese. Solche Synthesen sind in 8 nur
für die
Synthese von AAT, TGC, TGT, GTA, GTG und CCG dargestellt.
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II. Gesamtbeschreibung
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1 zeigt eine Gesamtdarstellung von einem
Aspekt der Erfindung. Wie dort dargestellt, werden die Monomere
A und B, die den gesamten oder einen Teil des ersten Basissatzes
von Monomeren darstellen, an Substrate 2 in den Gefäßen 4a und 4b gekuppelt.
Die Substrate in jedem der Gefäße 4a und 4b werden
geteilt. Ein Teil der Substrate aus jedem Gefäß 4a und 4b wird
im Gefäß 6 gemischt
und für
einen anschließenden Kupplungsschritt
in die Gefäße 6a und 6b aufgeteilt.
Eine weitere Fraktion der Monomere aus den Gefäßen 4a und 4b wird
nicht gemischt, wie durch die Gefäße 10 und 12 angegeben.
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Danach
werden die Substrate an Monomere aus einem zweiten Basissatz C,
D gekuppelt, der gleich dem Basissatz A, B sein kann oder nicht.
Wie dargestellt, wird Monomer C an die gemischten oder den "Pool" von Substraten im
Gefäß 6a gekuppelt,
während
das Monomer D an den "Pool" von Substraten im
Gefäß 6b gekuppelt
wird. Ein Teil der Produkte dieser Reaktionen kann für spätere Kupplungsschritte
gemischt werden, aber zumindest ein Teil der Produkte in den Gefäßen 6a und 6b wird
nicht gemischt.
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Die
Produkte in den Gefäßen 10 und 12 werden
vorzugsweise jeweils für
die Kupplung an Monomer C geteilt, wie in den Gefäßen 10b und 12b dargestellt.
Die Substrate in den Gefäßen 10a und 12a werden
für die
Kupplung der Monomers D an die wachsende Polymerkette verwendet.
Die Produkte der Reaktionen in den Gefäßen 10a und 10b werden
gemischt oder gepoolt und in Gefäß 20 überführt. Die
Produkte der Reaktionen in den Gefäßen 12a und 12b werden
gemischt oder gepoolt und in Gefäß 22 überführt.
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Die
Produkte in den Gefäßen 20 und 22 werden
anschließend
zur Identifikation eines ersten Monomers in einem Polymer verwendet,
das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist. Zu Veranschaulichung
wird hier angenommen, dass die Monomersequenz AC zum Rezeptor R
komplementär
ist. Ein beispielsweise mit einer fluoreszierenden oder radiaktiven
Markierung * markierter Rezeptor wird den Substanzen in den Gefäßen 20 und 22 ausgesetzt.
Ungebundener Rezeptor wird von den festen Trägern abgetrennt. Die Bindung
an die Substrate erfolgt nur mit den Substraten im Gefäß 20.
Daher wird nur in Gefäß 20 Fluoreszenz beobachtet.
Aus dieser Beobachtung kann man schließen, dass A das erste Monomer
in einem komplementären
Rezeptor ist, weil alle Polymere im Gefäß 22 das erste Monomer
B enthalten. Dagegen enthalten alle Polymere in Gefäß 20 das
erste Monomer A.
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Der
markierte Rezeptor wird auch den Polymeren in den Gefäßen 26a und 26b ausgesetzt.
In diesem Fall wird Bindung des markierten Rezeptors nur im Gefäß 26a beobachtet.
Also kann man das zweite Monomer in einer komplementären Sequenz
als C identifizieren, weil keines der Polymere im Gefäß 26b das
zweite Monomer C enthält.
Dagegen enthalten alle Polymer im Gefäß 26a das zweite Monomer
C. Daher kann man schließen,
dass die Sequenz AC zu R komplementär ist, weil in den Gefäßen 26a und 20 eine
Bindung beobachtet wird.
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1b veranschaulicht Aspekte einer bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung in mehr Einzelheiten mit einer größeren Polymerkette. Der in 1b gezeigten Ausführungsform zufolge wird in
jedem Kupplungsschritt ein Basissatz von 3 Monomeren A, B und C
verwendet. Die synthetisierten Polymere sollen drei Monomere lang
sein. Der Fachmann erkennt, dass die Anzahl Monomere in einem Basissatz
und die Anzahl Kupplungsschritte von einer Anwendung zur anderen
breit variieren. Auch zwischengeschaltete Kupplungsschritte von
beispielsweise gemeinsamen Monomersequenzen können bei einigen Ausführungsformen
verwendet werden. Wird beispielsweise ein Polymer hier durch die
Kennung "ABC" oder "ABE" dargestellt, soll dies
so verstanden werden, dass andere gemeinsame Monomere hinzugefügt werden
können,
so dass ABDC und ABDE durch ABC und ABE wiedergegeben werden. Die
in 1b gezeigte Ausführungsform
wird nur zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt.
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Siehe 1b: Die Synthese erfolgt an einer Mehrzahl
Substrate 2. Unter einem bevorzugten Aspekt der Erfindung
haben die Substrate 2 die Form von Perlen, beispielsweise
aus Glas, Harzen, Kunststoffen oder dgl. Der Begriff "Perlen" wird hier austauschbar
mit dem Wort "Substrat" verwendet. Es sollte
aber selbstverständlich
sein, dass die Perlen keine runde oder einförmige Gestalt annehmen müssen und
die Form jedes geeigneten Substrats haben könne. Es sollte weiter selbstverständlich sein,
dass die Substrate 2 nur im oberen Teil der 1b gezeigt sind, dass aber in jedem der
in 1b gezeigten Reaktionsprodukte
links von der Monomersequenz Substrate vorhanden sind. In jedem
Gefäß in 1b sind alle möglichen Polymerprodukte aufgelistet.
Viele "Kopien" jeder Sequenz sind
in der Regel vorhanden.
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Nach
einer Ausführungsform
werden herkömmliche
Merrifield-Techniken zur Synthese von Peptiden verwendet, wie beschrieben
in Atherton et al., "Solid
Phase Peptide Synthesis",
IRL Press (1989) beschrieben, das hier zuvor für alle Zwecke unter Bezugnahme
aufgenommen wurde. Andere Synthesetechniken sind natürlich geeignet,
werden andere Monomere verwendet. Zum Beispiel werden die in Gait
et al., Oligonucleotide Synthesis, das hier zuvor für alle Zwecke
unter Bezugnahme aufgenommen wurde, beschriebenen Techniken verwendet,
sind die zu der wachsenden Polymerkette hinzuzufügenden Monomere Nukleotide.
Diese Techniken dienen nur als Beispiele. Fortschrittlichere Techniken
werden bei einigen Ausführungsformen
verwendet, beispielsweise zur reversen und zyklischen Polymersynthese,
die in der hier zuvor für
alle Zwecke unter Bezugnahme aufgenommenen US-Anmeldung mit der
laufd. Nr. 07/796 727 offenbart sind.
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Eine
große
Zahl Perlen wird verwendet, so dass die Perlen in späteren Schritten
in getrennte Reaktionsgefäße aufgeteilt
werden können
und trotzdem in ausreichender Zahl vorhanden sind, dass das Vorliegen eines
komplementären
Rezeptors nachgewiesen werden kann. Als allgemeine Regel ist gewünscht, dass
das 10- bis 100-Fache der Anzahl kombinatorischer Möglichkeiten
für die
Synthese verwendet wird. So wird gewährleistet, dass jedes Element
eines Satzes synthetisiert wird. Zudem gewährleistet die Verwendung einer großen Zahl
Perlen, dass der Pool von Reaktionsprodukten in jedes folgende Reaktionsgefäß verteilt
wird, wird eine gepoolte Gruppe von Perlen aufgeteilt.
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Die
Perlen sind vorzugsweise so klein wie möglich, so dass die Reaktionsgefäße und weitere
bei dem Verfahren verwendete Ausrüstung zur Handhabung der Substanzen ebenfalls
so klein wie möglich
sein können.
Vorzugsweise haben die Perlen einen Durchmesser von weniger als
etwa 1 mm, vorzugsweise weniger als etwa 100 μm und stärker bevorzugt weniger als
etwa 10 μm.
Bei einigen Ausführungsformen
erfolgt die Synthese in Lösung.
Bei anderen Ausführungsformen
wird die Synthese an festen Substraten durchgeführt. Die erhaltenen Polymere
werden dann vor der Bindung an den Rezeptor von den Substraten abgespalten.
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Siehe 1b: Die Monomere A, B und C werden an
Substrate in drei Reaktionsgefäßen 4a, 4b bzw. 4c gekuppelt.
Zur Verdeutlichung ist in 1b ein einziges
Substrat gezeigt, aber man erkennt, dass in jedem Reaktionsgefäß eine große Zahl
Perlen vorhanden ist. Also wird in jedem der Reaktionsgefäße 4a, 4b und 4c eine
große
Zahl "Kopien" der Substrate mit
den jeweiligen daran gekuppelten Monomeren erzeugt. Man erkennt,
dass die Monomere nicht direkt an das Substrat gekuppelt werden
müssen.
In den meisten Fällen
werden Linkermoleküle
zwischen den Monomeren und dem Substrat bereitgestellt, wie die
in der US-Anmeldung mit der laufd. Nr. 07/624 120 beschriebenen,
die hier für
alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist. Es sollte zudem erkannt
werden, dass den Schritten in 1b andere
Syntheseschritte vorausgehen oder nachfolgen können, sie kombinatorische Schritte
unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken sein können oder
nicht.
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Danach
wird eine Fraktion der Produkte in jedem Gefäß 4a, 4b und 4c vereinigt,
gemischt und in jedes Reaktionsgefäß 6a, 6b und 6c erneut
verteilt. Die verbleibenden Fraktionen der Produkte in den Gefäßen 4a, 4b und 4c werden
nicht vereinigt. Stattdessen wird die verbleibende Fraktion der
Produkte im Reaktionsgefäß 4a aufgeteilt
und in die Reaktionsgefäße 8a, 8b und 8c überführt. Ebenso
wird die verbleibende Fraktion der Produkte im Gefäß 4b aufgeteilt
und in die Reaktionsgefäße 10a, 10b und 10c überführt. Die
verbleibende Fraktion der Produkte im Reaktantengefäß 4c wird
aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 12a, 12b und 12c überführt.
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Die
in die Gefäße 6a, 6b und 6c überführten Reaktanten
werden hier als "Pool" von Reaktanten bezeichnet,
weil sie ein Gemisch der Produkte umfassen, die aus dem vorhergehenden
Kupplungsschritt hervorgehen. Die in die Gefäße 8, 10 und 12 überführten Reaktanten
sind dagegen getrennte Reaktanten, weil sie keine Gemische der Produkte
aus den vorhergehenden Kupplungsschritten sind. Einer bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung zufolge werden die Reaktanten in den Gefäßen 8, 10 und 12 zunächst einem
getrennten Kupplungsschritt unterworfen und dann nur noch den Pool-Kupplungsschritten.
Dagegen werden in jedem anschließenden Kupplungsschritt die Pool-Reaktanten
einem Kupplungsschritt unterworfen und für anschließende getrennte und Pool-Kupplungsschritte
aufgeteilt.
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Vorzugsweise
werden die Reaktanten derart aufgeteilt, dass eine größere Fraktion
der Perlen auf die Pool-Synthese verteilt wird. Siehe 9:
Zum Beispiel gelangen 4/5 der Perlen in die erste Pool-Gruppe 905 und
1/5 in die Nicht-Pool-Gruppe 903.
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Danach
werden die Monomere A, B und C an die wachsende Polymerkette in
den Reaktionsgefäßen 8a, 8b bzw. 8c gekuppelt.
Die erhaltenen Polymere haben dann die Monomersequenz CA, CB und
CC in den Reaktionsgefäßen 8a, 8b bzw. 8c.
Die Produkte dieser Reaktionen werden dann im Reaktionsgefäß 9 gemischt
oder gepoolt. Die Mischung wird in die Reaktionsgefäße 14a, 14b und 14c erneut
verteilt. Die Monomere A, B und C werden erneut an die wachsende
Polymerkette in den Gefäßen 14a, 14b bzw. 14c gekuppelt. Die
Produkte dieser Reaktionen werden wiederum gemischt oder gepoolt
und in Gefäß 16a überführt.
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Ebenso
werden die Monomere A, B und C an die wachsende Polymerkette in
den Gefäßen 10a, 10b und 10c gekuppelt,
dann im Gefäß 18 gemischt,
aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 20a, 20b und 20c überführt. Die
Monomere A, B und C werden erneut an die wachsende Polymerkette
in den Gefäßen 20a, 20b bzw. 20c gekuppelt,
gemischt und in Gefäß 16b überführt. Die
Monomere A, B und C werden auch an die wachsende Polymerkette in
den Reaktantengefäßen 12a, 12b bzw. 12c gekuppelt,
gemischt und in Gefäß 21 überführt. Diese
Produkte werden für
die Reaktion mit den Monomeren A, B und C in die Gefäße 22a, 22b bzw. 22c aufgeteilt,
gemischt und in Gefäß 16c überführt. Ein
charakteristisches Merkmal der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
sollte in der rechten Hälfte
von 1b beachtet werden. Genauer gesagt,
werden die Produkte von Kupplungsschritten anschließend immer
gepoolt, wird aus den Produkten einer Reaktion einmal kein Pool
gebildet (wie in den Gefäßen 8, 10 und 12).
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Siehe
den linken Teil von 1b: Der Reaktanten-Pool
in den Gefäßen 6a, 6b und 6c wird
an die Monomere A, B bzw. C gekuppelt, was zu den in den Gefäßen 26a, 26b und 26c gezeigten
Produkten führt.
Weil die Produkte in den Gefäßen 26a, 26b und 26c von
einer "Kette" von Pool-Reaktionen
herrühren,
werden die Produkte für
Pool- und getrennte Reaktionen aufgeteilt. Genauer gesagt, wird
ein Teil der Substrate in den Gefäßen 26a, 26b und 26c vereinigt,
gemischt und für
Pool-Reaktionen mit den Monomeren A, B und C in die Gefäße 28a, 28b bzw. 28c aufgeteilt.
Zusätzlich
wird der verbleibende Teil der Produkte in den Gefäßen 26a, b
und c jeweils getrennt aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 30a-c, 32a-c
bzw. 34a-c überführt. Die
Substanzen in den Gefäßen 30a, 32a und 34a werden
an Monomer A gekuppelt, die Substanzen in den Gefäßen 30b, 32b und 34b an
Monomer B und die Substanzen in den Gefäßen 30c, 32c und 34c an
Monomer C. Weil die Produkte in den Gefäßen 30, 32 und 34 aus
einer vorhergehenden getrennten Reaktion stammen, werden die Produkte
in den Gefäßen 30, 32 und 34 gepoolt
oder gemischt und in die Gefäße 36a, 36b bzw. 36c überführt.
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Aus
Gründen,
die später
noch erläutert
werden, werden die Gefäße in Gruppe 42 zur
Bestimmung der Identität
des Monomers in der ersten Position in einem Polymer verwendet,
das zu einem Rezeptor komplementär
ist. Die Gefäße der Gruppe 44 werden
zur Bestimmung der Identität
des zweiten Monomers in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor
komplementär
ist. Die Gefäße der Gruppe 46 werden
zur Bestimmung der Identität
des dritten Monomers in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor
komplementär ist.
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Man
nehme beispielsweise an, dass ein gegebener Rezeptor zu der Monomersequenz
ABC komplementär
ist, aber die Sequenz des komplementären Polymers nicht ab initio
bekannt ist. Wird der Rezeptor mit einer geeigneten Markierung markiert,
wie Fluorescein, und in jedes Gefäß der Gruppen 42, 44 und 46 eingebracht,
wird Fluoreszenz nur in den Gefäßen 16c, 36b und 28c nachgewiesen,
weil die Polymersequenz ABC nur in diesen Gefäßen zugegen ist. Fluoreszenz
kann beispielsweise unter Verwendung der Verfahren nachgewiesen
werden, die beschrieben sind in Mathies et al., US-Patent 4 979
824, das hier durch Bezugnahme für
alle Zwecke vollinhaltlich aufgenommen ist.
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Weil
alle Polymere im Gefäß 16c das
Monomer A in erster Position haben und keines der Polymere in den
Gefäßen 16a oder 16b das
Monomer A in erster Position hat, ist leicht zu bestimmen, dass
das Monomer in der ersten Position eines komplementären Polymers
das Monomer A ist. Weil alle Polymere im Gefäß 36b das Monomer
B in zweiter Position haben, ist leicht bestimmbar, dass das Monomer
B die zweite Position einer komplementären Polymersequenz einnehmen
muss. Weil alle Polymere im Gefäß 28c das
Monomer C in dritter Position haben, muss der komplementäre Rezeptor
ein C an dritter Position haben. So ist leicht bestimmbar, dass
die komplementäre
Sequenz zu dem Rezeptor die Monomersequenz ABC hat.
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Bei
sorgfältiger
Betrachtung der Sequenzen in den Gefäßgruppen 42, 44 und 46 kommt
es ungeachtet der Monomersequenz, die zu dem Rezeptor von Interesse
komplementär
ist, in der Regel nicht zu Zweideutigkeiten. Zum Vergleich sei gesagt:
Ist der Rezeptor von Interesse komplementär zu der Sequenz BBA, wird Fluoreszenz
nur in den Gefäßen 16b, 36b und 28a ermittelt.
Aus dieser Information wird deutlich, dass die komplementäre Monomersequenz
BBA sein muss.
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Die
obige Ausführungsform
veranschaulicht die Synthese von Pools von Gruppen von Polymeren durch
Auftrennung in getrennte Gefäße und anschließendes Kuppeln
und Mischen. Man erkennt, dass die nur zur leichteren Veranschaulichung
erfolgt und dass bei einigen Ausführungsformen die Pools von
Gruppen von Polymeren unter gesteuerten Bedingungen durch gleichzeitige
Reaktion jedes an die Polymere zu kuppelnden Monomers in einem einzigen
Reaktor synthetisiert werden. Es wird zudem erkannt, dass die obigen
Syntheseschritte bei vielen Ausführungsformen
durch vorhergehende, zwischengeschaltete und anschließende Kupplungsschritte
ergänzt
werden, die zur leichteren Veranschaulichung nicht dargestellt sind.
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Das
vorstehende Verfahren kann allgemein durch Anwendung einer geeigneten
Nomenklatur dargestellt werden. Beispielsweise bezeichne Xi den Satz von Monomereinheiten, der in der
Reaktionsrunde i an eine wachsende Polymerkette gebunden wird. Man
nehme beispielsweise an, dass
X1 =
{L,G}
X2 = {P,Y}
X3 =
{R,A}
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Ein
bestimmtes Monomer wird als xij bezeichnet.
Zum Beispiel
X3,1 = R
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Die
Reaktionsprodukte S3 einer 3-Runden-Peptidsynthese
werden kurz dargestellt durch
S3 =
X3X2X1
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S3 wird bestimmt durch polynomisches Ausweiten
einer Reaktion, wie in Fodor et al., Science (1991) 251:767–773 beschrieben,
das hier für
alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist.
S3 =
(R + A)(P + Y)(L + G)
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S3 besteht also aus 8 Tripeptiden:
RPL,
RYL, RPG, RYG, APL, AYL, APG und AYG
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Sij bezeichnet einen Satz von Reaktionsprodukten,
der in der Monomereinheit xij endet. Im
obigen System ist zum Beispiel
S12 =
G
S21 = {PL,PG}
S32 =
{APL,AYL,APG,AYG}
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Diese
Drei-Runden-Synthese lässt
sich auch durch ein Reaktionsdiagramm, wie in 2 gezeigt,
darstellen. Jedes Reaktionsprodukt der Runde i ist durch einen ausgefüllten Punkt
auf dergleichen horizontalen Ebene dargestellt. Jeder Punkt der
Runde i ist mit jedem Punkt der vorhergehenden Runde und mit jedem Punkt
der darauf folgenden Runde verbunden. Zum Beispiel ist der S21 bezeichnende Punkt mit den Punkten für S11 und S12 und auch
mit den Punkten S31 und S32 verbunden.
Man beachte, dass Punkte auf der gleichen Ebene nie miteinander
verbunden sind, weil sich per definitionem die Monomereinheiten
einer Runde nicht vereinigen.
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Es
wird allgemein angenommen, dass die Produkte jeder Runde räumlich getrennt
und zuordnenbar sind. Jeder kann leicht untersucht werden. Die Anzahl
Verbindungen, die durch ein kombinatorisches System erzeugt wird,
kann nach einigen Runden die Anzahl experimentell verfügbarer Behälter oder
Gefäße sehr
stark übersteigen.
Dann ist es vorteilhaft, einen Pool der Produkte von mehr als einer
Syntheserunde zu bilden. Zum Beispiel ergibt eine 5-Runden-Synthese
unter Verwendung des Basissatzes von 20 Aminosäuren 205 oder
3,2 × 106 Pentapeptide. Bildet man dagegen von den
Produkten der ersten beiden Runden einen Pool, ergeben die anschließenden drei
Runden nur 8000 Sätze
von Produkten. Beim Pool-Verfahren geht Information verloren, aber
die Anzahl Produkte wird experimentell behandelbar.
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Die
obige Darstellung der kombinatorischen Synthese kann so modifiziert
werden, dass der Pool-Effekt berücksichtigt
wird. Nimmt man an, dass von den ersten beiden Runden der zuvor
erwähnten
3-Runden-Synthese ein Pool gebildet wird. Das Reaktionsdiagramm
mit Pool-Schritten ist in 3 dargestellt.
Der Produktpool der Runde i ist zur Unterscheidung von den getrennten
Produkten Si mit Pi bezeichnet.
In einem Reaktionsdiagramm ist der Pool durch dargestellt die Konvergenz
der Linien von den Si, von denen ein Pool gebildet
wird. Pi ist dann als offener Kreis dargestellt.
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Bei
diesem Beispiel gilt:
P1 = {L + G}
P2 = {PL + PG + YL + YG}
S3 =
X3P2 = {RPL + RPG
+ RYL + RYG, APL + APG + AYL + AYG}
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Das
Pluszeichen verbindet die in einem Gemisch vorhandenen Produkte.
Dagegen befinden sich durch Kommas getrennte Produkte in getrennten
Behältern
und sind räumlich
zuordnenbar. Bei diesem Beispiel befinden sich der Produktpool der
zweiten Runde in einem Behälter,
aber die Produkte nach drei Runden in zwei Behältern. Eine Behälter enthält das Gemisch
RPL + RPG + RYL + RYG, der andere Behälter das Gemisch APL + APG
+ AYL + AYG.
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Dieses
Reaktionsdiagramm kann vereinfacht werden. Man nehme an, dass P1 an ein äquimolares
Gemisch von x21 und x22 in
einem einzigen Behälter
gekuppelt wurde. Sind die Kupplungseffizienzen für alle Spezies gleich, sind
die Mengen und Arten der erhaltenen Produkte die gleichen wie bei
der Kupplung von P1 mit x21 und
x22 in getrennten Behältern und anschließendem Bilden
eines Produktpools. Also sind Pools von Produkten und Pools von
Reaktanten formal äquivalent,
vorausgesetzt, dass die Reaktionen in einer im Wesentlichen homogenen
Lösung
erfolgen und die Kupplungseffizienzen im Wesentlichen gleich sind.
Eine X3P2-Synthese
kann somit am einfachsten durch das in 4 gezeigte
Reaktionsdiagramm dargestellt werden.
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Die
Linie, die P2 mit P1 verbindet,
bedeutet, dass alle Produkte in P1 gleichermaßen an alle
Reaktanten X2 gekuppelt werden, entweder
durch (1) Einstellen der Konzentrationen von Reaktanten oder (2)
Treiben der Reaktionen bis zur Vollständigkeit in getrennten Behältern und
anschließendes
Bilden eines Pools. Bei Perlen oder einzelnen Partikeln gilt (2) öfter, so
dass jedes Partikel nur für
eine Art Produkt steht.
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Zum
Vergleich stellt sich die Synthese von 180 Pentapeptiden in Furka
et al., "General
Method for Rapid Synthesis of Multicomponent Peptide Mixtures", Int. J. Peptide
Protein Res. (1991) 37:487-493, in der obigen Nomenklatur als S5 = X5P4 dar,
wobei X1 = {A}, X2 =
{E,F,K}, X3 = {E,P,K}, X4 =
{E,F,G,K} und X5 = {E,G,K,L,P}. Die kombinatorische
Peptidbanksynthese in Houghton et al., "Generation and Use of Synthetic Peptide
Combinatorial Libraries for Basic Research an Drug Discovery", Nature (1991) 354:84-86,
ist S6 = X6X5P4, wobei Xi jeweils ein Satz von 18 natürlich vorkommenden
Aminosäuren
ist. Die S6-Produkte befinden sich in 18 × 18 oder
324 Behältern,
die jeweils ein Gemisch von 183 = 5832 Hexapeptiden
enthalten. Die Pool-Synthese in Lam et al., "A new type of synthetic peptide library
for identifying ligand-binding activity", Nature (1991) 354:82-84, wird unter
Verwendung der obigen Nomenklatur als P5 dargestellt,
wobei Xi jeweils ein Satz von 19 natürlich vorkommenden
Aminosäuren
ist. P5 ist ein Gemisch von 195 =
2,48 × 106 Perlen, die jeweils eine Art Peptid tragen.
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Bei
den Pool-Synthesen von Houghton, Lam und Furka werden alle Produkte
von Runde 1 bis Runde n gemischt. Bei der Furka-Synthese (X5,P4) wird ein Pool
von den ersten vier Runden gebildet. Bei einer X3P2-Synthese wird ein Pool von den ersten beiden
Runden gebildet.
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Hier
sind in den 5a, 5b und 5c repräsentative
Pool-Synthesetechniken nach einer bevorzugten Ausführungsform
dargestellt. Das Symbol Xip bedeutet, dass
von den Reaktanten der Runde i ein Pool gebildet wurde, aber nicht
von den Reaktionsprodukten der vorhergehenden Runden. Dies wird
beispielsweise durch (1) Mischen der Reaktanten Xi oder
(2) durch Umsetzen jedes Elements von Xi mit
jedem Reaktionsprodukt von Si-1 erzielt,
wie in 6 für
X3pX2X1p gezeigt.
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Bei
Pentapeptiden, die beispielsweise aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren hergestellt sind,
ist eine Familie von fünf
erfindungsgemäßen Pool-Synthesegruppen besonders
nützlich:
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Die
Produkte aus jeder dieser fünf
Syntheseproduktgruppen befinden sich in 20 physikalisch isolierten Behältern. Jeder
Behälter
enthält
ein anderes Gemisch von 160000 Pentapeptiden. Wie bei dem in 1b gezeigten Trimer wird die Identität der Monomere,
die ein komplementäres
Pentamer bilden, unzweideutig ermittelt, indem ermittelt wird, welcher
der 20 Behälter
in jeder der fünf
Syntheseproduktgruppen Bindung an einen Rezeptor zeigte.
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Es
sollte selbstverständlich
sein, dass "Behälter" hier zwar zur Vereinfachung
genannt werden, dass aber jede von einer Vielzahl Techniken zur
physikalischen Trennung des Peptidgemischs oder anderer Polymergemische
verwendet werden kann.
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Genauer
gesagt, wird eine Sequenz von Monomeren in einem komplementären Liganden
für einen Rezeptor
wie folgt identifiziert. Man betrachte beispielsweise die Familie
gepoolter Tripeptidbanken aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren:
X3X2pX1p X3pX2X1p X3pX2pX1
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Die
stärkste
Aminosäure
an der linken Position (x3i) ergibt sich
durch die Analyse der 20 Behälter
von X3X2pX1p; x2j wird bestimmt
durch Analyse von X3pX2X1p, und x1k wird
durch Analyse von X3pX2pX1 ermittelt. Die Sequenz des stärksten Tripeptids
wird dann als x3ix2jx1k vorausgesagt. Also enthüllt jede
gepoolte Gruppe in der Bank die Identität eines Monomers an einer anderen
Position in einem komplementären
Polymer.
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Man
erkennt, dass es nicht immer wünschenswert
ist, wenn die Identität
der gesamten Monomersequenz in einem Polymer, das komplementär zu einem
Rezeptor ist, bestimmt wird. Stattdessen ist es in einigen Fällen nur
nötig,
die Identität
ausgewählter
Monomere in dem Polymer zu ermitteln. Die Monomere von Interesse
können
sich an Stellen innerhalb der Polymerkette befinden und mit anderen
Monomeren durchsetzt sein. Im allgemeineren Sinne liefert also das
erfindungsgemäße Verfahren
die Synthese einer Bank von Polymeren. Die Bank wird zur Identifikation
von mindestens zwei Monomeren von Interesse in einer Polymerkette verwendet.
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Die
Identität
des x2j-Monomers wird beispielsweise ermittelt
durch Analyse einer Bank von Polymeren T-X2-I-X1p-T; und die Identität des Monomers x1k wird
ermittelt durch Analyse einer Bank von Polymeren T-X2p-I-X1-T, wobei T endständige Gruppen an der Polymerkette
darstellt, die Null-Gruppen sein können, und I für in der
Polymerkette befindliche Gruppen steht, die ebenfalls Null-Gruppen
sein können.
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Das
Verfahren zur Herstellung der Bank verwendete Pool- und getrennte
Syntheseschritte. Die Polymere besitzen mindestens zwei Monomerstellen,
an denen die Identität
von Monomeren ermittelt werden soll, die ein Polymer mit einer zu
einem Rezeptor komplementären
Sequenz ergeben. Die Bank wird derart synthetisiert, dass die Produkte
einer Pool-Synthese aufgetrennt und einer getrennten Synthese oder
einer zweiten Pool-Synthese
unterworfen werden. Die Produkte der getrennten Synthese werden
einer Reihe von Pool-Synthesen unterzogen, bei bevorzugten Ausführungsformen
ohne weitere getrennte Synthese. Dagegen werden die Produkte der
zweiten Pool-Synthese aufgeteilt und einer getrennten und einer
dritten Pool-Synthese unterzogen.
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Die
Syntheseschritte führen
zu einer Bank von Polymeren mit mindestens ersten und zweiten Untergruppen.
Die erste Untergruppe wird zur Ermittlung der Identität eines
Monomers oder von Monomeren an einer ersten Stelle in der Polymerkette,
die zu einem Rezeptor komplementär
ist, verwendet. Die zweite Untergruppe der Bank wird zur Ermittlung
der Identität
eines Monomers oder von Monomeren an einer zweiten Stelle in der
Polymerkette, die zu einem Rezeptor komplementär ist, verwendet.
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Das
Verfahren verwendet summierte Assays zur Identifikation optimaler
Sequenzen. Die Aktivitätsverteilung
in dem untersuchten Gemisch bleibt unbekannt. Nur die Aggregataktivität wird ermittelt.
Mehr Informationen können
aus Analysen von Perlen oder anderen Partikeln erhalten werden,
die mehrere Kopien einer Art von Sequenz enthalten. Die Aktivität jeder
Perle kann quantifiziert werden, obwohl ihre Identität unbekannt
ist.
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Man
nehme an, dass Perlen mit 2 μm
Durchmesser für
eine Pool-Synthese verwendet werden. Einige Eigenschaften typischer
Perlen sind:
Volumen = 4,2 μm3
Oberfläche = 12,6 μm2
Anzahl
Zielstellen = 1,3 × 105
(unter der Annahme von 1 pro 100 mm2)
Anzahl Perlen pro cm3 =
2,4 × 1011
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Fluoreszenzmessungen
von Perlen, die schnell durch einen Laserstrahl strömen, erfolgen
unter Verwendung von Techniken, wie denjenigen im US-Patent 4 979
824, das hier zuvor für
alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen wurde, die beispielhafte
Verfahren zur Ermittlung der Verteilung von Aktivitäten in einer Pool-Synthese
darstellen.
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Man
nehme an, dass ein Lichtstrahl von 2 μm Durchmesser zur Ermittlung
fluoresceinmarkierter Perlen bei einer Flussrate von 20 cm/s verwendet
wird. Die Durchgangszeit einer Perle durch den Strahl beträgt dann
10 μs. Die
Emissionsrate von einem einzigen Chromophor kann bis zu 108 s-1 betragen. Sind
10% der Zielstellen besetzt, entspricht dies einer Emissionsrate
von etwa 1012 s-1 oder
107 emittierten Photonen in 10 μs, die leicht
nachweisbar sind. Ist 10% des Probenvolumens von Perlen besetzt,
durchläuft
im Durchschnitt eine Perle alle 0,1 ms den Strahl. Also können 104 Perlen pro Sekunde analysiert werden. Eine
Bank von 3,2 × 106 Perlen (die jeweils ein anderes Pentapeptid
tragen) kann in etwa 6 Minuten analysiert werden.
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Ersatzweise
können
die Perlen durch Ausbreiten auf einer Oberfläche analysiert werden. Zum
Beispiel nehmen 3,2 × 106 Perlen 1,28 × 102 μm2 ein, wenn sie in eine quadratische Anordnung
gepackt werden. In 1,28 cm2 nähmen diese
Perlen 10% der Oberfläche
ein. Kleinere Perlen, z.B. 0,2 μm2, ergäben
ein ausreichendes Fluoreszenzsignal. Der Vorteil kleinerer Perlen
ist, dass höhere
Perlendichten verwendet werden können,
was zu einer deutlichen Verringerung der für die Analyse benötigten Zeit
führt.
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Die
Fluoreszenzimpulshöhenverteilung,
die sich aus jeder Analyse ergibt, enthüllt, ob in der Perlenprobe
viele oder wenige optimale Sequenzen enthalten sind. Im einfachsten
Fall sieht man eine einzige helle Perle in nur einem Behälter einer
Pool-Synthese. Die Identität
der besten Sequenz ergibt sich dann direkt aus der Analyse jeder
Pool-Synthese der Familie.
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In
anderen Fällen
gibt es eine Verteilung von Intensitäten in mehreren Sätzen von
Perlen. Als allgemeine Regel zeigen positionierte Banken, in denen
sich eine Bindung in mehreren Behältern zeigt, dass eine bestimmte
Position eine weniger signifikante Rolle bei der Bindung spielt.
Bei einigen Ausführungsformen
werden Positionen, an denen eine Zweideutigkeit ermittelt wird,
durch die VLSIPSTM-Technik weiter untersucht.
Die VLSIPSTM-Arrays variieren nur an den
Positionen, an denen das Monomer nicht zweifelsfrei ermittelt wurde. Die
Erfindung wird daher bei einigen Ausführungsformen dazu verwendet,
die Anzahl an Polymeren zu verringern, die mittels VLSIPSTM gescreent werden.
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In
anderen Fällen
werden in mehreren Behältern
synthetisierte Polymermischungen von ihren jeweiligen Perlen abgespalten
und dann auf ihre Aktivität
untersucht. Die freigesetzten Polymere können dann mit Rezeptoren in
verschiedenen Ausrichtungen wechselwirken. Die Aktivität dieser
Polymere kann mit verschiedenen bekannten Techniken untersucht werden,
wie ELISA.
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9 zeigt
eine alternative Beschreibung der Erfindung. Dorf wird im Schritt 901 eine
Kollektion von Substraten Pool- und getrennten Kupplungsschritten
unterzogen, wodurch der Pool von Produkten und die getrennten Produkte 905 bzw. 903 erhalten
werden. Verglichen mit der in 1b gezeigten
Ausführungsform sind
die Produkte 903 analog zu den in den Gefäßen 8, 10 und 12 gezeigten
Produkten. Die Produkte 905 sind analog zu den Produkten
in Gefäß 6.
Die Kollektion von Substratprodukten 903 wird dann den
Pool-Kupplungsschritten 903, 905, 907 und 909 unterzogen,
d.h. die anschließenden
Kupplungsschritte der getrennten Reaktanten sind nur Pool-Kupplungsschritte.
Also wird die Identität
des Monomers an der ersten Position eines Polymers, das zu einem
Rezeptor komplementär
ist, durch Untersuchung der Produkte 907 bestimmt.
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Dagegen
wird der Pool von Produkten 905 aufgeteilt und den Pool-
und getrennten Kupplungsschritten 909 unterzogen, woraus
sich der Pool von Produkten 907 bzw. die getrennten Produkte 913 ergeben.
Wie die getrennten Produkte 903, werden die getrennten
Produkte 913 anschließend
nur Pool-Kupplungsschritten unterzogen, was zu den Pools von Produkten 915 und 917 führt. Die
Produkte 917 werden zur Ermittlung des Monomers in einer
zweiten Position in einem Polymer, das zu einem Rezeptor von Interesse
komplementär ist,
verwendet.
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Ebenso
wird der Pool von Produkten 907 aufgeteilt und den Pool-
und getrennten Kupplungsschritten 919 unterzogen, woraus
sich der Pool von Produkten 923 bzw. die getrennten Produkte 921 ergeben.
Die getrennten Produkte 923 werden anschließend nur
einer Pool-Reaktion unterzogen, wobei die Produkte 925 zur Ermittlung
des Monomers in einer dritten Position in einem Polymer, das zu
einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet werden. Der
Pool von Produkten 921 wird aufgeteilt und den Pool- und
getrennten Reaktionen 927 unterzogen, was zu dem Pool von
Produkten 929 bzw. den getrennten Produkten 931 führt. Die
Produkte 907, 917, 925, 931 und 929 werden
zur Identifikation komplementärer
Rezeptoren verwendet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird anhand des
Pools von Produkten 927 zunächst ermittelt, ob überhaupt
Polymere von Interesse zugegen sind. Die getrennten Produkte 931 werden
zur Ermittlung der Identität
eines Monomers in einer vierten Position in einem Polymer, das zu
einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet.
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Siehe 9:
Pools von Produkten, die keinen vorhergehenden getrennten Reaktionen
unterworfen wurden, werden hier erfindungsgemäß aufgeteilt und Pool- und
getrennten Reaktionen unterzogen. Dagegen werden Produkte, die aus
einem vorhergehenden getrennten Kupplungsschritt hervorgehen, nur
Pool-Kupplungsschritten unterzogen.
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Bei
einer in den 10a–10c dargestellten
anderen Ausführungsform
wird eine rekursive Retrosynthese für das Screening eines Satzes
verschiedenartiger Polymere verwendet. Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen
rekursiven Retrosyntheseverfahren von Houghton et al. identifiziert
dieses Verfahren die Sequenz eines "besten" Polymers durch Identifikation einer
Kollektion von Polymeren ("Bank"), die die Perle
enthält,
die das stärkste
Signal ergibt. Dagegen identifizieren Houghton et al. die gesamte
Bank und nicht das einzelne Polymer (die Perle) mit dem stärksten Signal.
Also kann die Technik von Houghton et al. ein falsches Monomer in
der Sequenz von Interesse identifizieren, weil die Bank, die das
Monomer enthält,
das stärkste Signal
lieferte, während
sich das "beste" Polymer in einer
anderen Bank befindet. Die erfindungsgemäße Ausführungsform der rekursiven Retrosynthese
beseitigt diese Schwierigkeit des Verfahrens von Houghton et al., indem
das einzelne Polymer identifiziert wird, das das stärkste Signal
liefert.
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Siehe 10a–10c: Es ist ein Beispiel für dieses Verfahren beschrieben
für den
Satz aller Pentamere, die aus einem Basissatz von 50 Monomeren gebildet
werden. Siehe 10a: Die gesamte Kollektion von
Quadrameren wird an einer Anzahl Perlen (z.B. 3 × 108 Perlen)
durch vier Zyklen von abwechselndem Aufteilen, Umsetzen und Bilden
eines Pools der Perlen synthetisiert. Der Pool von Quadrameren wird
dann in 50 Behälter
aufgeteilt, die jeweils mit einem anderen Element des Basissatzes
umgesetzt werden, wobei 50 Behälter
von Pentameren erhalten werden, die jeweils nur die Pentamere enthalten,
die in einem bestimmten Monomer enden. Mit der hier verwendeten
Kennzeichnung wird diese Polymerkollektion als X1P X2P X4P X5(1-50) dargestellt.
Die einzelnen Perlen in jedem Behälter werden dann untersucht,
wodurch die einzelne beste Perle (d.h. die Perle, die das stärkste Signal
nach Bindung an den Rezeptor von Interesse liefert) identifiziert
wird. Dies kann in etwa acht Stunden beispielsweise mittels FACS,
wie oben be schrieben, erreicht werden. Nachdem der Behälter mit
der Perle, die das stärkste
Signal ergibt, ermittelt wurde, ist die Identität des Monomers in der fünften Position
bekannt. Bei dem Beispiel in 10 ist
dieses Monomer D.
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Dann
wird die vollständige
Kollektion von Trimeren wie zuvor hergestellt (z.B. aus 6 × 106 Perlen) durch Zyklen von Aufteilen, Umsetzen
und Bilden eines Pools der Perlen, wie in 10b dargestellt.
Ersatzweise kann die Trimerbank nach dem dritten Zyklus des vorhergehenden
Schritts (während
der Bildung der vollständigen
Pentamerbank) beiseite gelegt werden. An diesem Punkt wird der Pool
von Perlen in 50 Behälter aufgeteilt,
die jeweils mit einem anderen Element des Basissatzes umgesetzt
werden. Die Quadramere in jedem Behälter werden dann mit D umgesetzt,
so dass eine Kollektion von Perlen hergestellt wird, die durch X1P X2P X3P X4(1-50)D dargestellt wird. Die Perlen in
jedem Behälter
werden dann erneut untersucht, und die Perle, die das stärkste Signal
liefert, wird identifiziert. Der Behälter, aus dem diese Perle entnommen
wurde, identifizierte das Monomer an der nächsten Position: In diesem
Falle A. Das obige Verfahren wird wiederholt unter Bildung von X1P X2P X3(1-50)AD,
und das Monomer an der nächsten
Position wird identifiziert, wie in 10c dargestellt.
Bei diesem Beispiel wird als nächstes
Monomer Q identifiziert. Die abschließenden zwei Monomere der Sequenz
können
auf die gleiche Weise identifiziert werden. Es kann jedoch effizienter
sein, wenn die verbleibenden 2500 möglichen Pentamere mit einer
VLSIPSTM-Technik gescreent werden.
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Bei
einem Polymer der Länge
N, das aus einem Basissatz von n Monomeren synthetisiert wurde,
kann das endständige
Monomer in der Regel mit dem folgenden Verfahren identifiziert werden.
Zunächst
wird eine Pool-Bank von Substraten derart gebildet, dass auf jedem
Substrat ein anderes Polymer synthetisiert wird. Die Pool-Bank enthält eine
Kollektion von Polymeren, die durch X1pX2p ... X(N-1)p dargestellt
wird. Die Bank wird in n getrennte Behälter aufgeteilt, die dann jeweils
mit einem anderen Monomer umgesetzt werden, wodurch eine Bank X1pX2p ... X(N-1)pXN(1-n) erhalten
wird. Schließlich
wird ein Rezeptor dem Substrat in jedem der n getrennten Behälter ausgesetzt,
und der Behälter,
der das Polymer enthält,
das am stärksten
an den Rezeptor bindet, wird identifiziert. Dieser Behälter liefert
die Identität
des Monomers in der Position XN. Das vorletzte
Monomer wird mit einem ähnlichen
Verfahren aus X1pX2p ...
X(N-1) (1-n)R identifiziert,
wobei R das zuvor identifizierte endständige Monomer ist. Jedes darauf
folgende Monomer kann auf die gleiche Weise identifiziert werden.
Bei diesem Beispiel enthielten die beiden Basissätze, die zur Identifikation
der Monomere an den Positionen N und N-1 verwendet wurden, jeweils
n Elemente. Man erkennt, dass die Monomer-Basissätze, die zur Identifikation
des Monomers an jeder Position auf dem Polymer verwendet werden,
von dem anderen Basissätzen
unabhängig
sein können.
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Eine
kombinatorische Synthesekammer zur Durchführung der Synthese-, Pool- und Aufteilschritte,
die bei jedem erfindungsgemäßen Zyklus
eingesetzt werden, ist in 11a–11c dargestellt. Einzelne Kammern 200,
die jeweils eine bestimmte Menge gepackte Perlen 203 enthalten,
sind nahe beieinander unter Bildung eines zweidimensionalen Arrays
angeordnet. Die Reaktionskammern 200 sind auf einer Basis 207 über Durchgänge 211 befestigt.
Ein Filter 213 ist am Grund jeder Kupplungskammer 200 vorgesehen
und verhindert, dass die Perlen die Kupplungskammern 200 verlassen,
werden Lösungen
durch die Durchgänge 211 abgelassen.
Im Synthesemodus werden Kupplungslösungen durch die Passagen 205 eingebracht,
wobei die Abdeckung 201 geschlossen ist (wie in 11a dargestellt). Der Inhalt jeder Kammer 200 wird
durch die Abdeckung 201 daran gehindert, mit benachbarten
Kammern in Kontakt zu kommen. Die Durchgänge 205 und 211 werden über Ventile
oder andere nicht gezeigte Regelmechanismen geregelt.
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Nachdem
die Kupplungsreaktionen bis zu dem gewünschten Ausmaß abgelaufen
sind, werden die Kupplungslösungen
aus der Synthesekammer durch die Durchgänge 211 abgelassen.
Anschließende
Waschschritte können
vor dem Bilden eines Pools und der Wiederverteilung notwendig sein.
Bei diesen Waschschritten werden Waschlösungen durch die Durchgänge 205 eingebracht,
wobei die Abdeckung geschlossen ist. Nach einer ausreichenden Zeitspanne
wird die Waschlösung
durch die Durchgänge 211 abgelassen.
Mehrere Waschschritte können
durchgeführt
werden, wenn nötig,
wodurch ungebrauchte Kupplungslösungen
aus den Kammern 200 entfernt werden. Bei den Umsetzungs-
und Waschschritten können
die Perlen in den Reaktionskammern durch Drehen oder Schütteln der
gesamten Synthesekammer durchmischt werden.
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Siehe 11b: Das Bilden eines Pools und das Aufteilen
der Perlen erfolgt durch Wegschieben der Abdeckung 201 von
der Basis 207 unter Bildung einer Mischkammer 215.
Die zuvor gepackten Perlen 203 werden dann in einer Flüssigkeit
gerührt,
so dass sie sich in der Mischkammer 215 mischen. Schließlich, nachdem
das Rühren
gestoppt wurde, setzen sich die Perlen zufallsgemäß in verschiedenen
Kammern 200 ab. An diesem Punkt kann die Suspensionslösung durch
die Durchgänge 211 abgelassen
werden. Der Deckel 201 kann abgesenkt werden, so dass er
auf den Oberseiten der Kammer 200 ruht, wie in 11a gezeigt. Bei den Pool- und Aufteilschritten
sind die Ventile in den Durchgängen 205 und 211 geschlossen.
Eine Dichtungsvorrichtung 209 ist vorgesehen, so dass Perlen
oder Flüssigkeit
die Synthesekammer nicht verlassen können.
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11c zeigt eine Aufsicht auf einen zweidimensionalen
Array von Reaktionskammern 200, die auf einer Basis 207 befestigt
sind. 49 Kammern sind in einem 7 × 7-Array angeordnet.
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12 veranschaulicht
eine Bank von Polymeren, die erfindungsgemäß verwendbar ist. Die Polymere besitzen
eine Reihe von mit pi bezeichneten Monomerpositionen.
Die Monomere besitzen mindestens zwei Positionen von Interesse,
p1 und p2, die bei
einigen Ausführungsformen
durch verschiedene dazwischen liegende Monomere getrennt sein können und
an die auch verschiedene Endgruppen gebunden sein können. Die
Monomere werden in eine Reihe physikalisch voneinander isolierter
Behälter
oder Gefäße 1002 eingebracht,
die verbunden sein können,
wie bei einer Mikrotiterplatte. Die Behälter/Gefäße können auch getrennte Behälter sein,
wie Teströhrchen,
Mikrotitertabletts oder dgl.
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Ein
erster Behälter 1002a enthält Polymere
mit einem ersten Monomer M1 in der ersten
Position p1 in jedem der Polymere darin.
Die Polymermoleküle
im ersten Behälter
haben jedoch eine Reihe von Monomeren, wie M1,
M2 und M3, in der
zweiten Position p2. In dem zweiten Behälter 1002b befindet
sich ein zweites Monomer M2 in der ersten
Position p1 in jedem der Polymere darin,
und unterschiedliche Monomere, wie M1, M2 und M3, befinden
sich in der zweiten Position p2. In dem
dritten Behälter 1002c befindet
sich ein drittes Monomer M3 in der ersten
Position p1 in jedem der Polymere darin,
und unterschiedliche Monomere, wie M1, M2 und M3, befinden
sich in der zweiten Position p2. Der erste,
zweite und dritte Behälter
umfasst alle oder einen Teil einer Kollektion von Behältern ...X1...X2p....
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Dagegen
enthält
der vierte Behälter 1002d Polymere
mit einem ersten Monomer M1 in der zweiten
Position p2 in jedem der Polymere darin.
Die Polymermoleküle
im ersten Behälter
haben eine Reihe verschiedener Monomere, wie M1,
M2 und M3, in ihrer
ersten Position p1. In dem fünften Behälter 1002e befindet
sich ein zweites Monomer M2 in der zweiten
Position p2 in jedem der Polymere darin,
und unterschiedliche Monomere, wie M1, M2 und M3, befinden
sich in der ersten Position p1. In dem sechsten
Behälter 1002f befindet
sich ein drittes Monomer M3 in der zweiten
Position p2 in jedem der Polymere darin,
und unterschiedliche Monomere, wie M1, M2 und M3, befinden
sich in der ersten Position p1. Der vierte,
fünfte
und sechste Behälter
umfasst alle oder einen Teil einer Kollektion von Behältern ...X1p...X2....
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Bei
Screening-Studien werden die Behälter 1002a, 1002b und 1002c zur
Bestimmung der Identität des
Monomers in Position 1 eines Polymers, das zu einem Rezeptor von
Interesse komplementär
ist, verwendet. Die Behälter 1002d, 1002e und 1002f werden zur
Bestimmung der Identität
des Monomers in Position 2 eines Polymers, das zu einem Rezeptor
von Interesse komplementär
ist, verwendet.
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Man
erkennt, dass die Polymere, die einem Screening mit den obigen Verfahren
unterzogen werden, eine breit schwankende Länge und Zusammensetzung haben
können.
Bei bevorzugten Ausführungsformen sind
die Polymermoleküle
zum Beispiel länger
als 3 Monomereinheiten, vorzugsweise länger als 5 Monomereinheiten,
stärker
bevorzugt länger
als 10 Monomereinheiten und am stärksten bevorzugt länger als
20 Monomereinheiten. In 12 ist
zwar eine vereinfachte Bank gezeigt, aber man erkennt, dass bei
den meisten Ausführungsformen
die Bank zusätzliche
Polymerbehälter
enthält,
so dass Monomere an mehr als 3 Positionen, vorzugsweise mehr als
5 Positionen, stärker
bevorzugt mehr als 10 Positionen und am stärksten bevorzugt mehr als 20
Positionen in einem zu einem Rezeptor komplementären Polymer ermittelt werden
können.
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III. Auf das Screening
angewendete polynomische Faktorierung
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Bei
einigen Ausführungsformen
wird eine Population aller möglichen
Polymere mit einer Länge
n synthetisiert. Wird gefunden, dass ein Rezeptor an ein Polymer
in dem Gemisch bindet, wird eine zweite Synthese ausgeführt, bei
der die Polymere "faktoriert" werden, d.h. zwei
Behälter
gebildet werden, die jeweils die Hälfte der zu Beginn synthetisierten
Population aufweisen. Dann wird bestimmt, welcher der beiden Behälter Bindung an
den Rezeptor zeigt, wobei der Behälter, der Bindung zeigt, als "Zielgruppe" bezeichnet wird.
Es wird noch eine Synthese durchgeführt, bei der zwei Behälter jeweils
mit der Hälfte
der Population der Zielgruppe in dem früheren Behälter erzeugt werden. Das Verfahren
wird wiederholt, bis die Sequenz des Polymers oder der Polymere,
die Bindung an die Rezeptoren zeigen, ermittelt worden ist.
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Genauer
gesagt, stellt die Erfindung die Synthese einer Population bereit:
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Diese
Lösung
wird faktoriert als:
wobei:
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Führt P1 zu einem "Treffer", wird P1 faktoriert.
Führt P2 zu einem "Treffer", wird P2 faktoriert.
Jede Synthese erfordert nur die Hälfte der Anzahl Polymere, die
im vorhergehenden Schritte hergestellt wurde.