DE69233351T2

DE69233351T2 - Multimere der löslichen Formen der TNF-Rezeptoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE69233351T2
Application number: DE69233351T
Authority: DE
Inventors: David Wallach; Cord Brakebusch
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1991-08-07
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2012-08-08
Also published as: CA2075358C; AU661008B2; EP0526905A2; ATE266724T1; AU2090992A; DE69233351D1; EP0526905B1; PT526905E; CA2075358A1; EP0526905A3; ES2218518T3; IL99120A0; ZA925904B; JPH07145068A; US5478925A; DK0526905T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Multimere der löslichen Formen der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptoren, deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel.
Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist ein Cytokin, das von einer Reihe von Zelltypen, besonders von mononukleären Phagocyten gebildet wird. Bis jetzt sind zwei verschiedene TNFs identifiziert worden: TNF-α und TNF-β (Lymphotoxin). Sowohl TNF-α als auch TNF-β leiten ihre Wirkungen ein, indem sie an spezifische Rezeptoren der Zelloberfläche binden.
Es ist bekannt, dass TNF-α und TNF-β (nachstehend „TNF" genannt) sowohl vorteilhafte als auch schädliche Wirkungen auf eine Reihe verschiedener Zielzellen ausüben, die bei der Entzündungsantwort beteiligt sind. Zu seinen zahlreichen Wirkungen gehört zum Beispiel, dass der TNF das Wachstum von Fibroblasten stimuliert und in diesen Zellen die Synthese von Kollagenase, Prostaglandin E2 und IL-6 induziert. Ebenso senkt TNF in Adipocyten die Aktivität von Lipoprotein-Lipase, aktiviert Osteoclasten und steigert die Adhäsivität von Endothelzellen für Leukocyten aus dem Blut.
TNF hat jedoch auch extrem zerstörerische Wirkungen: Überproduktion von TNF kann eine wesentliche pathogene Rolle bei zahlreichen Erkrankungen spielen; zum Beispiel ist bekannt, dass TNF-α eine wesentliche Ursache für die Symptome des septischen Schocks ist. Bei einigen Erkrankungen kann TNF durch Unterdrückung der Aktivitäten von Adipocyten und durch Hervorrufen von Anorexie übermäßigen Gewichtsverlust (Kachexie) verursachen (TNF-α wurde deshalb Kachektin genannt). Vgl. z. B. Beutler et al., Annu. Rev. Biochem., S. 507–518 (1988) und Old, Sci. Am. 258, S. 41–49 (1988). Übermäßige TNF-Produktion ist gleichfalls bei Patienten mit AIDS nachgewiesen worden.
In der Absicht, den cytotoxischen Wirkungen von TNF zu begegnen, wurde nach Wegen gesucht, auf endogen gebildeten TNF oder exogen verabreichten TNF antagonistisch zu wirken oder ihn zu eliminieren. Darüber hinaus wurde nach Wegen gesucht, spezifisch nur einige der vielen Wirkungen von TNF zu induzieren oder seine Wirkung auf eine spezifische Sorte von Zielzellen zu begrenzen. Der erste Versuch in dieser Richtung war die Entwicklung von monoclonalen Antikörpern, die die cytotoxische Aktivität des TNF-α neutralisieren. Solche monoclonalen Antikörper werden in EP 186 833 und im israelischen Patent Nr. 73883 beschrieben.
Wie vorstehend genannt, initiiert TNF seine Funktion durch Bindung an spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Zwei solcher TNF-Rezeptoren (nachstehend „TNF-R"), die in verschiedenen Zellen unterschiedlich exprimiert werden, sind bekannt, der p55-TNF-Rezeptor und der p75-TNF-Rezeptor (p55-TNF-R und p75-TNF-R). Es ist gezeigt worden, dass zwei Proteine, TBP-I und TBP-II genannt, die spezifisch an TNF binden, immunologisch mit den beiden Rezeptoren kreuzreagieren. Beide Proteinen bieten Schutz gegen die zelltötende in vitro Wirkung von TNF, und beide binden TNF-β weniger effektiv als TNF-α. Man fand heraus, dass die Bildung der TBPs bei der proteolytischen Spaltung der TNF-Rs der Zelloberfläche auftritt, was zur Freisetzung eines größeren Teils ihrer extrazellulären Domäne führt (vgl. EP 308 378 , 398 327 und EP-Anmeldung 90 12 4133.1). Tatsächlich stellte sich heraus, dass die Sequenzen der Aminosäuren von TBP-I und TBP-II vollständig identisch mit Sequenzen waren, die in den extrazellulären Domänen der Rezeptoren der Zelloberfläche gefunden wurden, aber keinen einzigen Teil der intrazellulären Domäne der Rezeptoren enthielten.
Diese Befunde implizieren, dass die Hemmung der TNF-Funktion durch TBP-I und TBP-II die Konservierung eines Teils der strukturellen Merkmale der TNF-Rs der Zelloberfläche in TBP-I und TBP-II widerspiegelt, die für die Bindung von TNF durch die Rezeptoren und damit die Initiierung der Zellantwort auf TNF von Bedeutung sind. Aufgrund dieser Konservierung der Struktur haben TBP-I und TBP-II die Fähigkeit, mit den TNF-Rs der Zelloberfläche um TNF zu konkurrieren und auf diese Weise seine Funktion zu blockieren.
Es ist bekannt, dass TNF in seiner natürlichen Form als ein Multimer (Trimer) vorliegt, das aus drei identischen Polypeptidketten besteht, von denen jede eine molekulare Größe von etwa 17.000 D aufweist.
Um seine Wirkungen zu entfalten, muss TNF in seiner trimeren Form an die TNF-Rezeptoren binden. Obwohl das TNF-Monomer auch an Zellen bindet (allerdings im Vergleich zu dem TNF-Trimer mit einer geringeren Affinität), hat es keine Wirkung.
Die vorliegende Erfindung liefert nun Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs und Salze oder funktionelle Derivate hiervon. Diese Multimere stören wirksam die Bindung von TNF an die Rezeptoren der Zelloberfläche und lassen auf diese Weise nicht zu, dass TNF seine zerstörerische Wirkung entfaltet.
Der hierin verwendete Ausdruck „Multimere" betrifft jede Kombination von Monomeren, die zusammengehalten werden, zum Beispiel durch kovalente Bindung, Liposomen-Bildung, den Einbau von Monomeren der löslichen Form der TNF-R in ein einzelnes rekombinantes Molekül oder jede andere Kombination von Monomeren.
Die Multimere können sowohl in dimerer, trimerer oder anderer multimerer Form vorliegen und können zum Beispiel TBP-I, TBP-II oder ein Gemisch hieraus umfassen.
Die Erfindung liefert auch Verfahren zur Herstellung dieser Multimere durch kovalente Querverknüpfung der löslichen Formen der TNF-Rs.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, die die Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs codierende Nucleotidsequenzen umfassen, diese enthaltende Expressionsvehikel, mit ihnen transformierte Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung der Multimere durch Kultivierung der transformierten Zellen in einem geeigneten Kulturmedium.
Die Erfindung betrifft auch DNA-Moleküle, die mit den vorstehend genannten DNA-Molekülen hybridisieren und die ein Multimer der löslichen Formen der TNF-Rs oder ein funktionelles Derivat hiervon codieren. Der Ausdruck „funktionelles Derivat" wird nachstehend definiert.
Die Multimere der Erfindung und die Salze und funktionellen Derivate hiervon können den aktiven Inhaltstoff von Arzneimitteln zum Schutz von Säugerarten vor den zerstörerischen Wirkungen von TNF enthalten. Diese Arzneimittel sind wiederum eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Wie vorstehend genannt, liegt TNF als ein Trimer vor und entfaltet als solches seine biologische Funktion. Bisher war jedoch nichts über die Form der TNF-Rs bekannt, an die TNF bindet, d. h. ob das TNF-Trimer an einzelne Moleküle der TNF-Rs bindet oder ob die Rezeptoren selbst auch als Multimere vorliegen oder nach der Bindung von TNF zu Multimeren werden, um den TNF-Trimeren besser angepasst zu sein.
Wir haben nun herausgefunden, dass die TNF-Rs in Zellen, die TNF ausgesetzt sind, in Aggregatformen vorliegen.
Dies wurde durch Analyse der Formen mit voller Länge und von am C-terminalen Ende verkürzten Formen der menschlichen p55-TNF-Rs, die über Querverknüpfung an markierten TNF gebunden waren, gezeigt. Zu diesem Zweck produzierten wir verkürzte Formen des menschlichen p55-TNF-R durch ortsgerichtete Mutagenese der cDNA und exprimierten sie in murinen A9-Zellen. Zu diesen Zellen wurde radiomarkierter TNF gegeben und chemisch über Querverknüpfung mit den TNF-Rs verbunden. Die TNF-Rs wurden mit einem Detergenz solubilisiert, und Antikörper, die für die menschlichen Rezeptoren spezifisch waren, wurden eingesetzt, um die menschlichen Rezeptoren zur Immunfällung zu bringen, womit untersucht wurde, ob murine Rezeptoren als eine Folge der Aggregation der Rezeptoren nicht kovalent mit dem menschlichen Rezeptor assoziieren.
Monomere von TBP-I und TBP-II müssen in sehr hohen Dosierungen verabreicht werden, um eine wirksame Hemmung der TNF-Bindung an Zellen im menschlichen Körper zur Folge zu haben. Man nimmt an, dass die Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs der Erfindung die TNF-Aktivität in geringeren Dosierungen wirksamer hemmen, da sie wirkungsvoll mit den TNF-Trimeren um die Bindungsstellen auf den Aggregaten der TNF-Rs der Zelloberfläche konkurrieren können.
Die Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs können auf chemischem Wege hergestellt werden, indem bekannte Verfahren verwendet werden, die zur Bildung von Dimeren oder höheren Multimeren der löslichen Formen der TNF-Rs führen.
Ein anderer Weg der Herstellung der Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs verwendet rekombinante Techniken. Auf diese Weise wird die massenhafte Produktion von Multimeren mit optimaler TNF-Bindungsaktivität ermöglicht.
Arzneimittel, die die Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs enthalten, können verwendet werden, um den zerstörerischen Wirkungen von TNF in Säugerarten entgegen zu wirken, d. h. sie dienen zu Behandlung von Zuständen, bei denen ein Überschuss an TNF entweder endogen gebildet oder exogen verabreicht wird.
Solche Zubereitungen enthalten die Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs der Erfindung oder ihre Salze oder funktionelle Derivate als ihre aktive Inhaltsstoffe. Die Arzneimittel sind bei jedem Überschuss an TNF angezeigt, sei er endogen produziert, wie etwa bei septischem Schock, Kachexie, Transplantat-Wirt-Reaktion, bei Autoimmun-Krankheiten wie etwa der rheumatoiden Arthritis und dergleichen, oder exogen verabreicht, d. h. bei Verabreichung einer Überdosis an TNF.
Der hierin verwendete Ausdruck „Salze" betrifft sowohl Salze der Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze der Aminogruppen des Proteinmoleküls. Salze einer Carboxylgruppe können mit auf dem Fachgebiet bekannten Mitteln gebildet werden und umschließen anorganische Salze, zum Beispiel Natrium, Calcium, Ammonium, Eisen- oder Zinksalze und dergleichen und Salze mit organischen Basen, wie jene, die zum Beispiel mit Aminen gebildet werden, wie etwa Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen. Säureadditionssalze umschließen zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie etwa zum Beispiel Salzsäure oder Schwefelsäure, und Salze mit organischen Säuren, wie etwa zum Beispiel Essigsäure oder Oxalsäure.
Der hierin verwendete Ausdruck „Funktionelle Derivate" umschließt Derivate, die mit auf dem Fachgebiet bekannten Mitteln mit den funktionellen Gruppen, die als Seitenketten auf den Resten erscheinen, oder mit den N- oder C-terminalen Gruppen gebildet werden können, und sind in die Erfindung eingeschlossen, soweit sie pharmazeutisch verträglich bleiben, d. h. sie zerstören nicht die Aktivität des Proteins und entfalten in den Zubereitungen, die sie enthalten, keine toxischen Eigenschaften.
Diese Derivate können zum Beispiel aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acyl-Derivate von freien Aminosäuregruppen der Aminosäurereste, gebildet mit Acyl-Einheiten (z. B. Alkanoyl- oder carboxyclischen Aroylgruppen), oder mit Acyl-Einheiten gebildete O-Acyl-Derivate freier Hydroxylgruppen (zum Beispiel jener von Seryl- oder Threonyl-Resten) umschließen.
„Funktionelle Derivate" umschließen auch Multimere, die aus löslichen Formen von TNF-Rs hergestellt wurden, in denen durch jedes herkömmliche Verfahren Veränderungen an der Sequenz der Aminosäuren vorgenommen wurden, die die löslichen TNF-Rs ausmachen. Diese Veränderungen können Verlängerung oder Verkürzung des löslichen TNF-R-Moleküls oder Deletion oder Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren, die den löslichen TNF-R ausmachen, umfassen. Es ist offensichtlich, dass keine dieser vorstehenden Veränderungen die biologischen Eigenschaften der TNF-Rs beeinträchtigen darf.
Die Arzneimittel der Erfindung werden in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Zustand über die bekannten Verabreichungsarten verabreicht. Zum Beispiel wird im Fall des septischen Schocks intravenöse Verabreichung bevorzugt sein, während im Fall von Arthritis lokale Injektion angezeigt sein kann. Die Arzneimittel können auch kontinuierlich verabreicht werden, d. h. über den Weg der Infusion, oder oral. Die Formulierung und die Dosis werden von dem zu behandelnden Zustand, der Art der Verabreichung und dem Zustand und dem Körpergewicht des zu behandelnden Patienten abhängig sein. Die genaue Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt werden.
Die Arzneimittel der Erfindung werden in herkömmlicher Weise hergestellt, zum Beispiel durch Vermischung des aktiven Inhaltstoffes mit pharmazeutisch und physiologisch verträglichen Trägern und/oder Stabilisatoren und/oder Exzipienten, wie es erforderlich ist, und werden in Dosisform, z. B. durch Lyophilisierung in Dosis-Ampullen hergestellt.
Wenn das Arzneimittel eine Liposomen-Zubereitung enthält, wird letztere so eingestellt, dass optimale Wechselwirkung des Liposoms mit phagocytischen Zellen, optimaler Zugang der Liposomen zum Blutkreislauf und/oder anderen Bereichen des Körpers und optimale Clearance-Raten der Liposomen aus diesen Bereichen sicher gestellt sind.
1A und 1B: zeigen die unterschiedlichen Rezeptorgrößen nach kovalenter Querverknüpfung mit markiertem TNF, Immunfällung und SDS-PAGE-Analyse.
Die dargestellten Muster sind wie folgt:
1A: Fällung mit vorheriger Ansäuerung, um nicht kovalente Verbindung zwischen Rezeptoren aufzubrechen. Fällung von Rezeptoren aus HeLa-Zellen (Reihe 1), Fällung aus Extrakten von nicht transfizierten A9-Zellen (Reihe 2), aus Extrakten von A9-Zellen, die den menschlichen Wildtyp-p55-TNF-R exprimieren (Reihe 3) und aus Extrakten von A9-Zellen, die Mutanten des menschlichen p55-TNF-R exprimieren: den menschlichen Δ:310-426-p55-TNF-R (Reihe 4), den menschlichen Δ:244-426-p55-TNF-R (Reihe 5) und den menschlichen Δ:215-426-p55-TNF-R (Reihe 6). Die mit Mr markierte Reihe ist die der Molekulargewichtsmarkierung.
1B: zeigt die gleiche Analyse zur Rezeptorgröße, jedoch ohne Ansäuerung vor der Immunfällung.
2 zeigt schematisch die Struktur des menschlichen Wildtyp-p55-TNF-R und von drei verkürzten Formen hiervon, d. h. verkürzt an Aminosäure 310 (die Mutante Δ:310-426 des menschlichen p55-TNF-R), an Aminosäure 244 (die Mutante Δ:244-426 des menschlichen p55-TNF-R) und an Aminosäure 215 (die Mutante Δ:215-426 des menschlichen p55-TNF-R).
3A zeigt die cytociden Wirkungen von TNF in A9-Zellen, die den menschlichen p55-TNF-R in voller Länge exprimieren, und in A9-Zellen, die die Mutanten hiervon mit cytoplasmatischer Deletion exprimieren (Δ:310-426, Δ:244-426 und Δ:215-426 des menschlichen p55-TNF-R).
3B stellt die cytociden Wirkungen von monoclonalen Antikörpern gegen den menschlichen p55-TNF-R in den selben Zellen wie von 3A dar.
4A, 4B und 4C zeigen, dass Behandlung von A9-Zellen, die eine Mutante mit cytoplasmatischer Deletion des menschlichen p55-TNF-R exprimieren, mit Antikörpern gegen den Rezeptor ihre Sensitivität auf die cytocide Wirkung von TNF wieder herstellt.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie darauf zu begrenzen.
Beispiel 1: Nachweis von Aggregaten von menschlichen TNF-Rs durch die Analyse ihrer Größe
A9-Zellen, sowohl Zellen, die den Wildtyp als auch mutierte Formen des menschlichen p55-TNF-R exprimieren, und HeLa-Zellen wurden durch Inkubation in PBS mit 5 mM EDTA abgelöst und nach Spülung mit Bindungspufferlösung in Aliquots von 5 × 10⁷ Zellen in 1 ml Bindungsmedium, das radiomarkierten TNF enthielt, suspendiert. Nach Inkubation unter gelegentlichem Schütteln über 4 h auf Eis wurden die Zellen einmal mit balancierter Dulbecco Salzlösung (PBS+) gewaschen und über 20 min in der gleichen Pufferlösung, die 1 mM Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (Pierce) enthielt, inkubiert. Die Querverknüpfung wurde durch Zugabe von Tris-HCl und Glycin-HCl, pH-Wert 7,4, (beides bis zu einer Endkonzentration von 100 nM) gestoppt, gefolgt von zwei Waschungen mit PBS+. Die Zellen wurden darauf unter Verwendung von 600 μl einer Lyse-Pufferlösung, die 20 mM Hepes, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1% deionisiertes Triton X-100, 1 μg/ml Leupeptin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, über 1 h bei 4°C auf Eis extrahiert. Nach Zentrifugation über 30 min bei 10.000 × g wurden die Zellextrakte in zwei gleiche Portionen aufgeteilt. Die eine (Portion A) wurde durch Zugabe von 90 μl 1 M Glycin-HCl-Pufferlösung, pH-Wert 2,5, angesäuert und, nach 1 h Inkubation auf Eis mit 30 μl 1 M NaOH neutralisiert. Zu dieser Portion der Extrakte wie auch zu der anderen (B) wurden monoclonale Antikörper gegen den menschlichen p55-TNF-R zugegeben. Nach weiterer Inkubation über 12 h bei 4°C wurden 20 μl Protein-A Sepharose-Perlen (Pharmacia), mit PBS+ äquilibriert, zugegeben und nach 60 min Inkubation bei 4°C dreimal mit der Lyse-Pufferlösung, die 2 M KCl enthielt, und zweimal mit PBS gewaschen. Die Perlen wurden in 15 μl Proben-Pufferlösung, die 4% (Gew./Vol.) SDS und 6% (Vol./Vol.) β-Mercaptoethanol enthielt, resuspendiert und für 3 min gekocht. Der Überstand wurde mittels SDS-PAGE (10% Polyacrylamid) analysiert, anschließend erfolgte eine Autoradiographie.
Wie in den 1A und 1B gezeigt, liegen die Rezeptoren für TNF in Zellen, die TNF ausgesetzt sind, in Aggregatformen vor. Diese Abbildungen zeigen SDS-PAGE-Analyse von vollständigen und verkürzten Formen der menschlichen p55-TNF-Rs (vgl. die schematische Darstellung der verschiedenen Formen in 2), exprimiert in murinen A9-Zellen und durch Behandlung der Zellen mit radiomarkiertem TNF, gefolgt von Querverknüpfung, markiert.
Nach der Ansäuerung der Extrakte wurden die Rezeptoren aus den Detergenz-Extrakten der Zellen immunpräzipitiert, um nicht kovalente Aggregate der Proteine (A) oder ohne solche Ansäuerung (B) zu trennen. Die Muster der markierten Proteine, gewonnen durch Fällung aus Extrakten von HeLa-Zellen (Reihe 1), aus Extrakten von nicht transfizierten A9-Zellen (Reihe 2), aus Extrakten von A9-Zellen, die den Wildtyp des menschlichen p55-TNF-R exprimieren (3) und aus Extrakten von A9-Zellen, die die Mutanten Δ:310-426 des menschlichen p55-TNF-R (4), Δ:244-426 des menschlichen p55-TNF-R (5) und Δ:215-426 des menschlichen p55-TNF-R (6) exprimieren, werden im Vergleich zur Wanderung der Molekulargewichtsmarkierung (Mr) dargestellt. Markierte Banden, deren Größe mit den exprimierten menschlichen Rezeptoren, die durch Querverknüpfung entweder mit einem oder zwei markierten TNF-Molekülen markiert sind, übereinstimmt, sind mit gefüllten Pfeilen gekennzeichnet (Größen von 72 und 89 kD für den Rezeptor in voller Länge, 59 und 76 kD für den menschlichen Δ:310-426-p55-TNF-R, 51 und 68 kD für den menschlichen Δ:244-426-p55-TNF-R und 48 und 65 kD für den menschlichen Δ:215-426-p55-TNF-R). Die markierten Banden, deren Größen mit den vollständigen murinen Rezeptoren, die entweder mit einem oder zwei TNF-Molekülen querverknüpft sind (72 und 89 kD), übereinstimmen, sind mit offenen Pfeilen gekennzeichnet, und die Banden, die mit den querverknüpften Monomeren, Dimeren und Trimeren von TNF (17, 34 und 51 Kilodalton) übereinstimmen, durch unterbrochene Linien.
Die Antikörper, die für die Immunfällung in dieser Analyse der Rezeptorgröße verwendet wurden, erkannten spezifisch Rezeptoren menschlicher Herkunft (gefüllte Pfeile). Diese Antikörper fällten keine TNF-Rezeptoren aus Extrakten von nicht transfizierten A9-Zellen aus (vergleiche Reihen 1 und 2). Bei der Anwendung dieser Antikörper auf Extrakte von A9-Zellen, die den menschlichen p55-TNF-R exprimieren, zeigte sich jedoch, dass die Antikörper, zusammen mit den menschlichen Rezeptoren, auch einige der murinen Rezeptoren ausfällen, die von den verkürzten menschlichen Rezeptoren leicht durch ihre der vollständigen Länge entsprechenden Größe zu unterscheiden waren (offene Pfeile) (Reihen 3–6 in 1B), was nahe legt, dass die TNF-Rezeptoren in den Zellen als Aggregate vorliegen, die beide Rezeptoren enthalten, sowohl menschlichen als auch murinen Ursprungs. Übereinstimmend mit diesen Befunden wurde herausgefunden, dass die menschlichen Rezeptoren auch noch ausgefällt werden konnten, wenn die Zellextrakte vor der Immunfällung einem niedrigen pH-Wert ausgesetzt waren, um nicht kovalente Bindung zwischen den Rezeptoren aufzubrechen. Die Fällung der murinen Rezeptoren wurde jedoch verhindert (vergleiche 1A bis 1B).
Beispiel 2
A. Konstruktion der mutierten p55-TNF-Rs
Die cDNA des menschlichen TNF-RI (vgl. EP-Anmeldung 90 12 4133.1) wurde mit BanII (bei den Nucleotiden 218-222) und NheI (bei den Nucleotiden 1723 und 1728) zerschnitten, was zur Entfernung großer Teile der nicht codierenden Regionen führte, einschließlich eines ATG in der nicht codierenden 5'-Region und eines multiplen GTn (n = 04-8) in der nicht codierenden 3'-Region. Ortsspezifische Mutagenese dieser verkürzten Form der cDNA wurde unter Verwendung des „Altered Sites" (Mutagenese)-Kits von Promega durchgeführt. Stopp-Codons wurden an den folgenden Stellen eingefügt: Nach Leucin 309 (Mutante Δ:310-426), unter Verwendung der Oligonucleotide:
5'-CCC CAA CCC CCT CTA GAA GTG GGA GG-3'
und nach Leucin 214 (Mutante Δ:215-426), unter Verwendung der Oligonucleotide:
5'-AGT CCA AGC TCT AGA CCA TTG TTT GTG G-3'
(1). Der Wildtyp und mutierte cDNAs wurden in einen eukaryontischen Expressionsvektor eingebracht. Zur Erzeugung der Mutante Δ:244-426 wurde der Expressionsvektor, der die Wildtyp-cDNA enthielt, mit HindIII geschnitten. Das Fragment mit 3,9 kb wurde isoliert und dann, nach Auffüllung der überstehenden Enden, religiert, wodurch Aminosäure 244 durch ein Stopp-Codon ersetzt wurde.
B. Expression der Wildtyp- und der mutierten Rezeptoren in kultivierten Zellen
Zellen der murinen A9-, L929-, NIH3T3- und der Hamster-BHK-Linien wurden in minimalem essentiellem Dulbecco-Medium (DMEM) kultiviert, das 10% fötales Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt. Die Expressionskonstruktionen, die den Wildtyp- und die mutierten Rezeptoren codierten, wurden zusammen mit der Resistenz für Neomycin unter Verwendung des Calcimuphosphat-Fällungsverfahrens cotransferiert, wobei das Plasmid pSV2neo in diese Zellen übertragen wurde. Nach 10 bis 14 Tagen Selektion in Wachstumsmedium, das 500 μg/ml G418 enthielt, wurden resistente Kolonien isoliert und auf die Expression von menschlichem p55-TNF-R durch Messung der TNF-Bindung an die Zellen überprüft.
2 zeigt die Struktur des menschlichen Wildtyp-p55-TNF-Rezeptors. Sie besteht aus Symbolen, die die volle Länge des menschlichen p55-TNF-R und die verkürzten Formen dieses Rezeptors, hervorgerufen durch ortsspezifische Mutagenese, darstellen. Unter Verwendung dieser Oligonucleotide wurden Stopp-Codons in die intrazelluläre Domäne des Rezeptors an den Aminosäuren 310 (Mutante Δ:310-426 des menschlichen p55-TNF-R), 244 (Mutante Δ:244-426 des menschlichen p55-TNF-R) und 215 (Mutante Δ:215-426 des menschlichen p55-TNF-R) eingefügt.
3 und 4 liefern sowohl weiteren Nachweis für die Existenz des Zelloberflächen-TNF-R als Aggregat als auch für zwei andere Punkte, nämlich dafür, dass Aggregation von funktionellen Rezeptoren für die Aktivität dieser Rezeptoren notwendig ist, als auch dafür, dass die Beteiligung von nicht funktionellen Rezeptoren an diesen Aggregaten zu wirksamer Hemmung der TNF-Funktion führt.
3 zeigt die cytociden Wirkungen von TNF (A) und von monoclonalen Antikörpern gegen den menschlichen p55-TNF-R (B) in A9-Zellen, in A9-Zellen, die den menschlichen p55-TNF-R in voller Länge exprimieren, und in A9-Zellen, die die Mutanten des menschlichen p55-TNF-R mit cytoplasmatischer Deletion exprimieren (den menschlichen :310-426-p55-TNF-R, den menschlichen :244-426-p55-TNF-R und den menschlichen :215-426-p55-TNF-R).
Die Zellen wurden 24 h vor der Untersuchung auf Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 30.000 Zellen/Vertiefung gesät. TNF und die monoclonalen Antikörper wurden gleichzeitig mit CHI (50 μg/ml) zugegeben. Nach weiteren 11 h Inkubation bei 37°C wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Untersuchung der Neutralrot-Aufnahme geprüft. Die beiden monoclonalen Antikörper wurden in gleichen Mengen zugegeben, die sich zu der in der Figur angegebenen Konzentration addierten.
In 4 wurde nun die cytocide Wirkung von TNF in Anwesenheit und in Abwesenheit von Antikörpern gegen den menschlichen p55-TNF-R untersucht, wobei TNF zusammen mit CHI (50 μg/ml) zu A9-Zellen (A), A9-Zellen, die den menschlichen Δ:310-426-p55-TNF-R exprimierten (B), und A9-Zellen, die den menschlichen Δ:215:426-p55-TNF-R exprimierten (C), gegeben wurde. Eine ähnliche Sensibilisierung durch die Antikörper auf die cytocide Wirkung von TNF wurde in A9-Zellen beobachtet, die die Mutante Δ:244-426 des menschlichen p55-TNF-R exprimierten.
Während die Antikörper also eine ausdrückliche cytocide Wirkung in den A9-Zellen hatten, die den menschlichen p55-TNF-R in voller Länge exprimierten, hatten sie keinerlei Wirkung in Zellen, die eine der drei verkürzten Formen des Rezeptors exprimierten, was nahe legt, dass diese verkürzten Formen nicht funktionell sind. Darüber hinaus zeigte sich bei der Untersuchung der Wirkung von TNF selbst auf die Zellen, dass im Gegensatz zu den menschlichen p55-TNF-R-Rezeptoren in voller Länge, deren Expression zu erhöhter Sensibilität der A9-Zellen auf TNF führte, die verkürzten Formen der Rezeptoren eine herabgesetzte Antwort auf die cytocide Wirkung von TNF bewirkten.
Diese Herabsetzung konnte in Clonen von A9-Zellen, die eine der verkürzten Formen der Rezeptoren exprimierten, in Ausmaßen beobachtet werden, die ungefähr proportional zum Ausmaß der Rezeptor-Expression zu sein schienen. Die Sensibilität auf TNF konnte wieder hergestellt werden, indem diesen Zellen Antikörper gegen den h-p55-TNF-R verabreicht wurden, wodurch bestätigt wurde, dass die Herabsetzung der Antwort auf TNF eine hemmende Wirkung der verkürzten menschlichen Rezeptoren auf die Funktion der Nagetier-Rezeptoren mit voller Länge widerspiegelt.
Beispiel 3: Herstellung von Multimeren der löslichen Formen von TNF-Rs durch chemische Querverknüpfung dieser Proteine
a) Einführung von Cystein oder alternativ von Biotin an die C-terminalen Enden der löslichen Rezeptoren
Verfahren I: Proben der löslichen Formen von entweder dem menschlichen p55- oder dem menschlichen p75-TNF-R werden mit Cysteinamid oder alternativ mit Biotinamid
und mit Carboxypeptidase Y inkubiert. Bei Anwesenheit eines Überschusses an Cysteinamid oder dem Biotinamid führt die enzymatische Reaktion überwiegend zur Einlagerung dieser Verbindungen an die C-terminalen Enden der löslichen Rezeptoren.
Verfahren II: Die Reaktionen werden wie vorstehend durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die Aminosäure innerhalb des Rezeptors, die als C-terminales Ende für die löslichen Rezeptoren ausgewählt wird, Lysin ist, und dass Lysin-Endopeptidase anstatt Carboxypeptidase eingesetzt wird. Die Verwendung dieses Enzyms stellt sicher, dass, abgesehen von der Entfernung einer einzelnen Aminosäure vom C-terminalen Ende des löslichen Rezeptors, keine weitere Verkürzung des löslichen Rezeptors stattfindet.
b) Verwendung von löslichen Rezeptoren, an deren C-terminalen Enden Cystein eingeführt wurde, zur Bildung von Dimeren der löslichen Rezeptoren
Rezeptoren, an deren C-terminalen Enden Cystein, wie vorstehend beschrieben, eingeführt wurde, werden quer verknüpft, um Dimere zu bilden, indem aktivierte Linkermoleküle mit einer der nachstehenden beiden Formeln verwendet werden:
Linkermoleküle mit unterschiedlichen Längen können verwendet werden. Die Funktion der Produkte wird miteinander verglichen, und auf diese Weise wird die optimale Länge des Linkermoleküls bestimmt. In dem Fall, dass freie Cysteinmoleküle innerhalb der löslichen Rezeptoren vorhanden sein sollten, werden sie durch Alkylierung vor der Einführung von Cystein an die C-terminalen Enden blockiert.
c) Verwendung von löslichen Rezeptoren, an deren C-terminalen Enden Biotin eingeführt wurde, zur Bildung von Tetrameren der löslichen Rezeptoren sowie noch komplexeren Strukturen der Rezeptoren
Die löslichen Rezeptoren, an deren C-terminalen Enden, wie vorstehend beschrieben, Biotin eingeführt wurde, werden mit Avidin quer verknüpft. Jedes Avidin-Molekül enthält vier Biotin-Bindungsstellen. Auf diese Weise werden Tetramere der Rezeptoren gebildet. Alternativ dienen Teile der vier Bindungsstellen im Avidin zur Bindung anderer Proteine, an die Biotin gebunden wurde. Auf diese Weise werden mehrere Avidin-Moleküle miteinander verbunden, was zur Bildung von höheren Aggregaten der löslichen Formen der menschlichen TNF-Rs führt. Dieser Ansatz erlaubt auch die Bindung von zusätzlichen Molekülen an die löslichen Formen der TNF-Rs (z. B. Fc-Abschnitte von Antikörpern).
Alternativ kann Avidin durch Streptavidin ersetzt werden, das Verfahren selbst bleibt das gleiche.
d) Bildung von Multimeren der löslichen Rezeptoren durch Querverknüpfung von Cysteinmolekülen, die innerhalb der Rezeptorsequenz liegen
Solche Multimere aus TNF-Rezeptoren werden gebildet, indem die Moleküle der löslichen Formen der TNF-Rs unter Verwendung von quer verknüpfenden Reagenzien, die spezifisch für Amingruppen oder Thiole sind, miteinander verbunden werden. (Letztere nach partieller Reduktion der Cysteine in den löslichen Rezeptoren mit β-Mercaptoethanol oder Dithiothreit).
e) Bildung von Liposomen, die multiple Moleküle der verkürzten Rezeptoren enthalten
Verfahren I: Liposomen, die ein beliebiges Biotin enthaltendes Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren, können für diesen Zweck eingesetzt werden. Lösliche Formen der TNF-Rs, an deren C-terminale Enden Biotin gebunden wurde, werden unter der Verwendung von (dem tetravalenten) Avidin an diese Liposomen gebunden.
Verfahren II: Rekombinante Rezeptoren, deren intrazelluläre Domänen verkürzt sind, die aber die transmembranen Domänen enthalten, werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Sie werden dann durch Dissoziation in Detergenzien in die Liposomen eingelagert und anschließend in Anwesenheit von Lipiden durch Entfernung der Detergenzien wiederhergestellt.
f) Isolierung von löslichen Rezeptor-Multimeren mit der am stärksten hemmenden Wirkung auf die TNF-Funktion
Präparationen von löslichen Rezeptor-Dimeren oder -Multimeren werden chromatographisch fraktioniert, und die Fraktionen, die die größte hemmende Wirkung auf die TNF-Funktion aufweisen, werden weiter analysiert, um die für TNF-Hemmung optimalen Strukturen zu definieren. Alternativ wird eine Affinitäts-Reinigung der optimalen Hemmstoffe durchgeführt, indem Präparationen der löslichen Rezeptor-Dimere oder -Multimere auf TNF-Affinitätssäulen aufgetragen werden.
Beispiel 4: Schaffung von rekombinanten DNA-Molekülen, die die Nucleotidsequenzen enthalten die die Multimere der löslichen TNF-Rs codieren, und deren Expression
Die Dimere und höheren Multimere der löslichen Rezeptoren können auch auf gentechnischem Weg hergestellt werden, und ihre Herstellung umfasst all jene Techniken, die in diesen Verfahren eingesetzt werden. Auf diese Weise erhält man DNA-Moleküle, die die Nucleotidsequenz enthalten, die solche Dimere oder Oligomere codiert. Diese DNA-Moleküle können aus genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA und einer Kombination hieraus bestehen.
Die Schaffung von DNA-Molekülen, die ein Dimer der löslichen Rezeptoren codieren, wird durchgeführt, indem die cDNA-Sequenz, die die lösliche Form eines TNF-R codiert, an eine Sequenz ligiert wird, die ein Linkerpeptid codiert, und dann weiter an ein synthetisches Polynucleotid, das die Translation des löslichen Rezeptors in der Gegensinn-Richtung – vom ursprünglichen C-terminalen Ende zum N-terminalen Ende codiert, und dem die Sequenz des Leaderpeptids fehlt.
Polymere Formen der löslichen Rezeptoren können, wie vorstehend genannt, hergestellt werden, indem rekombinante, verkürzte Rezeptoren gebildet werden, denen intrazelluläre Domänen fehlen, die aber transmembrane Domänen enthalten, und diese mit Techniken zur Wiederherstellung der Membran in Liposomen eingebracht werden.
Expression der rekombinanten Proteine kann unter Verwendung der geeigneten Expressionsvektoren in eukaryontischen Zellen, Bakterien oder Hefen durchgeführt werden. Jedes auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren kann eingesetzt werden.
Zum Beispiel werden die DNA-Moleküle, die die Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs, erhalten durch die vorstehenden Verfahren, codieren, in geeignet konstruierte Expressionsvektoren mit auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren (vgl. Maniatis et al., op. cit.) inseriert. Doppelsträngige cDNA wird durch Anhängen von Homopolymerschwänzen oder durch Restriktionsverknüpfung unter Verwendung von synthetischen DNA-Linkern oder durch Verfahren zur Ligierung glatter Enden an Plasmidvektoren gebunden. DNA-Ligasen werden verwendet, um die DNA-Moleküle zu verbinden, und unerwünschte Bindung wird durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase verhindert.
Um zur Expression eines gewünschten Proteins in der Lage zu sein, sollte ein Expressionsvektor auch spezifische Nucleotidsequenzen umfassen, die regulatorische Informationen zu Transkription und Translation enthalten, die auf solche Weise mit der das gewünschte Protein codierenden DNA verbunden sind, dass Genexpression und Produktion des Proteins ermöglicht werden. Zuerst muss dem Gen, das transkribiert werden soll, ein Promotor vorausgehen, der von RNA-Polymerase erkannt werden kann, an den die Polymerase bindet und damit den Transkriptionsprozess einleitet. Es sind eine Vielzahl solcher Promotoren in Gebrauch, die mit unterschiedlichen Wirksamkeiten arbeiten (starke und schwache Promotoren). Sie sind für prokaryontische und eukaryontische Zellen verschieden.
Die Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können entweder konstitutiv sein, zum Beispiel der int-Promotor des λ-Bakteriophagen, der bla-Promotor des β-Lactamase-Gens von pBR322 und der CAT-Promotor des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gens von pPR325, etc, oder induzierbar, wie etwa die prokaryontischen Promotoren, einschließlich der rechten und linken Hauptpromotoren des λ-Bakteriophagen (P_L und P_R), der trp-, recA-, lact-, lacZ-, ompF- und gal-Promotoren von E. coli oder des lac-Hybridpromotors etc. (Glick, B. R. (1987) J. Ind. Microbiol. 1: 277–282).
Neben der Verwendung von starken Promotoren, um große Mengen von mRNA zu erzeugen, ist es zum Erreichen eines hohen Ausmaßes an Genexpression in prokaryontischen Zellen notwendig, auch Ribosomen-Bindungsstellen zu verwenden, um sicherzustellen, dass die mRNA wirksam translatiert wird. Ein Beispiel ist die Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz), die zum Initiationscodon geeignet positioniert ist und die komplementär zu der terminalen 3'-Sequenz der 16S-RNA ist.
Für eukaryontische Wirtszellen können in Abhängigkeit von der Natur der Wirtszelle unterschiedliche transkriptionale und translationale Regulationssequenzen verwendet werden. Sie können aus viralen Quellen stammen, wie etwa Adenovirus, Papillomvirus vom Rind, Affenvirus oder dergleichen, bei denen die Regulationssignale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, das ein hohes Ausmaß an Expression aufweist. Beispiele sind der TK-Promotor des Herpesvirus, der frühe SV40-Promotor, der gal4-Gen-Promotor der Hefe etc. Regulationssignale zur transkriptionalen Initiation, die Repression und Aktivierung erlauben, können ausgewählt werden, so dass die Expression der Gene beeinflusst werden kann.
Das DNA-Molekül, das die die TNF-Multimere der Erfindung codierende Nucleotidsequenz und die funktionell verbundenen Regulationssignale für Transkription und Translation enthält, wird in einen Vektor inseriert, der in der Lage ist, die gewünschten Gensequenzen in das Chromosom der Wirtszelle einzufügen. Die Zellen, die die eingefügte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können selektiert werden, indem auch ein oder mehrere Marker eingefügt werden, die die Selektion der den Expressionsvektor enthaltenden Wirtszellen erlaubt. Der Marker kann Prototrophie bei einem auxotrophen Wirtsorganismus, Biozid-Resistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle wie etwa Kupfer oder dergleichen liefern. Das selektierbare Marker-Gen kann entweder direkt an die zu exprimierenden DNA-Gensequenzen gebunden oder durch Co-Transfizierung in die selbe Zelle eingefügt werden. Zusätzliche Elemente können ebenso zur optimalen Synthese der Einzelkette der Bindungsprotein-mRNA benötigt werden. Diese Elemente können sowohl Spleißsignale als auch Transkriptions-Promotoren, Enhancer und Terminierungssignale umschließen. cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente umfassen, schließen jene ein, die von Okayama, H., (1983) Mol. Cel. Biol. 3: 280 beschrieben wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das eingefügte DNA-Molekül in einem Plasmid oder viralen Vektor eingebaut sein, der zu autonomer Replikation im empfangenden Wirtsorganismus in der Lage ist. Wichtige Faktoren zur Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors umschließen: die Leichtigkeit, mit der empfangende Zellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von jenen empfangenden Zellen, die den Vektor nicht enthalten, selektiert werden können; die Anzahl der Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirtsorganismus gewünscht wird; und ob es wünschenswert ist, dass der Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Arten „pendeln" kann.
Bevorzugte prokaryontische Vektoren umschließen Plasmide wie jene, die zur Replikation in E. coli in der Lage sind, zum Beispiel pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184 etc. (vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, op. cit.); Bacillus-Plasmide wie etwa pC194, pC221, pT127 etc. (Gryczan, T., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), S. 307–329); Streptomyces-Plasmide einschließlich pIJ101 (Kendall, K. J. et al., (1987) J. Bacteriol. 169: 4177–4183); Streptomyces-Bakteriophagen wie etwa ØC31 (Chater, K. F. et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), S. 45–54) und Pseudomonas-Plasmide (John, J. F. et al., (1986) Rev. Infect. Dis. 8: 693–704) und Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33: 729–742).
Bevorzugte eukaryontische Plasmide umschließen BPV, Vaccinia, SV40, 2-Mikron-Ring etc. oder deren Derivate. Solche Plasmide sind im Fachgebiet gut bekannt (Botstein, D. et al., (1982) Miami Wint. Symp. 19: 265–274; Broach, J. R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445–470 (1981); Broach, J. R., (1982) Cell 28: 203–204; Bollon, D. P. et al., (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48; Maniatis, T., in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3: Gene Expression, Academic Press, NY, S. 563–608 (1980)).
Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, die die Konstruktionen) enthalten, zur Expression vorbereitet sind, kann (können) die DNA-Konstruktionen) in eine geeignete Wirtszelle mittels einer Vielzahl von geeigneten Verfahren eingefügt werden: Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion etc.
Wirtszellen zur Verwendung in dieser Erfindung können sowohl prokaryontisch als auch eukaryontisch sein. Bevorzugte prokaryontische Wirtsorganismen umschließen Bakterien wie E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia etc. Der am meisten bevorzugte prokaryontische Wirtsorganismus ist E. coli. Bakterielle Wirtsorganismen von besonderer Bedeutung umschließen E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 F, lambda, prototroph (ATCC 27325) und andere Enterobakterien wie etwa Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und zahlreiche Pseudomonas-Arten. Unter solchen Bedingungen wird das Protein nicht glycosyliert. Der prokaryontische Wirtsorganismus muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid vereinbar sein.
Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen sind Säugerzellen, z. B. Mensch-, Affen-, Maus-Zellen und Ovar (CHO)-Zellen des chinesischen Hamsters, weil sie posttranslationale Änderungen an Proteinmolekülen einschließlich korrekter Faltung oder Glycosylierung an den richtigen Stellen liefern. Auch Hefezellen können posttranslationale Änderungen an Peptiden, einschließlich Glycosylierung, durchführen. Es gibt eine Reihe von rekombinanten DNA-Stategien, die starke Promotorsequenzen und hohe Anzahl an Plasmidkopien verwenden, die zur Produktion des gewünschten Proteins in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Leadersequenzen bei clonierten Genprodukten von Säugern und sekretiert Peptide, die Leadersequenzen tragen (d. h., Präpeptide).
Nach der Einfügung des Vektors werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium gezüchtet, das das Wachstum der den Vektor enthaltenden Zellen selektiert. Die Expression der clonierten Gensequenzen) führt zur Produktion der gewünschten Multimere der löslichen Formen der TNF-Rs.
Reinigung der rekombinanten Proteine wird unter Verwendung monoclonaler Antikörper gegen die löslichen Formen der TNF-Rs oder durch Affinitätsreinigung auf Ligand-(TNF)-Säulen durchgeführt.

Claims

Multimere der löslichen Formen der TNF-Rezeptoren oder Salze davon, mit der Fähigkeit, die Bindung des TNF an seine Rezeptoren zu stören und die Wirkungen des TNF zu blockieren, wobei die Multimere TBP-I oder ein Gemisch aus TBP-I und TBP-II umfassen.
Multimer nach Anspruch 1 in dimerer Form.
Multimer nach Anspruch 1 in trimerer Form.
Multimer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Multimer in einem Liposom eingekapselt ist.
Arzneimittel, umfassend ein Multimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4 einer löslichen Form eines TNF-Rezeptors oder ein Salz davon, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Exzipienten und/oder Stabilisator.
Arzneimittel nach Anspruch 5, umfassend Liposomen, welche viele Moleküle des löslichen TNF-Rezeptors enthalten.
Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zum Schutz von Säugern vor schädlichen Wirkungen des TNF.