DE68917879T3

DE68917879T3 - Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von Polynucleotid-Sequenzen.

Info

Publication number: DE68917879T3
Application number: DE68917879T
Authority: DE
Inventors: Edwin Southern
Original assignee: Oxford Gene Technology Ltd
Current assignee: Oxford Gene Technology Ltd
Priority date: 1988-05-03
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2009-05-03
Also published as: GB8810400D0; US20090142751A2; US7888494B2; JP3923450B2; JPH03505157A; JP2004029026A; JPH11243999A; EP0373203B2; EP0373203A1; US20040259119A1; DE68917879D1; JP3386391B2; JP2003043043A; WO1989010977A1; ATE110790T1; JP3923372B2; EP0373203B1; DE68917879T2; JP3393528B2

Description

1. Einführung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse einer Polynukleotid-Sequenz, und zwar entweder einer unbekannten Sequenz oder einer bekannten Sequenz. Ein Glasträger, z.B. eine Glasplatte trägt eine Anordnung des gesamten oder eines ausgewählten Teils einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden, die durch eine kovalente Bindung an eine glatte, impermeable Oberfläche davon gebunden sind, wobei die verschiedenen Oligonukleotide separate Zellen der Anordnung besetzen und an Hybridisierungs-Reaktionen teilnehmen können. Die Anordnung kann ein oder mehrere Paare von Oligonukleotiden aufweisen. Die Polynukleotid-Sequenz oder Fragmente davon sind markiert und auf die Anordnung unter hybridisierenden Bedingungen aufgebracht. Die Anwendungen umfassen die Analyse von bekannten Punktmutationen, die Aufnahme von genetischen Fingerabdrücken, die Kopplungsanalyse, die Charakterisierung von mRNAs, mRNA-Populationen, und die Sequenzbestimmung.
Drei Verfahren beherrschen die molekulare Analyse von Nukleinsäure-Sequenzen: die Gel-Elektrophorese von Restriktionsfragmenten, die molekulare Hybridisierung und die raschen DNA-Sequenzierungsverfahren. Diese drei Verfahren haben in der Biologie einen sehr breiten Anwendungsbereich, und zwar sowohl bei Grundlagenuntersuchungen als auch auf Anwendungsgebieten wie der Medizin und der Landwirtschaft. Eine Vorstellung von dem Ausmaß, in dem diese Verfahren heute verwendet werden, gibt die Geschwindigkeit der Zunahme an DNA-Sequenzen, die heute deutlich über eine Million Basenpaare pro Jahr beträgt. Obwohl sie sehr leistungsfähig sind, haben sie jedoch ihre Grenzen. Die Restriktionsfragment- und Hybridisierungs-Verfahren ermöglichen die grobe Analyse einer ausgedehnten Region, sind aber schnell; die Sequenz-Analyse liefert die höchste Auflösung, ist aber langsam, weil lediglich eine kurze Strecke auf einmal analysiert wird. Es besteht ein Bedarf an Verfahren, die schneller sind als die vorliegenden Verfahren, und insbesondere an Verfahren, die mit jeder Analyse eine große Menge an Sequenzen abdecken.
Die Erfindung stellt ein neues Konzept bereit, bei dem sowohl ein Fingerabdruck als auch eine teilweise oder vollständige Sequenz in einer einzelnen Analyse produziert wird, und das direkt mit komplexen DNAs und RNA-Populationen verwendet werden kann, ohne daß kloniert werden muss.
In einer Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Polynukleotid-Sequenz bereit, bei dem ein Glasträger verwendet wird, an dessen glatte, impermeable Oberfläche eine Anordnung des gesamten oder eines ausgewählten Teils einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden ausgewählter Längen gebunden ist, wobei die verschiedenen Oligonukleotide durch eine kovalente Bindung gebunden sind und separate Zellen der Anordnung besetzen, wobei bei dem Verfahren die Polynukleotid-Sequenz oder Fragmente davon markiert werden, die Polynukleotid-Sequenz oder Fragmente davon unter Hybridisierungs-Bedingungen auf die Anordnung aufgebracht werden und die Lokalisierung der Markierung auf der Oberfläche, die mit bestimmten Bestandteilen der Gruppe von Oligonukleotiden verbunden ist, beobachtet wird.
In anderer Hinsicht stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die zur Analyse einer Polynukleotid-Sequenz mit dem obigen Verfahren geeignet ist, die einen Glasträger und, an eine glatte, impermeable Oberfläche davon gebunden, eine Anordnung des gesamten oder eines ausgewählten Teils einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden ausgewählter Längen umfasst, wobei die verschiedenen Oligonukleotide durch eine kovalente Bindung gebunden sind und separate Zellen der Anordnung besetzen und an Hybridisierungsreaktionen teilnehmen können.
In weiterer Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Anordnung von Oligonukleotiden ausgewählter Längen in diskreten Zellen eines Glasträgermaterials mit einer glatten, impermeablen Oberfläche bereit, bei dem

a) die glatte, impermeable Oberfläche des Glasträgermaterials in diskrete Zell-Lokalisierungen aufgeteilt wird;
b) ein Nukleotid an eine erste Gruppe von Zell-Lokalisierungen gekuppelt wird;
c) ein Nukleotid an eine zweite Gruppe von Zell-Lokalisierungen gekuppelt wird;
d) ein Nukleotid an eine dritte Gruppe von Zell-Lokalisierungen gekuppelt wird;
e) die Sequenz der Kupplungsschritte fortgesetzt wird, bis die gewünschte Anordnung erzeugt ist,

Die Oligonukleotide der Anordnung haben vorzugsweise eine definierte Sequenz und sind mit einer kovalenten Bindung an die glatte, impermeable Oberfläche des Glasträgers gebunden, vorzugsweise durch ein terminales Nukleotid.
Absicht der Erfindung ist es, auf diese Art und Weise eine strukturierte Anordnung des gesamten oder eines ausgewählten Teils einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden mit einer oder mehreren ausgewählten Längen bereitzustellen. Die Anordnung, die auf einer Glasplatte angeordnet werden kann, bildet das Ziel für eine Hybridisierungs-Reaktion.
Die gewählten Hybridisierungs-Bedingungen und die Länge der Oligonukleotide müssen auf alle Fälle so ausreichend sein, daß es mit einer verfügbaren Ausrüstung möglich ist, genau zwischen gepaarten und fehlgepaarten Oligonukleotiden zu unterscheiden. Bei der Hybridisierungs-Reaktion wird die Anordnung mit einer markierten Sonde untersucht, die Oligomere der gewählten Länge oder längere Polynukleotid-Sequenzen oder -Fragmente enthält und deren Natur von der bestimmten Anwendung abhängig ist. Beispielsweise kann die Sonde markierte Sequenzen enthalten, die von genomischer DNA mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurden, oder eine mRNA-Population, oder eine vollständige Gruppe von Oligonukleotiden von einer komplexen Sequenz wie einem vollständigen Genom. Bei dem Endergebnis handelt es sich um eine Gruppe von gefüllten Zellen, die zu den in der analysierten Sequenz vorhandenen Oligonukleotiden korrespondierenden, und um eine Gruppe "leeren Zellen", die zu Sequenzen korrespondierenden, die in der analysierten Sequenz abwesend sind. Das Muster produziert einen Fingerabdruck, der alle analysierten Sequenzen repräsentiert. Außerdem ist es möglich, die meisten oder alle der analysierten Sequenzen zusammenzuführen, wenn eine Oligonukleotid-Länge ausgewählt ist, so daß die meisten oder alle Oligonukleotid-Sequenzen lediglich einmal vorkommen.
Die Anzahl, die Länge und die Sequenzen der Oligonukleotide, die in der Anordnung "lookup table" vorhanden sind, hängt ebenfalls von der Anwendung ab. Die Anordnung kann alle möglichen Oligonukleotide der ausgewählten Länge enthalten, was erforderlich wäre, wenn es keine Sequenz-Information über die zu analysierende Sequenz gibt. In diesem Fall hängt die bevorzugte Länge des verwendeten Oligonukleotids von der Länge der zu analysierenden Sequenz ab, und zwar derart, daß es wahrscheinlich nur eine Kopie jedes bestimmten Oligomers in der zu analysierenden Sequenz gibt. Derartige Anordnungen sind groß. Wenn es irgendwelche verfügbaren Informationen über die zu analysierende Sequenz gibt, kann es sich bei der Anordnung um eine ausgewählte Untergruppe handeln. Zur Analyse einer bekannten Sequenz liegt die Größe der Anordnung in der gleichen Größenordnung wie die Länge der Sequenz und bei vielen Anwendungen, beispielsweise der Analyse eines Gens auf Mutationen, kann sie sehr klein sein. Diese Faktoren werden im folgenden im Detail diskutiert.
2. Oligonukleotide als Sequenz-Sonden
Oligonukleotide bilden Basen-gepaarte Doppelstränge mit Oligonukleotiden mit der komplementären Basen-Sequenz. Die Stabilität des Doppelstrangs hängt von der Länge der Oligonukleotide und von der Basen-Zusammensetzung ab. Die Auswirkungen der Basen-Zusammensetzung auf die Doppelstrang-Stabilität können durch die Gegenwart von hohen Konzentrationen an quaternären oder tertiären Aminen stark verringert werden. Die Fehlpaarungen in dem Oligonukleotid-Doppelstrang haben jedoch eine starke Auswirkung auf die thermische Stabilität des Hybrids, und dadurch wird die Hybridisierungstechnik mit Oligonukleotiden zu einem leistungsfähigen Verfahren zur Analyse von Mutationen und zur Auswahl von konkreten Sequenzen zur Amplifikation mit der DNA-Polymerase-Kettenreaktion. Die Lage der Fehlpaarung wirkt sich auf das Ausmaß der Destabilisierung aus. Fehlpaarungen in der Mitte des Doppelstrangs können eine Ver ringerung von Tm um 10°C verglichen mit 1°C für eine terminale Fehlpaarung verursachen. Es gibt dann einen Bereich der Unterscheidungskraft, der von der Lage der Fehlpaarung abhängt, war Auswirkungen auf das hier beschriebene Verfahren hat. Es gibt Möglichkeiten zur Verbesserung der Unterscheidungskraft, beispielsweise indem die Hybridisierung in der Nähe der Tm des Doppelstrangs durchgeführt wird, um die Bildungsrate von fehlgepaarten Doppelsträngen zu verringern, und indem die Länge von Oligonukleotiden über die erhöht wird, die für eine eindeutige Repräsentation erforderlich ist. Ein Weg zur systematischen Durchführung wird diskutiert.
3. Analyse einer vorbestimmten Sequenz
Eine der leistungsfähigsten Anwendungen von Oligonukleotid-Sonden ist der Nachweis des Austausches einzelner Basen in menschlichen Genen. Das erste Beispiel dafür war der Nachweis des Austausches einer einzelnen Base im beta-Globulin-Gen, was zur Sichelzell-Krankheit führt. Es besteht ein Bedarf für die Ausdehnung dieses Konzepts auf Gene, bei denen eine Anzahl von verschiedenen Mutationen zum gleichen Phänotyp führen kann, beispielsweise beim DMD-Gen und beim HPRT-Gen, und für eine leistungsfähige Möglichkeit zum Absuchen des menschlichen Genoms auf Mutationen in Regionen, für die durch Kopplungsanalyse gezeigt wurde, daß sie einen Krankheitsort für z.B. die Huntington'sche Krankheit und die zystische Fibrose enthalten. Jede bekannte Sequenz kann vollständig als Gruppe von überlappenden Oligonukleotiden dargestellt werden. Die Größe der Gruppe beträgt s + 1 ≈ N, wobei N für die Länge der Sequenz und s für die Länge eines Oligomers steht. Ein Gen von 1 kb kann beispielsweise in eine überlappende Gruppe von rund 1000 Oligonukleotiden irgendeiner ausgewählten Länge aufgeteilt werden. Eine Anordnung, die aus jedem dieser Oligonukleotide in einer separaten Zelle konstruiert ist, kann als multiple Hybridisierungs-Sonde zur Untersuchung der homologen Sequenz in jeder Umgebung verwendet werden, beispielsweise einem Einzellkopie-Gen im menschlichen Genom oder einer Boten-RNA in einer gemischten RNA-Population. Die Länge s kann derart ausgewählt werden, daß die Wahrscheinlichkeit nur sehr gering ist, daß irgendein Oligomer in der Sequenz irgendwo anders in der zu analysierenden Sequenz repräsentiert wird. Dies kann aus dem Ausdruck bestimmt werden, der unten in dem Abschnitt angegeben ist, in dem die Statistik diskutiert wird. Für eine weniger vollständige Analyse wäre es möglich, die Größe der Anordnung zu verringern, z.B. um einen Faktor von bis zu 5, nämlich indem die Sequenz in einer Teil- oder nicht-überlappenden Gruppe repräsentiert wird. Die Verwendung einer vollständig überlappenden Gruppe hat den Vorteil, daß sie eine genauere Lokalisierung jedes Sequenzunterschiedes liefert, und zwar weil die Fehlpaarung sich in s aufeinanderfolgenden Oligonukleotiden absuchen läßt.
4. Analyse einer unbestimmten Sequenz
Die Genome aller freilebenden Organismen sind größer als eine Million Basenpaare und bis heute ist keines davon vollständig sequenziert. Die Restriktionsstellen-Kartierung enthüllt nur einen kleinen Teil der Sequenz und kann lediglich einen kleinen Teil von Mutationen nachweisen, wenn sie zum Vergleich zweier Genome verwendet wird. Es werden leistungsfähigere Verfahren zur Analyse von komplexen Sequenzen benötigt, um die volle Leistungsfähigkeit der molekularen Genetik auf die vielen biologischen Probleme anwenden zu können, für die es keinen direkten Zugang zu dem/den damit verbundenen Gen oder Genen gibt. In vielen Fällen ist es nicht erforderlich, daß die vollständige Sequenz der Nukleinsäuren bestimmt wird; bei den wichtigen Sequenzen handelt es sich um diejenigen, die in zwei Nukleinsäuren unterschiedlich sind. Um drei Beispiele zu geben: die DNA-Sequenzen, die sich in einem Wildtyp-Organismus und einem eine Mutation tragenden unterscheiden, können zum Weg zur Isolierung des relevanten Gens führen; auf ähnliche Weise können die Sequenzunterschiede zwischen einer Krebszelle und ihrer normalen Entsprechung die Ursache für die Transformation enthüllen; und die RNA-Sequenzen, die sich bei zwei Zelltypen unterscheiden, weisen auf die Funktionen hin, welche sie unterscheiden. Diese Probleme können der molekularen Analyse durch ein Verfahren eröffnet werden, das Sequenzunterschiede identifiziert. Unter Verwendung des hier dargestellten Konzepts können derartige Unterschiede durch Hybridisierung der beiden Nukleinsäuren aufgedeckt werden, beispielsweise der genomischen DNA der beiden Genotypen oder der mRNA-Populationen der zwei Zelltypen, und zwar an einer Anordnung von Oligonukleotiden, die alle möglichen Sequenzen repräsentiert. Positionen in der Anordnung, die durch eine Sequenz besetzt sind, aber nicht von der anderen, zeigen Unterschiede in den beiden Sequenzen. Dies ergibt die erforderliche Sequenz-Information zur Synthese von Sonden, die dann zur Isolierung von Klonen der betreffenden Sequenz verwendet werden können.
4.1 Zusammenführen der Sequenz-Information
Sequenzen können rekonstruiert werden, indem das Ergebnis der Hybridisierung an eine Anordnung untersucht wird. Jedes Oligonukleotid mit der Länge s in einer langen Sequenz überlappt mit zwei anderen über eine Länge s-1. Ausgehend von jedem positiven Oligonukleotid kann die Anordnung auf die vier Oligonukleotide zur linken und die vier zur rech ten untersucht werden, die mit einem Einbasen-Austausch überlappen können. Wenn lediglich eins dieser vier Oligonukleotide positiv zur rechten ist, dann bestimmt die Überlappung und die zusätzliche Base zur rechten s Basen in der unbekannten Sequenz. Dieser Vorgang wird in beiden Richtungen wiederholt, wobei eindeutige Paarungen mit anderen positiven Oligonukleotiden in der Anordnung gesucht werden. Jede eindeutige Paarung fügt eine Base zur rekonstruierten Sequenz hinzu.
4.2. Statistik
Jede Sequenzlänge N kann in einer Gruppe von ~ N überlappenden Sequenzen mit s Basenpaaren in der Länge zerlegt werden. (Für doppelsträngige Nukleinsäuren beträgt die Sequenz-Komplexität einer Sequenz von N Basenpaaren 2N, weil die beiden Stränge unterschiedliche Sequenzen haben, jedoch ist für diese Zwecke dieser Faktor von 2 nicht signifikant). Für Oligonukleotide der Länge s gibt es 4^s verschiede Sequenz-Kombinationen. Wie groß sollte s sein, um sicherzustellen, daß die meisten Oligonukleotide in der zu analysierenden Sequenz mit der Komplexität N lediglich einmal repräsentiert werden? Für eine Zufallssequenz beträgt die erwartete Anzahl von s-meren, die in mehr als einer Kopie vorhanden sein werden: μ >,: ≈4s(1 – e–λ(1 + λ)) mit λ = (N – s + 1)/4s
Aus praktischen Gründen ist es auch nützlich zu wissen, wie viele Sequenzen mit irgendeinem gegebenen s-mer durch den Austausch einer einzelnen Base in Beziehung stehen. Jede Position kann durch eine von drei Basen substituiert sein, so daß daher 3 s-Sequenzen mit einem individuellen s-mer durch den Austausch einer einzelnen Base in Beziehung stehen, und die Wahrscheinlichkeit, daß irgendein s-mer in einer Sequenz von N-Basen mit irgendeinem anderen s-mer in dieser Sequenz, die eine Substition erlaubt, in Beziehung steht, beträgt 3s × N/4^s. Die relativen Signale von gepaarten und fehlgepaarten Sequenzen werden dann davon abhängen, wie gut die Hybridisierungsbedingungen eine perfekte Paarung von einer unterscheiden können, die sich durch eine einzelne Base unterscheidet. (Wenn 4^s eine Größenordnung größer ist als N, sollte es lediglich wenige geben, 3s/10, die durch den Austausch einer Base mit irgendeinem Oligonukleotid in Beziehung stehen.) Die Anzeichen sind, daß die Hybridausbeute der fehlgepaarten Sequenz einen Teil der durch einen perfekten Doppelstrang gebildeten darstellt.
Im folgenden wird angenommen, daß Bedingungen gefunden werden können, die gestatten, daß Oligonukleotide, die komplementäre in der Sonde haben, von denjenigen unterschieden werden können, die keine haben.
4.3 Anordnungsformat, Konstruktion und Größe

Um eine Vorstellung vom Umfang der benötigten Anordnungen zur Analyse von Sequenzen verschiedener Komplexität zu bekommen, ist es zweckmäßig, sich die Anordnung als quadratische Matrix vorzustellen. Alle Sequenzen einer gegebenen Länge können genau einmal in einer Matrix repräsentiert werden, die konstruiert wird, indem vier Reihen gezeichnet werden, welche die vier Basen darstellen, gefolgt von vier ähnlichen Spalten. Dadurch wird eine 4 × 4 Matrix gebildet, in der jedes der 16 Quadrate eins der 16 Dubletts reprä sentiert. Dann werden in den ursprünglichen Quadraten vier ähnliche Matrizen, aber mit einem Viertel der Größe, gezeichnet. Dadurch wird eine 16 × 16 Matrix gebildet, die alle 256 Tetranukleotid-Sequenzen enthält. Durch Wiederholung dieses Verfahrens wird eine Matrix mit jeder gewünschten Tiefe s gebildet, wobei die Anzahl der Zellen zu 4^s gleich ist. Wie oben diskutiert, ist die Auswahl von s von großer Wichtigkeit, weil dadurch die Komplexität der Sequenz-Repräsentation bestimmt wird. Wie unten diskutiert, bestimmt s auch die Größe der konstruierten Matrix, die für komplexe Genome sehr groß sein muß. Schließlich bestimmt die Länge der Oligonukleotide die Hybridisierungs-Bedingungen und ihre Unterscheidungskraft als Hydrierungs-Sonden.

s	4^s	Genome	Matrix-Seite (Pixel = 100 μm)	Anzahl der Filmblätter
8	65536	4^sx¹⁰
9	262144
10	1,0 × 10⁶	Cosmid	100 mm	1
11	4,2 × 10⁶
₁₂	1,7 × 10⁷
₁₃	6,7 × 10⁷	E.coli
14	2,6 × 10⁸	Hefe	1,6 m	9
15	1,1 × 10⁹
₁₆	4,2 × 10⁹
₁₇	1,7 × 10¹⁰
₁₈	6,7 × 10¹⁰	Mensch	25 m	2 500
19	2,7 ×10¹¹
₂₀	1,1 × 10¹²		100 m

Die Tabelle zeigt den erwarteten Umfang der benötigten Anordnungen zur Durchführung der ersten Analyse einiger Genome. Die Beispiele wurden gewählt, weil es sich um Genome handelt, die entweder mit herkömmlichen Verfahren sequenziert wurden – der Cosmid-Maßstab – oder sequenziert werden – der E.coli-Maßstab – oder bei denen es beträchtliche Diskussionen über die Größenordnung des Problems gibt – der Human-Maßstab. Die Tabelle zeigt, daß der erwartete Umfang des Matrix-Konzeptes nur einen kleinen Bruchteil von dem des herkömmlichen Konzepts darstellt. Dies läßt sich ohne weiteres anhand der Fläche an Röntgenfilm erkennen, die verbraucht werden würde. Es ist ebenso ersichtlich, daß die benötigte Zeit für die Analyse lediglich ein kleiner Bruchteil derjenigen wäre, die für Gel-Verfahren benötigt würde. Die "Genom"-Spalte zeigt die Länge der Zufalls-Sequenz, die etwa 5 % der Zellen in der Matrix füllen würde. Dies wurde als die optimale Bedingung für den ersten Schritt in der unten diskutierten Sequenzierungsstrategie bestimmt. Bei dieser Größe würde ein hoher Anteil an positiven Signalen das einzelne Auftreten jedes Oligomers repräsentieren, wobei diese Bedingungen benötigt werden, um zwei Genome auf Sequenzunterschiede zu vergleichen.
5. Verfeinerung einer unvollständigen Sequenz
Die Rekonstruktion einer komplexen Sequenz führt zu einem Ergebnis, bei dem die rekonstruierte Sequenz an jedem Punkt unterbrochen ist, an dem ein wiederholtes Oligomer in der Sequenz auftritt. Einige Wiederholungen sind als Bestandteile von langen Wiederholungsstrukturen vorhanden, die Teile der strukturellen Organisation der DNA bilden, beispielsweise in zerstreuten und Tandem-Wiederholungen in Human-DNA. Wenn aber die Länge der verwendeten Oligonukleotide in der Matrix geringer ist als die, die zur Repräsentation der eindeutigen Gesamtsequenz benötigt wird, treten Wiederholungen zufällig auf. Derartige Wiederholungen sind wahrscheinlich zu isolieren. Dies bedeutet, daß die Sequenzen, welche die wiederholten Oligomeren umgeben, miteinander in keiner Beziehung stehen. Die durch diese Wiederholungen verursachten Lücken können entfernt werden, indem die Sequenz auf längere Oligomere erstreckt wird. Im Prinzip könnten diejenigen Sequenzen, die in der ersten Analyse als wiederholt gezeigt werden, nämlich unter Verwendung einer Anordnungsrepräsentation aller möglichen Oligomeren, mit einer Verlängerung an jedem Ende resynthetisiert werden. Für jedes wiederholte Oligomer wären 4 × 4 = 16 Oligomere in der neuen Matrix. Die Hybridisierungs-Analyse würde dann wiederholt, bis die Sequenz vollständig ist. In der Praxis ist es, nämlich weil die Ergebnisse eines positiven Signals bei der Hybridisierung mehrdeutig sein können, besser, eine Verfeinerung des ersten Ergebnisses vorzunehmen, indem alle Sequenzen, die in der ersten Analyse kein klar negatives Ergebnis liefern, verlängert werden. Ein Vorteil dieses Konzeptes besteht darin, daß durch die Verlängerung der Sequenz Fehlpaarungen, die sich nahe an den Enden des kürzeren Oligomers befinden, näher zur Mitte des verlängerten Oligomers gebracht werden, wodurch sich die Unterscheidungskraft der Doppelstrangbildung erhöht.
5.1 Hypothetische Analyse der DNA-Sequenz des Bakteriophagen λ
Die Lambda-Phagen-DNA ist 48 502 Basenpaare lang. Die Sequenz wurde vollständig bestimmt, und ein Strang davon wurde als Testfall in einer Computer-Simulation der Analyse behandelt. Die Tabelle zeigt, daß die geeignete Größe des Oligomers zur Verwendung für eine Sequenz dieser Kom plexität das 10-mer ist. Mit einer Matrix aus 10-meren betrug die Größe 1024 Linienquadrate. Nach der "Hybridisierung" der Lamda-10-meren im Computer waren 46 377 Zellen positiv, 1957 zeigten doppeltes Auftreten, 75 dreifaches Auftreten und drei vierfaches Auftreten. Diese 46 377 positiven Zellen repräsentierten bekannte Sequenzen, die aus ihrer Position in der Matrix bestimmt wurden. Jede wurde durch vier × eine Base am 3'-Ende und vier × eine Base am 5'-Ende unter Erhalt von 16 × 46 377 = 742 032 Zellen verlängert. Diese verlängerte Gruppe verringerte die Anzahl von Zweifachauftritten auf 161, eine weitere 16fache Verlängerung verringerte die Anzahl auf 10 und eine weitere lieferte ein vollständig überlappendes Ergebnis. Natürlich könnte das gleiche Endergebnis, nämlich eine vollständig überlappte Sequenz, auch erzielt werden, indem mit einer 4¹⁶-Matrix begonnen wird, aber die Matrix wäre 4000mal größer als die Matrix, die zur Repräsentation aller 10-mere benötigt wird, und die meisten auf ihr repräsentierten Sequenzen wären redundant.
5.2. Entwurf der Matrix
Das hier beschriebene Verfahren sieht vor, daß die Matrix produziert wird, indem Oligonukleotide in den Zellen einer Anordnung durch Ablage der Vorläufer für die vier Basen in einem vorbestimmten Muster, von dem ein Beispiel oben beschrieben ist, synthetisiert werden. Eine automatische Ausrüstung zum Aufbringen der Vorläufer ist noch zu entwickeln, aber es gibt offensichtliche Möglichkeiten; es sollte nämlich nicht schwierig sein, einen Stift-Plotter oder eine andere computergesteuerte Druckeinrichtung für diese Zwecke anzupassen. Je kleiner die Pixelgröße der Anordnung ist, desto besser ist dies, weil komplexe Genome eine sehr große Anzahl von Zellen benötigen. Jedoch gibt es auch Grenzen dafür, wie klein diese gemacht werden können. 100 Mikron wären eine ziemlich zweckmäßige obere Grenze, könnten aber wahrscheinlich aus Gründen der Textur und der Diffusion nicht auf Papier erzielt werden. Auf einer glatten, impermeablen Oberfläche eines Glasträgers ist es möglich, eine Auflösung von ungefähr 10 Mikron zu erzielen, beispielsweise unter Verwendung eines Laser-Schriftsetzers, um ein Lösungsmittelabstoßendes Netz vorzubilden, und unter Einbau der Oligonukleotide in die freigelegten Regionen. Die Anlage einer sehr großen Anzahl von Linien oder Punkten kann sehr lange dauern, wenn der Druckmechanismus langsam ist. Ein billiger Tintenstrahldrucker kann jedoch Geschwindigkeiten von etwa 10.000 Flecken pro Sekunde drucken. Mit dieser Geschwindigkeit könnten 10⁸ Flecken in etwa 3 Stunden gedruckt werden.
5.3 Oligonukleotid-Synthese
Zur Synthese von Oligonukleotiden gibt es mehrere Verfahren. Bei den meisten Verfahren, die zur Zeit Verwendung finden, werden die Nukleotide an einem festen Träger aus Glas mit einer kontrollierten Porengröße (CPT) befestigt und sind zur Anpassung für die Synthese auf einer glatten, impermeablen Glasoberfläche geeignet. Die PCT-Anmeldung WO 85/01051 beschreibt ein Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden, die an eine CPG-Säule gebunden sind. In einem von uns zu Referenzzwecken durchgeführten Experiment wurde CPG als Träger in einem Oligonukleotid-Synthesiser von Applied Biosystems verwendet, um ein 13-mer zu synthetisieren, das zur linkshändigen cos-Stelle der Phagen Lambda komplementär ist. Die Kupplungsschritte lagen alle in der Nähe der theoretischen Ausbeute. Die erste Base war während aller Synthese- und Schutzgruppenabspaltungsschritte durch eine kovalente Bindung stabil an das Trägermedium gebunden.
6. Sonden, Hybridisierung und Nachweis
Bei der zu analysierenden Polynukleotid-Sequenz kann es sich um DNA oder RNA handeln. Zur Herstellung der Sonde kann das Polynukleotid zur Bildung von Fragmenten abgebaut werden. Vorzugsweise wird es mit einem Verfahren abgebaut, das so zufällig wie möglich ist, und zwar auf eine durchschnittliche Länge um die gewählte Länge s der Oligonukleotide der Träger, und der Oligomeren mit der genauen Länge s, die durch Elektrophorese auf einem Sequenzierungsgel ausgewählt wurden. Die Sonde wird dann markiert. Beispielsweise können die Oligonukleotide mit der Länge s am Ende markiert werden.
Wenn sie mit ³²P markiert werden, kann die Radioaktivitätsausbeute jedes individuellen s-mers sogar von Gesamt-Human-DNA mehr als 10⁴ dpm/mg Gesamt-DNA betragen. Zum Nachweis wird in einem Stückchen von 10–100 Mikron im Quadrat lediglich ein kleiner Bruchteil benötigt. Dies gestattet die Auswahl von Hybridisierungs-Bedingungen in der Nähe der Tm der Doppelstränge, was die Hybrid-Ausbeuten verringert und die Bildungsrate verringert, aber die Unterscheidungskraft erhöht. Da das gebundene Oligonukleotid im Oberschuss vorliegt, stellt das Signal kein Problem dar, sogar wenn in der Nähe des Gleichgewichts gearbeitet wird.
Es können die Hybridisierungs-Bedingungen gewählt werden, die bekanntermaßen für Standardverfahren geeignet sind, die zur Hybridisierung an Filter verwendet werden, aber die Einstellung von optimalen Bedingungen ist wichtig. Insbesondere muß die Temperatur genau gesteuert werden, vorzugsweise besser aus ± 0,5°C. Insbesondere wenn die gewählte Länge der Oligonukleotide gering ist, muß die Analyse in der Lage sein, zwischen leichten Unterschieden in der Rate und/oder des Ausmaßes der Hybridisierung zu unterscheiden. Es kann erforderlich sein, die Ausrüstung auf Unterschiede in der Basen-Zusammensetzung zwischen verschiedenen Oligonukleotiden zu programmieren. Bei der Konstruktion der Anordnung kann es vorzuziehen sein, diese in Untermatrizen mit ähnlichen Basen-Zusammensetzungen aufzuteilen. Dadurch kann es einfacher werden, die Tm zu definieren, die entsprechend der Basen-Zusammensetzung leicht differieren kann.
Die Autoradiographie, insbesondere mit ³²P, verursacht Bildzersetzung, was ein die Auflösung bestimmender Begrenzungsfaktor sein kann; die Grenze für Silberhalogenid-Filme liegt bei etwa 25 Mikron. Offenbar wären einige Direkt-Nachweissysteme besser. Es werden Fluoreszenz-Sonden ins Auge gefaßt; wegen der hohen Konzentration der Ziel-Oligonukleotide ist die geringe Empfindlichkeit der Fluoreszenz kein Problem.
Es gibt beträchtliche Erfahrung beim Abtasten von autoradiographischen Bildern mit einem digitalisierenden Abtaster. Die momentane Konstruktion liefert eine Auflösung bis runter zu 25 Mikron, die ohne weiteres auf weniger als die der vorliegenden Anwendung erstreckt werden könnte, und zwar in Abhängigkeit von der Qualität der Hybridisierungs-Reaktion und wie gut sie bei der Unterscheidung der Abwesenheit einer Sequenz von der Gegenwart einer oder mehrerer ist. Vorrichtungen zur Messung von astronomischen Platten haben eine Genauigkeit von etwa 1 μm. Die Abtastgeschwindigkeiten sind derart, daß eine Matrix von mehreren Millionen Zellen in wenigen Minuten abgetastet werden kann. Die Software für die Analyse der Daten ist unkompliziert, obwohl die großen Datensätze einen schnellen Rechner erfordern.
Die unten angegebenen Versuche demonstrieren die Durchführbarkeit der Ansprüche.
Als Träger werden im Handel erhältliche Mikroskop-Objektträger (BDH Super Premium 76 × 26 × 1 mm) verwendet. Diese werden mit einem langen aliphatischen Linker derivatisiert, der den Bedingung widerstehen kann, die bei der Schutzgruppenabspaltung bei aromatischen heterocyclischen Basen verwendet werden, d.h. 30 % NH₃ bei 55°C für 10 Stunden. Der Linker, der eine Hydroxyl-Gruppe trägt, die als Startpunkt für das anschließende Oligonukleotid dient, wird in zwei Schritten synthetisiert. Die Objektträger werden zuerst mit einer 25%igen Lösung von 3-Glycidoxypropyltriethoxysilan in Xylol, das einige Tropfen Hunig's Base als Katalysator enthält, behandelt. Die Umsetzung wird in einem Färbegefäß durchgeführt, das mit einem Trockenrohr verbunden ist, und zwar 20 Stunden lang bei 90°C. Die Objektträger werden mit MeOH und Et₂O gewaschen und luftgetrocknet. Dann wird sauberes Hexaethylenglycol und eine Spurenmenge konzentrierter Schwefelsäure zugegeben und das Gemisch 20 Stunden bei 80°C gehalten. Die Objektträger werden mit MeOH und Et₂O gewaschen und luftgetrocknet und bei –20°C bis zur Verwendung wasserfrei gelagert.
Der Oligonukleotid-Synthesezyklus wird wie folgt durchgeführt:
Die Kupplungslösung wird für jeden Schritt frisch hergestellt, indem 6 Vol. 0,5 M Tetrazol in wasserfreiem Acetonitril mit 5 Vol. einer 0,2 M Lösung des benötigten beta-Cyanoethylphosphoramidits gemischt werden. Die Kupplungszeit beträgt 3 Minuten. Die Oxidation mit einer 0,1 M Lösung von J₂ in THF/Pyridin/H₂O liefert eine stabile Phosphotriester-Bindung. Die Detritylierung des 5'-Endes mit 3%iger Trichloressigsäure in Dichlormethan erlaubt die weitere Verlängerung der Oligonukleotid-Kette. Es gab keinen Abkappungsschritt, da der verwendete Überschuß an Phosphoramiditen bezüglich der reaktiven Stellen auf dem Objektträger groß genug war, um die Kupplung vollständig ablaufen zu lassen. Nach der Beendigung der Synthese werden die Schutzgruppen des Oligonukleotids in 30%igem NH₃ abgespalten, und zwar 10 Stunden bei 55°C. Die in dem Kupplungsschritt verwendeten Chemikalien sind feuchtig keitsempfindlich und dieser kritische Schritt muß unter wasserfreien Bedingungen in einem verschlossenen Gefäß durchgeführt werden, nämlich wie folgt. Die Form des zu synthetisierten Stücks wurde aus einem Stück Silicongummi (76 × 26 × 0,5 mm) ausgeschnitten, das sandwichartig zwischen einem wie oben beschrieben derivatisierten Mikroskop-Objektträger und einem Stück Teflon mit der gleichen Größe und Dicke angeordnet wurde. An dieses wurde ein kurzes Stück Kunststoffschlauch angepaßt, das die Injektion und Entfernung der Kupplungslösung mit einer Spritze und die Spülung des Hohlraums mit Argon erlaubt. Die gesamte Anordnung wurde durch zurückklappbare Büroklammern zusammengehalten. Nach der Kupplung wurde der Aufbau zerlegt und der Objektträger wurden den anschließenden chemischen Reaktionen (Oxidation mit Jod und Detritylierung durch Behandlung mit TCA) durch Eintauchen in Färbegefäße unterzogen.
Beispiel 1
Als erstes Beispiel wurden die Sequenzen Oligo-dT₁₀-oligodT₁₄ auf einem Objektträger synthetisiert, indem allmählich die Menge der Kupplungslösung in den Schritten 10 bis 14 verringert wurde. So wurde das 10-mer auf dem oberen Teil des Objektträgers synthetisiert, das 14-mer unten und die 11-, 12- und 13-mere dazwischen. Es wurden 10 pMol Oligo-dA als Hybridisierungssonde verwendet, das am 5'-Ende mit ³²P bis zu einer Gesamtaktivität von 1,5 Millionen ppm markiert war, und zwar mit der Polynukleotid-Kinase-Reaktion. Die Hybridisierung wurde in einem Perspex (Plexiglas)-Gefäß durchgeführt, das an einen Mikroskop-Objektträger angepaßt worden war, welches mit 1,2 ml 1 M NaCl in TE, 0,1 % SDS gefüllt war, nämlich 5 Minuten bei 20°C. Nach kurzem Spülen in der gleichen Lösung ohne Oligonukleotid war es möglich, mehr als 2000 cps mit einem Strahlungsmonitor nachzuweisen.
Eine Autoradiographie zeigte, daß alle Zählungen aus der Fläche kamen, an der die Oligonukleotide synthetisiert worden waren, d.h. daß es keine unspezifische Bindung an das Glas gab oder an die Region, die lediglich mit dem Linker derivatisiert worden war. Nach teilweiser Flution in 0,1 M NaCl ist unterschiedliche Bindung an das Ziel nachweisbar, d.h. weniger Bindung an das kürzere als an das längere Oligo-dT. Durch allmähliches Erwärmen des Objektträgers in der Waschlösung wurde die Tm (Mittelpunkt des Übergangs, wenn 50 % eluierten) bestimmt, und zwar zu 33°C. Nach der Inkubation bei 39°C waren keine Zählungen nachweisbar. Die Hybridisierung und das Schmelzen wurde ohne Verringerung des Signals achtmal wiederholt. Es wurde bestimmt, daß mindestens 5 % der Eingangszählungen bei jedem Zyklus von dem Objektträger aufgenommen wurden.
Beispiel 2
Um zu bestimmen, ob es möglich ist, zwischen gepaarten und fehlgepaarten Oligonukleotiden zu unterscheiden, wurden zwei Sequenzen synthetisiert, 3' CCC GCC GCT GGA (cosL) und 3' CCC GCC TCT GGA, die sich durch eine Base in der Position 7 unterscheiden. Alle Basen, mit Ausnahme der siebten, wurden in einem rechtwinkligen Stück zu gegeben. Bei der siebten Base wurde die Hälfte des Rechtecks der Reihe nach zur Zugabe der beiden verschiedenen Basen freigelegt, und zwar in zwei Streifen. Hybridisiert wurde mit dem cosR-Sonden-Oligonukleotid (5' GGG CGG CGA CCT) (mit Kinase mit ³²P auf 1,1 Millionen cpm markiert, 0,1 M NaCl, TE, 0,1 % SDS), und zwar 5 Stunden bei 32°C. Die Vorderseite des Objektträgers zeigte nach dem Spülen 100 cps. Autoradiographie zeigte, daß Reassoziierung nur an dem Teil des Objektträgers mit dem vollständig komplementären Oligonukleotid statt fand. Auf dem Stück mit der fehlgepaarten Sequenz war kein Signal nachweisbar.
Beispiel 3
Für eine weitere Studie der Auswirkungen von Fehlpaarungen oder kürzeren Sequenzen auf das Hybridisierungsverhalten wurden zwei Anordnungen konstruiert; eine aus (a) 24 Oligonukleotiden und die andere (b) aus 72 Oligonukleotiden.
Diese Anordnungen wurden wie in Tabelle 1 (a) und 1 (b) gezeigt angeordnet. Die Masken, die verwendet wurden, um diese Anordnungen zu entwerfen, unterschieden sich von denjenigen, die in den vorhergehenden Experimenten verwendet wurden. Silicongummi-Schlauchstückchen (1 mm o.d.) wurden mit Siliconkautschuck-Kitt an die Oberfläche von einfachen Mikroskop-Objektträgern geklebt, und zwar in Form eines U. Durch Klemmen dieser Masken gegen einen derivatisierten Mikroskop-Objektträger wurde ein Hohlraum erzeugt, in den die Kupplungslösung mittels einer Spritze eingeführt wurde. Auf diese Weise kam nur der Teil des Objektträgers in dem Hohlraum mit der Phosphoramidit-Lösung in Kontakt. Ausgenommen in den Positionen der fehlgepaarten Basen wurden die in Tabelle 1 aufgelisteten Anordnungen unter Verwendung einer Maske, die den größten Teil der Breite des Objektträgers bedeckte, angelegt. Durch Versetzen dieser Maske um 3 mm ober- oder unterhalb des derivatisierten Objektträgers in anschließenden Kupplungs-Reaktionen wurden Oligonukleotide produziert, die an den 3'- oder 5'-Enden beschnitten waren.
Zur Einführung von Fehlpaarungen wurde eine Maske verwendet, welche die Hälfte (für Anordnung (a)) oder ein Drittel (für Anordnung (b)) der Breite der ersten Maske bedeckte.
Die Basen an den Positionen 6 und 7 wurden in zwei oder drei längsverlaufenden Streifen niedergelegt. Dies führte zur Synthese von Oligonukleotiden, die sich durch eine Base auf jeder Hälfte (Anordnung (a)) oder Drittel (Anordnung (b)) des Objektträgers unterscheiden. In anderen Positionen unterschieden sich die Sequenzen von der längsten Sequenz durch die Abwesenheit von Basen an den Enden.
In Anordnung (b) gab es zwei Spalten von Sequenzen zwischen den in Tabelle 1 (b) gezeigten, in denen die sechste und siebte Base in allen Positionen fehlt, weil der Objektträger in einem Streifen durch die Silicongummi-Dichtung maskiert war. So gab es insgesamt 72 unterschiedliche Sequenzen, die auf dem Objektträger in 90 unterschiedlichen Positionen vertreten waren.
Das 19-mer 5' CTC CTG AGG AGA AGT CTG C wurde zur Hybridisierung verwendet (2 Millionen cpm, 1,2 ml 0,1 M NaCl in TE, 0,1 % SDS, 20°C).
Die Wasch- und Elutionsschritte wurden durch Autoradiographie verfolgt. Der Objektträger wurde bei jedem Elutionsschritt 5 min in der Waschlösung gehalten und dann exponiert (45 min, verstärkt). Die Elutions-Temperaturen betrugen 23, 36, 42, 47, 55 bzw. 60°C. Wie in der Tabelle gezeigt, zeigten die Oligonukleotide unterschiedliches Schmelzverhalten. Kurze Oligonukleotide schmolzen vor längeren und bei 55°C war nur das perfekt gepaarte 19-mer stabil, alle anderen Oligonukleotide waren eluiert. Daher kann das Verfahren zwischen einem 18-mer und einem 19-mer unterscheiden, die sich lediglich durch die Abwesenheit einer Base am Ende unterscheiden. Alle Fehlpaarungen am Ende der Oligonukleotide und an allen internen Stellen können unter Bedingungen geschmolzen werden, unter denen der perfekte Doppelstrang übrig bleibt.
Daher ist es möglich, sehr stringente Hybridisierungs-Bedingungen zu verwenden, welche die Reassoziierung an Fehlpaarungssequenzen oder an Oligonukleotide, die sich in der Länge nur um eine Base unterscheiden, eliminieren. Kein anderes Verfahren, das die Hybridisierung von Oligonukleotiden verwendet, die an einen festen Träger gebunden sind, ist so empfindlich für die Wirkungen der Fehlpaarung.
Beispiel 4
Um die Anwendung der Erfindung zur Diagnose von Erbkrankheiten zu untersuchen, wurde die Anordnung (a) hybridisiert, welche die Oligonukleotid-Sequenzen trägt, die für den Wildtyp und die Sichelzell-Mutationen des β-Globin-Gens spezifisch sind, und zwar mit einem 110 Basenpaar DNA-Fragment, das aus dem β-Globin-Gen mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wurde. Die Gesamt-DNA aus dem Blut eines normalen Individuums (1 Mikrogramm) wurde durch PCR in Gegenwart eines geeigneten Starter-Oligonukleotids amplifiziert. Das erhaltene 110 Basenpaar-Fragment wurde durch Elektrophorese auf einem Agarosegel gereinigt. Nach der Flution wurde eine kleine Probe (ca. 10 Picogramm) unter Verwendung von α-³²P-dCTP (50 Mikrocurie) in einer zweiten PCR-Reaktion markiert. Diese PCR enthielt lediglich das stromaufwärts startende Oligonukleotid. Nach 60 Amplifizierungszyklen mit einer Verlängerungszeit von 9 min wurde das Produkt durch Gelfiltration von Vorläufern entfernt. Die Gel-Elektrophorese des radioaktiven Produkts zeigte eine Hauptbande, die bezüglich der Länge dem 110 Basenfragment entsprach. Ein Viertel dieses Produkts (100 000 cpm in 0,9 M NaCl, TE, 0,1 % SDS) wurde an die Anordnung (a) hybridisiert. Nach 2 Stunden bei 30°C waren ca. 15 000 cpm aufgenommen worden. Das Schmelzverhalten der Hybride wurde wie für das 19-mer in Beispiel 3 beschrieben verfolgt, und es wurde gefunden, daß das Schmelzverhalten dem des Oligonukleotids ähnlich war. Dies bedeutet, daß die Fehlpaarungen die Schmelztemperatur der Hybride beträchtlich verringerten und es wurden ohne weiteres Bedingungen gefunden, unter denen die perfekt gepaarten Doppelstränge übrig blieben, während die fehlgepaarten Doppelstränge vollständig schmolzen.
Daher kann die Erfindung sowohl zur Analyse von langen DNA-Fragmenten als auch von Oligonukleotiden verwendet werden und dieses Beispiel zeigt, wie sie verwendet werden kann, um Nukleinsäure-Sequenzen auf Mutationen zu untersuchen. Insbesondere zeigt es, wie sie zur Diagnose von genetischen Erkrankungen verwendet werden kann.
Beispiel 5
Um ein automatisiertes System zum Ablegen der Vorläufer zu untersuchen, wurde das cosL-Oligonukleotid synthetisiert, und zwar mit 11 der 12 Basen, die auf die oben beschriebene Art und Weise zugegeben wurden. Zur Zugabe der siebten Base wurde der Objektträger jedoch in eine mit Argon gefüllte Kammer überführt, die einen Stift-Plotter enthielt. Der Stift des Plotters war durch einen aus Nylon gefertigten Bestandteil ersetzt worden, der die gleiche Form und Abmessungen wie der Stift hatte, aber ein Polytetrafluorethylen (PTFE)-Röhrchen trug, durch das Chemikalien auf die Oberfläche des Glas-Objektträgers abgegeben werden konnten, der auf dem Bett des Plotters lag. Zur Steuerung des Plotters und der Spritzenpumpe, welche die Chemikalien abgab, wurde ein Mikrorechner verwendet. Der Stift, der das Abgaberöhrchen der Spritze trug, wurde über dem Objektträger in Position gebracht, der Stift wurde gesenkt und die Pumpe wurde in Betrieb genommen, um die Kupplungslösung abzusetzen. Durch aufeinanderfolgendes Füllen des Stiftes mit G-, T- und A-Phosphoramidit-Lösungen wurde eine Anordnung von 12 Flecken in drei Gruppen von vier mit drei unterschiedlichen Oligonukleotid-Sequenzen abgelegt. Nach der Hybridisierung an cosR, nämlich wie in Beispiel 2 beschrieben, und Autoradiographie waren Signale nur über den vier Flecken mit perfekt gepaarten Oligonukleotiden, zu denen dG zugegeben worden war, sichtbar.
Als Schlussfolgerung wird dadurch Folgendes demonstriert:

1. Es ist möglich, Oligonukleotide mit guten Ausbeuten auf einer flachen, glatten, impermeablen Glasplatte zu synthetisieren.
2. Es können mehrere Sequenzen der Probe in kleinen Flecken mit hoher Dichte synthetisiert werden, und zwar mit einem einfachen manuellen Verfahren oder automatisch unter Verwendung einer computergesteuerten Vorrichtung.
3. Die Hybridisierung der Oligonukleotide auf der Platte kann mit einem sehr einfachen Verfahren durchgeführt werden. Die Hybridisierung ist effizient und die Hybride können durch eine kurze autoradiographische Belichtung nachgewiesen werden.
4. Die Hybridisierung ist spezifisch. Es gibt keine nachweisbaren Signale auf Flächen der Platte, auf denen sich keine Oligonukleotide befinden. Die Auswirkungen von fehlgepaarten Basen wurde untersucht, und es wurde gefunden, daß eine einzelne fehlgepaarte Base an irgendeiner Position von Oligonukleotiden mit Längen im Bereich von 12- bis 19-mer die Stabilität des Hybrids ausreichend verringert, so daß das Signal auf ein sehr geringes Niveau verringert werden kann, während die signifikante Hybridisierung an das perfekt gepaarte Hybrid erhalten bleibt.
5. Die Oligonukleotide sind stabil an das glatte, impermeable Glas gebunden und Platten können wiederholt zur Hybridisierung verwendet werden.

Die Erfindung stellt daher eine neue Möglichkeit zur Analyse von Nukleotid-Sequenzen zur Verfügung, die einen breiten Anwendungsbereich finden sollte. Mögliche Anwendungen werden im folgenden aufgelistet:
Kleine Oligonukleotid-Anordnungen als Werkzeuge zum Fingerabdruck anfertigen und zur Kartierung.
Analyse von bekannten Mutationen einschließlich genetischer Erkrankungen.
Das obige Beispiel 4 zeigt, wie die Erfindung zur Analyse von Mutationen verwendet werden kann. Es gibt viele Anwendungen für ein derartiges Verfahren, einschließlich dem Nachweis von vererbten Erkrankungen.
Genetische Fingerabdrücke.
Auf die gleiche Weise wie Mutationen, die zu Erkrankungen führen, nachgewiesen werden können, könnte das Verfahren verwendet werden, um Punktmutationen in irgendeinem DNA-Strang nachzuweisen. Es sind nun Sequenzen für eine Anzahl von Regionen erhältlich, welche die Rasenunterschiede enthalten, die zu Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) führen. Eine Anordnung von Oligonukleotiden, die derartige Polymorphismen darstellen, könnte aus Paaren von Oligonukleotiden hergestellt werden, welche die beiden allelen Restriktionsstellen repräsentieren. Die Amplifikation der Sequenz, die den RFLP enthält, gefolgt von der Hybridisierung der Platte würde zeigen, welche Allelen in dem Testgenom vorhanden sind. Die Anzahl an Oligonukleotiden, die in einer einzelnen Analyse analysiert werden könnte, könnte sehr groß sein. 50 aus ausgewählten Allelen hergestellte Paare wären ausreichend, um einen für ein Individuum eindeutigen Fingerabdruck zu ergeben.
Kopplungsanalyse
Die Anwendung des im letzten Absatz beschriebenen Verfahrens auf einen Stammbaum würde Rekombinationen genau bestimmen. Jedes Paar von Flecken in der Anordnung würde die Information ergeben, die in der Spur der RFLP-Analyse sichtbar ist, und zwar unter Verwendung von Gel-Elektrophorese und Blotting, die nun routinemäßig für Kopplungsstudien verwendet werden. Es sollte möglich sein, viele Allele in einer einzelnen Analyse zu analysieren, und zwar durch Hybridisierung an eine Anordnung von Allelen-Paaren von Oligonukleotiden, wodurch die Verfahren stark vereinfacht werden, die zum Auffinden einer Kopplung zwischen einem DNA-Polymorphismus und einem phänotypischen Marker wie einem Krankheits-Gen verwendet werden.
Die obigen Beispiele können unter Verwendung des entwickelten und durch Experimente bestätigten Verfahrens ausgeführt werden.
Große Anordnungen von Oligonukleotiden als Sequenzablesewerkzeuge.
Es wurde gezeigt, daß Oligonukleotide in kleinen Flecken mit genau bestimmten Positionen mit zwei Verfahren synthetisiert werden können: Durch Zuführung der Vorläufer durch den Stift eines Stift-Plotters oder durch Maskierung von Flächen mit Silicon-Gummi. Es ist klar, wie ein Stift-Plotter angepaßt werden könnte, um große Anordnungen mit einer unterschiedlichen Sequenz in jeder Position zu synthetisieren. Für einige Anwendungen sollte die Anordnung vorbestimmt sein, beschränkte Gruppe; für andere Anwendungen sollte die Anordnung jede Sequenz einer vorbestimmten Länge enthalten. Das Maskierungsverfahren kann für die letzteren verwendet werden, indem die Vorläufer in einer Maske abgelegt werden, die sich überschneidende Linien produziert. Es gibt viele Möglichkeiten wie dies gemacht werden kann, und es wird zur Veranschaulichung ein Beispiel angegeben.

1. Die ersten vier Basen A, C, G, T werden in vier breiten Streifen auf eine quadratische Platte gelegt.
2. Eine zweite Gruppe wird in vier Streifen abgelegt, die in der Breite den ersten gleich sind, und zwar orthogonal zu ihnen. Die Anordnung ist nun aus allen 16 Dinukleotiden zusammengesetzt.
3. Die dritte und vierte Schicht werden in vier Gruppen von vier Streifen mit einem Viertel der Breite der ersten Streifen abgelegt. Jede Gruppe der vier schmalen Streifen verläuft in einem der breiteren Streifen. Die Anordnung ist nun aus allen 256 Tetranukleotiden zusammengesetzt.
4. Das Verfahren wird wiederholt, wobei jedesmal zwei Schichten mit Streifen abgelegt werden, die ein Viertel der Breite der vorhergehenden beiden Schichten haben. Jede zugefügte Schicht erhöht die Länge der Oligonukleotide um eine Base und die Anzahl der verschiedenen Oligonukleotid-Sequenzen um einen Faktor von vier.

Die Abmessungen derartiger Anordnungen werden durch die Breite der Streifen bestimmt. Der schmalste gelegte Streifen betrug 1 mm, aber dies ist sichtlich nicht die unterste Grenze.
Es gibt nützliche Anwendungen für Anordnungen, bei denen ein Teil der Sequenz vorbestimmt ist und ein Teil aus allen möglichen Sequenzen zusammengesetzt ist. Beispielsweise:
Charakterisierung von mRNA-Populationen.
Die meisten mRNAs in höheren Eukaryoten haben in der Nähe des 3'-Endes die Sequenz AAUAAA. Die zur Analyse von mRNAs verwendete Anordnung würde diese Sequenz auf der gesamten Platte aufweisen. Zur Analyse einer mRNA-Population würde diese an eine Anordnung hybridisiert, die aus allen Sequenzen des Typs N_mAATAAAN_n zusammengesetzt ist. Für m + n = 8, was ausreichen sollte, um eine eindeutige Oligonukleotid-Adresse für die meisten der vielen Tausend mRNAs zu ergeben, die schätzungsweise in einer Quelle wie einer Säugerzelle vorhanden sind, würde die Anordnung 256 Elemente im Quadrat umfassen. Die 256 × 256 Elemente würden unter Verwendung des oben beschriebenen Maskierungsverfahrens auf das AATAAA gelegt werden. Mit Streifen von etwa 1 mm würde die Anordnung ca. 256 mm im Quadrat messen.
Diese Analyse würde die Komplexizität der mRNA-Population messen und könnte als Grundlage zum Vergleich von Populationen aus unterschiedlichen Zelltypen verwendet werden. Der Vorteil dieses Konzepts besteht darin, daß die Unterschiede im Hybridisierungsmuster die Sequenz der Oligonukleotide liefern würde, die als Sonden zur Isolierung aller mRNAs verwendet werden könnten, die in den Populationen abweichen.
Sequenzbestimmung.
Um die Idee auf die Bestimmung von unbekannten Sequenzen zu erstrecken, macht die Verwendung einer Anordnung, die aus allen möglichen Oligonukleotiden einer ausgewählten zusammengesetzt ist, größere Anordnungen erforderlich, als zur Zeit synthetisiert wurden. Es ist jedoch möglich, die Größe der Flecken zu verkleinern und auf die benötigte Anzahl zu erhöhen, indem die für kleine Anordnungen entwickelten und getesteten Verfahren ausgedehnt werden. Die Erfahrung zeigt, daß das Verfahren beim Betrieb viel einfacher ist als die auf Gelen beruhenden Verfahren.
Tabelle 1
Für die Beispiele 3 und 4 wurde Anordnung (a) wie folgt angeordnet:
Für Beispiel 3 wurde Anordnung (b) wie folgt angeordnet:
Zwischen den drei Spalten der oben aufgelisteten Anordnung (b) waren zwei Spalten, in denen die Basen 6 und 7 von links in jeder Zeile fehlten. Diese Sequenzen schmolzen alle bei 20 oder 32°. (a, t) Fehlpaarungsbase (.) fehlende Base.

Claims

Verfahren zur Analyse einer Polynukleotid-Sequenz, bei dem ein Glasträger verwendet wird, an dessen glatte, impermeable Oberfläche eine Anordnung des gesamten oder eines ausgewählten Teils einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden ausgewählter Längen gebunden ist, wobei die verschiedenen Oligonukleotide durch eine kovalente Bindung gebunden sind und separate Zellen der Anordnung besetzen, wobei bei dem Verfahren die Polynukleotid-Sequenz oder Fragmente davon markiert werden, die Polynukleotid-Sequenz oder Fragmente davon unter Hybridisierungsbedingungen auf die Anordnung aufgebracht werden und die Lokalisierung der Markierung auf der Oberfläche, die mit bestimmten Bestandteilen der Gruppe von Oligonukleotiden verbunden ist, beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, verwendet zur Untersuchung von Unterschieden zwischen Polynukleotid-Sequenzen, bei dem die Anordnung aus dem gesamten oder einem ausgewählten Teil der vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden ausgewählter Längen besteht, umfassend die Polynukleotid-Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Anordnung ein oder mehrere Paare von Oligonukleotiden ausgewählter Längen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Anordnung ein oder mehrere Paare von Oligonukleotiden umfasst, die Normal- und Mutantenversionen einer untersuchten Punktmutation darstellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Polynukleotid-Sequenz statistisch zur Bildung eines Gemisches von Oligomeren ausgewählter Länge abgebaut wird, wobei das Gemisch danach zur Bildung von markiertem Material, das auf die Anordnung aufgebracht wird, markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Oligomeren mit ³²P markiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die ausgewählte Länge der Oligonukleotide 8 bis 20 Nukleotide beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jedes Oligonukleotid mit einer kovalenten Bindung durch ein terminales Nukleotid an den Träger gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Oligonukleotid in jeder Zelle eine definierte Sequenz besitzt.
Vorrichtung, welche zur Analyse einer Polynukleotid-Sequenz mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 geeignet ist, die einen Glasträger und an eine glatte, impermeable Oberfläche davon gebunden eine Anordnung des gesamten oder eines ausgewählten Teils einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden ausgewählter Längen umfasst, wobei die verschiedenen Oligonukleotide durch eine kovalente Bindung gebunden sind, separate Zellen der Anordnung besetzen und an Hybridisierungsreaktionen teilnehmen können.
Vorrichtung nach Anspruch 10 zur Untersuchung von Unterschieden zwischen Polynukleotid-Sequenzen, bei dem die Anordnung aus dem gesamten oder einem ausgewählten Teil einer vollständigen Gruppe von Oligonukleotiden ausgewählter Längen besteht, umfassend die Polynukleotid-Sequenzen.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Anordnung ein oder mehrere Paare von Oligonukleotiden ausgewählter Längen umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Anordnung ein oder mehrere Paare von Oligonukleotiden umfasst, die Normal- und Mutantenversionen einer zu untersuchenden Punktmutation darstellen.
Vorrichtung zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, die einen Glasträger umfasst, an dessen glatte, impermeable Oberfläche eine Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden mit definierten Sequenzen gebunden ist, wobei die Oligonukleotide Zellen der Anordnung besetzen und durch eine kovalente Bindung an die Oberfläche gebunden sind und an Hybridisierungsreaktionen teilnehmen können, wobei die definierte Sequenz eines Oligonukletids einer Zelle der Anordnung sich von der definierten Sequenz eines Oligonukleotids einer anderen Zelle der Anordnung unterscheidet.
Vorrichtung zur Analyse eines Polynukleotids, wobei die Vorrichtung einen Glasträger umfasst, der in mindestens zwei definierte Zellen aufgeteilt ist, wobei jede Zelle kovalent an eine glatte, impermeable Oberfläche davon gebundene Oligonukleotide mit bekannter Sequenz aufweist, die an Hybridisierungsreaktionen teilnehmen können, wobei die Sequenz der Oligonukleotide einer ersten Zelle sich von der Sequenz der Oligonukleotide einer anderen Zelle unterscheidet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die ausgewählte Länge der Oligonukleotide 8 bis 20 Nukleotide beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei jedes Oligonukleotid durch eine kovalente Bindung durch ein terminales Nukleotid an den Träger gebunden ist.
Verfahren zur Erzeugung, für die Vorrichtung nach Anspruch 14, einer Anordnung von Oligonukleotiden ausgewählter Längen in diskreten Zellen eines Trägermaterials aus Glas mit einer glatten, impermeablen Oberfläche, bei dem a) die glatte impermeable Oberfläche des Trägermaterials in diskrete Zell-Lokalisierungen aufgeteilt wird; b) ein Nukleotid an eine erste Gruppe von Zell-Lokalisierungen gekuppelt wird; c) ein Nukleotid an eine zweite Gruppe von Zell-Lokalisierungen gekuppelt wird; d) ein Nukleotid an eine dritte Gruppe von Zell-Lokalisierungen gekuppelt wird; e) und die Sequenz der Kupplungsschritte fortgesetzt wird, bis die gewünschte Anordnung erzeugt ist, wobei die Kupplung an jeder Lokalisierung entweder an die Oberfläche des Trägers oder an ein in einem vorherigen Schritt an diese Lokalisierung gekuppeltes Nukleotid erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei ein Mikrocomputer-gesteuerter Plotter die Nukleotide an die Gruppen von Zell-Lokalisierungen abgibt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei die Größe jeder diskreten Zelle zwischen 10 und 100 μm liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem außerdem eine Einrichtung zur Kupplung der Nukleotide an eine bestimmte Gruppe von diskreten Zell-Lokalisierungen unter Ausschluss von anderen diskreten Zell-Lokalisierungen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich bei der Einrichtung um eine Maske handelt.