DE60226321T2

DE60226321T2 - Zusammensetzungen für die systemische verabreichung von sequenzen, die für knochenmorphogenese-proteinen kodieren

Info

Publication number: DE60226321T2
Application number: DE60226321T
Authority: DE
Inventors: Brian Ashland CLANCY; Debra D. Windham PITTMAN; Howard Cambridge SEEHERMAN
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2022-06-01
Also published as: EP1399023A4; DK1399023T3; NZ530045A; US20030170208A1; JP2005500280A; US7226587B2; DE60226321D1; HK1063201A1; ATE393573T1; WO2002099037A2; WO2002099037A3; EP1399023B1; US20060099186A1; EP1399023A2; CA2449008A1; ES2305246T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Gewebereparatur. Im Besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen zur systemischen Verabreichung von Sequenzen, die für osteogene Proteine codieren. Die Erfindung umfasst außerdem Zusammensetzungen zur systemischen Verabreichung von osteogenen Proteinen für die Förderung der Osteogenese. Die Zusammensetzungen fördern die Osteogenese und deshalb umfassen die Anwendungen die Heilung und Reparatur der Fraktur sowie die Beschleunigung der Frakturheilung. Diese Zusammensetzungen lassen sich ferner zur Behandlung von osteoporotischem oder osteopenischem Knochen und/oder zur Prophylaxe und Behandlung von Osteoporose einsetzen. Als Veranschaulichung für den Stand der Technik wird im Werk Human Gene Therapy, Bd. 10, 1999, S. 2245–2253 die Abgabe eines Adenovirenvektors, der für BMP2 codiert, in die Oberschenkelmuskulatur von thymuslosen Nackt-Ratten und die Erzeugung von enchondralem Knochen an der Injektionsstelle offenbart.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen zur systemischen Verabreichung von DNA-Sequenzen, die für osteogene Proteine codieren. Die Erfindung umfasst außerdem Zusammensetzungen zur systemischen Verabreichung von osteogenen Proteinen oder Peptiden für die Förderung der Osteogenese. Die Zusammensetzungen lassen sich zur Förderung der Heilung und Reparatur der Fraktur sowie zur Beschleunigung der Frakturheilung verwenden. Diese Zusammensetzungen lassen sich ferner zur Behandlung von osteoporotischem oder osteopenischem Knochen und/oder zur Prophylaxe und Behandlung von Osteoporose einsetzen.
Die DNA-Sequenzen, die für osteogene Proteine codieren, sind Knochenmorphogeneseproteine (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs). Es wurde offenbart, dass BMPs eine osteogene Aktivität sowie sonstige Wachstums- und Differenzierungstypaktivitäten aufweisen. BMPs umfassen die BMP-Proteine BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5 und BMP-7, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, BMP-15, BMP-16, die nachstehend näher beschrieben werden. Als osteogenes Mittel werden die DNA-Sequenzen am meisten bevorzugt, die für BMP-6 oder BMP-6-Proteine oder -Peptide codieren. Die DNA- und Proteinsequenz und die Verfahren zur Produktion von BMP-6 werden in US 5,187,076 , US 5,459,047 und US 5,849,880 sowie in USSN 09/189,157 offenbart.
Die Erfindung stellt deshalb Zusammensetzungen zur Förderung der Osteogenese bereit, wobei die Zusammensetzung eine DNA-Sequenz, die für ein osteogenes Protein codiert, in einer injizierbaren Formulierung umfasst, die für die systemische Verabreichung geeignet ist. Das osteogene Protein ist ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP). Solche Zusammensetzungen sind zur Frakturheilung und -reparatur nützlich. Diese Zusammensetzungen können zur Erhöhung der Knochenmineraldichte verwendet werden. Ein osteoporotischer oder osteopenischer Knochen ist häufig durch eine suboptimale Knochendichte gekennzeichnet und deshalb lassen sich die Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung der Knochenmineraldichte und zur Behandlung der Osteoporose einsetzen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die Erfindung eine Zusammensetzung zur Förderung der Frakturreparatur auf, wobei die Zusammensetzung eine DNA-Sequenz umfasst, die für BMP-6 codiert und bei einem Verfahren angewendet wird, das die systemische Verabreichung an einen Patienten erfordert, der eine Frakturreparatur benötigt. Die DNA- und Proteinsequenz und die Verfahren zur Produktion von BMP-6 werden in US 5,187,076 , US 5,459,047 und US 5,849,880 sowie in USSN 09/189,157 offenbart. Bei anderen Ausführungsformen können die folgenden BMPs geeignet sein: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-7, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, BMP-15 und BMP-16, die nachstehend näher beschrieben werden.
Bei der vorliegenden Erfindung sind die für die Inkorporation und die Expression der DNA benutzten Vektoren vorzugsweise viralen Ursprungs und insbesondere Adenoviren sowie Retroviren. Adenoviren sind dahingehend von Vorteil, dass sie keine Zellen im Zustand der Proliferation benötigen und eine Hochleistungs-Infektionsrate sowohl in vitro als auch in vivo besitzen, wohingegen Retroviren häufiger für die In-vitro-Infektion geeignet sind. Adenoviren bieten ferner höhere Spiegel von transgener Expression und die Fähigkeit, höhere Titer zu erreichen. Diese Vorteile machen Adenoviren zu einem geeigneteren Kandidaten für die Primärzellen-, Zelllinien- und direkte In-vivo-Transduktion. Zusätzlich ist die Expression des Transgens transient und es findet keine Integration des Adenovirenvektors in das Zellgenom statt, was die Verwendung der Vektoren sicherer macht. Alle Generationen von rekombinanten Adenoviren sind geeignet, zu denen die gegenwärtige Generation, (E1-deletiert), und neue Generationen mit einer reduzierten Antigenität (E1-, E3-, E4-deletierte Viren oder E1-, E4-deletiert und E3-überexprimiert) gehören. Smith (1995); Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham (1991); Kozarsky (1993); und Ilan (1997).
Die Expression der Gene, die bei der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, kann konstitutiv oder reguliert sein. Die Regulation der Expression lässt sich erreichen durch äußere Regulierung mithilfe regulatorischer Elemente, wie z. B. mit einem induzierend regulierten Promotor, beispielsweise einem Tetracyclin-regulierten Promotor, wie dies in diesem Dokument näher beschrieben ist, oder unter Zuhilfenahme regulatorischer Elemente von gewebespezifischen oder temporal spezifischen Genen, um die Expression nur auf bestimmte vorgegebene Differenzierungswege oder auf bestimmte Differenzierungsstadien zu leiten. Beispielsweise lässt sich der Osteocalcinpromotor zur Induktion in späten Stadien der Knochenbildung und Kalzifikation einsetzen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die BMP-DNA-Sequenz, vorzugsweise BMP-6, in einem Adenovirenvektor enthalten, der eine injizierbare Formulierung umfasst, die zur systemischen Verabreichung geeignet ist. Diese Zusammensetzung kann bei einem Verfahren verwendet werden, das die systemische Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Zusammensetzung an einen Patienten, der die Frakturreparatur benötigt, umfasst.
Der Wirkstoff ist ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP). Osteogene Proteine, DNA-Sequenzen, Zusammensetzungen und Verfahren zu deren Produktion, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind jene, welche die folgenden BMP-Proteine umfassen: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, zum Beispiel offenbart in den US-Patenten 5,108,922 ; 5,013,649 ; 5,116,738 ; 5,106,748 ; 5,187,076 , 5,459,047 , 5,849,880 ; und 5,141,905 ; BMP-8, offenbart in der PCT-Veröffentlichung WO 91/18098 ; und BMP-9, offenbart in der PCT-Veröffentlichung WO 93/00432 , BMP-10, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 94/26893 ; BMP-11, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 94/26892 , oder BMP-12 oder BMP-13, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 95/16035 , oder BMP-15, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 96/36710 oder BMP-16, offenbart in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 08/715/202, die am 18. September 1996 eingereicht wurde.
Sonstige DNA-Moleküle und die Proteine, für die sie codieren, die zusätzlich zu der DNA, die für ein BMP-Protein codiert, nützlich sein können, umfassen DNA-Moleküle, die für sonstige therapeutisch nützliche Mittel codieren, umfassend Wachstumsfaktoren wie z. B. Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Transformierender Wachstumsfaktor (TGF-α und TGF-β), Hedgehog-Proteine wie z. B. sonic, indian und desert hedgehog, Parathormon und Parathormon-verwandtes Peptid, Cadherine, Activine, Inhibine und IGF-, FSH-, Frizzled-, Frzb- oder Frazzled-Proteine, PDGF und sonstige endotheliale Wachstumsfaktoren, BMP-Bindungsproteine wie z. B. Chordin und Fetuin, Östrogen und sonstige Steroide sowie trunkierte Versionen (truncated versions) davon und Transkriptionsfaktoren wie z. B. Wnt-Proteine, Mad-Gene und CBFA.
Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, zusammen mit deren Anwesenheit im Knochen, legen nahe, dass sie wichtige Regulatoren von Knochen- und Knorpelreparaturprozessen sind und sie an der normalen Erhaltung von Knochengewebe beteiligt sein können.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist eine Abbildung der Frakturvorrichtung, die in dem geschlossenen Femurfrakturmodell genutzt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen zur Förderung der Osteogenese bereit. Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen eine DNA-Sequenz, die für ein osteogenes Protein codiert, in einer injizierbaren Formulierung, die zur systemischen Verabreichung geeignet ist. Das osteogene Protein ist ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP). Solche Zusammensetzungen sind zur Frakturheilung und -reparatur nützlich. Diese Zusammensetzungen können zur Erhöhung der Knochenmineraldichte verwendet werden. Ein osteoporotischer oder osteopenischer Knochen ist häufig durch eine suboptimale Knochendichte gekennzeichnet und deshalb lassen sich die Zusammensetzungen zur Erhöhung der Knochenmineraldichte und zur Behandlung der Osteoporose einsetzen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die Erfindung eine Zusammensetzung zur Förderung der Frakturreparatur auf, wobei die Zusammensetzung eine DNA-Sequenz umfasst, die für BMP-6 codiert und bei einem Verfahren angewendet wird, das die systemische Verabreichung an einen Patienten erfordert, der eine Frakturreparatur benötigt. Die DNA- und Proteinsequenz und die Verfahren zur Produktion von BMP-6 werden in US 5,187,076 , US 5,459,047 und US 5,849,880 sowie in USSN 09/189,157 offenbart. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die BMP-DNA-Sequenz in einem Adenovirenvektor enthalten.
Bei anderen Ausführungsformen können die folgenden BMPs geeignet sein: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, BMP-15, BMP-16, die in diesem Dokument näher beschrieben werden.
Die Erfindung stellt deshalb Zusammensetzungen zur Förderung der Osteogenese bereit, wobei die Zusammensetzung eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein osteogenes Protein codiert. Das osteogene Protein ist ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP). Solche Zusammensetzungen sind zur Frakturheilung und -reparatur nützlich. Diese Zusammensetzungen können zur Erhöhung der Knochenmineraldichte verwendet werden. Ein osteoporotischer oder osteopenischer Knochen ist häufig durch eine suboptimale Knochendichte gekennzeichnet und deshalb lassen sich die Zusammensetzungen zur Erhöhung der Knochenmineraldichte und zur Behandlung der Osteoporose einsetzen. Die Zusammensetzungen können die Knochenmassendichte erhöhen und die Inzidenz von osteoporosebedingten Frakturen minimieren oder reduzieren. Die Zusammensetzungen sind bei Verfahren nützlich, die das Verabreichen einer injizierbaren Formulierung einer DNA-Sequenz, die für ein osteogenes Protein codiert, umfassen, die zur systemischen Verabreichung in einer für die Frakturreparatur wirksamen Menge geeignet ist. Die Zusammensetzungen können unter Beimischung eines pharmazeutisch verträglichen Vehikels verabreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die Erfindung eine Zusammensetzung zur Förderung der Frakturreparatur auf, wobei die Zusammensetzung eine DNA-Sequenz umfasst, die für BMP-6 codiert und bei einem Verfahren angewendet wird, das die systemische Verabreichung an einen Patienten erfordert, der eine Frakturreparatur benötigt. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die BMP-DNA-Sequenz in einem Adenovirenvektor enthalten.
Bei anderen Ausführungsformen können die folgenden BMPs geeignet sein: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, BMP-15, BMP-16, die nachstehend näher beschrieben werden.
Die Zusammensetzungen wären deshalb als injizierbares Mittel für die Frakturprävention und die Behandlung ohne chirurgischen Eingriff nützlich. Die Zusammensetzungen würden das Vorkommen und/oder den Schweregrad der Fraktur an einem osteoporotischen Knochen verringern.
Die Sequenzen codieren für osteogene Proteine, die Knochenmorphogeneseproteine (BMPs) sind. Der Wirkstoff umfasst mindestens ein Protein, das ausgewählt ist aus der Unterklasse von Proteinen, die im Allgemeinen als BMPs bekannt sind, von denen offenbart wurde, dass sie eine osteogene Aktivität und sonstige Wachstums- und Differenzierungstypaktivitäten besitzen. Diese BMPs umfassen die BMP-Proteine BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5 und BMP-7, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, BMP-15, BMP-16, die nachstehend näher beschrieben werden. Als osteogenes Mittel werden die DNA-Sequenzen am meisten bevorzugt, die für BMP-6 oder BMP-6-Proteine oder -Peptide codieren. Die DNA- und Proteinsequenz und die Verfahren zur Produktion von BMP-6 werden in US 5,187,076 , US 5,459,047 und US 5,849,880 sowie in USSN 09/189,157 offenbart.
Zu den DNA-Molekülen, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehören jene, die die Codierungssequenzen für eines oder mehrere der folgenden BMP-Proteine umfassen: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, offenbart zum Beispiel in den US-Patenten 5,108,922 ; 5,013,649 ; 5,116,738 ; 5,106,748 ; 5,187,076 ; und 5,141,905 ; BMP-8, offenbart in der PCT-Veröffentlichung WO 91/18098 ; und BMP-9, offenbart in der PCT-Veröffentlichung WO 93/00432 , BMP-10, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 94/26893 ; BMP-11, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 94/26892 , oder BMP-12 oder BMP-13, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 95/16035 , oder BMP-15, offenbart in der PCT-Anmeldung WO 96/36710 oder BMP-16, offenbart in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 08/715/202, die am 18. September 1996 eingereicht wurde.
Sonstige DNA-Moleküle, die zusätzlich zu der DNA, die für ein BMP-Protein codiert, nützlich sein können, umfassen DNA-Moleküle, die für sonstige therapeutisch nützliche Mittel codieren, umfassend Wachstumsfaktoren wie z. B. Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Transformierender Wachstumsfaktor (TGF-α und TGF-β), Hedgehog-Proteine wie z. B. sonic, indian und desert hedgehog, Parathormon und Parathormon-verwandtes Peptid, Cadherine, Activine, Inhibine und IGF-, FSH-, Frizzled-, Frzb- oder Frazzled-Proteine, PDGF und sonstige endotheliale Wachstumsfaktoren, BMP-Bindungsproteine wie z. B. Chordin und Fetuin, Östrogen und sonstige Steroide sowie trunkierte Versionen (truncated versions) davon und Transkriptionsfaktoren wie z. B. Wnt-Proteine, Mad-Gene und CBFA.
Bei der vorliegenden Erfindung sind die für die Inkorporation und die Expression der DNA benutzten Vektoren vorzugsweise viralen Ursprungs und insbesondere Adenoviren sowie Retroviren. Adenoviren sind dahingehend von Vorteil, dass sie keine Zellen im Zustand der Proliferation benötigen und eine Hochleistungs-Infektionsrate sowohl in vitro als auch in vivo besitzen, wohingegen Retroviren häufiger für die In-vitro-Infektion geeignet sind. Adenoviren bieten ferner höhere Spiegel von transgener Expression und die Fähigkeit, höhere Titer zu erreichen. Diese Vorteile machen Adenoviren zu einem geeigneteren Kandidaten für die Primärzellen-, Zelllinien- und direkte In-vivo-Transduktion. Zusätzlich ist die Expression des Transgens transient und es findet keine Integration des Adenovirenvektors in das Zellgenom statt, was die Verwendung der Vektoren sicherer macht. Alle Generationen von rekombinanten Adenoviren sind geeignet, zu denen die gegenwärtige Generation, (E1-deletiert), und neue Generationen mit einer reduzierten Antigenität (E1-, E3-, E4-deletierte Viren oder E1-, E4-deletiert und E3-überexprimiert) gehören. Smith (1995); Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham (1991); Kozarsky (1993); und Ilan (1997).
Die Expression der Gene, die bei der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, kann konstitutiv oder reguliert sein. Die Regulation der Expression lässt sich erreichen durch äußere Regulierung mithilfe regulatorischer Elemente, wie z. B. mit einem induzierend regulierten Promotor, beispielsweise einem Tetracyclin-regulierten Promotor, wie dies in diesem Dokument näher beschrieben ist, oder unter Zuhilfenahme regulatorischer Elemente von gewebespezifischen oder temporal spezifischen Genen, um die Expression nur auf bestimmte vorgegebene Differenzierungswege oder auf bestimmte Differenzierungsstadien zu leiten. Beispielsweise lässt sich der Osteocalcinpromotor zur Induktion in späten Stadien der Knochenbildung und Kalzifikation einsetzen.
Die DNA-Sequenzen, die für die BMP-Proteine codieren, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, wie sie in den erwähnten Anmeldungen und den oben angeführten Patenten offenbart sind, umfassen außerdem die offenbarten DNA-Sequenzen, frei von einer Assoziation mit DNA-Sequenzen, die für sonstige proteinhaltige Materialien codieren und bei Expression für die Proteine der Erfindung codieren. Außerdem enthalten sind jene Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [siehe T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laborstory (1982), Seiten 387 bis 389] zu der speziellen DNA-Sequenz hybridisieren und eine Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zeigen. Eine solche Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität kann beim Assay für die Knochenbildung von Ratten vorhanden sein. Ein Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung mit 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von einer Stunde Waschen in 0,1 × SCC bei 65°C. Ein alternatives Beispiel für stringente Hybridisierung ist eine Hybridisierung in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C.
Ebenso codieren DNA-Sequenzen, die für Proteine codieren, die mit dem Protein vergleichbar sind, für das die offenbarte Sequenz codiert, sich aber infolge der Degeneriertheiten des genetischen Codes oder der Allelvariationen (natürlich vorkommende Basenänderungen in der Speziespopulation, die gegebenenfalls zu einer Aminsäureänderung führen) in der Codonsequenz unterscheiden, ebenfalls für die Proteine der Erfindung, die in diesem Dokument beschrieben sind. Variationen der DNA-Sequenzen, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen (umfassend Insertion, Deletion und Substitution) verursacht werden, um die Aktivität, die Halbwertszeit oder die Produktion der Polypeptide, die dadurch codiert werden, zu verbessern, sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.
Ebenso umfassen die hier in diesem Dokument bereitgestellten Proteine außerdem Faktoren, für welche die Sequenzen, die mit jenen der natürlich vorkommenden BMP-verwandten Proteine, wie z. B. BMP-6, vergleichbar sind, codieren, aber in welche Modifikationen natürlich bereitgestellt werden (z. B. Allelvariationen in der Nucleotidsequenz, die zu Aminosäureänderungen in dem Polypeptid führen kann) oder absichtlich manipuliert werden. Zum Beispiel können synthetische Polypeptide kontinuierliche Sequenzen von Aminosäurenresten des speziellen BMP-Proteins vollständig oder teilweise duplizieren. Diese Sequenzen können aufgrund dessen, dass sie die Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur- und die Konformationseigenschaften mit den die Knochenbildung hervorrufenden Polypeptiden von natürlich vorkommenden BMPs teilen, biologische Eigenschaften wie dieselben besitzen.
Bei weiteren Ausführungsformen können Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, außer den DNA-Sequenzen, die für ein BMP-Protein codieren, eine DNA-Sequenz umfassen, die für zusätzliche Proteine codiert, wie z. B. zusätzliche Mitglieder der TGF-β-Superfamilie von Proteinen, die oben beschrieben sind.
Diese Zusammensetzungen lassen sich zur Förderung der Osteogenese und für die Frakturreparatur einsetzen. Die Zusammensetzungen können ferner bei der Erhöhung der Knochenmassedichte nützlich sein.
Es wird damit gerechnet, dass die osteogenen Proteine mit, oder vielleicht synergistisch mit, sonstigen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren zusammenwirken können. Deshalb umfassen weitere therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung eine therapeutische Menge einer Sequenz, die für das osteogene Protein codiert, und zwar mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der oben beschriebenen BMP-Proteine. Solche Zusammensetzungen können separate Moleküle der BMP-Proteine oder Heteromoleküle umfassen, die aus verschiedenen BMP-Teilen bestehen.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lassen sich mit sonstigen Mitteln kombinieren, für die für die Behandlung des betreffenden Defektes, der betreffenden Wunde oder des betreffenden Gewebes vorteilhaft sind.
Bei der vorliegenden Erfindung sind die für die Inkorporation und die Expression der DNA benutzten Vektoren vorzugsweise viralen Ursprungs und insbesondere Adenoviren sowie Retroviren. Adenoviren sind dahingehend von Vorteil, dass sie keine Zellen im Zustand der Proliferation benötigen und eine Hochleistungs-Infektionsrate sowohl in vitro als auch in vivo besitzen, wohingegen Retroviren häufiger für die In-vitro-Infektion geeignet sind. Adenoviren bieten ferner höhere Spiegel von transgener Expression und die Fähigkeit, höhere Titer zu erreichen. Diese Vorteile machen Adenoviren zu einem geeigneteren Kandidaten für die Primarzellen-, Zelllinien- und direkte In-vivo-Transduktion. Zusätzlich ist die Expression des Transgens transient und es findet keine Integration des Adenovirenvektors in das Zellgenom statt, was die Verwendung der Vektoren sicherer macht. Alle Generationen von rekombinanten Adenoviren sind geeignet, zu denen die gegenwärtige Generation, (E1-deletiert), und neue Generationen mit einer reduzierten Antigenität (E1-, E3-, E4-deletierte Viren oder E1-, E4-deletiert und E3-überexprimiert) gehören. Smith (1995); Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham (1991); Kozarsky (1993); und Ilan (1997).
Die Expression der Gene, die bei der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, kann konstitutiv oder reguliert sein. Die Regulation der Expression lässt sich erreichen durch äußere Regulierung mithilfe regulatorischer Elemente, wie z. B. mit einem induzierend regulierten Promotor, beispielsweise einem Tetracyclin-regulierten Promotor, wie dies in diesem Dokument näher beschrieben ist, oder unter Zuhilfenahme regulatorischer Elemente von gewebespezifischen oder temporal spezifischen Genen, um die Expression nur auf bestimmte vorgegebene Differenzierungswege oder auf bestimmte Differenzierungsstadien zu leiten. Beispielsweise lässt sich der Osteocalcinpromotor zur Induktion in späten Stadien der Knochenbildung und Kalzifikation einsetzen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sollen als injizierbare Formulierung systemisch verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann außerdem ein Implantat oder eine Vorrichtung erfordern. Bei der Verabreichung liegt die therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung bei dieser Erfindung selbstverständlich in einer pyrogenfreien, physiologisch verträglichen Form vor. Außerdem kann die Zusammensetzung, wie erwünscht, eingekapselt vorliegen oder für die Abgabe an die Stelle der Gewebeschädigung in einer viskosen Form injiziert werden. Therapeutisch nützliche Mittel, die auch gegebenenfalls in der Zusammensetzung wie oben beschrieben enthalten sein können, können alternativ dazu oder zusätzlich, gleichzeitig oder nacheinander mit der Zusammensetzung der Erfindung verabreicht werden. Ferner lassen sich die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zusammen mit gegenwärtig verfügbaren Behandlungen einsetzen.
Bei Ausführungsformen zum Beispiel für die Behandlung von osteoporotischen Zuständen können Materialien, die als Träger zur Ausübung der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, pharmazeutisch verträgliche Materialien umfassen, die eine solche Viskosität und Polarität aufweisen, dass sie bei Zugabe zu einem Knochenmorphogeneseprotein eine Zusammensetzung bilden, die für die injizierbare Abgabe an die Stelle des osteoporotischen oder osteogenischen Knochens geeignete Handhabungseigenschaften besitzen. Die Zugabe eines Trägers zum Knochenmorphogeneseprotein gestattet es dem Protein, ausreichend lange an der erkrankten oder geschädigten Stelle zu bleiben, damit das Protein die sonst natürliche Rate der regenerativen osteogenischen Aktivität der infiltrierenden Säugetiervorläufer- oder sonstigen Zellen erhöhen und einen Raum bilden kann, in dem neues Gewebe wachsen kann und das Einwachsen der Zellen möglich ist. Der Träger kann es auch dem Knochenmorphogeneseprotein ermöglichen, von der erkrankten oder geschädigten Stelle aus über ein Zeitintervall, das für die optimale Erhöhung der Rate der regenerativen osteogenischen Aktivität der Vorläuferzellen geeignet ist, freigesetzt zu werden. Außerdem kann der Träger ein Gerüst zur Verfügung stellen, an dem die neue Knochenbildung in einem hochgradig osteoporotischen Knochen hervorgerufen werden kann.
Die am meisten bevorzugte Familie von Trägern umfasst Kollagenmaterialien. Diese liegen vorzugsweise in einer für die Injektion geeigneten Form vor, z. B. als Gel. Solche Gele können vernetzt oder unvernetzt sein. Andere Formen von Kollagen, wie z. B. Dispersionen oder fibrilläres Kollagen, können ebenfalls beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Eine weitere bevorzugte Familie von Trägern sind cellulosehaltige Materialien wie z. B. Alkylcellulose, umfassend Hydroxyalkylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei die kationischen Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) am meisten bevorzugt werden.
Im Falle der cellulosehaltigen Träger und Kollagengele wird es bevorzugt, dass der Träger in Form eines hydrierten cellulosehaltigen viskosen Gels vorliegt. Die Viskosität kann durch mechanische Mittel, wie z. B. starkes Rühren oder Schütteln für einen geeigneten Zeitraum, gefolgt von einer Autoklavbehandlung, oder chemisch erhöht werden. Der Wirkstoff und der cellulosehaltige Träger liegen vorzugsweise in einer Lösung eines geeigneten Puffers vor. Eine bevorzugte Pufferlösung ist eine Zusammensetzung, die außer dem Wirkstoff, etwa 1,0 bis etwa 10,0% (w/v) Glycin, etwa 0,1 bis etwa 5,0% (w/v) eines Zuckers, vorzugsweise Saccharose, etwa 1 bis etwa 20 mM Glutaminsäurehydrochlorid, und gegebenenfalls etwa 0,01 bis etwa 0,1% eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes, wie z. B. Polysorbat 80 umfasst. Die bevorzugten Lösungen liegen im Bereich von etwa 1% bis etwa 20% w/v cellulosehaltigem Träger/Puffer. Falls gewünscht, kann ein Salz zugegeben werden. Ein bevorzugter viskoser Gelträger ist nachstehend im Beispiel 2 beschrieben. Die Menge an osteogenem Protein, die mit dem viskosen Gelträger nützlich ist, liegt im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100 mg; am meisten bevorzugt etwa 10 bis etwa 80 mg pro Kubikzentimeter des benötigten Implantatmaterials.
Eine andere Klasse von Materialien, die für injizierbare Träger von besonderem Interesse sind, sind resorbierbare Hydroxyapatite sowie Mineralien, Keramiken und Phosphate. Resorbierbare Hydroxyapatite lassen sich zum Beispiel mit verschiedenen Porositäten und somit veränderlichen Resorptionsraten formulieren; deren Handhabungseigenschaften variieren von hart implantierbaren Typen, über solche mit gelartiger Konsistenz, bis zu jenen, die injizierbar sind, aber bei Körpertemperatur erhärten. Geeignete Hydroxyapatit- und Keramikträger sind zum Beispiel beschrieben in WO 96/36562 ; und den US-Patenten 5,543,019 ; 5,306,305 ; 5,258,044 ; 5,496,399 ; 5,455,231 ; 5,336,264 ; 5,178,845 ; 5,053,212 ; 5,047,031 ; 5,129,905 ; 5,034,059 ; 4,880,610 ; 5,290,763 ; und 5,563,124 ; deren Offenbarungen hier in dieses Dokument durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Eine weitere bevorzugte Familie von Trägern für die Verabreichung des Wirkstoffes der vorliegenden Erfindung sind injizierbare Polymere, die viskos sein können und die gegebenenfalls auch ein Sequestrierungsmittel enthalten können. Geeignete Polymere und Sequestrierungsmittel umfassen jene, die im US-Patent 5,171,579 beschrieben sind, dessen gesamte Offenbarung hier in dieses Dokument durch Bezugnahme aufgenommen wird. Sonstige Polymere umfassen die „Pluronics"-Produkte, wie z. B. das Gel Poloxamer 407. „Pluronics"-Produkte sind eine Klasse von wasserlöslichen Block-Surfactant-Copolymeren vom Typ ABA, die die einzigartige Eigenschaft der umgekehrten thermischen Gelbildung aufweisen. Sie sind bei 4°C flüssig (und daher durch Spritzen abgebbar) und bei Körpertemperatur ein Gel. Poloxamer 407, MW 12,500, wird nach systemischer Absorption im Urin unverändert ausgeschieden und soll in Tieren nachweislich ungiftig sein. Polylactide und/oder Polyethylenglycole, umfassend Poly(lactid)-Poly(ethylenglycol)-Gele. Polylactide (PLA) können in Polyethylenglycolen (PEG) gelöst sein, wie z. B. PLA mit niedrigem Molekulargewicht (2000) gelöst in PEG, um eine durch Spritzen abgebbare Lösung zu produzieren, die bei Injektion in ein wässriges Milieu PLA präzipitiert, was ein relativ festes Gel ergibt. Darüber hinaus werden in der Literatur Konjugate, wie z. B. Poly(milchsäure)-Poly(ethylenglycol)-Konjugate, als geeignete Träger für BMPs erwähnt (Miyamoto et al., Clin. Orthop. Rel. Res. 294: 333 (1993)). Materialien, die als Sequestrierungsmittel nützlich sind, umfassen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglycol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol) sowie cellulosehaltige Materialien, wie z. B. Hydroxycellulosen. Ein solches bevorzugtes Mittel ist Carboxymethylcellulose.
Die obigen Materialien, die nützlich als Sequestrierungsmittel offenbart wurden, können selbst wiederum als Träger für die Injektion nützlich sein. Zusätzlich lassen sich Kombinationen der oben beschriebenen Materialien einsetzen.
In Fällen, in denen der Träger eine höhere Viskosität als die optimale aufweisen kann, lässt sich der Träger gegebenenfalls mit einem Verdünnungsmittel, wie z. B. wässrigem Glycerol, kombinieren, wobei das Träger-Verdünnungsmittel vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 10 bis etwa 80% (v/v) vorliegen sollte. Außerdem lassen sich die obigen Materialien bei speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kombinieren. Beispielsweise können Polymere, wie z. B. poröse, aus einzelnen Partikeln bestehende Polymere gelöst werden oder zum Erhöhen der Viskosität in cellulosehaltigen Trägern oder Gelträgern suspendiert werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Wirkstoffe mittels Injektion örtlich verabreicht, wobei nur ein geeigneter Puffer als Träger verwendet wird. Ein geeigneter Puffer umfasst Glycin, Saccharose und Glutaminsäurehydrochlorid, bei einem pH-Wert von kleiner als 6,0. Bevorzugte Zusammensetzungen von Pufferlösungen umfassen etwa 1,0 bis etwa 10,0% (w/v) Glycin, etwa 0,1 bis etwa 5,0% (w/v) eines Zuckers, vorzugsweise Saccharose, etwa 1 bis etwa 20 mM Glutamin, Glutaminsäure oder Glutaminsäurehydrochlorid, und gegebenenfalls etwa 0,01 bis etwa 0,1% eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes, wie z. B. Polysorbat 80. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst diese Formulierung etwa 2,5% Glycin (g/100 ml (w/v)), etwa 0,5% Saccharose (w/v), etwa 5 mM Glutaminsäurehydrochlorid (etwa 0,1% w/v) und etwa 0,01% (w/v) Polysorbat 80, bei einem pH-Wert von etwa 4,5. Dieser Puffer wurde als MFR 842 beschrieben. Weitere Puffer, die sich für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung eignen, sind in dem US-Patent 5,385,887 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Bevorzugte Lösungen können auch Kombinationen von Puffer und sonstigem Träger, wie z. B. eine Kombination aus Puffer und cellulosehaltigem Träger, umfassen. Bevorzugt werden für diese Kombination Bereiche von etwa 1% bis etwa 20% w/v cellulosehaltigem Träger/Puffer. Falls gewünscht, kann ein Salz zugegeben werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen können die Zusammensetzungen eine geeignete Matrix und/oder ein geeignetes Sequestrierungsmittel als Träger umfassen. Beispielsweise kann die Matrix die Zusammensetzung unterstützen oder eine Oberfläche für die Knorpel- und/oder Knochengewebebildung und/oder sonstige Gewebebildung bereitstellen. Die Matrix kann eine langsame Freisetzung des Proteins und/oder das geeignete Milieu für die Präsentation derselben bereitstellen. Das Sequestrierungsmittel kann eine Substanz sein, die die leichtere Verabreichung durch Injektion oder sonstige Mittel unterstützt oder die die Proteinmigration von der Anwendungsstelle aus verlangsamen kann.
Bei einigen Ausführungsformen können genetisch manipulierte Zellen in Kombination mit einer geeigneten Matrix verabreicht werden, beispielsweise zum Unterstützen der Zusammensetzung und Bereitstellen einer Oberfläche für das Wachstum von Knochen-, Knorpel- und/oder sonstigem Bindegewebe. Die Matrix kann in Form von traditionellen Matrixbiomaterialien vorliegen. Die Matrix kann die langsame Freisetzung des exprimierten Proteins und der entsprechenden differenzierten Zellen und/oder das geeignete Milieu für die Präsentation derselben bereitstellen. Bei einigen Ausführungsformen wird damit gerechnet, dass verschiedene kollagene und nicht kollagene Proteine aufreguliert und von den pluripotenten Stammzellen sezerniert werden. Dieses Phänomen beschleunigt die Geweberegeneration durch Verbessern der Matrixabscheidung. Außerdem können Matrixproteine in den genetisch manipulierten Zellen exprimiert werden und die Inkorporation und Bindung der transplantierten Zellen in die Transplantatfläche verbessern.
Die Wahl eines Trägermaterials erfolgt basierend auf Bioverträglichkeit, biologische Abbaubarkeit, mechanische Eigenschaften, kosmetisches Erscheinungsbild und Schnittstelleneigenschaften. Die spezielle Anwendung für die Zusammensetzungen definiert die passende Formulierung. Mögliche Matrizen für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubar und chemisch definiert sein. Weitere Matrizen bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixkomponenten. Sonstige mögliche Matrizen sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert. Die bevorzugten Matrizen umfassen Materialien auf Kollagenbasis, umfassend Schwämme, wie z. B. Helistat⁷ (Integra LifeSciences, Plainsboro, NJ, USA), oder Kollagen in einer injizierbaren Form, sowie Sequestrierungsmittel, die biologisch abbaubar sein können, beispielsweise abgeleitet von Hyaluronsäure. Biologisch abbaubare Materialien, wie z. B. Cellulosefolien, oder chirurgische Maschengewebe, können ebenfalls als Matrizen dienen. Solche Materialien könnten in eine Verletzungsstelle genäht oder um den Knorpel herum gewickelt werden.
Eine andere bevorzugte Klasse von Trägern sind Polymermatrizen, umfassend Polymere von Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure) und Copolymere von Milchsäure und Glycolsäure. Diese Matrizen können in Form eines Schwammes oder in Form von porösen Partikeln vorliegen und können auch ein Sequestrierungsmittel enthalten. Geeignete Polymermatrizen sind zum Beispiel in WO 93/00050 beschrieben, dessen Offenbarung hier in dieses Dokument durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Bevorzugte Familien von Sequestrierungsmitteln umfassen Blut, Fibringerinnsel und/oder cellulosehaltige Materialien wie z. B. Alkylcellulosen (umfassend Hydroxyalkylcellulosen), umfassend Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei die kationischen Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) am meisten bevorzugt werden. Sonstige bevorzugte Sequestrierungsmittel umfassen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglycol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol). Die Menge an Sequestrierungsmittel, die dabei nützlich ist, beträgt 0,5–20 Gew.-%, vorzugsweise 1–10 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung, was für die Menge steht, die erforderlich ist, um die Desorption des Proteins aus der Polymermatrix zu verhindern und um eine geeignete Handhabung der Zusammensetzung bereitzustellen, die aber dennoch nicht so groß ist, dass die Vorläuferzellen an der Infiltration in die Matrix gehindert werden, wodurch das Protein die Möglichkeit bekommt, die Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen.
Zusätzliche optionale Komponenten, die bei der Ausübung der Sachanmeldung nützlich sind, umfassen z. B. Kryoprotektoren wie z. B. Mannit, Saccharose, Lactose, Glucose oder Glycin (zum Schutz des Proteins vor der Degradation während der Lyophilisierung), antimikrobielle Konservierungsmittel wie z. B. Methyl- und Propylparabene und Benzylalkohol; Antioxidationsmittel wie z. B. EDTA, Citrat und BHT (Butylhydroxytoluol); und oberflächenaktive Stoffe wie z. B. Poly(sorbate) und Poly(oxyethylene).
Die Identifizierung von Patienten, die wegen verschiedener Zustände, die osteoporotische oder osteopenische Zustände umfassen, eine Behandlung benötigen, lässt sich mittels Verfahren bewerkstelligen, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind. Diese Verfahren umfassen die Messung der Knochenmasse bzw. Knochendichte unter Verwendung der Dual-Röntgen-Absorptiometrie (dual-energy X-ray absorptiometry, DEXA), Kilgus et al., J. Bone & Joint Surgery, 75-B: 279–287 (1992); Markel et al., Acta Orthop Scand, 61: 487–498 (1990); und Quantitativen Computertomographie (quantitative computed tomography, QCT), Laval-Jeantet et al., J Comput Assist Tomogr, 17: 915–921 (1993); Markel, Calcif Tissue Int, 49: 427–432 (1991); Single-Photon-Absorptiometrie (single-photon absorptiometry, SPA), Markel et al., Calcif Tissue Int, 48: 392–399 (1991); Ultraschalltransmissionsgeschwindigkeit (ultrasound transmission velocity, UTV); Heaney et al., JAMA, 261: 2986–2990 (1989); Langton et al., Clin Phys Physiol Meas, 11: 243–249 (1990); und Röntgenauswertung (radiographic assessment), Gluer et al., J Bone & Mineral Res, 9: 671–677 (1994). Sonstige Verfahren zur Identifizierung von Patienten mit einem Knochenfrakturrisiko umfassen die Bewertung von altersspezifischen Faktoren, wie z. B. Erkenntnis aufgrund von Klassifikationen, sowie die Berücksichtigung eines früheren Vorkommens von osteoporosebedingten Frakturen. Porter et al., BMJ, 301: 638–641 (1990); Hui et al., J Clin Invest, 81: 1804–1809 (1988). Die obigen Veröffentlichungen werden hiermit durch diese Bezugnahme aufgenommen.
Das Dosierungsschema wird vom behandelnden Arzt festgelegt, der verschiedene Faktoren, die die Wirkung der Zusammensetzung modifizieren, z. B. die gewünschte Menge an zu bildendem Gewebe, die Stelle der Gewebeschädigung, den Zustand des beschädigten Gewebes, die Größe einer Wunde, den Typ des beschädigten Gewebes, das Alter, das Geschlecht und die Diät des Patienten, den Schweregrad einer Infektion, die Verabreichungszeit und sonstige klinische Faktoren, berücksichtigt. Die Dosierung kann sich je nach Typ des Vehikelträgers oder der Matrix, der oder die bei der Wiederherstellung verwendet wird, und den Typen der zusätzlichen Proteine oder DNA-Sequenzen in der Zusammensetzung ändern. Die Zugabe von sonstigen bekannten Wachstumsfaktoren zu der endgültigen Zusammensetzung kann ebenfalls die Dosierung beeinflussen.
Die Zubereitung und Formulierung von solchen physiologisch verträglichen Nuclein- oder Proteinzusammensetzungen, die in Bezug auf pH-Wert, Isotonizität, Stabilität und dergleichen bestimmte Werte einhalten müssen, liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind infolge des Mangels an Speziesspezifitäten bezüglich der TGF-β-Proteine gegenwärtig auch für veterinäre Anwendungen wertvoll. Insbesondere sind Haustiere und Vollblutpferde neben Menschen Wunschpatienten für eine solche Behandlung mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Der Fortschritt lässt sich durch eine periodische Bewertung des Wachstums der Gewebebildung und/oder der Gewebereparatur überwachen. Die Überwachung des Fortschritts kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Röntgen, Arthroskopie, histomorphometrische Bestimmungen und Tetracyclinmarkierung und verschiedene Verfahren, die in den nachstehenden Beispielen dargelegt werden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIEL I: Systemische Verabreichung von BMP-6
A. BMP-6-adenovirale Vektoren
Die volle Länge des BMP-6 Klones definiert ein offenes Leseraster (open readinf frame, ORF) von 1539 Basenpaaren, das für das 513-Aminosäuren-hBMP-6 codiert. Die humane BMP-6 cDNA wurde als Sa/I-Fragment von dem BMP-6EMC Vektor isoliert und die Enden wurden mit Vent Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) ausgefüllt. Der Adori 1-1 BMP-6 Vektor wurde mit der Insertion der BMP-6 cDNA in die EcoRV-Restriktionsstelle des Adenovirenvektors Adori 1-1 erzeugt. Das endgültige Konstrukt wurde durch extensive Restriktionskartierung und eine Sequenzierung des BMP-6 Inserts in voller Länge verifiziert. Der Adori 1-1 EGFP (enhanced green fluorescence protein) Vektor wurde von einem Digest von pEGFP-N1 (CLONTECH Laborstories, Inc., Palo Alto, CA, USA) mit EcoR1 und Not1 abgeleitet und die EGFP cDNA wurde zwischen die EcoR1 und Not1 Stellen von Adori 1-1 inseriert. Das Adori 1-1 EGFP Konstrukt wurde durch Restriktionskartierung und eine Sequenzierung mittels des 5'-Endes bestätigt. Die Expression von hBMP-6 und GFP mRNA Transkripten wird angetrieben von der Zytomegalievirus-(cytomegalovirus, CMV) IEP-(immediate early promoter) Promotor- und Enhancer-Sequenz. Die Expressionskassette befindet sich stromabwärts vom SV40-Ursprung und Enhancer und 0–1 Karteneinheiten vom Adenovirentyp 5(Ad5). Die SV40-Spleißdonor- und -Akzeptorsequenz befindet sich zwischen dem CMV-Promotor und der cDNA. Auf das Insert folgen ein SV40-Poly-A-Site, 9–16 Karteneinheiten von Ad5, und der pUC-19-Ursprung.
Das replikationsdefekte, E1- und E3-Minus-, Typ-5-(del327) rekombinante Adenovirus wurde durch homologe Rekombination in menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293-Zellen) (ATCC, Rockville, Maryland, USA) erzeugt. Das Virus wurde durch Co-Transfektion von Adori-Expressionsplasmiden, wie dies oben beschrieben ist, und 9 bis 36 Karteneinheiten der Adenovirushauptkette erzeugt. Das rekombinante Adenovirus wurde amplifiziert und durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen aus 293 Zellen freigesetzt. Außerdem wurde das Virus mittels zwei Cäsiumchloridgradienten durch Zentrifugation gereinigt und für die Gleichgewichtsherstellung gegen Phosphat gepufferte Saline (Phosphate buffered saline) dialysiert, pH 7,2 bei 4°C. Nach der Dialyse wurde Glycerol so zugegeben, dass sich eine Endkonzentration von 10% ergab und das Virus wurde bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Die in Partikel/ml angegebene Viruskonzentration wurde dadurch ermittelt, dass die optische Dichte bei 260 nm gemessen wurde. Die Messung der Endotoxin-Spiegel erfolgte unter Verwendung eines LAL-(Limulus Amebocyte Lysate) Kits (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA). Das Virus war ferner gekennzeichnet durch die PCR-Amplifikation des Inserts, wobei vektorspezifische Primer verwendet wurden:
Die PCR-Produkte wurden sequenziert, um die Unversehrtheit des Inserts zu bestätigen. Die Expression des Transgens und die Sekretion von reifen BMP-6 wurden durch die metabolische Markierung von 293 Zellen und die Immunpräzipitation mit einem BMP-6 selektiven monoklonalen Antikörper bestätigt.
B. Geschlossenes Femurfrakturmodell
Männliche C57BL/6-Mäuse (Jackson Lab.) im Alter von 12 bis 16 Wochen wurden mit Pentobarbital (60 mg/kg, i. p.) anästhesiert. Eine sterile Augensalbe wurde zum Schutz auf beide Augen aufgetragen. Die rechte Hinterextremität wurde oben bis auf die Haut abrasiert und die freigelegte Haut wurde nacheinander mit einem Ethanol- und Duraprep-Wattepolster chirurgisch gewaschen.
Nach chirurgischen Vorbereitungen wurden die Mäuse in einem sterilen Operationsfeld platziert. Ein 5–10 mm langer Schnitt wurde dorsal zum Femurkopf gemacht. Eine 25-G-, 1-Zoll-Nadel wurde durch die Trochantergrube eingeführt und in der Markhöhle bis zum distalen Femur heruntergeschoben. Nach der Einführung der Nadel wurde die Nadel direkt unterhalb der Haut abgeschnitten. Der Schnitt wurde mithilfe des Nexaband-Operationsklebers geschlossen. Die Mäuse wurden während des Operationsverfahrens überwacht, um die Anästhesie und die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
Die geschlossenen Femurfrakturen wurden in einer ähnlichen Weise hergestellt, wie sie beschrieben wurden von Bonnarens und Einhorn (J. Orthop. Res. 2: 97–101, 1984). Die Frakturvorrichtung ist in 1 dargestellt.
Das vorher befestigte, rechte Bein einer Maus wurde sicher positioniert, so dass die Mitte des Femurs zwischen dem zweizinkigen Tierstütztisch und der stumpfen Klinge auflag. Ein 150-Gramm-Gewicht wurde bis auf eine Höhe von 7,5 cm angehoben und dann auf die darunter befindliche Feder fallen gelassen. Die Frakturvorrichtung wurde so eingestellt, dass die Verschiebung der stumpfen Klinge infolge des Schlages zum Femur hin etwa 1 mm betrug.
Jede Maus wurde nach einer einzigen Gewalteinwirkung infolge des Schlages aus der Frakturvorrichtung entfernt und einer radiografischen Analyse unterzogen, wobei ein Digitalkamera-Röntgenschrank (Faxitron X-Strahl Corporation; MX-20) verwendet wurde. Die Tiere wurden geröntgt, um sowohl die Anbringung des Markraumnagels als auch die Qualität der Fraktur zu evaluieren. Die Anbringung des Nagels wurde als erfolgreich beurteilt, wenn: i) die chirurgische Einführung nicht mehr als fünf Minuten pro Maus dauerte oder keine übermäßige Tierhandhabung erforderte; ii) der Nagel in der Mitte der Markhöhle platziert wurde; und iii) der Nagel nicht verbogen war oder in einem anderen Teil des Femurs steckte. Die Frakturen wurden als erfolgreich beurteilt, wenn: i) die Fraktur in der Mitte des Femurs auftrat; ii) es sich bei der Fraktur um eine Querfraktur handelte und diese nicht zersplittert war. Tiere, die diese Kriterien nicht erfüllten, wurden sofort euthanisiert.
Mäuse, welche diese radiografischen Kriterien erfüllten, durften sich, während sie überwacht wurden, unter einer wärmenden Decke erholen.
C. Wirkung der adenoviralen Konstrukte auf die Frakturreparatur
Die Mäuse mit Femurfakturen wurden zufällig zwei Gruppen zugeordnet, bevor sie vom chirurgischen Anästhesiezustand aus wieder zu Bewusstsein kamen. Die Mäuse in Gruppe 1 erhielten eine 50-μl-Injektion Adenovirus-GFP in die Schwanzvene. Die Mäuse in Gruppe 2 erhielten eine 50-μl-Injektion Adenovirus-BMP-6 in die Schwanzvene. Die Anzahl der Virionen, die jedem Tier verabreicht wurden, betrug 5 × 10¹⁰ Partikel/Injektion. Die Mäuse wurden zweimal am Tag überwacht, bevor die geplante Euthanasie an den Tagen 5, 7 und 10 erfolgte. Zu den geplanten Zeitpunkten wurden die Mäuse euthanisiert und zur Evaluation der Nagelanbringung und Frakturqualität der radiografischen Analyse unterzogen. Tiere, bei denen die Fraktur durch den Nagel nicht als stabilisiert erschien, wurden aus der Studie entfernt. Die rechten Beine der verbliebenen Mäuse wurden entfernt. Die Markraumnägel wurden zu diesem Zeitpunkt nicht entfernt und die Beine (abzüglich Haut und Haaren) wurden in einer Lösung von 10%igem neutral gepuffertem Formalin (Hydrol Chemical Co., Yeadon, PA, USA) fixiert.
D. Histologische Analyse von Oberschenkelbrüchen
Die Gewebe wurden seziert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
Tag 5
Ein repräsentativer Femur von jeder der zwei Gruppen zeigte die Anfänge eines Frakturreparaturprozesses. Der Reparaturprozess zeigte sich durch Bereiche am Schnitt (bei 2facher Vergrößerung), die eine periostale Zellproliferation neben der Fraktur aufwiesen. Bei einer stärkeren Vergrößerung (20fach) waren Bereiche der aktiven Chondrogenese, wie sie durch das Vorhandensein von hypertrophischen Chondrozyten gegeben ist, in einem Femur von der BMP-6-Gruppe leicht sichtbar. Dagegen ließen sich in der GFP-Gruppe die hypertrophischen Chondrozyten in Bereichen neben der Fraktur nicht leicht erkennen. Es gab am Tag 5 in jeder der beiden Gruppen keine gut abgrenzbaren äußeren Kallusse.
Tag 7
Es gab keinen gut abgrenzbaren äußeren Kallus um den Bereich der Fraktur in einem Femur von der GFP-Gruppe. Dieser Schnitt schien mit dem der GFP-Femur vom Tag 5 vergleichbar zu sein. Dagegen gab es einen deutlichen und gut abgrenzbaren äußeren Kallus um den Knochenbruch von der BMP-6-Gruppe.
Tag 10
Es gab keinen gut abgrenzbaren äußeren Kallus um den Bereich der Fraktur in einem Femur von der GFP-Gruppe. Bei geringer Vergrößerung schien der Schnitt mit den GFP-Femuren von den Tagen 5 und 7 vergleichbar zu sein. Es ließ sich jedoch bei stärkerer Vergrößerung erkennen, dass eine begrenzte Anzahl von periostalen Zellen, neben der Fraktur, hypertrophische Chondrozyten waren. Dagegen gab es einen deutlichen und gut abgrenzbaren äußeren Kallus um den Knochenbruch von der BMP-6-Gruppe. Dieser Kallus wies auf eine Knochenbildung und Neovaskularisation hin.
Sonstige Bereiche des Knochens wurden während der Erzeugung der Fraktur beschädigt. Zum Beispiel wurde der Femurkopf beim Vorgang der Nageleinführung punktiert. Diese zusätzlichen Bereiche des beschädigten Knochens wiesen ebenfalls deutliche Anzeichen eines Knochenreparatur- bzw. eines Knochenbildungsprozesses in den Femura von der BMP-6-Gruppe auf, was aber bei denen von der GFP-Gruppe nicht der Fall war.
Die histologischen Daten zeigen, dass das systemische BMP-6, das hauptsächlich von den Hepatozyten sezerniert wird, die Frakturreparatur beschleunigen kann.
Beispiel II (allgemeiner Stand der Technik zur vorliegenden Erfindung und veranschaulicht diese nicht)
A. Ektope Knochenbildung
Es wurden mehrere unabhängige Experimente durchgeführt, um die osteogenen Wirkungen des hBMP-6 adenoviralen Vektors zu evaluieren. Bei diesen Experimenten erhielten weibliche C57BI/6-SCID- oder immunkompetente Mäuse eine intramuskuläre Injektion in die beiden Quadrizepsmuskeln, und zwar eine einzige Dosis Adenovirus, der für hBMP-6 oder GFP codiert (1 bis 2,5 × 10¹⁰ Partikel/Injektion). Mäuse von jeder Versuchsgruppe wurden zu verschiedenen, gewöhnlich zu einem oder zu zwei, Zeitpunkten nach der Injektion getötet. Die Gewebe wurden geerntet, in Formalin fixiert und mit Hämatoxylin und Eosin zur Histopathologie gefärbt. Bei allen Experimenten induzierte hBMP-6 die enchondrale Knochenbildung in Muskeln, die von immungeschwächten Mäusen stammten, und in einem geringeren Ausmaß in immunkompetenten Mäusen. Im Folgenden werden die Ergebnisse beschrieben, die von einem Versuch erhalten wurden, bei dem immungeschwächte Mäuse verwendet und die Gewebe zu fünf Zeitpunkten nach der Injektion gesammelt wurden.
Die weiblichen C57BL/6-SCID-Mäuse (Jackson Lab.) wurden in zwei Gruppen eingeteilt, um die knochenanabolen Effekte von hBMP-6 zu studieren. Alle Mäuse wurden durch die Inhalation von Isofluran kurz anästhesiert. Auf die Anästhesie folgte die intramuskuläre Injektion entweder von Adenovirus-GFP oder Adenovirus-BMP-6 in beide Quadrizepsmuskeln von jeder Maus. Jeder Quadrizepsmuskel wurde mit 1,25 × 10¹⁰ Viruspartikel in einem Volumen von 25 Mikroliter injiziert. Die Mäuse wurden zu fünft in einem Käfig bei einer Standarddiät von Nahrung und Wasser untergebracht und Tiergruppen wurden an den Tagen 2, 3, 4, 7 und 14 euthanisiert. Beide Quadrizepsmuskeln wurden freigelegt und von den Tieren entfernt und in einer Lösung von 10%igen neutral gepuffertem Formalin (Hydrol Chemical Co., Yeadon, PA, USA) fixiert. Am Tag 14 wurden die Mäuse einer Röntgenanalyse unterzogen, wobei ein Digitalkamera-Röntgenschrank (Faxitron X-Strahl Corporation; MX-20) zur Anwendung kam. Diese Tiergruppe wurde geröntgt, um die Bildung von ektopem Knochen in den Quadrizepsmuskeln zu evaluieren.
Ausgewählte Muskelproben wurden bereitgestellt und die gesamte RNA wurde unter Verwendung der RNAgents- und RNeasy-Kits (jeweils Promega und Qiagen) isoliert. Das RNAgents-Kit wurde, wie vom Hersteller empfohlen, bis zur und einschließlich der RNA-Präzipitation eingesetzt, wobei Isopropanol zur Anwendung kam. Isopropanol wurde mit einer 75%igen Ethanollösung aus dem RNA-Pellet gewaschen. Die gesamte RNA wurde unter Verwendung einer Mikrozentrifuge gesammelt und das Pellet wurde in Lysepuffer aus dem RNeasy-Kit gelöst. Die RNA-Reinigung wurde, wie vom Hersteller empfohlen, durchgeführt. Die gesamte RNA wurde in Wasser eluiert und die Konzentration mithilfe eines Spektrophotometers ermittelt.
Die RT-PCR wurde zum Messen der relativen GFP- und BMP-6-Spiegel eingesetzt. Die RT-PCR wurde unter Zuhilfenahme eines ABI PRISM 7700 Sequenznachweissystems (Sequence Detection System; Applied Biosystems) ausgeführt. Die Primer und die Sonden nutzten eine Nucleotidsequenz, die sich in der SV40-Poly-A-Sequenz befand, die dem GFP- und dem BMP-6-Adenoviruskonstrukt gemein war. Folgende Primer und Sonden wurden verwendet:
Bevor die RT-PCR ausgeführt wurde, wurden alle Proben von gesamter RNA einer Behandlung mit RNase-free DNase unterzogen, um die Spurenmengen von genomischer DNA zu entfernen. Das TaqMan EZ RT-PCR CORE REAGENTS-Kit (Perkin Elmer) wurde, gemäß den Anweisungen des Herstellers, eingesetzt. Die PCR erfolgte in 50-μl-Lösungen, die 50 ng gesamter RNA und 5 μM Sonde und Primer enthielten. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:

Stadium 1: 50°C für 2 Min.

60°C für 30 Min.

Stadium 2: 95°C für 5 Min.

Stadium 3: 95°C für 15 Sek. X40

60°C für 1 Min.
Diese Analyse wies die lokale Expression von mRNA für GFP und BMP-6 in Quadrizepsmuskeln nach.
D. Histologische Analyse der Quadrizepsmuskeln
Die Gewebe wurden seziert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
Die Injektion von Adenovirus-GFP führte nicht zur Bildung von ektopem Knochen im Muskel, wie dies die Evaluation durch Sichtprüfung des Muskels, Röntgendarstellungen und Histologie ergab. Die histologische Analyse der Gewebeschnitte zeigte eine akute und subakute Entzündung, die durch eine neutrophile Lymphozyten- und Makrophagen-Infiltration gekennzeichnet war. Diese zelluläre Infiltration wurde schon am Tag 2 festgestellt, hatte anscheinend an den Tagen 4 und 7 ihren Spitzenwert und schien am Tag 14 abgeklungen zu sein. Außer der zellulären Infiltration gab es auch Anzeichen für Ödem und Faserdegeneration des Skelettmuskels an den Tagen 3 und 4 und Muskelfaserregeneration an den Tagen 7 und 14.
Die Injektion von Adenovirus-BMP-6 führte zur Bildung von ektopem Knochen im Muskel, wie dies die Evaluation durch Sichtprüfung des Muskels, Röntgendarstellungen und Histologie ergab. Es ließ sich bezüglich der Größe des Muskels schon am Tag 4 nach der Injektion eine Vergrößerung erkennen. Röntgenaufnahmen zeigten das Vorhandensein von röntgenstrahlenundurchlässigen Massen in den Muskeln der Tiere am Tag 14. Die histologische Analyse der Gewebeschnitte zeigte eine akute Entzündung an den Tagen 2 und 3. Eine mesenchymale Zellproliferation wurde an den Tagen 4, 7 und 14 beobachtet. Knorpelgewebe war an den Tagen 7 und 14 festzustellen und eine ausgeprägte Knochenbildung wurde am Tag 14 klar identifiziert.
Diese Daten weisen nach, dass die intramuskuläre Verabreichung von Adenovirus-BMP-6 die enchondrale Knochenbildung zur Folge hat.
Beispiel III. Adenovirus-BMP-6 beschleunigt die Osteotomieheilung in einem Kaninchen-Ulna-Modell (allgemeiner Stand der Technik zur vorliegenden Erfindung und veranschaulicht diese nicht)
Das Kaninchen-Ulna-Modell wurde eingesetzt, um zu ermitteln, ob die perkutane Injektion des Adenovirus, das BMP-6-cDNA enthielt, dazu verwendet werden könnte, die Osteotomieheilung zu beschleunigen. Dieses Modell ist als Screening-Modell benutzt worden, um die Beschleunigung der Osteotomieheilung als Reaktion auf die chirurgische Implantation von rhBMP-2 auf einem Kollagenschwamm und in einem Calciumphosphat-Träger nachzuweisen.
A. Verfahren
Bilaterale, 1–2 mm große Osteotomien in der Mitte der Diaphyse der Ulna wurden in 18 adulten männlichen Kaninchen erzeugt. Im Anschluss an den chirurgischen Eingriff wurden 200 ml, die 1 × 10¹² Adenovirus-BMP-6-Partikel enthielten, bei 12 Tieren in eine Osteotomie perkutan injiziert. Ein vergleichbares Volumen, das die gleiche Anzahl von Adenovirus-GFP-Partikel enthielt, wurde in eine Osteotomie bei den restlichen 6 Tieren injiziert. Die Adenovirus-GFP-Tiere dienten als Kontrollen für die Wirkung der Verabreichung von Adenovirus ohne BMP-6-cDNA. In beiden Gruppen diente die kontralaterale Osteotomie als eine unbehandelte chirurgische Kontrolle (chirurgische KT). Einer Anzahl von Tieren wurden außerdem intramuskuläre Injektionen von verabreicht, um die Wirksamkeit des Virenvektorsystems in Bezug auf die Expression der abgegebenen cDNA zu validieren. Sechs der Tiere in der Adenovirus-BMP-6-Gruppe wurden jeweils 6 Wochen und 8 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff euthanisiert. Die Tiere in der Adenovirus-GFP-Gruppe wurden 6 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff euthanisiert. Die Maßnahmen zur Ergebnisermittlung umfassten Röntgenseriendarstellung, Torsionsbiomechanik, Histologie und GFP-Expression.
B. Ergebnisse
Durch die histologische Auswertung der intramuskulären Adenovirus-GFP-Injektionen wurde verifiziert, dass es eine cDNA-Expression nach der viralen Injektion gab. Röntgenserienaufnahmen zeigten das Vorhandensein von mineralisiertem Kallus schon zwei Wochen nach der Injektion des Adenovirus-BMP-6 (3 Wochen nach der Erzeugung der Osteotomie). 6 Wochen nach der Erzeugung der Osteotomie lag bei allen Adenvirus-BMP-6-injizierten Tieren über die Osteotomiestelle hinweg ein mineralisierter Brückenkallus vor. Die Osteotomie wurde überbrückt und die Osteotomie war 8 Wochen nach Erzeugung der Osteotomie in den Adenovirus-BMP-6-Extremitäten nicht länger sichtbar. Das Auftreten des mineralisierten Knochens und des Brückenkallus war in den chirurgischen Kontrollosteotomien und in den mit Adenovirus-GFP-injizierten Osteotomien verzögert. Alle chirurgischen Kontroll- und Adenovirus-GFP-injizierten Extremitäten wiesen nach 8 Wochen sichtbare Osteotomielinien auf.
Die maximale Torsionsfestigkeit und Torsionssteifigkeit bezüglich der Osteotomien waren im Vergleich zu den kontralateralen chirurgischen Kontroll-Extremitäten sowohl 6 als auch 8 Wochen nach Erzeugung der Osteotomie in den Adenovirus-BMP-6-Extremitäten größer (Tabelle 1 und 2). Zu diesen beiden Zeitpunkten waren die maximale Torsionsfestigkeit und Torsionssteifigkeit in den Adenvirus-BMP-6-Osteotomien gleichwertig zu denen einer jeweiligen Ulna von normalen Kaninchen. Die maximale Torsionsfestigkeit für die kontralateralen chirurgischen Kontrollen betrug 44% bzw. 66% des Wertes für die jeweilige Ulna von normalen Kaninchen, und zwar 6 bzw. 8 Wochen nach der Erzeugung der Osteotomie. Die Torsionssteifigkeit betrug 56% bzw. 72% des Wertes für die jeweilige Ulna von normalen Kaninchen, und zwar 6 bzw. 8 Wochen nach Erzeugung der Osteotomie. Die Torsionsfestigkeit und die Torsionssteifigkeit lagen im Vergleich zu den kontralateralen chirurgischen Kontrollen 6 Wochen nach Erzeugung der Osteotomie bei den Adenovirus-GFP-Extremitäten in ähnlicher Größenordnung.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die perkutane Injektion von Adenovirus-BMP-6, die eine Woche nach dem chirurgischen Eingriff erfolgte, die Osteotomieheilung im Kaninchen-Ulna-Modell beschleunigt. Es gab keine Wirkung, wenn der Adenovirus ohne BMP-6 verabreicht wurde. Die Verwendung des Adenovirus, das cDNA für BMP-6 enthält, stellt eine potenzielle injizierbare Behandlung zur Beschleunigung einer geschlossenen Frakturreparatur bei Menschen dar. Tabelle 1: Torsionsfestigkeit (Nm: Mittelwert ± SA)

Zeit	AdenoBMP-6	Chirurgische KT	AdenoGFP	Chirurgische KT	Normal
6 Wochen	0,63 ± 0,21	0,29 ± 0,26	0,32 ± 0,23	0,29 ± 0,18	0,66 ± 0,15
8 Wochen	0,67 ± 0,20	0,43 ± 0,17			0,66 ± 0,15

Tabelle 2: Torsionssteifigkeit (Nm/deg: Mittelwert ± SA)

Zeit	AdenoBMP-6	Chirurgische KT	AdenoGFP	Chirurgische KT	Normal
6 Wochen	0,036 ± 0,015	0,018 ± 0,017	0,017 ± 0,014	0,016 ± 0,012	0,032 ± 0,008
8 Wochen	0,038 ± 0,016	0,023 ± 0,012			0,032 ± 0,008

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Knochenmorphogeneseprotein (Bone Morphogenetic Protein, BMP) codiert, bei der Herstellung eines Medikaments um die Osteogenese in einem Patienten durch systemische Verabreichung desselben zu fördern.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP) codiert, bei der Herstellung eines Medikaments um die Fraktur in einem Patienten durch systemische Verabreichung desselben zu heilen.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP) codiert, bei der Herstellung eines Medikaments um die Knochenmineraldichte in einem Patienten durch systemische Verabreichung einer wirksamen Menge desselben zu erhöhen.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP) codiert, bei der Herstellung eines Medikaments um die Osteoporose in einem Patienten durch systemische Verabreichung einer wirksamen Menge desselben zu behandeln.
Verwendung einer DNA-Sequenz, die für ein Knochenmorphogeneseprotein 6 (BMP-6) codiert in einem geeigneten Vektor bei der Herstellung einer Zusammensetzung, um die Frakturreparatur in einem Patienten, der diese benötigt, zu fördern, wobei das Medikament systemisch verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Knochenmorphogeneseprotein aus der Gruppe, bestehend aus BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13, BMP-15, BMP-16 und Kombinationen davon, ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Knochenmorphogeneseprotein BMP-6 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die DNA-Sequenz in einem Adenovirusvektor enthalten ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Knochenmorphogeneseprotein zur systemischen Verabreichung geeignet ist.