DE60223635T2 - Reagenzien, Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Analyten - Google Patents

Reagenzien, Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Analyten Download PDF

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    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Description

  • STAND DER TECHNIK
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien, Verfahren und Vorrichtungen zur Messung von Analyten und genauer gesagt Reagenzien, Verfahren und Vorrichtungen zur Messung von Glukose in Blut.
  • Durch die Beobachtung bestimmter Analytkonzentrationen im Körper können Gesundheitsrisiken früh festgestellt werden, und es wird erkannt, ob therapeutische Maßnahmen zu ergreifen sind. Einer der am häufigsten beobachteten Analyten ist Glukose, deren Konzentration in Blut zur Bestimmung der geeigneten Insulindosis für Diabetiker wichtig ist. Zur Beobachtung von Blutglukosewerten wurden verschiedene Verfahren entwickelt, einschließlich der Verwendung von elektrochemischen Biosensoren. Elektrochemische Biosensoren basieren auf enzymkatalysierten chemischen Reaktionen, die den Analyten von Interesse involvieren. Bei der Überwachung von Glukose ist die relevante chemische Reaktion die Oxidation von Glukose zu Glukonolacton. Diese Oxidation wird durch eine Reihe von Enzymen katalysiert, von denen manche gegebenenfalls ein gebundenes Coenzym, wie z. B. Nicotinamidadenindinucleotid(phosphat) (NAD(P)), aufweisen, während andere gegebenenfalls einen gebundenen Cofaktor, wie z. B. Flavinadenindinucleotid (FAD) oder Pyrrolochinolinchinon (PQQ), aufweisen.
  • Bei Biosensoranwendungen werden die im Laufe der Oxidation von Glukose gebildeten Redoxäquivalente zur Oberfläche einer Elektrode transportiert, wodurch ein elektrisches Signal erzeugt wird. Die Stärke des elektrischen Signals wird anschließend mit der Glukosekonzentration korreliert. Die Übertragung der Redoxäquivalente aus der Stelle der chemischen Reaktion im Enzym zur Oberfläche der Elektrode wird durch die Verwendung von Elektronenübertragungsmediatoren erreicht.
  • Ein wesentliches Problem bei der Verwendung von Elektronenübertragungsmediatoren in Biosensoren ist die Instabilität dieser Verbindungen bei Ausgesetztsein gegenüber herkömmlichen Umweltbedingungen, wie z. B. Temperatur und Feuchtigkeit. Folglich ist die Anzahl an Mediatoren, die sich zur Verwendung in Glukosebiosensoren eignen, relativ beschränkt.
  • Im an Bloczynski et al. erteilten US-Patent 5.520.786 ('786) sind Familien von Phenothiazin- und Phenoxazinverbindungen beschrieben, die sich zur Verwendung als Elektronenübertragungsmediatoren mit den Enzymen Dihydronicotinamidadenindinucleotid (NADH), NADPH und Analoga davon eignen. Enyzme auf Cofaktorbasis, wie z. B. FAD-Glukoseoxidase und PQQ-Glukosedehydrogenase, weisen gegenüber Enzymen auf NAD-Basis mehrere Vorteile auf, einschließlich geringerer Kosten, höherer Enzymaktivität, erhöhter Stabilität, und sie sind im Gegensatz zu einem jederzeit dissoziierbaren Cofaktor gebunden.
  • Elektronenübertragungsmediatoren wurden früher in Zusammenhang mit FAD-Glukoseoxidase und PQQ-Glukosedehydrogenase, einschließlich Chinone, Phenzinmethosulfat, Dichlorphenolindophenol und Ferricyanid, verwendet. Leider haben sich diese Verbindungen als sehr anfällig gegenüber den oben beschriebenen Umweltfaktoren erwiesen, was zu Biosensorreagenzien mit geringer Stabilität führt. Daher sind Mediatoren erforderlich, die bei Ausgesetztsein gegenüber herkömmlichen Umweltfaktoren gute Stabilität aufweisen und die in Systemen auf Flavoprotein- und Chinoproteinbasis verwendet werden können.
  • Zusätzlich zu der Notwendigkeit für Biosensorreagenzien, die gegenüber den oben beschriebenen Umweltfaktoren stabil sind, wäre es wünschenswert, Biosensorreagenzien bereitzustellen, die gegenüber den herkömmlich bei der Sterilisierung von Lanzetten angewandten Bestrahlungsbedingungen stabil sind. Reagenzien, die gegenüber solcher Strahlensterilisation stabil sind, könnten in äußerst benutzerfreundliche Einheiten aufgenommen werden, in denen Lanzette und Biosensor kombiniert sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Elektronenübertragungsmediatoren zur Verwendung in Biosensorreagenzien auf Flavoprotein- und Chinoproteinbasis, die sowohl gegenüber Umwelteinflüssen als auch gegenüber Strahlensterilisation eine verbesserte Stabilität aufweisen.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist ausschließlich durch die beigefügten Ansprüche definiert und in keinster Weise durch die Darstellung in dieser Zusammenfassung betroffen. Einführend ist zu erwähnen, dass die hierin beschriebenen vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen die Behebung der zuvor angemerkten Stabilitätsprobleme von Elektronenübertragungsmediatoren und Enzymbiosensoren betrifft.
  • Kurz gesagt, betrifft ein Zusammensetzungsaspekt der vorliegenden Erfindung ein Reagens zum Nachweis eines Analyts, das (a) ein Enzym, ausgewählt aus der aus einem Flavoprotein, einem Chinoprotein und einer Kombination davon bestehenden Gruppe, und (b) einen Mediator, ausgewählt aus der aus einem Phenothiazin, einem Phenoxazin und einer Kombination davon bestehenden Gruppe, umfasst.
  • Hierin offenbart ist ein elektrochemischer Sensor, der (a) eine Arbeitselektrode mit einer Oberfläche und (b) eine zweite mit der Arbeitselektrode verbundene Elektrode umfasst. Die Oberfläche der Arbeitselektrode ist mit einer Lösung oder einem Gemisch eines Reagens beschichtet, die/das ein aus der aus einem Flavoprotein, einem Chinoprotein und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewähltes Enzym sowie einen aus der aus einem Phenothiazin, einem Phenoxazin und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählten Mediator umfasst.
  • Ebenfalls offenbart ist eine Vorrichtung zur Messung eines Analyts, die (a) eine Lanzette und (b) eine mit der Lanzette verbundene Messkammer umfasst. Die Messkammer umfasst ein Reagens, das ein aus der aus PQQ-Glukosedehydrogenase, FAD-Glukoseoxidase und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausge wähltes Enzym sowie (b) einen aus der aus einem Phenothiazin, einem Phenoxazin und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählten Mediator umfasst.
  • Hierin ist ein Verfahren zur Herstellung einer sterilisierten Vorrichtung zur Messung eines Analyts offenbart, das (a) die Bereitstellung einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung und (b) die Bestrahlung der Vorrichtung mit Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen umfasst.
  • Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zum Nachweis eines Analyts, der eine chemische Reaktion erfährt, wobei das Verfahren (a) die Bereitstellung einer Elektrodenoberfläche, (b) die Katalysierung der chemischen Reaktion mit einem aus einem Flavoprotein, einem Chinoprotein und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählten Enzym, (c) die Bildung eines Redoxäquivalents durch die chemische Reaktion und (d) die Übertragung des Redoxäquivalents auf die Elektrodenoberfläche unter Verwendung eines aus der aus einem Phenothiazin, einem Phenoxazin und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählten Mediators umfasst.
  • Die hierin erläuterten vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen weisen im Vergleich zu anderen Biosensorreagenzien auf Flavoprotein- und Chinoproteinbasis gegebenenfalls einen oder mehrere Vorteile auf, die Folgendes umfassen können, jedoch nicht darauf beschränkt sind: verbesserte Biosensorreagensstabilität; erhöhtes Elektronenübertragungsvermögen von Mediatoren; Fähigkeit, Mediatoren für einen optimalen Elektrodenbetrieb einzustellen; reduzierte Sauerstoffanfälligkeit von Mediatoren; erhöhte thermische Stabilität von Mediatoren; erhöhte Stabilität von Mediatoren gegenüber Umgebungsfeuchtigkeit; geringeres Redoxpotenzial von Mediatoren; reduzierte Anfälligkeit gegenüber störenden Stoffen in Blut; und Stabilität von Biosensorreagenzien gegenüber Strahlensterilisationsbedingungen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Messen eines Analyts, die Merkmale der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • 2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer integrierten Lanzetten/Biosensor-Vorrichtung zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 3 zeigt ein Diagramm der Hintergrundströme für 3 Formulierungen von Biosensorreagenzien, die ansteigenden Strahlungskonzentrationen ausgesetzt sind.
  • 4 zeigt ein Diagramm einer Stromantwort auf strahlungssterilisierte Biosensorreagenzien nach Ausgesetztsein gegenüber Glukose.
  • 5 zeigt eine graphische Darstellung des Stroms über der Glukosekonzentration bei größer werdenden Zeitintervallen für einen PQQ-Glukosedehydrogenase/Phenothiazin-Biosensor.
  • 6 zeigt eine graphische Darstellung des Stroms über der Glukosekonzentration für einen [FAD]-Glukoseoxidase/Phenothiazin-Biosensor.
  • 7 zeigt eine graphische Darstellung des Stroms über der Glukosekonzentration für einen PQQ-Glukosedehydrogenase/Phenothiazin-Biosensor, der eine Wärme- und Feuchtigkeitsbeanspruchung erfährt.
  • Die 8 bis 12 zeigen graphische Darstellungen des Stroms über der Glukosekonzentration für 5 Formulierungen von PQQ-Glukosedehydrogenase/Phenothiazin-Biosensoren, die unterschiedlichen Strahlungskonzentrationen ausgesetzt sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • In der gesamten Beschreibung und in den beigefügten Ansprüchen sind die nachstehenden Definitionen folgendermaßen zu verstehen: Die Bezeichnung „Analyt" steht für eine oder eine Vielzahl an Spezies mit einer Konzentration von Interesse. Die Bezeichnung „Flavoprotein" steht für Enzyme, die Flavin-Cofaktoren aufweisen. Die Bezeichnung „Chinoprotein" steht für Enzyme, die PQQ oder ähnliche Cofaktoren aufweisen. Die Bezeichnung „Redoxäquivalent" steht für eine oder eine Vielzahl an geladenen Spezies (z. B. Elektronen), die in elektrochemischen Reaktionen, welche den Analyt umfassen, gebildet werden. Die Bezeichnung „Elektronenstrahlen" steht für ein Verfahren zur Bestrahlung mit einem konzentrierten hohen Elektronenstrom. Die Bezeichnungen „Alkyl", „Alkenyl", Alkinyl", „Aryl", „Heteroaryl", „Zyklyl", „Heterozyklyl", „Halogen", „Halogenalkyl", „Carboxy", „Carboxyalkyl", „Alkoxycarbonyl", „Aryloxycarbonyl", „aromatisches Keto", „aliphatisches Keto", „Alkoxy", „Aryloxy", „Nitro", „Dialkylamino", „Aminoalkyl", „Sulfo", „Dihydroxybor" und dergleichen stehen für auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Substituenten, die verzweigt oder unverzweigt sein können und selbst mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein können. Die Bezeichnung „Biosensorreagens" steht für die Kombination eines Enzyms, das eine Reaktion eines Analyts katalysiert, mit einem Phenothiazin- und/oder Phenoxazin-Mediator. Die Bezeichnung „Gesamtkeimzahl" steht für die Population lebensfähiger Mikroorganismen auf einem Produkt, die unmittelbar vor der Bestrahlung bestimmt wird.
  • Ein Biosensorreagens zum Nachweis eines Analyts gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst (1) ein aus der aus einem Flavoprotein, einem Chinoprotein und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewähltes Enzym und (2) einen aus der aus einem Phenothiazin, einem Phenoxazin und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählten Mediator.
  • Die Art des gemäß der vorliegenden Erfindung beobachteten Analyts unterliegt keiner Beschränkung, vorausgesetzt, dass der Analyt eine chemische Reaktion erfährt, die durch ein aus einem Flavoprotein, einem Chinoprotein und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewähltes Enzym katalysiert wird. Bevorzugte Analyte umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Glukose, Lactat, D-Aminosäuren, Ascorbat, Alkohol, Cholesterin, Cholin und Acetylcholin.
  • Flavoproteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen FAD-Glukoseoxidase (Enzymklassifizierungs-Nr. 1.1.3.4), Flavinhexoseoxidase (EC-Nr. 1.1.3.5) und FAD-Glukosedehydrogenase (EC-Nr. 1.1.99.10). Für weitere Informationen bezüglich dieser Flavoproteine siehe Adriaan Joseph Jan Olsthoorn, "Structural and Mechanistic Aspects of Soluble Quinoprotein Glucose Dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus", Doktorarbeit, Delft University of Technology, Niederlande (1999). Zusätzliche Oxidaseenzyme zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Lactatoxidase, Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase (z. B. Methanoloxidase), D-Aminosäureoxidase, Cholinoxidase und FAD-Derivate davon. Ein bevorzugtes Flavoprotein zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist FAD-Glukoseoxidase.
  • Chinoproteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, membrangebundene und lösliche PQQ-Glukosedehydrogenase (EC-Nr. 1.1.99.17). Informationen bezüglich PQQ-Glukosedehydrogenase sind im oben angeführten Olsthoorn-Verweis zu finden. Zusätzliche Chinoproteinenzyme zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Lactatdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase, Methylamindehydrogenase, Alkoholdehydrogenase (z. B. Methanoldehydrogenase) und PQQ-Derivate davon. Ein bevorzugtes Chinoprotein zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist PQQ-Glukosedehydrogenase.
  • Mediatoren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Phenothiazine der Formel
    Figure 00080001
    und Phenoxazine der Formel
    Figure 00080002
    worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Zyklyl, Heterozyklyl, Halogen, Halogenalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, aromatischem Keto, aliphatischem Keto, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Dialkylamino, Aminoalkyl, Sulfo, Dihydroxybor und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt sein können.
  • Im Gegensatz zur Einzelelektronenübertragungs-Tragefähigkeit von K3Fe(CN)6 sind Mediatoren gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage, zwei Redoxäquivalente zu tragen, und eignen sich deshalb gut zur Verwendung in FAD und Chinoproteinoxidations/Reduktions-Verfahren, die im Allgemeinen die Übertragung von zwei Elektronen umfassen. Darüber hinaus kann das Potenzial von Mediatoren der vorliegenden Erfindung für eine spezifische Probenmatrix durch Variieren der Substitution auf den aromatischen Ringen auf das optimale Potenzial eingestellt werden (nämlich das Potenzial, bei dem der Signalbeitrag von Interferenzen minimiert wird). Elektronenspendende Substituenten (z. B. Alkyl, Alkoxy, Amin, Hydroxy etc.) führen zu verringerten Redoxpotenzialen, während elektronenabziehende Substituenten (z. B. Carbonsäure, Ester, Aldehyd, Keton, Nitril, Nitro, Sulfonsäure, Trifluormethyl etc.) zu erhöhten Redoxpotenzialen führen. Für Blut- oder Plasmaproben liegt das ideale Po tenzial verglichen mit einer Ag/AgCl-Referenz üblicherweise zwischen etwa –200 und etwa 100 mV.
  • Die Substituenten auf den aromatischen Ringen können neben ihrer Nützlichkeit bei der Einstellung der Redoxpotenziale der Mediatoren auch zur Verbesserung der Mediatorlöslichkeit verwendet werden. Es ist beispielsweise zu erwarten, dass die Einführung eines Substituenten, welcher in der Lage ist, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, den Mediator wasserlöslicher macht als ein Mediator, dem diese Substitution fehlt. Darüber hinaus können solche Substituenten als funktionelle Gruppen zur Immobilisierung der Mediatoren an einen Träger (z. B. die Elektrodenoberfläche oder alternativ dazu eine chemische Matrix, wie z. B. ein Polymer-Grundgerüst, das sich zur Aufbringung auf die Elektrodenoberfläche eignet) dienen.
  • Vorzugsweise umfassen Mediatoren, die in Biosensorreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, 3-(4'-Chlorphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Diethylaminophenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Ethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Trifluormethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Methoxycarbonylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Nitrophenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Methoxyphenylimino)-3H-phenothiazin, 7-Acetyl-3-(4'-methoxycarbonylphenylimino)-3H-phenothiazin, 7-Trifluormethyl-3-(4'-methoxycarbonylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-ω-Carboxy-n-butylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Aminomethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-(2''-(5''-(p-Aminophenyl)-1,3,4-oxadiazoyl)phenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-β-Aminoethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 6-(4'-Ethylphenyl)amino-3-(4'-ethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 6-(4'-[2-(2-Ethanoloxy)ethoxy]ethoxyphenyl)amino-3-(4'-[2-(2-ethanoloxy)ethoxy]ethoxyphenylimino-3H-phenothiazin, 3-(4'-[2-(2-Ethanoloxy)ethoxy]ethoxyphenylimino-3H-phenothiazin, 3-(4'-Phenylimino)-3H-phenothiazinboronsäure, 3-(3',5'-Dicarboxyphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Carboxyphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(3',5'-Dicarboxyphenylimino)-3H-phenoxazin, 3-(3',5'-Phenylimino)-3H-phenothiazindisulfonsäure und 3-(3-Phenylimino)-3H-phenothiazinsulfonsäure.
  • Noch bevorzugter wird der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Mediator aus der aus
    Figure 00100001
    und
    Figure 00100002
    bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Verglichen mit Ferricyanid sind Phenothiazinmediatoren, insbesondere Mediator I, weniger anfällig gegenüber oxidativer Zersetzung, thermisch stabiler und stabiler gegenüber Umgebungsfeuchtigkeit. Darüber hinaus arbeitet der Mediator I bei einem geringeren Redoxpotenzial als Ferricyanid. E0 für Mediator I ist gegenüber einer Ag/AgCl-Referenz beispielsweise etwa 0 mV, während E0 für Ferricyanid gegenüber einer Ag/AgCl-Referenz etwa 250 mV beträgt. Das niedrigere Redoxpotenzial von Phenothiazinmediatoren ist dahingehend von Vorteil, als dass es einen Bereich um 0 mV gegenüber Ag/AgCl-Referenz gibt, bei dem die Menge der elektrochemischen Interferenzen minimiert wird. Folglich kann die Auswirkung störender chemischer Stoffe im Blut durch Verwendung dieser Mediatoren minimiert werden.
  • Reagenzien, die Merkmale der vorliegenden Erfindung umfassen, können in einer Reihe von Biosensorvorrichtungen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, in jenen aufgenommen werden, die in den US-Patenten 5.120.420 und 5.798.031 beschrieben sind, deren gesamter Inhalt hierin durch Verweis aufgenommen ist, mit der Ausnahme, dass im Falle einer mit der vorliegenden Anmeldung nicht übereinstimmenden Offenbarung oder Definition die hierin offenbarte Definition als die ausschlaggebende angesehen wird.
  • Bezugnehmend auf die Zeichnungen zeigt 1 einen repräsentativen elektrochemischen Sensor gemäß der vorliegenden Erfindung. Der elektrochemische Sensor 2 besteht aus einer isolierenden Basis 4, auf die eine Elektrodenstruktur (6 und 8) (üblicherweise mittels Siebdruckverfahren) aufgedruckt ist, und einer Reagensschicht 10, die ein Reagens umfasst, das Merkmale der vorliegenden Erfindung aufweist. Die zwei Teile des Elektrodendrucks 6 und 8 stellen die zur elektrochemischen Bestimmung erforderlichen Arbeits- und Bezugselektroden bereit. Ein Lanzettenelement 12 kann in den elektrochemischen Sensor (z. B. zwischen den Schichten 1 und 2) aufgenommen werden, wie im weiteren Verlauf ausführlicher beschrieben wird. Die drei in 1 gezeigten Schichten können abhängig von der Art der Materialien mit einem Haftmittel (z. B. Haftklebstoff, Heißkleber etc.) oder durch Ultraschallschweißen verbunden werden.
  • Es wurde herausgefunden, dass Biosensorreagenzien, die PQQ-Glukosedehydrogenase und bestimmte Phenothiazinmediatoren umfassen, hohe Stabilität gegenüber Strahlungssterilisation aufweisen. Eine bevorzugte Anwendung von strahlungsstabilen Biosensorreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung findet sich in der Entwicklung von integrierten Lanzetten/Biosensor-Vorrichtungen. Ein Beispiel für eine solche integrierte Vorrichtung ist in 2 dargestellt und im US-Patent 5.801.057 beschrieben, dessen gesamter Inhalt hierin durch Verweis aufgenommen ist, mit der Ausnahme, dass im Falle einer mit der vorliegenden Anmeldung nicht übereinstimmenden Offenbarung oder Definition die hierin offenbarte Definition als die ausschlaggebende angesehen wird.
  • Wie in 2 gezeigt, weist die integrierte Lanzetten/Biosensor-Vorrichtung 14 eine feingebohrte Nadel 16 auf, die mit einer Probeentnahmekammer 18 verbunden ist. Die Probeentnahmekammer 18 weist zumindest ein optisches Fenster 20 und ein Lüftungsloch 22 auf, durch welches Luft verdrängt werden kann, wenn die Kammer 18 mit Blut oder anderen Fluiden befüllt wird. Vorzugsweise umfasst die Probeentnahmekammer 18 ein Biosensorreagens, das PQQ-Glukosedehydrogenase und einen Phenothiazin- und/oder Phenoxazin-Mediator umfasst. Vorzugsweise ist der Mediator ein Phenothiazin. Noch bevorzugter weist der Mediator eine Struktur auf, die durch den obigen Mediator I oder Mediator II dargestellt ist. Ist die Probeentnahmekammer 18 mit dem Biosensorreagens befüllt, kann die gesamte Vorrichtung 14 einer Strahlungssterilisation unterzogen werden. Vorzugsweise umfasst das Sterilisationsverfahren Elektronen- oder Gammastrahlen.
  • Wie im Dokument ANSI/AAMI/ISO 11137-1994 der US-amerikanischen Association for the Advancement of Medical Instrumentation dargelegt, müssen Produkte, die die Haut durchdringen und mit dem Blut in Kontakt kommen, eine Sterilitätsgewährleistungskonzentration (SAL = sterility assurance level) von 10–6 aufweisen, was einer Wahrscheinlichkeit der Gegenwart eines lebensfähigen Mikroorganismus auf einem Produkt nach der Sterilisation von 1 zu 1 Million entspricht. Die zur Erzielung einer SAL von 10–6 erforderliche Sterilisationsdosis hängt von der Gesamtkeimzahl der Probe ab. Eine Probe mit einer Gesamtkeimzahl von 1.021 erfordert beispielsweise eine Sterilisationsdosis von 24,9 kGy zur Erzielung einer SAL von 10–6.
  • In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurden Elektronenstrahlen als Sterilisationsverfahren angewandt. Die den Elektronenstrahlen ausgesetzten Biosensorreagenzien absorbieren die Energie aus den Elektronen. Die pro Masseneinheit des Materials absorbierte Energie wird als absorbierte Dosis bezeichnet, und diese Energieabsorption, oder Dosisabgabe, zerstört die reproduktiven Zellen und DNA-Ketten von Mikroorganismen, wodurch das Produkt steril bleibt. Es wurde eine Elektronenstrahlendosis von 25, 50 und 100 kGy eingesetzt, da die Gesamtkeimzahl der Biosensorreagenzien unbekannt war.
  • 3 zeigt ein Diagramm der Hintergrundströme für 3 Formulierungen von Biosensorreagenzien, die erhöhten Strahlungskonzentrationen ausgesetzt sind: (1) NAD-Glukosedehydrogenase mit Mediator I, (2) PQQ-Glukosedehydrogenase mit Ferricyanid und (3) PQQ-Glukosedehydrogenase mit Mediator I. Die PQQ-Formulierungen tolerierten die Bestrahlung äußerst gut. Im Gegensatz dazu wies die NAD-Formulierung eine schlechte Toleranz gegenüber den Sterilisationsbedingungen auf und führte zu einem Hintergrundsignal, das eine signifikante Menge des Glukosesignals ausmachte. Während Formulierung (2) gute Toleranz gegenüber dem Bestrah lungsverfahren aufwies, war die Aktivität des extrahierten Enzyms geringer als die entsprechende Aktivität des aus Formulierung (3) extrahierten Enzyms. 4 zeigt ein Diagramm der Stromantwort, als diese strahlungssterilisierten Sensoren 600 mg/dl Glukose ausgesetzt waren.
  • Die Art, wie eine Vorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung umfasst, hergestellt wird, und das Verfahren, mit dem eine solche Vorrichtung zur Überwachung eines Analyts verwendet wird, ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung unter Berücksichtigung sowohl der vorangegangenen Beschreibung als auch der nachstehenden repräsentativen Verfahren klar. Es versteht sich, dass viele Variationen in den hierin dargestellten vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sind und im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche bleiben.
  • Die in elektrochemischen Sensoren gemäß der vorliegenden Erfindung angewandte Arbeitselektrode kann beispielsweise variiert werden, wobei geeignete Elektroden, jedoch nicht darauf beschränkt, Kohleelektroden, Platinelektroden, Palladiumelektroden, Goldelektroden und dergleichen umfassen. Die Bezugselektrode kann auf ähnliche Weise variiert werden, wobei geeignete Elektroden, jedoch nicht darauf beschränkt, Silber-Silberchlorid-Elektroden, Kalomelelektroden, gesättigte Kalomelelektroden und dergleichen umfassen. Alternativ dazu kann eine Quasi-Bezugselektrode (z. B. eine Platinelektrode mit großer Oberfläche) des in nichtwässrigen elektrochemischen Experimenten herkömmlich verwendeten Typs (nämlich eine Elektrode, die keine spezifische Redoxspezies aufweist, auf die ihr Potenzial bezogen wird) gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Die Oberflächen sämtlicher gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeter Elektroden erfahren ebenfalls Variationen. Vorzugsweise weist die Arbeitselektrode Abmessungen von etwa 0,6 mm × 1,2 mm auf.
  • Ferner unterliegen die Zusammensetzungen und pH-Werte der eingesetzten Pufferlösungen sowie die Enzymaktivitäten und -konzentrationen der Komponenten der Biosensorreagenzien starker Veränderung. Geeignete Pufferlösungen umfassen, je doch nicht darauf beschränkt, HEPES (d. h. N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), MOPS (d. h. 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure), TES (d. h. N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure, 2-([2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino)ethansulfonsäure), PIPES (d. h. Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure), 1,4-Piperazindiethansulfonsäure), ACES (d. h. N-(Carbamoylmethyl)-2-aminoethansulfonsäure, N-(2-Acetamidol)-2-aminoethansulfonsäure), BES (d. h. N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure) und Dulbecco-Puffer (d. h. 0,008 M Natriumphosphat, 0,002 M Kaliumphosphat, 0,14 M Natriumchlorid, 0,01 M Kaliumchlorid, pH 7,4).
  • Die Art, wie Reagenzien und Vorrichtungen, die Merkmale der vorliegenden Erfindung umfasst, hergestellt werden, und das Verfahren, mit dem diese Reagenzien und Vorrichtungen zur Überwachung eines Analyts verwendet werden, ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung unter Berücksichtigung sowohl der vorangegangenen Beschreibung als auch der nachstehenden repräsentativen Verfahren klar.
  • Während nachstehend bereitgestellte Beispiele In-vitro-Anwendungen der erfindungsgemäßen Biosensorreagenzien betreffen, wird in Erwägung gezogen, dass diese Reagenzien auch zur Beobachtung von In-vivo-Analyten angeordnet werden können, indem die Phenoxazin- und/oder Phenothiazinmediatoren (z. B. durch chemische Reaktion an einer oder mehreren Substituentengruppen auf den aromatischen Ringen) chemisch immobilisiert werden und die immobilisierten Mediatoren in eine Vorrichtung aufgenommen werden, die subkutan in einen Patienten implantiert werden kann.
  • BEISPIELE
  • Herstellung des Biosensors und Glukosedosisantwort
  • Ein flüssiges chemisches Reagens wurde hergestellt, um 20 Einheiten/μl Pyrollochinolinchinon-Glukosedehydrogenase (PQQ-GDH) und 24 mM Mediator I in 100 mM Natriumphosphat mit einem pH 7,4 zu ergeben. Die erste Komponente des Reagens wurde hergestellt, indem der Mediator in 100 mM Phosphat mit einem pH von 7,4 gelöst, der pH wieder auf 7,4 eingestellt und die Lösung filtriert wurde, indem sie durch ein Whatman-0,45-μm-PTFE-Spritzenfilter gezwungen wurde. Das Reagens wurde fertiggestellt, indem lyophiliertes PQQ-GDH (Toyobo Produkt Nr. GLD-321) auf eine Aktivität von 20 U/μl zugesetzt wurde.
  • Die chemische Formulierung wurde auf Elektroden aufgebracht, die mittels eines Siebdruckverfahrens mit 3 Durchgängen von Conductive Technologies, Inc. hergestellt worden waren. Während dieses Verfahrens wurden die Silber/Silberchlorid-(DuPont-5870-Druckfarbe-)Leitungen und die Bezugselektrode zuerst auf ein Polycarbonatbasismaterial aufgedruckt. Der zweite Durchgang der Kohle-Graphit-Arbeitselektrode Dupont 7102T wurde darüber gedruckt. Ein Enddurchgang des Norcote-RDMSK4954-A2-Dielektrikums definierte die Arbeitselektrodenoberfläche mit 0,0113 cm2.
  • Die Chemie wurde mittels eines Asymtek-Automove®-402-Abgabesystems über der Arbeitselektrode aufgebracht. Das System war programmiert, um die Übertragung durch Eintauchen einer 62-ml-Edelstahlnadel in eine mit dem Reagens befüllte 1,5-ml-Eppendorf-Phiole durchzuführen. Das Deckelmaterial aus Polycarbonat wurde auf die Sensoren laminiert, was eine Kapillarfläche über den Arbeits- und Bezugselektroden bildete, die etwa 3 μl der Testlösung tragen konnte. Die Kapillarfläche, welche das Probenvolumen definiert, wird zuerst im Polycarbonatdeckelmaterial durch ein Präge- oder Stanzverfahren ausgebildet.
  • Wie in 5 gezeigt, wurde die Reaktivität der Chemie durch Erzeugen einer Glukosedosis-Antwortskurve mit gepufferten (100 mM Phosphat, 100 mM Natriumchlorid mit einem pH von 7,4) Proben, die eine Reihe von Glukosekonzentrationen von 0 bis 600 mg/dl enthalten, analysiert. Der bei jeder der Glukosekonzentrationen erzeugte Strom wurde mittels eines Potentiostats gemessen, der programmiert ist, um ein 150-mV-Potenzial mit einem auf 100 nA eingestellten Auslösepegel anzulegen, und dessen Zeiteinstellung programmiert ist, um den Strom bei 5, 10, 15 und 20 Sekun den aufzunehmen. Der Auslösepegel betrifft einen Grenzpegel, über welchem die Zeiteinstellung und Aufzeichnung initiiert werden.
  • Sensoren, die mit 20 U Glukoseoxidase/Sensor und 6 mM Mediator I formuliert Waren, wurden wie oben auf Elektrodensensoren aufgebracht. Das in 6 gezeigte Dosisantwortdiagramm wurde erhalten.
  • Herstellung eines elektrochemischen Biosensors und Wärme/Feuchtigkeits-Stabilität
  • Elektrochemische Biosensoren wurden mittels eines Siebdruckverfahrens aufgebaut. Sensoren bestanden aus einer Kohlearbeitselektrode und einer Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode. Eine Lösung (150 bis 800 nl), die 12 mM Mediator I in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) enthielt, und das Enzym PQQ-Glukosedehydrogense (10 U/ul) wurden auf den Oberfläche der Arbeitselektrode aufgebracht und bei Raumtemperatur 5 min lang vor der Trocknung trocknen gelassen. Die Elektroden wurden zu einem Format mit einem kleinen Kapillarspalt zusammengebaut, das die Inokulierung der Sensoren mit Probelösungen ermöglichte.
  • In darauf folgenden Tests wurden die Sensoren vor dem Testen folgenden Umweltbedingungen ausgesetzt: 1) 50°C für 2, 4 und 8 Wochen; und (2) Raumtemperatur mit 40% relativer Feuchtigkeit. Die Sensoren wurden bei einem Potenzial von 150 mV in Bezug auf die Ag/AgCl-Bezugselektrode gehalten, und der resultierende Strom wurde gemessen. Diese Mediator/Enzym-Kombination ist, wie in 7 gezeigt, relativ stabil gegenüber sowohl Wärme- als auch Feuchtigkeitsbeanspruchung.
  • Sterilisation von Biosensoren und Bestrahlungsstabilitätsdaten
  • Fünf Formulierungen von Biosensorreagenzien (Tabelle 1) wurden hergestellt und mittels SureBeam®-Sterilisationstechnologie bei Titan Scan Technologies (San Diego, CA, USA) Elektronenstrahlen ausgesetzt. Formulierung I wurde bei 25 kGy, 50 kGy und 100 kGy bestrahlt, während jede der Formulierungen II-V ausschließlich bei 25 kGy bestrahlt wurde. In den zwei rechtsäußersten Spaltenüberschriften von Ta belle 1 steht die Abkürzung CMC für Carboxymethylcellulose und die Abkürzung PEO für Polyethylenoxid. Tabelle 1
    Formulierung Nr. Enzymkonzentration PQQ-GDH-Einheiten Konzentration Mediator I mM Polymerkonzentration CMC% Polymerkonzentration PEO%
    I 20 12 0 0
    II 20 12 0 0
    III 20 12 1 0
    IV 20 12 2 0
    V 20 12 0 2
  • 8 bis 12 zeigen Glukosedosisantwortkurven für jede der fünf Formulierungen sowohl vor als auch nach der Bestrahlung. Die Stabilität der fünf Formulierungen ist hoch, wie die enge Überlappung der vor und nach der Bestrahlung erzeugten Glukoseantwort klar zeigt.
  • Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von Enzymtests, die auf den fünf Formulierungen sowohl vor als auch nach der Bestrahlung durchgeführt wurden. Enzymaktivität nach erfolgter Bestrahlung bleibt in allen Fällen hoch. Tabelle 2
    Formulierung Nr. kGy-Pegel Enzymaktivität
    I 0 4,67
    25 4,32
    50 4,20
    100 4,24
    II 0 3,31
    25 3,34
    III 0 4,93
    25 4,87
    IV 0 4,96
    25 4,86
    V 0 3,63
    25 4,05
  • Die vorangegangene detaillierte Beschreibung und die Beispiele wurden zu Erklärungs- und Veranschaulichungszwecken bereitgestellt und dienen nicht der Beschränkung des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche.

Claims (9)

  1. Reagens zum Nachweis eines Analyts, umfassend: ein aus der aus einem Flavoprotein, einem Chinoprotein und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewähltes Enzym; und einen Mediator, der aus
    Figure 00190001
    und Kombinationen davon ausgewählt ist, worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Zyklo, Heterozyklo, Halogen, Halogenalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, aromatischem Keto, aliphatischem Keto, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Dialkylamino, Aminoalkyl, Sulfo, Dihydroxybor und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt sein können.
  2. Reagens nach Anspruch 1, worin der Mediator aus der aus 3-(4'-Chlorphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Diethylaminophenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Ethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Trifluormethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Methoxycarbonylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Nitrophenylimino)-3H-phe nothiazin, 3-(4'-Methoxyphenylimino)-3H-phenothiazin, 7-Acetyl-3-(4'-methoxycarbonylphenylimino)-3H-phenothiazin, 7-Trifluormethyl-3-(4'-methoxycarbonylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-ω-Carboxy-n-butylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Aminomethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-(2''-(5''-(p-Aminophenyl)-1,3,4-oxadiazoyl)phenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-β-Aminoethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 6-(4'-Ethylphenyl)amino-3-(4'-ethylphenylimino)-3H-phenothiazin, 6-(4'-[2-(2-Ethanoloxy)ethoxy]ethoxyphenyl)amino-3-(4'-[2-(2-ethanoloxy)ethoxy]ethoxyphenylimino-3H-phenothiazin, 3-(4'-[2-(2-Ethanoloxy)ethoxy]ethoxyphenylimino-3H-phenothiazin, 3-(4'-Phenylimino)-3H-phenothiazinboronsäure, 3-(3',5'-Dicarboxyphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(4'-Carboxyphenylimino)-3H-phenothiazin, 3-(3',5'-Dicarboxyphenylimino)-3H-phenoxazin, 3-(3',5'-Phenylimino)-3H-phenothiazindisulfonsäu re, 3-(3-Phenylimino)-3H-phenothiazinsulfonsäure und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  3. Reagens nach Anspruch 1, worin der Mediator
    Figure 00200001
    umfasst.
  4. Reagens nach Anspruch 1, worin der Mediator
    Figure 00200002
    umfasst.
  5. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Flavoprotein aus der aus FAD-Glukoseoxidase, Flavinhexoseoxidase, FAD-Glukosedehydrogenase, [FAD]-Lactatoxidase, [FAD]-Cholesterinoxidase, [FAD]-Alkoholoxidase, [FAD]-d-Ami nosäureoxidase, [FAD]-Cholinoxidase und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  6. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Chinoprotein aus der aus PQQ-Membran-gebundener Glukosedehydrogenase, PQQ-löslicher Glukosedehydrogenase, [PQQ]-Lactatdehydrogenase, [PQQ]-Aldehyddehydrogenase, [PQQ]-Methylamindehydrogenase, [PQQ]-Alkoholdehydrogenase und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  7. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Enzym aus der aus FAD-Glukoseoxidase, PQQ-Glukosedehydrogenase und einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  8. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ferner ein aus der aus Carboxymethylcellulose, Polyethylenoxid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewähltes Polymer umfasst.
  9. Reagens zum Nachweis von Glukose, umfassend: PQQ-Glukosedehydrogenase in einer Aktivität von etwa 20 Einheiten/μl; einen Puffer mit einer Konzentration zwischen etwa 0,1 mM und etwa 100 mM und einem pH zwischen etwa 4,5 und etwa 9,5; und einen Mediator mit nachstehender Struktur
    Figure 00210001
    worin der Mediator eine Konzentration im Puffer zwischen etwa 0,1 mM und etwa 30 mM aufweist.
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