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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft allgemein Mikrofluidvorrichtungen und insbesondere
Vorrichtungen zur Analyse von biologischen Proben, wie Blut, Urin
usw. Diese Mikrofluidvorrichtungen bringen kleine Mengen einer flüssigen Probe
in Kontakt mit Reagenzien, um ein qualitatives oder quantitatives
Maß des
Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyten von Interesse
bereitzustellen. Üblicherweise
wird eine abgemessene Menge der Probe durch eine oder mehrere Kammern
geführt,
die Reagenzien oder Konditionierungsmittel enthalten, die dazu dienen, die
für das
Inkontaktbringen mit den Reagenzien vorgesehene Probe vorzubereiten.
Die Menge der Probe ist normalerweise kleiner als 10 μl, und die
Kammern sind von ähnlicher
Größe. Sie
sind über
Kapillarverbindungswege miteinander verbunden, durch die sich die
Probe mittels Kapillarkräften
oder einer angewandten Kraft, wie etwa einer Zentrifugalkraft, bewegt.
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In
vielen Fällen
ist es notwendig, die Probe mit einer Konditionierungsflüssigkeit
in Kontakt zu bringen, um die Probe zu verdünnen oder die Probe in sonstiger
Form für
eine nachfolgende Reaktion vorzubereiten. Beispielsweise ist es
in Assays oft erforderlich, eine Probe in Kontakt zu bringen, um
Interferenzen zu minimieren, Reaktionsbedingungen, wie pH-Wert,
Co-Faktoren oder Innenstärke,
zu kontrollieren, Komplexe zu bilden, wie Multi-Dentat-Liganden,
Proteine, wie Antikörper-Antigen-Komplexe,
Nukleinsäuren,
Polykohlenhydrate, Lipide oder Metalle, zur Lyse von Zellen, z.
B. Bakterien, roten Blutkörperchen
oder weißen
Blutkörperchen,
und um Analyten und Metabolite in nachweisbarer Form zur Reaktion zu
bringen. Das Mischen der Probe mit einer Konditionierungsflüssigkeit
bereitet wegen der kleinen Größe der Mikrofluidvorrichtung
Probleme. Die Bewegung kleiner Flüssigkeitsmengen durch enge
Verbindungswege mithilfe von Kapillarkräften umfasst die Interaktion
der Flüssigkeit
mit den Wänden
der Verbindungswege. Wenn die Flüssigkeit
wasserhaltig ist, was für
biologische Proben typisch ist, und die Wände der Verbindungswege hydrophil
und schmal sind, beispielsweise 200 bis 200 μm breit und 1 bis 200 μm tief, erzeugt
die Oberflächenenergie
der Flüssigkeit eine
Kraft, die die Flüssigkeit
durch den Verbindungsweg bewegen kann. Aufgrund des großen Verhältnisses
von Oberfläche
zu Volumen ist die Oberflächenwirkung
auf die Flüssigkeit
groß.
Die Reynolds-Zahl, eine dimensionslose Kennzahl, die die Flüssigkeitsströmung kennzeichnet,
ist sehr klein, was darauf hinweist, dass die Flüssigkeitsströmung laminar
und nicht turbulent ist. Die laminare Strömung ist ohne Wirbelbildung,
wobei sich die Geschwindigkeit mit dem Abstand zur Wandung erhöht.
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Das
Mischen einer Probe mit Konditionierungsflüssigkeiten ist schwierig, wenn
laminare Strömung
vorherrscht. Mischen erfolgt üblicherweise durch
Erzeugen von Turbulenzen. Nach dem bisherigen Stand der Mikrofluidtechnik
werden Flüssigkeiten
in laminaren Strömungen
in engen Kontakt gebracht, wobei man sich auf die Diffusion von
Molekülen
aus einer Schicht der Flüssigkeit
in die andere verlässt,
um eine Mischung der Flüssigkeiten
zu erhalten. In aktiven Mikromischern, die mit Makrotechniken arbeiten,
z. B. mechanischem Rühren,
kann die Einbeziehung aktiver Elemente sehr komplexe und kostspielige
Vorrichtungen erfordern.
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Im
US-Patent 6,136,272 beschreiben
Weigl et al. eine Vorrichtung, die zwei oder mehr flache Laminarschichten
erzeugt, um die Diffusion von Molekülen aus einer Schicht in eine
benachbarte Schicht zu ermöglichen.
Die Patentinhaber behaupten, dass ihre Vorrichtung so entwickelt
wurde, dass die Reynolds-Zahl kleiner als 1 und vorzugsweise kleiner
als 0,1 ist. Sie beobachteten, dass dann, wenn die Reynolds-Zahl
größer als
1 ist, die Strömung
laminar sein kann, aber dass derartige Systeme gegen Turbulenzbildung
anfällig
sind, wenn das Strömungsmuster
gestört
wird. Das System der Patentinhaber wurde daher entwickelt, um laminare
Strömung
mit Diffusionsmischen zu gewährleisten.
In einer weiteren veröffentlichten US-Patentanmeldung
2002/0076300 (Weigl et al.) wird die Bildung einer verbesserten
Diffusion zwischen parallelen Strömen in laminarer Strömung beschrieben.
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Die
veröffentlichte
US-Patentanmeldung 2002/0097532 beschreibt eine Scheibe, die viele
Kanäle
enthält.
Es wurden zwei Flüssigkeiten
durch einen Zick-Zack-Kanal in laminarer Strömung geführt, während die Scheibe gedreht wurde,
wobei die Mischung laut Beschreibung durch Diffusion erfolgte.
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In
der veröffentlichten
US-Patentanmeldung 2001/0042712 wird ein T-Sensor gezeigt. Der Sensor berührt eine
flüssige
Probe mit einer Indikatorflüssigkeit,
wobei die Ströme
in paralleler laminarer Strömung
fließen
und wobei zwischen den Strömen
Diffusion auftritt.
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Die
veröffentlichte
US-Patentanmeldung 2001/0048637 beschreibt eine ähnliche Vorrichtung, die das
Problem des "Schmetterlingseffekts" löst, der dadurch
entsteht, dass die Diffusion an den Wänden stärker ist als in der Mitte der
parallelen, laminaren Strömung.
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Die
veröffentlichte
US-Patentanmeldung 2002/0076350 veranschaulicht ein weiteres Verfahren
zur Verbesserung der Diffusion zwischen laminaren Strömungen.
Parallele, laminare Strömungen wurden
durch 90°-Kehren
geführt,
um das Seitenverhältnis
der Ströme
zu ändern,
wodurch sich die Diffusion zwischen den Strömen verbesserte.
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Mikromischer
werden in den
US-Patenten 6,190,034
B1 und
6,241,379
B1 beschrieben. Flüssigkeiten
werden durch Erzeugen dünner
Schichten gemischt, um das Mischen durch Diffusion zu ermöglichen.
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Die
vorstehend erörterten
Patente und Patentanmeldungen betreffen das Durchtreten eines Reagenzstroms
in Nachbarschaft zu einem Probenstrom, so dass durch Diffusion eine
Reaktion eintritt, die dann gemessen wird. In anderen Patenten und Patentanmeldungen
wird das Mischen mithilfe verschiedener Mittel versucht, ungeachtet
der Tatsache, dass sich die Flüssigkeiten
in laminarer Strömung
befinden.
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Die
veröffentlichte
US-Patentanmeldung 2001/0048900 beschreibt das Mischen separater Ströme, indem
eine Verwirbelung in einer Kammer erzeugt wird. Die Erfinder geben
an, dass in einigen Ausführungsformen
eine Reynolds-Zahl von 320 erzielt wird und dass die erste und zweite
Flüssigkeit Reynolds-Zahlen
zwischen 1 und 2000 aufweisen. Die Strömung liegt somit in einem Bereich
zwischen laminarer Strömung
und turbulenter Strömung.
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Das
US-Patent 5,921,678 beschreibt
einen Flüssigkeitsmischer,
in dem zwei Ströme
einer Flüssigkeit
frontal aufeinander treffen und gemeinsam in einem Kanal in 90° zu den Eintrittskanälen austreten. Die
Reynolds-Zahl der Ströme
wird mit 2000–6000 angegeben.
Es werden scharfkantige Pfeiler gezeigt, die das Erzeugen einer
Turbulenz am Schnittpunkt der Mischungsströme unterstützen sollen.
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In
der veröffentlichten
US-Patentanmeldung 2002/0048535 ist eine Vorrichtung dargestellt,
in der zwei Flüssigkeiten
während
der Drehung der Vorrichtung vereinigt werden, um die Flüssigkeiten
aus einem Behälter
in einen anderen zu übertragen.
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Das
US-Patent 6,264,900 beschreibt
das Mischen paralleler, laminarer Strömungen zur Durchführung schneller
chemischer Reaktionen.
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Das
US-Patent 6,065,864 beschreibt
ein Mikro-Mischsystem mit blasengesteuerten Pumpen und Ventilen
zur Erzeugung einer zirkulierenden Strömung in einer Mischkammer.
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Die
veröffentlichte
US-Patentanmeldung 2003/0133358 A1 beschreibt einen Mehrstrom-Mikrofluidaperturmischer.
In einer Ausführungsform enthalten
diese Vorrichtungen Mikrofluidkanäle, die in verschiedenen Schichten
einer dreidimensionalen Struktur ausgebildet sind. Das Mischen ist
durch verschiedene Manipulationen der Flüssigkeitsströmungsbahn
und/oder der Kontakte zwischen Flüssigkeitsströmen erzielbar.
In verschiedenen Ausführungsformen
sind in einer Mischvorrichtung Strukturen vorsehbar, wie Kanalüberlagerungen,
Rutschen, konvergierende oder divergierende Bereiche, Kehren und/oder
Aperturen. Eine Mikrofluidvorrichtung zum Mischen mehrerer Flüssigkeitsströme kann
mehrere Einlasskanäle
beinhalten, die in einen Übergangskanal
zusammenlaufen, und mehrere Kontraktions-/Expansionsbereiche, die in Fließbeziehung
mit dem Übergangskanal
stehen. Jeder Kontraktions-/Expansionsbereich beinhaltet eine kleine
Apertur oder Öffnung.
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Walter
et al. beschreiben in Fluiddynamische Aspekte in Mikrostrukturreaktoren,
Chemie Ingenieur Technik, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 1999, Band
71, Nr. 5 (447-455) einen Mikrokanalreaktor mit bis zu einhundert
Mikrokanälen.
Die Fluiddynamik in Vorrichtungen mit 20 oder 30 Mikrokanälen wird
untersucht.
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US-A-2003/0044322 beschreibt
ein Verfahren und eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff der Ansprüche 1 und
21.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine effektive
Mischung von flüssigen
Reagenzien oder Konditionierungsflüssigkeiten mit Probenflüssigkeiten
in Mikrofluidvorrichtungen bereitzustellen. Ein derartiges Mischen
wird aufgrund des Missverhältnisses
zwischen der Viskosität
und dem Volumen der zu mischenden Flüssigkeiten erschwert. Die Lösung dieser
Aufgabe wird nachfolgend detailliert beschrieben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Flüssigkeiten
werden in einer Mikrofluidvorrichtung nach Anspruch 21 mithilfe
eines Verfahrens nach Anspruch 1 derart gemischt, dass mindestens zwei
Flüssigkeiten
in eine erste Kammer gegeben werden, um die Flüssigkeiten zu vereinigen. In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Flüssigkeiten
in die erste Kammer aus Behältern
gegeben, die diese Flüssigkeiten
enthalten. In einem zweiten Schritt werden die vereinigten Flüssigkeiten
aus der ersten Kammer durch mindestens einen Kapillarverbindungsweg
in eine zweite Kammer entleert, um die Flüssigkeiten zu mischen. In einigen
Ausführungsformen
werden zwei oder mehr parallele Kapillarverbindungswege verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform
steht die zweite Kammer über
mindestens einen Kapillarverbindungsweg mit mindestens einer dritten
Mischkammer in Fließbeziehung.
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Das
Mischen von Flüssigkeiten
erfolgt, wenn die Flüssigkeiten
in Kammern ein- und austreten, die, bezogen auf die engen Kanäle, durch
die sie ein- und austreten, relativ groß sind. Die Störung in
dem Strömungsmuster
der Flüssigkeiten
wird dafür
verantwortlich gemacht, dass das zu beobachtende Mischen erfolgt.
In einigen Fällen
wurde beobachtet, dass sich Tröpfchen
bilden, wenn die Flüssigkeiten aus
einem kapillaren Verbindungsweg in eine große Kammer austreten. Derartige
Tröpfchen
können
zum Mischvorgang beitragen, wenn sie in der Kammer koaleszieren.
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Der
Mischvorgang wird abgeschlossen, indem die Flüssigkeiten in der ersten Kammer
durch einen oder mehrere Kapillarverbindungswege in die zweite Kammer
gedrückt
werden. In Mikrofluidvorrichtungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
arbeiten, haben die Kapillarverbindungswege Querschnitte zwischen
1 und 2000 μm,
vorzugsweise zwischen 200 und 1000 μm oder wie aufgrund der Eigenschaften
der Flüssigkeiten
erforderlich. Die Länge
der Kapillaren zwischen den beiden Kammern beträgt zwischen 0,5 und 100 mm,
vorzugsweise zwischen 1 und 50 mm. Die Querschnittsform der Kapillarverbindungswege
gilt als nicht kritisch. Die Verbindungswege haben üblicherweise
einen rechtwinkligen Querschnitt, wobei die Form allerdings von
dem Verfahren abhängt,
das zur Ausbildung der Verbindungswege verwendet wird. Die Abmessungen
in einer typischen Konstruktion werden derart gewählt, dass
in den Verbindungswegen unter Berücksichtigung der Viskosität der Flüssigkeit
und der angewandten Kraft eine Flüssigkeitsgeschwindigkeit von 1
mm/s oder mehr erzielt wird.
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Jede
der beiden Kammern ist größer als
das Gesamtvolumen der gemischten Flüssigkeiten. Vorzugsweise ist
das Volumen jeder Kammer doppelt so groß wie das Volumen der vereinigten
Flüssigkeiten oder
größer. Die
Tiefe jeder Kammer reicht aus, um einen Freiraum über den
Flüssigkeiten
bereitzustellen, nachdem diese in die Kammer eingetreten sind. Vorzugsweise
ist der Raum über
der Flüssigkeit
ausreichend groß,
damit sich die in die Kammer eintretende Flüssigkeit in Tröpfchen von
z. B. ca. 100 μm oder
größer aufzuteilen
vermag. Noch bevorzugter ist die Tiefe der Kammer doppelt so groß wie notwendig
wäre, um
das Volumen der zu mischenden vereinigten Flüssigkeiten aufzunehmen. Die
Kapillarverbindungswege sind vorzugsweise in dem freien Raum über der
Flüssigkeit
in den Kammern angeordnet.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Es
zeigen
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1 das erfindungsgemäße Mischen von zwei Flüssigkeiten.
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2 eine alternative Ausführungsform
der Erfindung.
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3 eine
Mikrofluidvorrichtung.
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Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Strömung
in Mikrokanälen
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Die
die Erfindung nutzenden Mikrofluidvorrichtungen verwenden üblicherweise
Kanäle
mit Querschnittmaßen
im Bereich von ca. 1 bis 2000 μm, vorzugsweise
von ca. 200–1000 μm. Wenn die
Kanäle
einen Querschnitt aufweisen, der im Allgemeinen rechteckig ist,
kann sich das Maß auf
die Diagonale des Rechtecks beziehen. Das Mindestmaß für solche Kanäle liegt
für viele
praktische Anwendungen vermutlich bei ca. 5 μm, da kleinere Kanäle Komponenten
in der zu analysierenden Probe effektiv ausfiltern können. Sofern
keine Probleme auftreten, sind auch kleinere Maße verwendbar. Kanäle in dem
bevorzugten Bereich ermöglichen
es, flüssige
Proben alleine durch Kapillarkräfte
zu bewegen. Auch ist es möglich, die
Bewegung durch Kapillarwände
zu stoppen, die derart behandelt wurden, dass sie im Verhältnis zu der
Probenflüssigkeit
hydrophob geworden sind, oder durch merkliche Änderungen in den Kanalabmessungen.
Der Widerstand gegenüber
der Strömung
kann durch Anwenden einer Druckdifferenz überwunden werden, beispielsweise
durch Pumpen, Vakuum, Elektroosmose, Erwärmen, Absorptionsmaterialien,
zusätzliche
Kapillarwirkung oder Zentrifugalkraft. Demnach können Flüssigkeiten dosiert und aus
einem Bereich der Vorrichtung in einen anderen Bereich bewegt werden,
so wie dies für
die in der Mikrofluidvorrichtung durchgeführte Analyse erforderlich ist.
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Es
ist ein mathematisches Modell verwendbar, um die Druckdifferenz
(z. B. Zentrifugalkraft), die physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit,
die Oberflächenspannung
der Flüssigkeit,
die Oberflächenenergie
der Kapillarwände,
die Kapillargröße und die
Oberflächenenergie
der Teilchen, die in den zu analysierenden Flüssigkeiten enthalten sind,
ins Verhältnis
zu setzen. Es ist möglich,
die Strömungsgeschwindigkeit
einer Flüssigkeit
durch die Kapillarwirkung und den gewünschten Grad an Hydrophobie oder
Hydrophilie vorherzusagen. Aus der Beziehung dieser Faktoren zueinander
lassen sich die nachfolgenden Grundsätze ableiten.
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Für einen
gegebenen Verbindungsweg kann die Interaktion einer Flüssigkeit
mit der Oberfläche des
Verbindungswegs ggf. eine deutliche Wirkung auf die Bewegung der
Flüssigkeit
haben. Wenn das Verhältnis
der Oberfläche
zum Volumen des Verbindungswegs groß ist, d. h. wenn die Querschnittsfläche klein
ist, werden die Interaktionen zwischen der Flüssigkeit und den Wänden des
Verbindungswegs sehr ausgeprägt.
Dies ist insbesondere der Fall, wenn man es mit Verbindungswegen
zu tun hat, deren Nenndurchmesser kleiner als ca. 200 μm ist, wenn
Kapillarkräfte,
die sich auf die Oberflächenenergien
der Flüssigkeitsprobe
und der Wände
beziehen, vorherrschen. Wenn die Wände von der Flüssigkeit
benetzt sind, bewegt sich die Flüssigkeit
ohne Anwendung äußerer Kräfte durch
den Verbindungsweg. Wenn die Wände
von der Flüssigkeit
nicht benetzt sind, versucht die Flüssigkeit dagegen, sich aus dem
Verbindungsweg zurückzuziehen.
Diese allgemeinen Tendenzen sind nutzbar, um zu bewirken, dass sich
eine Flüssigkeit
durch einen Verbindungsweg bewegt, oder um die Bewegung an dem Übergang
zu einem anderen Verbindungsweg, der eine andere Querschnittsfläche aufweist,
zu stoppen. Wenn sich die Flüssigkeit
im Ruhezustand befindet, kann sie mithilfe einer Druckdifferenz
bewegt werden, beispielsweise durch Anwendung einer Zentrifugalkraft.
Andere Mittel sind ebenfalls verwendbar, u. a. Druckluft, Vakuum,
Elektroosmose, Erwärmung, Absorptionsmaterialien,
zusätzliche
Kapillarwirkung usw., welche in der Lage sind, die zusätzlich benötigte Druckdifferenz
an dem Übergang
zwischen Verbindungswegen mit unterschiedlichen Querschnittsflächen oder
Oberflächenenergien
anzuwenden. In der vorliegenden Erfindung stehen hohe Kapillarkräfte zur
Verfügung,
wodurch es möglich
ist, Flüssigkeiten ausschließlich durch
Kapillarkräfte
zu bewegen, ohne dass externe Kräfte
erforderlich sind, ausgenommen für
kurze Perioden, wenn ein Kapillarstopp überwunden werden muss. Allerdings
sind die kleineren Verbindungswege wahrscheinlich gegenüber einer
Behinderung aufgrund von Teilchen in den biologischen Proben oder
den Reagenzien inhärent
stärker
anfällig.
Daher wird die Oberflächenenergie
der Verbindungswegwände
nach Bedarf zur Verwendung mit der zu prüfenden Probenflüssigkeit
abgestimmt, z. B. Blut, Urin usw. Dieses Merkmal ermöglicht die Anfertigung
flexiblerer Entwürfe
von Analysenvorrichtungen.
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Mikrofluid-Analysenvorrichtungen
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Die
erfindungsgemäßen Analysenvorrichtungen
können
als „Chips" bezeichnet werden.
Sie sind im Allgemeinen klein und flach, üblicherweise ca. 1 bis 2 Zoll
im Quadrat (25 bis 50 mm im Quadrat), oder scheibenförmig mit
einem Radius von ca. 40 bis 80 mm. Das Volumen der Proben ist klein.
Beispielsweise enthalten sie lediglich 0,1 bis 10 μl für jedes
Assay, obwohl das Gesamtvolumen eines Musters zwischen 10 und 200 μl betragen
kann. Die Kammern, die die Probenflüssigkeiten und Reagenzien enthalten,
sind üblicherweise
relativ breit und flach, damit die Proben leicht zu erkennen sind,
und damit Änderungen,
die auf die Reaktion der Proben zurückzuführen sind, durch geeignete
Geräte
gemessen werden können. Die
verbindenden Kapillarverbindungswege haben üblicherweise einen Querschnitt
im Bereich von 1 bis 2000 μm,
vorzugsweise von 200 bis 500 μm.
Die Form wird anhand des Verfahrens bestimmt, das zur Ausbildung
der Verbindungswege verwendet wird, wobei allerdings Verbindungswege
mit rechteckigen Querschnitten bevorzugt werden. Die Tiefe der Verbindungswege
beträgt
in vielen praktischen Anwendungen, bei denen Proben Teilchen enthalten,
mindestens 5 μm,
kann jedoch kleiner sein, wenn es die Art der Probe zulässt.
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Zwar
gibt es mehrere Möglichkeiten,
nach denen Kapillarverbindungswege und Kammern ausgebildet werden
können,
beispielsweise Spritzgießen,
Laserablation, Diamantfräsen
oder Stanzen, aber das bevorzugte Verfahren ist das Spritzgießen, um
die Kosten der Chips zu reduzieren. Im Allgemeinen enthält ein Unterteil
des Chips das gewünschte Netz
aus Kammern und Kapillarverbindungswegen. Nachdem Reagenzverbindungen
wie gewünscht
in den Kammern angeordnet worden sind, wird ein Oberteil über dem
Unterteil befestigt, um den Chip zu vervollständigen.
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Die
Chips sind im Allgemeinen dazu vorgesehen, nach einmaligem Gebrauch
entsorgt zu werden. Demnach werden sie – soweit möglich – aus preisgünstigen
Materialien hergestellt, wobei sie aber mit den Reagenzien und den
Proben, die es zu analysieren gilt, verträglich sein müssen. In
den meisten Fällen
werden die Chips aus Kunststoffen hergestellt, wie Polycarbonat,
Polystyrol, Polyacrylaten oder Polyurethanen, und können alternativ
aus Silicaten, Glas, Wachs oder Metall hergestellt werden.
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Die
Kapillarverbindungswege werden so abgestimmt, dass sie entweder
hydrophob oder hydrophil sind, wobei die Eigenschaften hinsichtlich
des Kontaktwinkels definiert werden, der von einer flüssigen Probe
oder einem Reagenz an einer Festkörperoberfläche gebildet wird. Üblicherweise
gilt eine Oberfläche
als hydrophil, wenn der Kontaktwinkel von Wasser an der Oberfläche kleiner
als 90° ist,
und als hydrophob, wenn der Kontaktwinkel größer als 90° ist. Vorzugsweise wird die
Oberflächenenergie durch
plasmainduzierte Polymerisation an der Oberfläche der Verbindungswege angepasst.
Die erfindungsgemäßen Analysenvorrichtungen
sind zudem mit anderen zur Steuerung der Oberflächenenergie der Kapillarwände verwendeten
Verfahren herstellbar, wie etwa durch Beschichten mit hydrophilen
oder hydrophoben Materialien, Pfropfen oder Coronabehandlungen.
Die Oberflächenenergie
der Kapillarwände
kann zur Verwendung mit der vorgesehenen Probenflüssigkeit
abgestimmt werden, um beispielsweise Ablagerungen an den Wänden eines
hydrophoben Verbindungsweges zu vermeiden oder um zu gewährleisten,
dass kein Rest der Flüssigkeit
in einem Verbindungsweg verbleibt. Für die meisten Verbindungswege
in den erfindungsgemäßen Mikrofluidvorrichtungen
ist die Oberfläche
im Allgemeinen hydrophil, da die Flüssigkeit dazu tendiert, die
Oberfläche
zu benetzen, und da die Oberflächenspannungskräfte die
Flüssigkeit
dazu bringen, in den Verbindungsweg zu strömen. Die Oberflächenenergie
der Kapillarverbindungswege ist beispielsweise so abgestimmt, dass
der Kontaktwinkel von Wasser an der Oberfläche zwischen 10° und 60° beträgt, wenn
der Verbindungsweg dazu vorgesehen ist, Vollblut zu berühren, oder
dass der Kontaktwinkel von Wasser an der Oberfläche 25° bis 80° beträgt, wenn der Verbindungsweg
dazu vorgesehen ist, Urin zu berühren.
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Die
Bewegung von Flüssigkeiten
durch die Kapillarverbindungswege kann durch Kapillarstopps unterbunden
werden, die – wie
der Name besagt – verhindern,
dass Flüssigkeiten
durch die Kapillarverbindungswege strömen. Wenn der Kapillarverbindungsweg
hydrophil ist und die Flüssigkeitsströmung fördert, ist
ein hydrophober Kapillarstopp verwendbar, d. h. ein kleinerer Verbindungsweg
mit hydrophoben Wänden.
Die Flüssigkeit
vermag nicht durch den hydrophoben Kapillarstopp hindurchzutreten,
weil die Kombination aus der kleinen Größe und der nicht benetzbaren
Wände eine
Oberflächenspannungskraft aufbaut,
die dem Eintritt der Flüssigkeit
entgegensteht. Alternativ dazu gilt, dass bei einem hydrophoben
Kapillarverbindungsweg kein Kapillarstopp zwischen einer Kammer
und dem Kapillarverbindungsweg erforderlich ist. Die Flüssigkeit
in der Kammer wird an dem Eintreten in den Kapillarverbindungsweg gehindert,
bis eine ausreichende Kraft anliegt, etwa durch Zentrifugalkraft,
die bewirkt, dass die Flüssigkeit
die entgegenwirkende Oberflächenspannungskraft überwindet
und durch den hydrophoben Kapillarverbindungsweg tritt. Die Zentrifugalkraft
wird allerdings nur benötigt,
um die Flüssigkeitsströmung zu veranlassen.
Sobald die Wände
des hydrophoben Verbindungswegs vollständigen Kontakt mit der Flüssigkeit
haben, reduziert sich die entgegenwirkende Kraft, weil das Vorhandensein
der Flüssigkeit
die der hydrophoben Oberfläche
zugeordneten Energiebarriere herabsetzt. Um zu strömen, bedarf
die Flüssigkeit daher
keiner Zentrifugalkraft mehr. Ohne notwendig zu sein, kann es in
einigen Fällen
sinnvoll sein, die Zentrifugalkraft weiter anzuwenden, während die Flüssigkeit
durch die Kapillarverbindungswege strömt, um eine schnelle Analyse
zu ermöglichen.
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Wenn
ein hydrophober Kapillarstopp in einem hydrophilen Kapillarverbindungsweg
angeordnet ist, muss ein Druckdifferenzial angewandt werden, um
die Wirkung des hydrophoben Kapillarstopps zu überwinden. Im Allgemeinen ist
die erforderliche Druckdifferenz eine Funktion der Oberflächenspannung
der Flüssigkeit,
des Cosinus ihres Kontaktwinkels mit dem hydrophilen Kapillarverbindungsweg
und der Änderung
der Kapillarverbindungswegmaße.
Eine Flüssigkeit,
die eine große Oberflächenspannung
aufweist, benötigt
demnach weniger Kraft, um den hydrophoben Kapillarstopp zu überwinden,
als eine Flüssigkeit
mit einer kleineren Oberflächenspannung.
Eine Flüssigkeit,
die die Wände
des hydrophilen Kapillarverbindungswegs benetzt, d. h. die einen
kleinen Kontaktwinkel hat, bedarf einer größeren Kraft, um den hydrophoben
Kapillarstopp zu überwinden,
als eine Flüssigkeit,
die einen größeren Kontaktwinkel
hat. Je kleiner der hydrophobe Kanal ist, umso größer muss
die angewandte Kraft sein.
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Wenn
die Kapillarverbindungswege hydrophil sind, strömt eine Probenflüssigkeit
(die wasserhaltig sei) auf natürliche
Weise durch die Kapillarverbindungswege, ohne dass es einer zusätzlichen
Kraft bedarf. Wenn ein Kapillarstopp benötigt wird, besteht eine Alternative
darin, einen schmaleren hydrophoben Abschnitt zu verwenden, der
als ein Kapillarstopp – wie
zuvor beschrieben – dienen
kann. Ein hydrophiler Kapillarstopp ist ebenfalls verwendbar, auch
wenn der Kapillarverbindungsweg hydrophil ist. Ein derartiger Kapillarstopp
ist breiter und tiefer als der Kapillarverbindungsweg und bildet
einen „Kapillarsprung", wodurch die Oberflächenspannung
der Flüssigkeit
eine kleinere Kraft zur Unterstützung
der Flüssigkeitsströmung erzeugt.
Wenn die Änderung der
Abmessungen zwischen dem Kapillarverbindungsweg und dem breiteren
Kapillarstopp ausreichend ist, stoppt die Flüssigkeit am Eingang zu dem Kapillarstopp.
Es wurde festgestellt, dass die Flüssigkeit schließlich entlang
den hydrophilen Wänden
des Kapillarstopps kriecht, aber durch entsprechende Konstruktion
der Form kann diese Bewegung ausreichend verzögert werden, so dass dieser
Kapillarstopp auch dann effektiv ist, wenn die Wände hydrophil sind.
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Um
Chips zu entwerfen, in denen Zentrifugalkraft angewandt wird, um
hydrophile oder hydrophobe Kapillarstopps zu überwinden, sind empirische
Tests oder computergestützte
Strömungssimulationen
verwendbar, um aufschlussreiche Informationen zu erhalten, die es
ermöglichen,
die Position der flüssigkeitshaltigen
Kammern auf Chips anzuordnen und die verbindenden Kapillarkanäle so zu
bemessen, dass eine flüssige
Probe wie gewünscht
bewegt werden kann, indem die notwendige Kraft durch Abstimmen der
Drehzahl bereitgestellt wird.
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Mikrofluidvorrichtungen
können
so viele Formen annehmen, wie für
die Analysenverfahren notwendig sind, mit denen der Analyt von Interesse
gemessen wird. Die Mikrofluidvorrichtungen verwenden typischerweise
ein System aus Kapillarverbindungswegen, die Kammern miteinander
verbinden, die trockene oder flüssige
Reagenzien oder Konditionierungsmaterialien enthalten. Analysenverfahren
können
die Herstellung einer dosierten Probe durch Verdünnen der Probe, Vorreagieren
des Analyten zu dessen Bereitstellung für nachfolgende Reaktionen, Entfernen
von Interferenzkomponenten, Mischen von Reagenzien, Lysieren von
Zellen, Erfassen von Biomolekülen,
Ausführen
von enzymatischen Reaktionen oder Inkubieren für Bindungsereignisse, Färben oder
Abscheiden enthalten. Diese Vorbereitungsschritte können vor
dem Dosieren oder während
des Dosierens der Probe oder nach dem Dosieren erfolgen, aber vor
Ausführen
von Reaktionen, die ein Maß des
Analyten bereitstellen.
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In
derartigen Analysenverfahren wird eine Probe mit einer Konditionierungsflüssigkeit
oder mit einer Reagenzflüssigkeit
vereinigt und dann in eine Mischkammer übergeben, bevor sie zur weiteren Verarbeitung übertragen
wird. Es liegt auf der Hand, dass ein gründliches Mischen der Probe
mit dem Reagenz oder der Konditionierungsflüssigkeit wichtig ist, um genaue
und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Bekanntermaßen ist
die Strömung
in Mikrofluidvorrichtungen üblicherweise
laminar, d. h. die Viskosität
der Flüssigkeit
hat eine größere Wirkung als
das Beharrungsvermögen
der strömenden
Flüssigkeit,
so dass die Flüssigkeit
linear und ohne Turbulenzen strömt.
Eine Folge laminarer Strömungsbedingungen
ist, dass das Mischen von zwei oder mehreren Flüssigkeiten langsam erfolgt,
da dies grundsätzlich
die Folge einer molekularen Diffusion ist. Wie zuvor besprochen,
wurden einige Mikrofluidvorrichtungen derart entworfen, dass sie
die Diffusion zwischen Flüssigkeitsschichten
in laminarer Strömung verbessern.
In vielen dieser Vorrichtungen ist nicht vorgesehen, dass es zu
einer vollständigen
Mischung kommt, während
in anderen vorgesehen ist, dass die Flüssigkeitsströme engen
Kontakt miteinander bilden.
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In
der vorliegenden Erfindung ist ein vollständiges Mischen erwünscht. Es
wurde festgestellt, dass gründliches
Mischen durch entsprechende Konstruktion der Vorrichtung erzielbar
ist, sodass einheitliche Mischungen erzeugt werden, die flüssige Proben
mit flüssigen
Reagenzien oder Konditionierungsmitteln vereinigen, die unterschiedliche
Viskositäten und
Volumina aufweisen.
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Mischen von Flüssigkeiten
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Wenn
genaue Analysenergebnisse erzielt werden sollen, ist das Mischen
von Proben mit größeren Volumina
von flüssigen
Reagenzien oder Konditionierungsmitteln wichtig. Obwohl gründliches
Mischen bei der Kombination von Kammern und Kapillarverbindungswegen
nachgewiesen wurde, die hier beschrieben sind, ist der Prozess,
nach dem das Mischen erfolgt, nicht vollständig geklärt. Nach dem Stand der Technik
gehen die meisten davon aus, dass laminare Strömung ein effizientes Mischen
verhindert, und legen daher den Schwerpunkt auf die Erzeugung dünner Schichten
aus parallel strömender Flüssigkeit,
um Diffusionsmischen zu ermöglichen. Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung gehen davon aus, dass in ihren
Verfahren örtlich
begrenzte Effekte auftreten, die dem Mischen zugute kommen, aber schwierig
zu messen sind. Wenn Flüssigkeiten
durch Kapillarverbindungswege treten, befinden sich diese in laminarer
Strömung;
man würde
daher erwarten, dass ein geringes Mischen auftritt. Während Flüssigkeiten
in Kapillarverbindungswege ein- und austreten, die relativ große Kammern
verbinden, ist es jedoch wahrscheinlich, dass einige örtlich begrenzte Wirbel
oder Turbulenzen auftreten, die entstehen, wenn die Strömungsgeschwindigkeit
der Flüssigkeiten
zu- oder abnimmt und wenn die Flüssigkeit
markante Kanten umströmt.
Während
die Strömung
von Natur aus zwar laminar sein mag, tragen die am Schnittpunkt
der Wände
der Kapillarverbindungswege und Kammern mit der Flüssigkeit
erzeugten Effekte möglicherweise
zum Mischen der Flüssigkeiten bei.
Zudem wirkt zusätzliche
Energie auf die Flüssigkeiten
durch Anwendung von Zentrifugalkraft (oder anderen Kräften) ein,
um zu erwirken, dass die Flüssigkeiten
Kapillarstopps überwinden.
Die Flüssigkeiten
werden beschleunigt und verzögert,
wenn sie sich aus ihren Ausgangspositionen durch Kapillarverbindungswege
in große
Kammern bewegen. Es wurde beobachtet, dass sich häufig Tröpfchen bilden, wenn
die Flüssigkeiten
aus Kapillarverbindungswegen austreten. Die Bildung von Tröpfchen,
die unterschiedliche Flüssigkeiten
miteinander vereinigen, induziert möglicherweise das Mischen der
Flüssigkeiten.
Man geht davon aus, dass das Vereinigen der einzelnen Tröpfchen ein
weiteres Mischen in einem Prozess erzeugt, der analog zur Schichtung
ist. Das heißt,
wenn zwei unverträgliche
Flüssigkeiten
durch aufeinander folgendes Trennen und Schichten vereinigt werden,
werden die Schichten schließlich
so dünn,
dass sie nicht mehr unterscheidbar sind. Wenn Tausende von Tröpfchen vereinigt
werden, ist daher eine Trennung der beiden Flüssigkeiten nicht mehr offensichtlich,
und die Flüssigkeiten
sind effektiv vollständig
gemischt. Man geht zudem davon aus, dass das Mischen zum gewissen
Grad durch molekulare Diffusion erfolgt, wenn sich die Unterteilung
der Flüssigkeiten
fortsetzt und sich die Entfernung, um die die Moleküle sich
bewegen, reduziert. Zwar kann der Mischungsgrad ermittelt werden,
nachdem diese stattgefunden hat, aber der Entwurf der notwendigen
Mikrofluidmerkmale variiert abhängig
von den relativen Volumina der zu mischenden Flüssigkeiten und ihren physischen
Eigenschaften und bedarf ggf. einer Bestätigung durch Versuche.
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Diese
allgemeine Beschreibung des Mischungsprozesses gilt für verschiedene
Flüssigkeiten.
Allerdings verlangen die verwendeten Bedingungen eine Modifikation
je nach Viskosität
und relativen Volumina der zu mischenden Flüssigkeiten. Es liegt auf der
Hand, dass das Mischen einer viskosen Flüssigkeit mit einer, die viel
weniger viskos ist, schwieriger ist, als das Mischen von zwei Flüssigkeiten
mit ähnlich
niedrigen Viskositäten.
Das gleichmäßige Mischen
von zwei viskosen Flüssigkeiten
ist zudem schwierig. Es ist zu erwarten, dass das Vereinigen von
zwei Flüssigkeiten
mit deutlich unterschiedlichen Volumina schwieriger ist als das
Mischen von Flüssigkeiten
mit gleichen Volumina.
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Es
wurde festgestellt, dass bestimmte Parameter verwendbar sind, um
die Bedingungen zu definieren, die erforderlich sind, um ein erfindungsgemäßes Mischen
von Flüssigkeiten
zu erzeugen. Im Allgemeinen werden zwei oder mehr Flüssigkeiten
in einer ersten Kammer vereinigt, die durch mindestens einen verbindenden
Kapillarverbindungsweg in eine zweite Kammer entleert wird, wo die
Flüssigkeiten den
Mischungsprozess abschließen.
Ein derartiger Prozess wird in einem vereinfachten und nachfolgend
erörterten
Diagramm in 1 dargestellt. Die Bewegung
der Flüssigkeiten
erfordert üblicherweise die
Anwendung von Kraft zur Überwindung
des Strömungswiderstands,
wie er der Verwendung kleiner Verbindungswege zueigen ist, und desjenigen,
der sich aus Kapillarstopps ergibt, die hinzugenommen werden, um
ein Strömen
von Flüssigkeiten
zu verhindern. Zu diesem Zweck wird häufig Zentrifugalkraft verwendet,
aber auch andere Verfahren, die die benötigte Kraft erzeugen können, sind
verwendbar, einschließlich
Luftdruck, Vakuum, Elektroosmose, Absorptionsmaterialien, zusätzliche
Kapillarwirkung usw. Die angewandte Kraft ist ausreichend, um eine Strömung der
Flüssigkeit
in den Kapillarverbindungswegen von 1 mm/s oder mehr zu erzeugen.
Diese Verbindungswege haben Querschnitte zwischen 1 μm und 2000 μm, vorzugsweise
zwischen 200 und 1000 μm,
wie durch die physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeiten
bestimmt. Die Verbindungswege weisen eine Länge zwischen 0,5 und 100 mm
auf, vorzugsweise zwischen 1 und 50 mm, je nach Anordnung der Kammern
und Verbindungswege auf dem Chip. Der Unterschied in den Abmessungen
der Kapillarverbindungswege und der zugehörigen Kammern ist so groß, dass
die Bewegung von Flüssigkeiten
aus einer Kammer in eine andere eine Turbulenz in der Strömung erzeugt.
Man geht zudem davon aus, dass die Oberflächenspannung der Flüssigkeiten
für die
Tröpfchen
verantwortlich ist, die sich nach Beobachtung an dem Punkt bilden,
an dem Flüssigkeiten
aus den Kapillarverbindungswegen austreten und zum Mischen in eine
größere Kammer
eintreten. Die Tröpfchen
werden (im üblichen
Fall) durch Zentrifugalkraft zur Außenseite der Aufnahmekammer
gedrängt,
wo sie sich wiedervereinigen.
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Die
Kammern können
unterschiedliche Formen aufweisen, aber üblicherweise sind sie im Allgemeinen
kreisförmig
oder rechteckig. Sie können
interne Merkmale, wie Stufen oder Rampen, aufweisen. Man geht davon
aus, dass solche Merkmale nur eine geringe Wirkung auf das Mischen
der Flüssigkeiten
haben, obwohl sie aus anderen Gründen
vorgesehen werden können.
Es gilt als wichtig, dass ein ausreichender Raum in den Mischkammern
oberhalb der zu mischenden Flüssigkeiten
bereitgestellt wird. Mindestens 100 μm freier Raum gilt in einer üblichen Kammer
als notwendig, die ca. 0,1 bis 50 μl enthält. Vorzugsweise haben die
Kammern ein Volumen, das ca. dem Doppelten des Gesamtvolumens der
zu mischenden Flüssigkeiten
entspricht, und die Tiefe der Kammer beträgt ca. das Doppelte des Flüssigkeitsstandes
in der Kammer. Man geht davon aus, dass größere Kammern und größere Tiefen
das Mischen verbessern, ohne dass dies notwendigerweise optimal
sein muss. Kleinere Kammern und kleinere Tiefen ergeben möglicherweise
zufrieden stellende Ergebnisse, obwohl zu erwarten ist, dass das
Mischen darunter leidet, da oberhalb der Flüssigkeiten weniger Luftraum
vorhanden ist.
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1A u.
B zeigen das erfindungsgemäße Mischen
in Mikrofluidvorrichtungen in vereinfachter Form. Eine Probenflüssigkeit
im Behälter 10 wird
solange im Behälter 10 zurückgehalten, bis
diese durch Anwenden einer Kraft, z. B. einer Zentrifugalkraft,
zur Überwindung
des Kapillarstopps 12 freigesetzt wird. Desgleichen verbleibt
wegen eines Kapillarstopps 16 ein flüssiges Reagenz oder eine Konditionierungsflüssigkeit,
z. B. eine Pufferlösung,
im Behälter 14, bis
die notwendige Kraft angewandt worden ist. Die beiden Flüssigkeiten
strömen
durch Kapillarverbindungswege in die erste Kammer 18. Die
Kammer 18 nimmt die Probe und die zweite Flüssigkeit
gleichzeitig auf, so dass ein vorläufiges Mischen erfolgt, wenn die
Flüssigkeiten
in die Kammer 18 eintreten. In den meisten Fällen ist
das Mischen nicht ausreichend, weshalb ein zweiter Schritt notwendig
ist. Die vereinigten Flüssigkeiten
treten aus der ersten Kammer 18 durch mindestens einen
Kapillarverbindungsweg 20 aus und in die zweite Mischkammer 22 ein.
Die Flüssigkeit
kann kleine Tröpfchen
bilden, wenn sie aus dem Kapillarverbindungsweg 20 austritt
und in die Mischkammer eintritt, wodurch die Flüssigkeiten in den Tröpfchen während ihrer
Bildung gemischt werden. Ein weiteres Mischen erfolgt, wenn sich
die Tröpfchen
am Boden der Mischkammer 22 wiedervereinigen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
aus 1 werden drei Kapillarverbindungswege
verwendet, z. B. 20, 20a und 20b, um
die erste Kammer 18 mit der zweiten Mischkammer 22 zu
verbinden. Es sind auch mehr als drei Kapillarverbindungswege verwendbar,
wie in Beispiel 1 nachstehend gezeigt. Vorzugsweise haben die Kapillarverbindungswege nicht
denselben Durchmesser, so dass die Geschwindigkeit in den Kapillarverbindungswegen
variiert, wodurch unterschiedlich große Tröpfchen erzeugt werden, was
das Mischen weiter verbessert. Wenn mehrere Kapillarverbindungswege
verwendet werden, können
diese so angeordnet werden, dass diese ein Aufeinandertreffen der
austretenden Flüssigkeiten
in der Kammer 22 bewirken.
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Eine
weitere in 2A und B gezeigte Alternative
ist besonders sinnvoll, wenn Flüssigkeiten mit
unterschiedlichen Viskositäten
gemischt werden. Die Kapillarverbindungswege 20 et al.
würden
sich dann in eine Vormischkammer 24 entladen, aus der zusätzliche
Kapillarverbindungswege 21 et al. die vereinigten Flüssigkeiten
in die Mischkammer 22 heraustragen würden. Um das Mischen weiter
zu verbessern, könnten
zusätzliche
Vormischkammern bereitgestellt werden. In beiden Schnittansichten
in 1B und 2B ist
zu erkennen, dass die Kapillarverbindungswege 20 und 21 üblicherweise
oben auf einem Chip angeordnet werden, der die tieferen Kammern
umfasst. Wenn auf die Flüssigkeiten
Kraft angewandt wird, bewegen sich diese demnach hoch zu den Verbindungswegen
und treten dann in die nächste
Kammer ein.
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Nachdem
mehrere Ausführungsformen
beschrieben worden sind, die in der Praxis ein effektives Mischen
ermöglichen,
wird deutlich, dass es bestimmte Varianten gibt, die in speziellen
Fällen
zu berücksichtigen
sind. Eine Alternative bestände
darin, die Kapillarverbindungswege zu vereinigen, die die getrennten
Flüssigkeiten
einspeisen, bevor diese in die erste Kammer eintreten. Dies hätte den
Vorteil, dass mit Erhöhen
der Geschwindigkeit der Flüssigkeit
ein gewisses Mischen in dem vereinigten Kapillarverbindungsweg erzielt
wird, was mit Eintreten in die Kammer zu einem stärkeren Mischen
führen
würde.
Auch in diesem Fall könnte
die erste Kammer mit Mikrostrukturen versehen werden, um örtlich begrenzte
Wirbel oder Turbulenzen zur Verbesserung des Mischens zu erzeugen.
Im einfachsten Fall könnten
die Flüssigkeiten
direkt in der ersten Kammer 18 gelagert werden, anstatt
zunächst
in den Behältern 10 und 14 angeordnet
zu werden.
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Es
wurde bereits vorgeschlagen, dass bei Verwendung mehrerer Kapillarverbindungswege
zur Einspeisung der Flüssigkeiten
in die zweite Mischkammer die Kapillarverbindungswege unterschiedliche
Durchmesser aufweisen könnten,
und dass diese so angeordnet sein könnten, dass sie aufeinander treffen,
wenn die Flüssigkeitsströme/Tröpfchen in
die Mischkammer eintreten. Eine weitere Alternative bestände darin,
die mehreren Kapillarverbindungswege vor Eintreten in die zweite
Mischkammer zu vervielfältigen,
um die Vorteile zu nutzen, die eintrittsbedingt erzeugte Wirbel
und Änderungen
der Flüssigkeitsgeschwindigkeit
mit sich bringen. Die zweite Mischkammer könnte ebenfalls mit Mikrostrukturen
versehen werden, um ein Mischen zu unterstützen.
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Die
in 3 dargestellte Mikrofluidvorrichtung wird in Beispiel
3 unter Verwendung in einem bestimmten Analysenverfahren beschrieben.
Die Vorrichtung mischt eine Flüssigkeit
in Kammer 18 mit einer dosierten Probe, die im Kapillarverbindungsweg 14 und
in der Kammer 16 enthalten ist. Die Flüssigkeiten werden in der Kammer 20 aufgenommen und
an die Mischkammer 30 übergeben,
aus der die gemischten Flüssigkeiten
zur Analyse herausströmen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bewegung der gemischten
Flüssigkeiten
in nachgelagerte Kammern zur weiteren Verarbeitung. Es liegt auf
der Hand, dass das Mischen abgeschlossen sein sollte, bevor die
Flüssigkeiten
bewegt werden. Es wurden mehrere Mittel erwogen, um eine frühzeitige Bewegung
der Flüssigkeiten
zu verhindern, bevor das Mischen abgeschlossen ist. Nach einem Verfahren
treten die gemischten Flüssigkeiten
in einen Kapillarverbindungsweg ein, der über der normalen Tiefe der
Flüssigkeit
in dem Mischbehälter
angeordnet ist. Es wurde festgestellt, dass nachdem die Zentrifugalkraft,
die die Flüssigkeit
in der Mischkammer in ihrer Position hält, reduziert worden ist, die
Flüssigkeit dazu
tendiert, an den Wänden
der Kammer hochzukriechen, und dass sie den Austrittsverbindungsweg erreichen
kann. In einem zweiten Verfahren erfolgt der Eintritt in den Austrittskapillarverbindungsweg von
unterhalb des Flüssigkeitsstands
in der Mischkammer, jedoch erst dann, wenn der Widerstand eines
hydraulischen Stopps durch Anwenden der nötigen Kraft überwunden
worden ist. In einem dritten Verfahren ist der Austrittskapillarverbindungsweg oberhalb
der Flüssigkeitstiefe
in der Mischkammer angeordnet, und die natürliche Tendenz der Flüssigkeit,
sich durch Kapillarkräfte
zu bewegen, wird durch Bereitstellen von Mikrostrukturen unterstützt, beispielsweise einer
gerillten Rampe, die zu dem Austrittskapillarverbindungsweg führt.
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Anwendungen
-
Für Mikrofluidvorrichtungen
gibt es zahlreiche Anwendungen. Analysen können für Proben von zahlreichen biologischen
Flüssigkeiten
durchgeführt werden,
beispielsweise, aber nicht abschließend, Blut, Urin, Wasser, Speichel,
Rückenmarksflüssigkeit,
Darmflüssigkeit,
Lebensmittel und Blutplasma. Blut und Urin sind von besonderem Interesse.
Eine Probe der zu testenden Flüssigkeit
wird in dem Probenbehälter
angeordnet und nachfolgend in einem oder mehreren Dosierverbindungswegen
oder -behältern
in der zu analysierenden Menge abgemessen. Die dosierte Probe wird
auf den Analyten von Interesse analysiert, beispielsweise, aber
nicht abschließend,
ein Protein, eine Zelle, ein kleines organisches Molekül oder ein
Metall. Beispiele solcher Proteine sind u. a. Albumin, HbA1c, Protease,
Protease-Inhibitor, CRP, Esterase und BNP. Zu analysierende Zellen
können
E. coli, Pseudomonas, weiße Blutkörperchen,
rote Blutkörperchen,
H. pylori, Strep A, Chlamdia und Mononucleosis sein. Zu den Metallen,
die nachgewiesen werden können,
zählen
Eisen, Mangan, Natrium, Kalium, Lithium, Calcium und Magnesium.
-
In
vielen Anwendungen wird die durch die Reaktion von Reagenzien mit
einer Probe entwickelte Farbe gemessen. Weitere spektroskopische
Analysen der Probe sind möglich
unter Verwendung von Sensoren, die angeordnet sind, um Absorption,
Reflexion, Transmission und Emission, wie beispielsweise Fluoreszenz,
Phosphoreszenz, Lumineszenz und sonstige Änderungen in den Nah- und Ferninfrarot-,
Raman- und Ultraviolett-Wellenlängen, nachzuweisen.
Zudem ist es möglich,
elektrische Messungen der Probe mithilfe von Elektroden durchzuführen, die
in den kleinen Behältern
in der Vorrichtung angeordnet sind. Beispiele solcher Analysen sind
u. a. elektrochemische Signalwandler auf Grundlage von amperometrischen,
impedimetrischen und potentimetrischen Nachweisverfahren. Beispiele umfassen
den Nachweis von oxidativen und reduktiven Chemikalien und den Nachweis
von Bindungsereignissen.
-
Es
gibt diverse Reagenzverfahren, die in Mikrofluidvorrichtungen verwendet
werden könnten. Reagenzien
sind Änderungen
unterworfen, wodurch die Stärke
des erzeugten Signals proportional zu der in dem klinischen Muster
gemessenen Konzentration des Analyten ist. Diese Reagenzien enthalten
Indikatorfarbstoffe, Metalle, Enzyme, Polymere, Antikörper, elektrochemisch
reagierende Inhaltsstoffe und verschiedene andere, auf Trägern getrocknete
Chemikalien. Häufig
verwendete Träger
sind Papiere, Membranen oder Polymere mit verschiedenen Probenaufnahme-
und Transporteigenschaften. Sie können in die Reagenzkammern
in den Mikrofluidvorrichtungen eingebracht werden.
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Für Reagenzien
sind verschiedene Verwendungen möglich.
Beispielsweise kann ein Analyt mit einem Reagenz in einer ersten
Kammer zur Reaktion gebracht und das reagierte Reagenz zur weiteren Reaktion
in eine zweite Kammer weitergeleitet werden. Zudem kann ein Reagenz
in einer ersten Kammer in einer Flüssigkeit resuspendiert und
für eine Reaktion
in eine zweite Kammer bewegt werden. Ein Analyt oder Reagenz kann
in einer ersten oder zweiten Kammer eingefangen und eine Bestimmung
des freien versus gebundenen Reagenz durchgeführt werden. Ein drittes flüssiges Reagenz
kann verwendet werden, um Materialien in der zweiten Kammer zu waschen
und Materialien zur Entsorgungskammer zu bewegen.
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Die
Bestimmung des freien versus gebundenen Reagenz ist insbesondere
für Mehrzonen-Immunoassays
und Nukleinsäure-Assays
verwendbar. Es gibt verschiedene Arten von Mehrzonen-Immunoassays, die
für diese
Vorrichtungen adaptiert werden können.
Im Falle der Adaption von Immunochromatographie-Assays werden Reagenzien und Filter
in separaten Kammern platziert und müssen keinen physischen Kontakt
haben, da keine chromatographischen Kräfte im Spiel sind. Immunoassays
oder DNA-Assay können
zum Nachweis von Bakterien entwickelt werden, wie etwa gramnegative
Arten (z. B. E. Coli, Entereobacter, Pseudomonas, Klebsiella) und
grampositive Arten (z. B. Staphylococcus Aureus, Entereococc).
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Immunoassays
können
für vollständige Panels
von Proteinen und Peptiden entwickelt werden, wie Albumin, Hämoglobin,
Myoglobulin, α-1-Microglobulin,
Immunoglobuline, Enzyme, Glycoproteine, Protease-Inhibitoren, Arzneimittel
und Cytokine. Siehe beispielsweise: Greenquist in
US-Patent 4,806,311 , Multizone analytical
Element Having Labeled Reagent Concentration Zone, 21. Februar 1989,
Liotta in
US-Patent 4,446,232 ,
Enzyme Immunoassay with Two-Zoned Device Having Bound Antigens,
1. Mai 1984.
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Potenzielle
Anwendungen, in denen getrocknete Reagenzien wieder löslich gemacht
werden, sind u. a. Filtration, Sedimentationsanalyse, Lyse von Zellen,
Zellsortieren (Massendifferenz) und Zentrifugaltrennung. Um die
Empfindlichkeit zu verbessern, kann eine Anreicherung (Konzentration)
des Probenanalyten auf eine feste Phase (z. B. Mikroperlen) vorgenommen
werden. Die angereicherten Mikroperlen könnten durch kontinuierliches
Zentrifugieren getrennt werden. Multiplexing ist verwendbar (z.
B. Dosieren verschiedener Reagenzkammern parallel und/oder in Folge),
was mehrere Kanäle
ermöglicht, von
denen jeder ein definiertes, diskretes Ergebnis erzeugt. Multiplexing
kann mithilfe eines Arrays aus Kapillarverbindungswegen erfolgen,
das eine Vielzahl von Dosierungs-Kapillarschleifen
umfasst, und in Flüssigkeitsverbindung
mit der Eintrittsöffnung steht,
oder mithilfe eines Arrays aus Dosierungskanälen und/oder Kapillarstopps,
die mit jedem der Dosierungs-Kapillarschleifen verbunden sind. Beim
Entwurf des Geräts
kann die Kombination mit sekundären
Kräften
genutzt werden, wie beispielsweise Magnetkräften. Teilchen, wie Magnetperlen,
dienen als Träger
für Reagenzien
oder zum Erfassen von Probenbestandteilen, wie Analyten oder Störsubstanzen.
Trennung der Teilchen nach physikalischen Eigenschaften, wie Dichte
(analog zur Fraktionierung mit Split).
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Das
folgende Beispiel 3 stellt die Erfindung zur Durchführung eines
Assays dar, um den Glykohämoglobingehalt
(HbA1c) im Blut eines Patienten zu messen, was auf den Zustand von
Patienten mit Diabetes hinweisen kann. Das verwendete Verfahren
ist Gegenstand einer Reihe von Patenten, jüngst des
US-Patents
6,043,043 . Normalerweise liegt die Konzentration von Glykohämoglobin
im Bereich von 3 bis 6%. Bei Diabetespatienten kann die Konzentration auf
das 3- bis 4-fache ansteigen. Der Assay misst die mittlere Blutglukosekonzentration,
der Hämoglobin über einen
Zeitraum von ca. 100 Tagen ausgesetzt worden ist. Monoklonale Antikörper, die
speziell für den
glykierten N-endständigen
Peptidrest in Hämoglobin
A1c entwickelt wurden, werden mit gefärbten Latexteilchen markiert
und in Kontakt mit einer Blutprobe gebracht, um die markierten Antikörper an
das Glykohämoglobin
anzulagern. Vor Anlagern der markierten Antikörper wird die Blutprobe zunächst durch Kontakt
mit einem Denaturierungsmittel/Oxidationsmittel denaturiert, z.
B. Lithiumthiocyanat, wie von Lewis in
US-Patent 5,258,311 beschrieben. Dann
wird die denaturierte und markierte Blutprobe in Kontakt mit einem
Agglutinatorreagenz gebracht, und die erzeugte Trübung ist
proportional zu der Menge des in der Probe vorhandenen Glykohämoglobins.
Die Gesamtmenge des vorhandenen Hämoglobins wird ebenfalls gemessen,
um den Prozentsatz des Hämoglobins
zu ermitteln, der glykiert ist. Das Mischen der Blutprobe mit dem
Denaturierungsmittel/Oxidationsmittel erfolgt erfindungsgemäß.
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Beispiel 1
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Es
wurde eine Mikrofluidvorrichtung mit der in 1 dargestellten
allgemeinen Konfiguration hergestellt, die fünf parallele Kapillarverbindungswege 20 et
al. aufwies, die die Kammern 18 und 22 verbanden.
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Der
Probenbehälter 10 wurde
mit 10 μl
einer Phenolrot-Lösung
mit Puffer (pH 4,0) gefüllt.
Der Probenbehälter 14 wurde
mit 10 μl
einer Phenolrot-Lösung
(pH 7,0) gefüllt.
10 mm lange Kapillarverbindungswege verbanden die Proben- und Reagenzkammern
mit der ersten Kammer 18. Jeder Kapillarverbindungsweg
war 200 μm
tief und 700 μm
breit und enthielt 0,4 μl.
Die erste Kammer 18 war 5,5 mm im Durchmesser, 1,5 mm tief
und hatte eine Kapazität von
ca. 36 μl.
Die zweite Kammer 22 war 5,5 mm im Durchmesser, 1,1 mm
tief und hatte eine Kapazität von
ca. 26 μl.
Die Vorrichtung war auf einer Plattform angeordnet und drehte sich
mit 2.500 U/min in einem Abstand von ca. 28 mm, um den Widerstand
der Stopps 12 und 16 zu überwinden und Flüssigkeiten aus
den Behältern 10 und 14 gleichzeitig
in die erste Kammer 18 einzuspeisen. Die gemischten Flüssigkeiten
traten sofort durch fünf
Kapillarverbindungswege (20 et al.), die die erste Kammer 18 und
die zweite Kammer 22 miteinander verbanden. Jeder Kapillarverbindungsweg
war 3,5 mm lang, 200 μm tief
und 200 μm
breit. Die Farbe der Flüssigkeit,
die sich in der zweiten Kammer 22 sammelte, war gleichmäßig gelb,
was darauf hinwies, dass ein vollständiges Mischen stattgefunden
hatte.
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Es
wurde festgestellt, dass sich die Flüssigkeit nach Wegfall der Zentrifugalkraft
entlang den Seiten der zweiten Mischkammer 22 hochbewegt hatte,
so dass die (in 1 nicht gezeigten)
Austritts-Kapillarverbindungswege gefüllt werden konnten.
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Beispiel 2
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Es
wurde eine weitere Mikrofluidvorrichtung hergestellt, die sich von
der Vorrichtung in Beispiel 1 dadurch unterschied, dass nur ein
Kapillarverbindungsweg die erste Kammer 18 und die zweite
Kammer 22 verband. Zudem war die zweite Kammer 22 mit
einer Reihe von fünf
Stufen versehen, die in Richtung der angewandten Zentrifugalkraft
herabführten. Die
erste Kammer 18 war 5,5 mm im Durchmesser, 1,5 mm tief
und hatte eine Kapazität
von ca. 36 μl.
Die zweite Kammer 22 war 5 mm breit und 7 mm lang mit einer
mittleren Tiefe von ca. 1,2 mm und einem Volumen von ca. 46 μl. Der einzelne
Kapillarverbindungsweg (3 mm lang, 200 μm tief, 500 μm breit) trat oben an der abgestuften
Rampe aus. Die Mischkammer und die beiden Kapillarverbindungswege,
die die Verdünnungskammer
versorgten, hatten die gleichen Abmessungen wie in Beispiel 1.
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10 μl einer Phenolrot-Lösung (pH
7,0) wurden dem Behälter 10 zugegeben,
und 10 μl
einer Phenolrot-Lösung
mit Puffer (pH 4,0) wurden dem Behälter 14 zugegeben.
Die Vorrichtung wurde mit einer Drehzahl gedreht, die ausreichte,
um die Kapillarstopps zu überwinden
und die beiden Lösungen
zu der abgestuften Verdünnungskammer
und dann zur Mischkammer zu transportieren. Die Farbe der Flüssigkeit
in der Mischkammer erwies sich als gleichmäßig, was darauf hinwies, dass
ein vollständiges
Mischen stattgefunden hatte.
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Beispiel 3
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In
diesem Beispiel wurde ein Test auf HbA1c in einem Mikrofluidchip
des in 3 gezeigten Typs durchgeführt. Die Oberflächenenergie
der internen Merkmale wurde derart eingestellt, dass ein Kontaktwinkel
von 25° für Wasser
auf der Oberfläche
erzeugt wird, und diese wurden mit einem Polypropylenfoliendeckel
bedeckt (Excel 2930). Eine Blutprobe wurde über eine Probenöffnung 10 eingebracht, über die sie
durch Kapillarwirkung zur Vorkammer 12 und dann zur Dosierkapillare 14 gelangte.
Der zusätzliche
Dosierbehälter 16 ist
optional und wird nur dann bereitgestellt, wenn die Probengröße zusätzliches Volumen
erfordert. Das Volumen der Probe in der Dosierkapillare 14 und
dem Dosierbehälter 16 betrug 0,3 μl. Die Denaturierungs-/Oxidationsflüssigkeit (9,62 μl) (Sigma-Säugerzell-Lyse/Extraktionsreagenz)
war in Behälter 18 enthalten.
Sie wurde in die erste Kammer 20 (18,84 μl) gleichzeitig
mit dem Dosierbehälter 16 und
der zugehörigen
Dosierkapillare 14 durch Anwendung einer Zentrifugalkraft
unter Schleudern mit 1200 U/min in einem Abstand von 29 mm entleert,
um die (nicht gezeigten) Kapillarstopps zu überwinden. Die erste Kammer 20 hatte
Platz für die
Blutprobe und das Denaturierungs-/Oxidationsmittel. Die vereinigten
Flüssigkeiten wurden über einen
Satz von drei 2000 μm
langen Kapillarverbindungswegen mit einem Querschnitt von 30 × 30 μm übertragen.
Die zweite Kammer 30 nahm die Flüssigkeiten auf und mischte
diese. Nach Wegnahme der Kraft trat die Flüssigkeit oben aus der Kammer 30 aus
und durch den Kapillarverbindungsweg 23 in die Kammer 24 ein. Überschüssige Flüssigkeiten
wurden in den Entsorgungsbehälter 31 durch
Schleudern mit 2.500 U/min bei einem Abstand von 43 mm übertragen.
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Die
Kammer 24 erzeugte einen gleichmäßigen Kontakt der vorkonditionierten
Probe mit markierten, monoklonalen Antikörpern, die auf einem trockenen
Substrat angeordnet waren und als ein zweiter Dosierbereich dienten.
Das Volumen der Probe in der zur Kammer 24 führenden
Kapillare betrug 2,0 μl. Der
Kontakt ungebundener, markierter Antikörper mit dem Agglutinator,
der auf einem Substrat angeordnet war, erfolgte in Kammer 26 und
erzeugte eine Farbe, die gemessen wurde, um die Menge des Glykohämoglobins
in der Probe zu bestimmen. Die Anwendung einer Zentrifugalkraft
durch Schleudern mit 2.500 U/min in einem Abstand von 53 mm bewirkte,
dass sich das inkubierte Konjugat in Kammer 24 und der Waschpuffer
in Kammer 22 in die Kammer 26 entleerten. Die
verbleibenden Behälter
stellten Raum für überschüssige Probe
(28), überschüssige denaturierte
Probe (31) und für
ein Dochtmaterial (32) bereit, das verwendet wurde, um
die Probe über
das Substrat in Kammer 26 zu ziehen.
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Eine
Probe von 2 μl
wurde in die Probenöffnung 10 pipettiert,
aus der sie durch einen in dem (nicht gezeigten) Chip angeordneten
Verbindungsweg hindurch und in die Vorkammer 12, die Dosierkapillare 14 und
dem zusätzlichen
Dosierbehälter 16 trat.
Jegliche überschüssige Probe
trat in den Überlaufbehälter 28,
der einen Feuchtigkeitsdetektor enthielt. Es wurde keine Zentrifugalkraft
angewandt, obwohl die Verwendung von bis zu 400 U/min möglich gewesen
wäre. Die
Probengröße (0,3 μl) wurde durch
das Volumen der Kapillare 14 und dem Dosierbehälter 16 bestimmt.
Ein Kapillarstopp am Einlass des Kapillarverbindungsweges, der den
Dosierbehälter 16 und
die erste Kammer 20 verbindet, verhinderte eine weitere
Bewegung der Blutprobe bis zur Überwindung
des Widerstands durch Zentrifugalkraft, was in diesem Beispiel durch
Schleudern des Chips mit 1.200 U/min erfolgte. Auch die Denaturierungs-/Oxidationslösung (Sigma-Säugerzell-Lyse/Extraktionsreagenz)
wurde mit einem Kapillarstopp daran gehindert, den Behälter 18 zu
verlassen, bis eine Drehzahl von 1.200 U/min angewandt wurde, um
10 μl der
Denaturierungs-/Oxidationslösung
zusammen mit der dosierten Blutprobe in die erste Kammer 20 und
anschließend
in die zweite Mischkammer 30 zu übertragen. Das Volumen der
ersten Kammer 20 betrug ca. das Doppelte der Menge der
vereinigten Denaturierungs-/Oxidationslösung und der Blutprobe. Nach dem
Mischen verließen
2 μl der
Mischung die zweite Kammer 30 durch eine Kapillarverbindungsweg
und traten in die Kammer 24 ein, in der Mikrostrukturen eine
einheitliche Benetzung des Substrats gewährleisteten (eine Whatman Glasfaser-Konjugattrennmembrane),
das die latexmarkierten, monoklonalen Antikörper für HbA1c enthielt. Die Inkubation
war innerhalb weniger Minuten abgeschlossen, wonach die markierte
Probe in die Kammer 26 entlassen wurde, indem die Drehzahl
auf 2.500 U/min angehoben wurde, um den (nicht gezeigten) Kapillarstopp
am Auslass der Kammer 24 zu überwinden. Die markierte Probe
gelangte in Kontakt mit dem Agglutinator (Polyaminasparginsäure HbA1c-Peptide),
der auf ein Whatman Nitrozellulosereagenz mit 5 μm Porengröße in Konzentrationen von 0,1
bis 3 mg/ml abgestrichen worden war. Das Absorptionsmaterial (Whatman
Glasfasermembrane) im Behälter 32 ermöglichte
einen gleichmäßigen Durchtritt
der markierten Probe über
dem Streifen. Während
die markierte Probe bei 2.500 U/min in die Kammer 26 transportiert
wurde, verließ die
Pufferlösung
(phosphatgepufferte Salzlösung)
den Behälter 22 und
trat durch die Kammer 24 und über den Streifen in die Kammer 26,
um die Genauigkeit der Messergebnisse der Bänder auf dem Streifen zu verbessern.
Die entwickelte Farbe wurde durch Reflexionsmessung mit einer Digitalkamera
gemessen.
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Beispiel 4
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Der
Chip aus 3 wurde mit zwei Arten von Lösungen getestet.
In dem ersten Test wurde eine Lösung
eines Phosphatpuffers mit pH 4 an der Probenöffnung 10 eingebracht,
von wo diese zur Dosierkapillare 14 und zum Behälter 16 transportiert wurde.
Diese Lösung
wurde dann mit dem Phosphatpuffer bei pH 10 in der Kammer 18 in
der ersten Mischkammer 20 vereinigt. Durch Farbstoffmessung stellte
sich heraus, dass das Mischen der beiden Pufferlösungen im Wesentlichen in Kammer 30 bei
pH 7 abgeschlossen war. Wenn Blut als Probe diente, also eine stärker viskose
Flüssigkeit
als der Puffer, erforderte das Mischen mit einem Lyse-Puffer (Lithiumthiocyanat)
aus Kammer 18 die Verwendung sowohl der ersten Kammer 20 als
der zweiten Kammer 30 aus 3.
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Beispiel 5
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Um
das Mischen von Blut mit einer wasserhaltigen Pufferlösung in
einer Mikrofluidvorrichtung zu simulieren, die die allgemeine Konfiguration
und die Konstruktionselemente aus 1 aufwies,
wurden 25% Polyethylenglycol (PEG, Molmasse 20.000) einer 0,5 N
NaOH Lösung
zugegeben. Die Viskosität entsprach
ungefähr
der von menschlichem Blut. 10 μl der
PEG/NaOH Lösung
wurden dem Behälter 10 zugegeben,
und 100 μl
eines Puffers mit pH 4 (50 mm Phosphat) wurden dem Behälter 14 zugegeben.
Ein Phenol-Rot-pH-Indikator wurde benutzt, um den Mischungsfortschritt
anzuzeigen, während
die beiden Lösungen
in den Kammern 18 und 22 vereinigt wurden. Es
wurde festgestellt, dass bei Sichtprüfung die Flüssigkeiten bei Anwenden einer
stärkeren
Zentrifugalkraft dazu tendierten, als getrennte Flüssigkeiten zu
erscheinen, dass aber ein vollständiges
Mischen erfolgte, wenn die Zentrifugalkraft reduziert wurde.
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Aus
einer Reihe ähnlicher
Tests konnte hergeleitet werden, dass es keinen wesentlichen Unterschied
in der Mischungseffizienz zwischen dem Chip mit einer oder vier
Kapillaren gab, zwischen Chips mit rechteckigen oder zylindrischen
Aufnahmekammern, zwischen Chips mit oder ohne Rampenstrukturen, und
dass ein vollständiges
Mischen viskoser Flüssigkeiten
möglich
ist.
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Beispiel 6
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Die
Effizienz der Blut-Lyse mit einem Puffer wurde durch Zentrifugieren
verdünnter
Proben der Blut-Puffer-Mischung und durch Untersuchen der Blut-Puffer-Mischung
mit einem Bayer-Reagenzstreifen
für okkultes
Blut geprüft.
Wenn die Lyse unvollständig
war, bildeten sich rote Blutpellets in der Zentrifuge oder dunkelgrüne Punkte
in dem Reagenzstreifen für
okkultes Blut. Für
Vergleichszwecke wurden Lösungen
aus 50 μl
Blut und 500 μl
verdünnter oder
unverdünnter
Lyse-Puffer (Lithiumthiocyanat) für 3 Minuten inkubiert und dann
in einer Zentrifuge bei 1.300 U/min für 10 Minuten geschleudert.
Anschließend
wurde die Lösung
100-fach in Phosphatpuffer-Salzlösung (pH
7,0) verdünnt
und erneut bei 1.300 U/min für
10 Minuten zentrifugiert. Das Mischen des Bluts in dem Lyse-Puffer in einer Mikrofluidvorrichtung
wurde durchgeführt,
wonach die Mischung aus der Mischkammer entnommen und 100- und 10.000-fach
in Phosphatpuffer verdünnt
wurde, um diese dann mit dem Zentrifugierverfahren und dem Verfahren
mit Reagenzstreifen zum Nachweis von okkultem Blut zu testen. Es
wurde festgestellt, dass das Blut im Wesentlichen vollständig in
der Mikrofluidvorrichtung lysiert worden war.
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Eine
weitere Untersuchung zeigte, dass die Blut-Lyse nahezu unmittelbar
während
des Mischens in der Mikrofluidvorrichtung erfolgte.