DE60037671T2

DE60037671T2 - Kolloidale stabpartikel als nanobarcodes

Info

Publication number: DE60037671T2
Application number: DE60037671T
Authority: DE
Inventors: Michael J. Los Altos NATAN; Thomas E. State College MALLOUK
Original assignee: Oxonica Inc
Current assignee: Oxonica Inc
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2020-10-03
Also published as: WO2001025002A9; EP1222609A1; EP1222609A4; WO2001025002A1; EP1227929A4; EP1227929A1; EP1227929B1; JP2003529128A; CA2386047A1; ATE382471T1; MXPA02002787A; AU7844800A; AU7746200A; JP2003511675A; WO2001026038A9; CA2386165A1; WO2001026038A1; US7225082B1; KR20020062283A; DE60037671D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nanopartikeln, vorzugsweise Metall, zum Kodieren von Informationen über ein Material oder Produkt und ihre Herstellungsverfahren. Die Nanopartikel können als molekulare (oder zelluläre) Markierungen, Kennzeichnungen und Substrate dienen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung segmentierter Partikel und Anordnungen unterscheidbarer Partikel.
Zweifellos hat es einen Paradigmenwechsel gegeben, was traditionellerweise als bioanalytische Chemie definiert wird. Diese neuen Technologien konzentrieren sich wesentlich auf das, was man als "erhöhten Informationsgehalt pro Volumen" bezeichnen kann. Dieser Begriff beinhaltet mehrere Ansätze von der Reduktion des Probenvolumens, das zur Durchführung eines Assays erforderlich ist, bis zu hochparallelen Messungen ("Multiplexing"), wie jenen, die immobilisierte molekulare Arrays beinhalten, bis zum Einbau zweiter (oder dritter) In formationskanäle, wie in 2-D-Gelelektrophorese oder CE-Elektrospray-MS/MS.
Viele dieser anscheinend revolutionären Technologien sind leider dadurch beschränkt, dass ihnen relativ herkömmliche Materialien, Verfahren und Analysen zu Grunde liegen. Die Entwicklung von DNA-Mikroarrays ("Gen-Chips") zur Analyse von Genexpression und Gentypisierung von Affymetrix, Incyte und ähnlichen Firmen hat beispielsweise dazu geführt, dass bis zu 20.000 unterschiedliche Fragmente oder DNA-Stücke mit voller Länge in einem räumlich begrenzten 1 cm²-Array immobilisiert werden müssen. Die Verwendung dieser Chips erfordert gleichzeitig jedoch in jedem Fall die Hybridisierung von DNA in Lösung an DNA, die auf einer planaren Oberfläche immobilisiert ist, die sowohl durch eine Abnahme der Effizienz der Hybridisierung (insbesondere bei cDNA) und einen noch größeren Grad an unspezifischer Bindung gekennzeichnet ist. Es ist noch unklar, ob diese Probleme vollständig überwunden werden können. Es hat zudem sowohl hinsichtlich der Kosten des Aneignens von externer Technologie als auch der Produktionszeit, die zum internen Entwickeln der DNA-Arraytechnik erforderlich ist, eine allgemeine Desillusionierung stattgefunden.
Ein zweites Beispiel dafür, wie bahnbrechende Entdeckungen durch schlechtes Werkzeug ausgebremst werden können, liegt in der pharmazeutischen Auffindung durch kombinatorische Chemie. Momentan werden Latexperlen mit 5 bis 10 μm Durchmesser in der Lösungsphase in großem Umfang als Stellen für die molekulare Immobilisierung verwendet. Durch die Ausnutzung der weit verbreitet angewendeten "Split and Pool"-Strategie (Aufteilen und Zusammenführen) können Bibliotheken mit bis zu 100.000 Verbindungen in einfacher und rascher Weise aufgebaut werden. Der Flaschenhals der Arzneimittelauffindung hat sich somit von der Synthese zum Screening und, genauso wichtig, zur Verbindungsidentifizierung (d. h. welche Verbindung befindet sich auf welcher Perle?) verschoben. Die aktuellen Ansätze für das Letztere beinhalten das "Perlenkodieren", wodurch man jede auf eine Perle angewendete Synthesestufe durch parallele Zugabe eines organischen "Kode"-Moleküls aufzeichnet, wobei das Ablesen des Kodes die Identifizierung der Arzneimittelableitung auf der Perle ermöglicht. Die "Kodeablese"-Protokolle sind leider alles andere als optimal: Bei jeder Strategie muss das Codemole kül von dem Kopf abgespalten und separat durch HPLC, Massenspektrometrie oder andere Verfahren analysiert werden. Es gibt in anderen Worten momentan keinen Weg, potentiell interessante Arzneimittelkandidaten durch direkte rasche Abfrage der Perlen, auf denen sie sich befinden, zu identifizieren, obwohl es mehrere Screening-Protokolle gibt, bei denen diese Fähigkeit erwünscht wäre.
Zwei alternative Technologien mit potentieller Relevanz sowohl für die kombinatorische Chemie als auch für die genetische Analyse beinhalten "selbstkodierte Perlen", bei denen eine spektral identifizierbare Perle eine räumlich definierte Position ersetzt. In dem Ansatz, für den Walt und Mitarbeiter den Weg gebahnt haben, werden Perlen chemisch mit einem Verhältnis von Fluoreszenzfarbstoffen modifiziert, das die Perlen in unverwechselbarer Weise identifizieren soll, welche dann weiter mit einer unverwechselbaren Chemie modifiziert werden (z. B. mit einem anderen Antikörper oder Enzym). Die Perlen werden dann statistisch auf einem geätzten Faser-Array dispergiert, so dass zu jeder Faser eine Perle gehört. Die Identität der Perle ist durch ihre Fluoreszenzablesung gesichert, und der Analyt wird durch Fluoreszenzablesung derselben Faser in einem anderen Spektralbereich detektiert. Die Erstveröffentlichung dieses Themas (Michael et al., Anal. Chem., 70, 1242–1248 (1998)) weist darauf hin, dass mit 6 unterschiedlichen Farbstoffen (15 Kombinationen von Paaren) und mit 10 unterschiedlichen Verhältnissen von Farbstoffen 150 "unverwechselbare optische Signaturen" erzeugt werden könnten, wobei jede für ein anderes Perlen-"Aroma" steht. Eine sehr ähnliche Strategie beschreiben die Mitarbeiter von Luminex, die aromatisierte Perlen, die für die chemische Modifizierung bereit sind (100 im Handel erhältlich), mit einer der Durchflusszytometrie ähnlichen Analyse kombinieren (siehe z. B. McDade et al., Med. Rev. Diag. Indust. 19, 75–82 (1997)). Das spezielle Aroma wird wiederum durch Fluoreszenz bestimmt, und nachdem die Biochemie auf die Perle aufgebracht worden ist, kann jede spektral unterscheidbare Fluoreszenz infolge der Anwesenheit von Analyten abgelesen werden kann. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der aktuellen Konfiguration eine Laserfarbe verwendet werden muss, um das Partikelaroma abzufragen, und ein weiterer separater Laser, um die Bioassay-Fluorophore anzuregen.
Bei selbstkodierten Latexperlen sind die Einschränkungen, die durch die mit der molekularen Fluoreszenz zusammenhängende weite Bandbreite auferlegt werden, eine bedeutsamere Überlegung. Wenn der Frequenzraum der molekularen Fluoreszenz sowohl zum Kodieren als auch für Bioassay-Analyse verwendet wird, kann man sich kaum vorstellen, wie beispielsweise bis zu 20.000 unterschiedliche Aromen erzeugt werden können. Dieses Problem könnte durch Verwendung von Kombiationen von glasbeschichteten Quantenpunkten etwas gelindert werden, die schmalere Fluoreszenzbandbreiten zeigen. (Siehe z. B. Bruchez et al., Science, 281, 2013–2016 (1998)). Diese "Designer"-Nanopartikel lassen sich jedoch recht schwer herstellen, und derzeit gibt es mehr Fluorophortypen als (veröffentlichte) Quantenpunkte. Wenn es jedoch möglich wäre, mit irgendeinem Mittel sehr große Zahlen an von sich aus unterscheidbaren Partikeln zu erzeugen, würde die Bioanalyse auf Partikelbasis außergewöhnlich attraktiv, da dann für die mehreren Forschungsgebiete mit hohem Informationsgehalt, einschließlich kombinatorischer Chemie, Genomen und Proteomen (durch Multiplex-Immonoassays), eine einzige Technologieplattform in Frage käme.
Frühere Arbeiten haben ursprünglich gelehrt, wie Metall in den Poren einer metallisierten Membran abgeschieden werden kann, um ein Array von Metall-Nanopartikeln herzustellen, die in den Wirt eingebettet sind. Sie haben sich auf die optischen und/oder elektrochemischen Eigenschaften dieser Materialien konzentriert. Es wurde eine ähnliche Technik zur Herstellung segmentierter zylindrischer magnetischer Nanopartikel in einer Wirtmembran verwendet, wobei die Zusammensetzung der Partikel über die Länge variiert wurde. Es sind in keinem Fall jedoch freistehende stabförmige Nanopartikel mit variablen Zusammensetzungen entlang ihrer Länge hergestellt worden. In der Tat ist nie über "freistehende" stabförmige Metall-Nanopartikel aus einer einzigen Zusammensetzung berichtet worden, deren Länge mindestens ein Mikrometer beträgt. In ähnlicher Weise ist nie über freistehende stabförmige Metall-Nanopartikel berichtet worden, die nicht in solchen Wirtmaterialien eingebettet oder anderweitig in diesen enthalten sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es sind stabförmige Nanopartikel hergestellt worden, deren Zusammensetzung entlang der Länge des Stabs variiert. Diese Partikel werden als Nanopartikel oder Nanobarcodes bezeichnet, obwohl in Wirklichkeit einige oder alle Abmessungen im Mikrometergrößenbereich liegen können.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung freistehender Partikel, die mehrere Segmente aufweisen, wobei die Partikellänge 10 nm bis 50 μm und die Partikelbreite 5 nm bis 50 μm beträgt, zum Kodieren von Informationen über ein Material oder Produkt. Die Segmente der erfindungsgemäßen Partikel können aus jedem beliebigen Material zusammengesetzt sein. Zu den möglichen Materialien gehören ein Metall, ein beliebiges Metallchalcogenid, ein Metalloxid, ein Metallsulfid, ein Metallselenid, ein Metalltellurid, eine Metalllegierung, ein Metallnitrid, ein Metallphosphid, ein Metallantimonid, ein Halbleiter, ein Halbmetall, eine beliebige organische Verbindung oder ein beliebiges organische Material, eine beliebige anor ganische Verbindung oder ein beliebiges anorganisches Material, eine beliebige organometallische Verbindung oder ein beliebiges organometallisches Material, eine partikuläre Schicht oder ein partikuläres Material oder ein Kompositmaterial. Die Segmente der erfindungsgemäßen Partikel können aus polymeren Materialien, kristallinen oder nicht-kristallinen Materialien, amorphen Materialien oder Gläsern zusammengesetzt sein. Die Partikel sind in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung "funktionalisiert" (ihre Oberfläche ist z. B. mit IgG-Antikörpern beschichtet). Diese Funktionalisierung kann an ausgewählten oder allen Segmenten, an dem Körper oder einer oder beiden Spitzen des Partikels gebunden sein. Diese Funktionalisierung kann in übrigens Segmente oder das gesamte Partikel beschichten. Diese Funktionalisierung kann üblicherweise organische Verbindungen einschließen, wie einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Oligonukleotid, anorganische Verbindungen und Kombinationen davon. Diese Funktionalisierung kann auch eine detektierbare Markierung sein oder eine Spezies enthalten, die eine detektierbare Markierung bindet.
In die vorliegende Erfindung ist auch die Verwendung einer Anordnung oder Sammlung von Partikeln eingeschlossen, umfassend eine Vielzahl von Partikeltypen, wobei jeder Partikel eine Länge von 10 nm bis 50 μm hat und aus mehreren Segmenten zusammengesetzt ist, und wobei die Partikeltypen unterscheidbar sind. Die Partikeltypen sind in den bevorzugten Ausführungsformen basierend auf Unterschieden der Länge, Breite oder Form der Partikel und/oder der Zahl, Zusammensetzung, Länge und Muster der Segmente unterscheidbar. Die Partikel sind in anderen Ausführungsformen basierend auf der Natur ihrer Funktionalisierung oder ihren physikalischen Eigenschaften unterscheidbar (wie z. B. durch Massenspektrometrie oder Lichtstreuung gemessen wird).
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung einer Zusammensetzung ein, die aus einem Partikel und einer funktionalen Einheit zusammengesetzt ist (z. B. einem IgG-Antikörper auf der Oberfläche), wobei der Partikel mehrere Segmente enthält und eine Länge von 10 nm bis 50 nm hat. Die spezifische Natur der funktionalen Einheit ist in bestimmten Ausführungsformen durch den Partikel kodiert, vorzugsweise basierend auf der Länge, der Breite oder der Form des Partikels und/oder der Zahl, Zusammensetzung, Länge oder Muster der Segmente.
Die vorliegende Erfindung schließt die Anordnung von Partikeln ein, die mehrere Typen von Partikeln enthält, wobei jeder Partikel mindestens eine Dimension von weniger als 10 μm aufweist und wobei die Partikeltypen unterscheidbar sind. Die Partikeltypen sind vorzugsweise basierend auf der Länge, Breite, Form und/oder Zusammensetzung der Partikel unterscheidbar. In die Erfindung eingeschlossen ist die Verwendung von Zusammensetzungen, die aus einem Partikel und einer funktionalen Einheit zusammengesetzt sind, wobei der Partikel mindestens eine Dimension von weniger als 10 μm hat und wobei die Natur der funktionalen Einheit durch den Partikel kodiert wird.
Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zum Kodieren von Information über ein Material oder Produkt (z. B. Farbe, Kautschuk, Metall, Holz, Textilien, Schießpulver, Papier, Kunststoffe, Glas, Polystyrolperlen, usw.) ein, bei dem man einen freistehenden Partikel in das Material einarbeitet oder an das Material bindet, der Information betreffend das Material kodiert, wobei der Partikel eine Vielzahl von Segmenten aufweist, wobei die Länge des Partikels von 10 nm bis 50 μm und die Breite des Partikels von 5 nm bis 50 μm beträgt und wobei die kodierte Information auf der Länge, der Breite oder der Form des Partikels und/oder der Zahl, Zusammensetzung, Länge oder dem Muster von Segmenten basiert.
Verfahren zur Durchführung eines Assays oder Messung der Analytkonzentration oder Aktivität sind erfindungsgemäß auch eingeschlossen. Bei solchen Verfahren bringt man eine Lösung, die den Analyten enthalten kann, mit einer Zusammensetzung in Kontakt, die ein Molekül, eine Spezies oder Material, die den Analyten binden kann, und einen Partikel enthält, der einen Vielzahl von Segmenten aufweist, wobei der Partikel eine Länge von 10 nm bis 50 μm und eine Breite von 5 nm bis 50 μm aufweist, und man ermittelt, ob eine Wechselwirkung zwischen der Spezies und dem Analyten stattgefunden hat. Diese Verfahren schließen auch jene zur Durchführung von Assays oder Messungen von Analyten in der Dampf- oder festen Phase ein.
Es werden auch Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung einer Vielzahl von Tests auf eine Vielzahl von Analyten oder Messungen von Analytkonzentrationen oder Aktivitäten mit mehreren Analyten gelehrt, bei dem man eine Lösung, welche die Analyte enthalten kann, mit einer Vielzahl von Zusammensetzungen in Kontakt bringt, wobei jede Zusammensetzung ein Molekül, eine Spezies oder ein Material, das bzw. die mit einem der Analyte in Wechselwirkung tritt, kann, gebunden an einen Partikel enthält, der eine Vielzahl von Segmenten aufweist, wobei die Länge des Partikels von 10 nm bis 50 μm und die Breite des Partikels von 5 nm bis 50 μm beträgt und wobei die Beschaffenheit der Zusammensetzung durch den Partikel kodiert wird, an den sie gebunden ist, und man ermittelt, welche Wechselwirkungen stattgefunden haben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A–1D zeigen schematisch 4 verschiedene beispielhafte Nanopartikel, die erfindungsgemäß verwendet werden können.
2 zeigt eine graphische Darstellung des Reflexionsvermögens gegen Wellenlänge für Massen-Pt und Au.
3 ist ein mit einem Lichtmikroskop im reflektierten Lichtmodus aufgenommenes Bild eines erfindungsgemäßen 9-streifigen Barcodes (Au/Ag/Au/Ag/Au/Ag/Au/Ag/Au).
4 zeigt gleichzeitige Barcode-Detektierung durch Reflexionsvermögen und Analytquantifizierung durch Fluoreszenz. Jedes der Bilder ist eine Mischung von gestreiften Nanostäben, die in Beispiel 4 beschrieben sind. In 4A ist die Wellenlänge der FITC-Emission mit einem Bandpassfilter abgebildet. In 4B ist die Wellenlänge von Texasrot abgebildet. 4C ist ein Bild des Reflexionsvermögens bei 400 μm.
5 ist ein Bild, das eine Anordnung von sechs Typen von Nanobarcodes zeigt. Die Figur zeigt diagrammartig die sechs Aromen der Nanobarcodes, A-F, und das Bild ist beschriftet, damit man erkennen kann, welche der Nanobarcodes in dem Bild den verschiedenen Aromen oder Typen des Nanobarcodes entsprechen.
6A ist ein Bild einer Sammlung von Ag/Au-Nanostäben bei 400 μm, und 6B ist ein Bild derselben Sammlung bei 600 nm.
DETAILLIERTE SCHRIFTLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nanopartikeln, wie in den Ansprüchen definiert.
Weil das Barcodesystem in der makroskopischen Welt so weit verbreitet ist, ist das Konzept in einer Vielfalt von bildhaf ten Manifestationen in die molekulare Welt übertragen worden. Es gibt somit "Barcodes" auf Basis der Analyse offener Leserahmen, Barcodes auf Basis von isotopen Massenvariationen, Barcodes auf Basis von Zeichenketten von chemischen oder physikalischen Reporterperlen, Barcodes auf Basis von elektrophoretischen Mustern von mit Restriktionsenzym gespaltener mRNA, mit Barcode versehenen Oberflächen zur wiederholbaren Bildgebung von biologischen Molekülen unter Verwendung von Rastersondenmikroskopien und Chromosomen-Barcodes (auch bekannt als Chromosomen-Painting), die durch Multichromophor-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung erzeugt wird. Alle diese Verfahren beinhalten Wege zum Kodieren von biologischen Informationen, keines bietet jedoch den Bereich von Vorteilen, die die erfindungsgemäßen echten Barcodes bieten, übertragen auf den Nanometermaßstab.
Die erfindungsgemäß verwendeten Partikel werden alternativ als Nanopartikel, Nanobarcodes, Stäbe und stabförmige Partikel bezeichnet. Die angewendete Bezeichnung sollte dann ignoriert werden, wenn die Beschreibung als den Umfang der Erfindung einschränkend angesehen werden kann. Obwohl in einigen Ausführungsformen der Erfindung die Zusammensetzung des Partikels Informationsgehalt trägt, trifft dies beispielsweise nicht auf alle Ausführungsformen der Erfindung zu. Obwohl Partikel von Nanometergröße in den Umfang der Erfindung fallen, fallen in ähnlicher Weise nicht alle erfindungsgemäßen Partikel in diesen Größenbereich.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Nanobarcodepartikel durch elektrochemisches Abscheiden in einer Aluminiumoxid- oder Polycarbonatmatrize bewirkt, wobei anschließend die Matrize gelöst wird, und typischerweise werden sie durch alternierende elektrochemische Reduktion von Metallionen hergestellt, obwohl sie leicht durch andere Mittel sowohl mit als auch ohne ein Matrizenmaterial hergestellt werden können. Die Nanobarcodes haben in der Regel Breiten zwischen 30 nm und 300 Nanometern, obwohl sie Breiten von mehrere Mikrometern aufweisen können. Obwohl die Längen (d. h. die Längsdimension) der Materialien in ähnlicher Weise in der Größenordnung von 1 bis 15 μm liegen kann, können sie in ähnlicher Weise leicht in Längen bis zu 50 μm und in Längen, die so kurz wie 10 Nanometer sind, hergestellt werden. Die Nanobarcodes enthalten in einigen Ausführungsformen zwei oder mehr unterschiedliche Materialien, die entlang der Länge alternieren, obwohl prinzipiell so viele wie Dutzende von unterschiedlichen Materialien verwendet werden können. Die Segmente können in ähnlicher Weise aus nicht-metallischem Material bestehen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Polymere, Oxide, Sulfide, Halbleiter, Isolatore, Kunststoffe oder sogar dünne (d. h. Monoschicht) Filme organischer oder anorganischer Spezies.
Wenn die erfindungsgemäßen Partikel durch elektrisches Abscheiden hergestellt werden, kann die Länge der Segmente durch Kontrolle der Strommenge eingestellt werden, die in jeder Elektroplattierstufe hindurchgeleitet wird. Die Dichte und Porosität der Partikel (oder Partikelsegmente) kann auch elektrochemisch kontrolliert werden.
Der resultierende Stab erinnert an einen "Barcode" im Nanometermaßstab, wobei jede Segmentlänge (und Identität) vorab programmierbar ist. Das gleiche Ergebnis kann auch mit einem anderen Fertigungsverfahren erreicht werden, in dem die Länge oder ein anderes Merkmal der Segmente kontrolliert werden kann. Obwohl der Durchmesser der Stäbe und die Segmentlängen typischerweise Nanometerdimensionen haben, ist die Gesamtlänge so, dass sie in bevorzugten Ausführungsformen direkt in einem Lichtmikroskop zu sehen ist, wobei das unterschiedliche Reflexionsvermögen der Metallkomponenten genutzt wird.
Der Begriff Barcode ist zweckmäßig, weil beispielsweise Stäbe mit 9 Segmenten hergestellt worden sind, sowie Partikel mit Segmenten, die aus 4 unterschiedlichen Materialien (jeweils mit einem anderen Reflexionsvermögen) zusammengesetzt sind. Es gibt somit in diesem Beispiel 4⁹ (> 260.000) unverwechselbare Typen von Barcodenanopartikeln, die potentiell hergestellt werden können. Wenn man berücksichtigt, dass der Partikeldurchmesser oder die Partikelbreite, die Segmentlänge und die Gesamtpartikellänge variiert werden können und es eine große Zahl weiterer Materialien gibt, die den bereits erhältlichen zugefügt werden können, gibt es in Wirklichkeit viele weitere. Der Punkt ist, dass es buchstäblich Milliarden von unverwechselbaren (und identifizierbaren) Materialzusammensetzungen gibt.
Ein zweites Schlüsselmerkmal der Barcodenanopartikel ist, dass der vollständige Bereich der chemischen Oberflächenfunktionalisierung auf die Nanopartikeloberfläche angewendet werden kann, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Funktionalisierung mit selbstorganisierten Monoschichten (self assembled monolayers; SAMs), Polymeren, Oxiden, anderen Metallen, Nukleinsäuren, Proteinen, Lipiden und Kombinationen davon. Sie können daher für Träger für Sensoren auf Fluoreszenzbasis verwendet werden (die Metalloberflächen quenchen die Fluoreszenz der oberflächengebundenen Moleküle nicht) und können auch ein absolut neuartiges aktives Sensorelement auf Basis von Änderungen des Reflexionsvermögens bilden. Weil jede beliebige Sensorkonfiguration auf die Nanobarcodeoberfläche übertragen werden kann, kann die Detektierung auch durch elektrochemische, massenspektrometrische, gravimetrische, optische, mechanische und zahlreiche andere Verfahren erfolgen. Man sollte erwähnen, dass der Lösungsmittelzugang zu immobilisierten Biomolekülen, weil die Stäbe in erster Näherung eine eindimensionale Struktur sind, relativ zu einer Kugel mit der gleichen linearen Dimension und insbesondere in Bezug auf planare Oberflächen signifikant erhöht ist. Dies kann leicht verifiziert werden, beispielsweise durch Betrachtung der Massentransportgleichungen von halbkugelförmigen und halbunendlichen zylindrischen Mikroelektroden und der makroskopischen planaren Elektroden. Insbesondere bei schmaleren Stäben verhalten sich Molekülerkennungsreaktionen somit sehr ähnlich zu ihren Entsprechungen in Lösung. Aus dem gleichen Grund sollte die unspezifische Bindung signifikant reduziert sein. Die Gesamtoberfläche von beispielsweise einem 200 nm breiten, 3 μm langen Stab ist < 0,1 μm². Kurz gesagt weisen zylindrisch geformte Nanopartikel Oberflächeneigenschaften auf, die für den Aufbau von Bioassays nützlich sind.
Die Synthese und Charakterisierung von mehreren segmentierten Partikeln ist in Martin et al., Adv. Materials 11; 1021–25 (1999) beschrieben.
Bei der Beschreibung des Umfangs der erfindungsgemäß verwendeten Partikel sei auf 1 verwiesen. Diese Figur zeigt in Diagrammform 4 nicht-einschränkende mögliche Formen der erfindungsgemäßen Nanobarcodes. In diesen Diagrammen ist jedes der Partikel aus 3 Segmenten, A, B und C, zusammengesetzt, und die als die Länge definierte Dimension wird mit x bezeichnet, und die als die Breite definierte Dimension wird mit y bezeichnet. In jeder dieser Ausführungsformen ist die Länge als Achse definiert, die allgemein senkrecht zu Linien verläuft, welche die Segmentübergänge definieren, während die Breite die Dimension des Partikels ist, die parallel zu der Linie verläuft, welche die Segmentübergänge definiert. Wie in 1C zu erkennen ist, kann die Partikelbreite über die Länge des Partikels variieren, und die Partikellänge kann gleichermaßen über die Breite des Partikels variieren. Wie in 1D zu erkennen ist, können die Partikel gekrümmt sein. Zu anderen möglichen Formen der Partikel gehören verzweigte, "T"-förmige oder sogar Doughnut-förmige Partikel. Es kann in solchen Ausführungsformen zweckmäßig sein, sich auf die längste Dimension der Partikel als deren Länge und eine kürzere, ungefähr senkrechte Dimension als die Breite zu beziehen. Die Partikel sind durch ihre Größe und durch die Existenz von mindestens 2 Segmenten teilweise definiert. Die Länge der Partikel kann 10 nm bis zu 50 μm betragen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Partikel 500 nm bis 30 μm. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Länge der erfindungsgemäßen Partikel 1 bis 15 μm.
Die erfindungsgemäß verwendeten Partikel werden oft als "stab"-förmig bezeichnet. Der Querschnitt der Partikel kann, betrachtet entlang der Längsachse, jedoch jede beliebige Form haben. Diese Querschnitte können kreisrund, oval, quadratisch, rautenförmig oder sogar rohrförmig sein. Die Querschnitte können außerdem an unterschiedlichen Abschnitten des Partikels unterschiedlich sein. Die Partikel können somit an einem Ende einen dreieckigen Querschnitt und am anderen Ende einen kreisrunden Querschnitt haben. Der Partikel kann alternativ durchgehend einen kreisrunden Querschnitt aufweisen, der Radius kann sich über die Länge jedoch verändern (z. B. ein "kegelförmiges" Segment). Der Querschnitt ist in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ein Kreis, und die Partikel sind "stab"-förmig. Obwohl die erfindungsgemäß verwendeten Partikel viele Formen haben können, sind die sequentiellen Segmente der vorliegenden Erfindung nicht kugelförmig.
Die Breite oder der Durchmesser der erfindungsgemäß verwendeten Partikel liegt innerhalb des Bereichs von 5 nm bis 50 μm. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Breite 10 nm bis 1 μm, und in den am meisten bevorzugten Ausführungen beträgt die Breite oder die Querschnittdimension 30 nm bis 500 nm.
Die Partikel sind, wie bereits erörtert, durch die Anwesenheit von mindestens zwei Segmenten gekennzeichnet. Ein Segment steht für einen Bereich des Partikels, der durch irgendein Mittel von benachbarten Bereichen des Partikels auseinandergehalten werden kann. In 1A teilen Segmente des Partikels die Länge des Partikels unter Bildung von Bereichen, die (allgemein) denselben Querschnitt und dieselbe Breite wie der ganze Partikel haben, während sie einen Abschnitt der Länge des ganzen Partikels repräsentieren. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein Segment aus anderen Materialien als seine benachbarten Segmente zusammengesetzt. Es muss jedoch nicht jedes Segment von allen anderen Segmenten des Partikels unterscheidbar sein. Ein Partikel kann beispielsweise aus 2 Typen von Segmenten zusammengesetzt sein, z. B. Gold und Platin, während es 10 oder sogar 20 unterschiedliche Segmente aufweist, indem einfach Segmente von Gold und Platin alterniert werden. Ein erfindungsgemäßer Partikel enthält mindestens zwei und bis zu 50 Segmente. Die erfindungsgemäßen Partikel haben vorzugsweise 2 bis 30 Segmente und am meisten bevorzugt 3 bis 20 Segmente. Die Partikel können 2 bis 10 unterschiedliche Typen von Segmenten haben, vorzugsweise 2 bis 5 unterschiedliche Segmenttypen.
Ein Segment der erfindungsgemäß verwendeten Partikel ist dadurch definiert, dass es von benachbarten Segmenten des Partikels unterscheidbar ist. Die Möglichkeit, zwischen Segmenten zu unterscheiden, schließt Unterscheiden durch jedes beliebige physikalische oder chemische Abfragemittel ein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf elektromagnetisch, magnetisch, optisch, spektrometrisch, spektroskopisch und mechanisch. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Verfahren zur Abfrage zwischen Segmenten optisch (Reflexionsvermögen).
Benachbarte Segmente können sogar aus demselben Material sein, solange sie durch irgendein Mittel unterscheidbar sind. Es können beispielsweise unterschiedliche Phasen des gleichen elementaren Materials, oder Enantiomere von organischen Polymermaterialien benachbarte Segmente bilden. Außerdem kann ein aus einem Einzelmaterial zusammengesetzter Stab als unter den Schutzumfang der Erfindung fallend angesehen werden, wenn Segmente voneinander unterschieden werden können, beispielsweise durch Funktionalisierung an der Oberfläche, oder indem sie unterschiedliche Durchmesser haben. Partikel, umfassend organische Polymermaterialien, könnten auch Segmente aufweisen, die durch den Einschluss von Farbstoffen definiert sind, welche die relativen optischen Eigenschaften der Segmente verändern würden.
Die Zusammensetzung der erfindungsgemäß brauchbaren Partikel wird am besten definiert, indem die Zusammensetzungen der Segmente beschrieben werden, die die Partikel bilden. Ein Partikel kann Segmente mit extrem unterschiedlichen Zusammensetzungen enthalten. Ein einzelner Partikel könnte beispielsweise aus einem Segment, das ein Metall ist, und einem Segment, das ein organisches Polymermaterial ist, zusammengesetzt sein.
Die erfindungsgemäßen Segmente können aus jedem beliebigen Material zusammengesetzt sein. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten die Segmente ein Metall (z. B. Silber, Gold, Kupfer, Nickel, Palladium, Platin, Kobalt, Rhodium, Indium); irgendein Metallchalcogenid; ein Metalloxid (z. B. Kupfer(II)oxid, Titandioxid); ein Metallsulfid; ein Metallselenid; ein Metalltellurid; eine Metalllegie rung; ein Metallnitrid; ein Metallphosphid; ein Metalantimonid; einen Halbleiter; ein Halbmetall. Ein Segment kann auch aus einer organischen Mono- oder Doppelschicht zusammengesetzt sein, wie einem molekularen Film. Monoschichten organischer Moleküle oder selbstorganisierte kontrollierte Schichten von Molekülen können mit vielen verschiedenen Metalloberflächen assoziiert sein.
Ein Segment kann aus jeder organischen Verbindung oder jeden organischen Material oder jeder anorganischen Verbindung oder jedem anorganischen Material oder organischen polymeren Materialien einschließlich dem großen Bereich der Mono- und Copolymere, die Fachleuten bekannt sind, zusammengesetzt sein. Biologische Polymere, wie Peptide, Oligonukleotide und Kohlenhydrate, können auch die Hauptkomponenten eines Segments sein. Segmente können auch aus teilchenförmigen Materialien zusammengesetzt sein, z. B. Metallen, Metalloxid oder organischen teilchenförmigen Materialien oder Kompositmaterialien, z. B. Metall in Polyacrylamid, Farbstoff in polymerem Material, porösen Metallen. Die Segmente der erfindungsgemäßen Partikel können aus polymeren Materialien, kristallinen oder nicht-kristallinen Materialien, amorphen Materialien oder Gläsern zusammengesetzt sein. Segmente können durch Kerben, Dellen oder Löcher in der Oberfläche des Partikels definiert sein, die mit einem anderen Material gefüllt sein können oder nicht. Eine texturierte Oberfläche kann beispielsweise hergestellt werden, indem eine Silber/Gold-Legierung abgeschieden wird und danach das Silber aufgelöst wird.
Segmente können auch durch Vesikel, Blasen, Poren, Hohlstellen oder Tunnel in dem Partikel definiert sein, die in Kontakt mit der äußeren Oberfläche des Partikels sein können oder nicht und die mit einem anderen Material gefüllt sein können oder nicht. Texturierte Oberflächen oder poröse Parti kel haben den Vorteil der größeren Oberfläche und können in der Tat selbst als einstückige stationäre Phase (Monolith) für Chromatographiestudien verwendet werden. Segmente können auch durch eine wahrnehmbare Veränderung der Form, des Winkels oder der Kontur des Partikels definiert sein, oder irgend ein anderes physikalisches Merkmal des Partikels (z. B. Dichte). In Ausführungsformen der Erfindungen, in denen der Partikel beschichtet ist, beispielsweise mit einem Polymer oder Glas, kann das Segment aus einem Leerraum zwischen anderen Materialien bestehen.
Die Länge jedes Segments kann 10 nm bis zu 50 μm betragen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Länge jedes Segments 50 nm bis 20 μm. Die Verbindungsstelle zwischen Segmenten wird, wie in 1 gezeigt, als saubere Querschnittgrenzfläche dargestellt. Die Grenzfläche zwischen Segmenten muss in einigen Ausführungsform jedoch nicht senkrecht zu der Länge des Partikels verlaufen oder eine glatte Übergangslinie sein. In einigen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung von einem Segment außerdem in die Zusammensetzung des benachbarten Segments gemischt werden. Zwischen Segmenten von Gold und Platin kann es beispielsweise einen Bereich von 5 bis 50 nm geben, der aus sowohl Gold als auch Platin zusammengesetzt ist. Dieser Übergangstyp ist akzeptabel, solange die Segmente unterscheidbar sind. Die Segmente können für jeden gegebenen Partikel eine beliebige Länge relativ zu der Länge der Segmente des restlichen Partikels haben.
Die erfindungsgemäß verwendeten Partikel können wie oben beschrieben jede Querschnittform haben. Die Partikel sind in bevorzugten Ausführungsformen entlang der Längsachse im allgemeinen gerade. Die Partikel können in bestimmten Ausführungsformen jedoch gekrümmt oder helixförmig sein. Die Enden der erfindungsgemäßen Partikel können flach, kovex oder konkav sein. Die Enden können außerdem mit Dornen versehen oder bleistiftspitzenartig sein. Ausführungsformen der Erfindung mit scharfer Spitze sind möglicherweise bevorzugt, wenn die Partikel in Raman-Spektroskopieanwendungen oder anderen verwendet werden, in denen Energiefeldeffekte wichtig sind. Die Enden von jedem gegebenen Partikel können gleich oder unterschiedlich sein. Die Kontur des Partikels kann in ähnlicher Weise so gewählt sein, dass sie zu der Sensitivität oder Spezifität des Assay beiträgt (es wird z. B. erwartet, dass eine undulierende Kontur das "Quenchen" von Fluorophoren verstärkt, die sich in Tälern befinden).
In vielen Ausführungsformen der Erfindung wird eine Anordnung oder Sammlung von Partikeln hergestellt. Die Mitglieder der Anordnung sind in bestimmten Ausführungsformen identisch, während die Anordnung in anderen Ausführungsformen aus mehreren unterschiedlichen Typen von Partikeln zusammengesetzt ist. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die die Verwendung von Anordnungen identischer Partikel aufweisen, kann die Länge von im Wesentlichen allen Partikeln bei Partikeln im Bereich von 1 μm bis 15 μm bis zu 10% variieren. Segmente von 10 nm Länge variieren um ± 5 nm, während Segmente im Bereich von 1 μm bis zu 10% variieren. Die Breite dieser Partikel kann zwischen 10 und 100%, vorzugsweise weniger als 50% und am meisten bevorzugt weniger als 10% variieren. Anordnungen von Partikeln mit Breiten- und Längenparameter, die diese Spezifikationen erfüllen, können direkt synthetisiert werden. Diese Anordnungen können alternativ nach bekannten Verfahren (z. B. Gradientenzentrifugation) aus einer heterogeneren Mischung von Partikeln abgetrennt werden. Dieselben Verfahren können auch zum Entfernen von zerbrochenen oder Zwillingspartikeln verwendet werden, die zwischen direkt synthetisierten Partikeln vorhanden sein können.
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung von Anordnungen oder Sammlungen von Nanobarcodes ein, die aus einer Vielzahl von Partikeln zusammengesetzt sind, die voneinander unterscheidbar sind. Anordnung oder Sammlung bedeutet hier nicht, dass die Nanopartikel, die diese Anordnung oder Sammlung stellen, in irgendeiner speziellen Weise geordnet oder organisiert werden. Eine derartige Anordnung wird als aus einer Vielzahl unterschiedlicher Typen oder "Aromen" von Partikeln gebildet angesehen. In einigen derartigen Anordnungen kann jeder der Nanobarcodes der Anordnung in irgendeiner Art funktionalisiert sein. In vielen Anwendungen ist die Funktionalisierung unterschiedlich und für das spezifische Aroma des Nanopartikels spezifisch. Die Anordnungen können 2 bis 10¹⁰ unterschiedliche und identifizierbare Nanopartikel einschließen. Bevorzugte Anordnungen schließen mehr als 10, mehr als 100, mehr als 1000 und in einigen Fällen mehr als 10.000 unterschiedliche Aromen von Nanopartikeln ein. Die Partikel, welche die erfindungsgemäßen Anordnungen oder Sammlungen bilden, sind in den meisten Ausführungsformen segmentiert. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Partikel einer Anordnung von Partikeln jedoch nicht notwendigerweise eine Vielzahl von Segmenten.
In den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in denen die Nanobarcodes einen Informationsgehalt enthalten, oder in denen eine Anordnung von Nanobarcodes eine Vielzahl von Partikeltypen enthält, sind die Partikeltypen neben der Natur der Funktionalisierung von jedem Partikeltyp unterscheidbar. In dieser Erfindung wird die Fähigkeit, Partikeltypen zu differenzieren oder die in einem Partikel kodierte Information zu interpretieren, als "Abfragen" oder "Ablesen" oder "Differenzieren" (Unterscheiden) oder "Identifizieren" des Nanopartikels bezeichnet. Diese Differenzierung der Parti kel kann mit jedem Mittel abgelesen werden, einschließlich optischer Mittel, elektronischer Mittel, physikalischer Mittel, chemischer Mittel und magnetischer Mittel. Der Partikel kann sogar unterschiedliche Abschnitte enthalten, die mit unterschiedlichen Mitteln abgefragt oder abgelesen werden. Eine Hälfte eines Partikels kann beispielsweise aus Segmenten zusammengesetzt sein, deren Muster und Formen mit optischen Mitteln abgelesen werden können, und die andere Hälfte kann aus einem Segment zusammengesetzt sein, deren Muster und Formen mit magnetischen Mitteln abgelesen werden können. In einem anderen Beispiel können zwei oder mehr unterschiedliche Abfrageformen auf den Partikel angewendet werden, z. B. können die Form oder Länge des Partikels mit optischen Mitteln und die Segmentmuster mit magnetischen Mitteln gelesen werden. Diese Mehrfachabfrageformen können auf den gesamten Partikel, ein gegebenes Segment des Partikels oder eine Kombination davon angewendet werden.
In vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere Segmente des Partikels, die Enden der Partikel oder der gesamte Partikel funktionalisiert werden. Mit Funktionalisierung oder Anbindung einer funktionalen Einheit ist gemeint, dass einige Spezies oder bestimmtes Material kovalent oder nicht-kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sein können. Zu Beispielen für Funktionalisierung gehört das Binden an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, an ein Oligonukleotid oder eine detektierbare Markierung, oft über einen Linker. In einigen Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Partikel mehrfach funktionalisiert. Der Begriff funktionale Einheit soll hier jegliche Spezies definieren, die Beschichtungen modifiziert, an diese bindet, an diese angehängt ist, oder kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche irgendeines Abschnitts des Nanocodepartikels gebunden ist.
Die Funktionalisierung der erfindungsgemäßen Partikel kann viele Formen annehmen. Funktionalisiert schließt, wie hier definiert, jegliche Modifikation der Oberfläche des Partikels ein, wie kovalent oder nicht kovalent modifiziert, derivatisiert oder anderweitig mit einer organischen, anorganischen, organometallischen oder Zusammensetzung, Monoschicht, Multischicht, Film, Polymer, Glas, Keramik, Metall, Halbmetall, Halbleiter, Metalloxid, Metallchalcogenid oder Kombinationen davon beschichtet. Obwohl diese Funktionalisierung am häufigsten an der äußeren Oberfläche des Partikels erfolgen kann, kann sie auch an den inneren Oberfläche des Partikels erfolgen, wie es bei einem porösen oder hohlen Partikel der Fall sein kann. Diese Funktionalisierung kann an individuellen Segmenten stattfinden. Ein Gold- und Silberpartikel kann somit am Gold und nicht am Silber funktionalisiert sein. Alternativ kann das Goldsegment einseitig (z. B. mit einem Typ von Antikörper) funktionalisiert sein, während das Silber anders funktionalisiert ist (z. B. mit einem anderen Typ von Antikörper). Als eine weitere Möglichkeit können beide Segmente in der gleichen Weise funktionalisiert sein (z. B. mit einem Typ von Antikörper), jedoch in unterschiedlichen Graden.
Der gesamte Partikel kann in anderen Ausführungsformen möglicherweise mit der gleichen Substanz beschichtet sein, es können nur bestimmte Segmente des Partikels beschichtet sein, oder verschiedene Segmente können unterschiedliche Beschichtungen aufweisen. Diese Beschichtungen können aus beliebigem Material zusammengesetzt sein. In Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Partikel beschichtet sind und Trennungen durch unterschiedliche Absorption/Desorption von dem Beschichtungsmaterial erfolgen, kann die Funktionalisierungsbeschich tung oder der Funktionalisierungsfilm jede organische funktionale Gruppe enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Säuren, Amine, Thiole, Ether, Ester, Thioester, Thioether, Carbamate, Amide, Thiocarbonate, Dithiocarbonate, Imine, Alkene, Alkane, Alkine, aromatische Gruppen, Alkohole, Heterocylen, Cyanate, Isocyanate, Nitrile, Isonitrile, Isothiocyanate und Organocyanide oder Kombinationen davon. Die Beschichtung oder Funktionalisierung kann jeden beliebigen anorganischen Koordinationskomplex enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- und 9-fach koordinierte Komplexe. Die Beschichtung oder Funktionalisierung kann jeden beliebigen organometallischen Komplex enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Spezies, die eine oder mehrere Metall-Kohlenstoff-, Metall-Silicium- oder Metall-Stickstoff-Bindungen enthalten. Die Beschichtungen oder Funktionalisierung der erfindungsgemäßen Partikel kann zusätzlich jegliche Kombination von organischen funktionalen Gruppen oder Molekülen, anorganischen oder organometallischen Spezies oder darauf basierenden Kompositen enthalten.
Die Funktionalisierung der erfindungsgemäß verwendeten Partikel kann an dem gesamten Partikel, auf ausgewählten Segmenten oder in bestimmten Ausführungsformen auf den Spitzen oder Enden der Partikel stattfinden. In einer solchen Ausführungsform können beide oder nur eine der Spitzen funktionalisiert sein, und die Art der Funktionalisierung kann sich an den Spitzen unterscheiden.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung enthält die funktionale Einheit oder Funktionalisierung des Partikels eine detektierbare Markierung. Eine detektierbare Markierung ist jegliche Spezies, die zur Detektierung, Identifizierung, Aufzählung, Verfolgung, Positionierung, Positionsvermessung und/oder Quantifizierung verwendet werden kann. Diese Messun gen können basierend auf Absorption, Emission, Erzeugung und/oder Streuung von einem oder mehreren Photonen, Absorption, Emissionserzeugung und/oder Streuung von einem oder mehreren Partikeln, Masse, Ladung, faraday'schen oder nicht-faraday'schen elektrochemischen Eigenschaften, Elektronenaffinität, Protonenaffinität, Neutronenaffinität oder jeder anderen physikalischen oder chemischen Eigenschaft bewirkt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Löslichkeit, Polarisierbarkeit, Schmelzpunkt, Siedepunkt, Tripelpunkt, Dipolmoment, magnetisches Moment, Größe, Form, Acidität, Basizität, isoelektrischen Punkt, Diffusionskoeffizient oder Sedimentationskoeffizient. Diese molekulare Markierung kann durch eine oder eine beliebige Kombination dieser Eigenschaften detektiert oder identifiziert werden.
In bestimmten anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Partikel monomolekulare Schichten einschließen. Diese monomolekularen Schichten können sich an den Spitzen oder Enden des Partikels oder zwischen Segmenten befinden. Beispiele für die Verwendung von monomolekularen Schichten zwischen Segmenten sind in dem folgenden Abschnitt mit dem Titel "Elektronische Vorrichtungen" beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung freistehender Nanobarcodes. Mit "freistehend" ist gemeint, dass Nanobarcodes, die durch irgendeine Form von Abscheidung oder Wachstum (Züchten) innerhalb einer Matrize produziert werden, sich von der Matrize gelöst haben. Diese Nanobarcodes können typischerweise frei in einer Flüssigkeit abgegeben werden und sind nicht permanent mit einer stationären Phase assoziiert. Nanobarcodes, die nicht durch irgendeine Form von Abscheidung oder Wachstum (Züchten) innerhalb einer Matrize produziert werden (z. B. selbstorganisierte Nanobarcodes) können als freistehend angesehen werden, selbst wenn sie nicht aus einer Matrize gelöst worden sind. Der Begriff "freistehend" bedeutet nicht, dass diese Nanopartikel in Lösung sein müssen (obwohl sie es sein dürfen), oder dass die Nanobarcodes nicht an eine Makrostruktur gebunden, in diese eingebaut oder Teil derselben sein können. In der Tat können in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung die Nanopartikel in einer Lösung, z. B. Farbe, dispergiert oder in eine polymere Zusammensetzung eingebaut sein.
Die erfindungsgemäßen Partikel können zur Kodierung von Informationen über ein Material oder Produkt verwendet werden. Es gibt zwei Hauptklassifikationen der Anwendungen: jene Ausführungsformen, in denen die Segmente des Partikels Informationsgehalt tragen, und jene, in denen die Segmente keinen Informationsgehalt haben. In jenen Ausführungsformen, in denen die Segmente Informationsgehalt haben, sind makroskopische Barcodes die beste Analogie. Konventionelle Barcodes weisen einen Streifen schwarzer Linien auf, wobei der Abstand zwischen den Linien und die Dicke der Linien zum "Kodieren" eines signifikanten Informationsgehalts verwendet werden. Es ist aufgrund der geringen Größe der erfindungsgemäßen Partikel in bestimmten Ausführungsformen möglich, die erfindungsgemäßen Partikel als molekulare oder zelluläre Markierung zu verwenden. Unverwechselbare Identifizierungs-Markierungen, die "gelesen" werden können, können an jedem Material einschließlich molekularer Entitäten angebracht werden, um molekulare Ereignisse zu verfolgen.
Zu den nicht informationshaltigen Modi der Erfindung gehören Ausführungsformen, in denen unterschiedliche Eigenschaften der Segmente der Partikel zur Bereitstellung von Matrizen im Nanomaßstab verwendet werden. Beispiele für unterschiedliche Reaktivitäten sind erkennbar, wenn die Partikel aus unterschiedlichen Metallsegmenten zusammengesetzt sind. Gold bindet thiolhaltige Verbindungen, Platin-Isocyanide; Kupfer-Dithiocarbamate; Nickel-Glyoxime. Die genau kontrollierten Dimensionen der erfindungsgemäßen Partikel ermöglichen in Kombination mit der unterschiedlichen Reaktivität der Segmente Anwendungen der Erfindung, in denen präzise Nanometertrennungen erforderlich sind. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel und des Elektroplattierverfahrens, wie es allgemein unten in 1 beschrieben wird, können relativ präzise Segmentlängen erzeugt werden. Molekulare Wechselwirkungen können untersucht werden, indem an der Oberfläche der Segmente gebundene Spezies getrennt werden und die Länge des Segments zwischen den unterschiedlich funktionalisierten Segmenten variiert wird, wodurch der Abstand zwischen den Spezies genau abgestimmt wird. In anderen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Partikel wegen der Eigenschaften, die durch Nebeneinanderstellung von Segmente erreicht werden, nützlich sein, wobei diese Eigenschaften physikalische, chemische, optische, elektrische und magnetische Eigenschaften einschließen. Chemische Reaktionen, die nur an der Oberfläche von Grenzflächen zwischen zwei Metallen stattfinden, können beispielsweise durch Katalyse unter Verwendung erfindungsgemäßer Partikel optimiert werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Partikel können nach vielen verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung eines speziellen Partikels kann oft eine Funktion der Beschaffenheit der Segmente sein, die den Partikel ausmachen. In den meisten Ausführungsformen der Erfindung wird eine Matrize oder Form verwendet, in welche die Materialien, die die verschiedenen Segmente bilden, eingebracht werden. Materialien mit definierten Poren sind für viele der erfindungsgemäße bevorzugten Partikel die bevorzugten Matrizen. Al₂O₃-Membranen, die konsistent bemessene Poren ent halten, gehören zu den bevorzugten Matrizen, obwohl auch poröse Polycarbonatmembranen, Zeolithe und Blockcopolymere verwendet werden können. Zu Verfahren zur Herstellung von Segmenten von Partikeln gehören galvanische Metallabscheidung, chemische Abscheidung, Bedampfen, chemische Selbstorganisation, Festphasen-Fertigungstechniken, Photochemie und Photolithographietechniken. Chemische Selbstorganisation ist ein Verfahren zur Herstellung von Partikeln aus vorgebildeten Segmenten, durch das die Segmente derivatisiert werden und eine chemische Reaktion zwischen Spezies an unterschiedlichen Segmenten eine Verbindung zwischen Segmenten erzeugt. Chemisch selbstorganisierte Nanopartikel haben die einzigartige Fähigkeit, dass sie durch Umkehr des chemischen Bindungsbildungsprozesses kontrollierbar zwischen Segmenten getrennt werden. Andere Verfahren, die für Nanobarcode-(und Matrizen)-Synthese verwendet werden können, schließen jene ein, die in Lösung (z. B. Mikrofluidsynthese) stattfinden und/oder photochemische Techniken, MEMS, Elektronenstrahl, Mikrokontaktdruck und Laserablationsverfahren beinhalten.
Eine Schlüsseleigenschaft bestimmter Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendeten Partikel ist, dass Unterschiede im Reflexionsvermögen der Komponentenmetalle durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden können, wenn die Nanostäbe segmentiert sind. Bei einem segmentierten Au/Pt/Au-Stab mit 200 nm Durchmesser und einer Gesamtlänge von 4 bis 5 μm werden die Segmente beispielsweise in einem konventionellen Lichtmikroskop leicht visualisiert, wobei die Au-Segmente einen Goldschimmer haben und die Pt-Segmente einen eher weißlichen hellen Glanz haben. Eine weitere Schlüsseleigenschaft der Materialien ist, dass die Länge der Segmente, wenn sie durch alternierende elektrochemische Reduktion von zwei oder mehr Metallionen in einer Membran hergestellt werden, vollständig durch a) die Zusammensetzung der Lösung und b) die Anzahl der Coulomb Ladung, die in jeder Stufe einer elektrochemischen Reduktion hindurchfließen, kontrolliert (und definiert) werden kann. Die Zahl der Segmente kann in ähnlicher Weise nach Wunsch variiert werden. Die Durchmesser und Querschnitte der Partikel können durch Auswahl (oder Erzeugung) von Membranen mit geeigneter Porengröße und Form kontrolliert werden. 5 zeigt ein Bild einer Sammlung von erfindungsgemäßen Nanopartikeln, die aus sechs unterschiedlichen Typen oder Aromen von Nanopartikeln zusammengesetzt sind. Dieses Bild zeigt die Möglichkeit, in einer Sammlung von Nanobarcodes zwischen den unterschiedlichen Typen von Nanobarcodes zu differenzieren.
Eine weitere Schlüsseleigenschaft bestimmter Ausführungsformen ist, dass ihre Oberflächen wie bei anderen Metall-Nanopartikeln unter Verwendung vieler verschiedener Ansätze leicht derivatisiert oder funktionalisiert werden können. Biomoleküle können auf diese Weise durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel in einer Weise an die Oberfläche gebunden werden, bei der die volle biologische Aktivität erhalten bleibt. Wie bereits erwähnt, ist die Funktionalisierung nicht auf Biomoleküle beschränkt, in der Tat können die Oberflächen mit irgendeiner organischen Verbindung, anorganischen Verbindung, Molekül oder Material einschließlich Kombinationen davon funktionalisiert werden.
Die Möglichkeit, einen Nanobarcode durch sein Reflexionsvermögen zu identifizieren, und die Möglichkeit, ihre Oberflächen mit Biomolekülen zu modifizieren, erlauben die Verwendung der Nanobarcodes als optische Markierung.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanobarcodepartikel können als Markierung in praktisch jeder Anwendung verwendet werden, in der heutzutage fluoreszierende Markierungen oder Quantenpunkte verwendet werden, oder im Zusammenhang mit praktisch jedem Assay- oder Analyseverfahren, das Fachleuten bekannt ist. Beispielsweise kann ein Standard-Immunoassay vom Sandwichtyp durchgeführt werden, wobei ein erfindungsgemäßes Nanobarcodepartikel als stationäre Phase dient, oder möglicherweise sogar als "Markierung". Die Oberfläche des Partikels wird funktionalisiert, um einen Antikörper für einen Analyten einzuschließen. Wenn sich ein Analyt an den Antikörper bindet, signalisiert ein zweiter, fluoreszierend markierter Antikörper die Anwesenheit des Analyten. Die Verwendung des Nanobarcodes ermöglicht Multiplexing, indem die Möglichkeit der Durchführung großer Assayzahlen zur gleichen Zeit geboten wird. Positive Signale können identifiziert und der Nanobarcode abgelesen werden, um festzustellen, welcher Analyt detektiert wurde. Das gleiche allgemeine Prinzip kann mit kompetitiven Assays verwendet werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
Wie bei makroskopischen Barcodes, die auf Kontrastunterschieden eng beabstandeter Linien aus Tinte oder anderen Materialien basieren, unterscheiden sich in vielen Ausführungsformen die erfindungsgemäßen Nanobarcodes bezogen auf unterschiedliche Muster des Reflexionsvermögens der verschiedenen Segmente oder werden auf dieser Basis identifiziert. Nanobarcodes unterscheiden sich von anderen Typen von optischen Markierungen oder in der Tat von jedem Typ von Markierung, der jemals auf ein molekulares System angewendet wurde (einschließlich Isotopen-Markierungen, radioaktiven Markierungen, molekularen Markierungen für kombinatorische Perlen, Markierungen auf Fluoreszenzbasis, Markierungen auf Raman-Basis, elektrochemischen Markierungen und anderen Markierungen, die Fachleuten bekannt sind) in der praktisch unbegrenzten Variabilität. Es gibt bei der Möglichkeit der Verwendung von 7 oder mehr unterschiedlichen Metallen, 20 oder mehr unterschiedlichen Segmenten und 4 oder mehr unterschiedlichen Segmentlängen und mit 3 oder mehr unterschiedlichen Stabbreiten praktisch eine unendliche Zahl unterschiedlicher Nanobarcodes, die hergestellt werden können. Selbst mit nur zwei Typen von Metallen und nur 10 Segmenten, mit nur einer Segmentlänge und mit nur einer Stabbreite lassen sich über 1000 unterschiedliche Typen von Nanobarcodes herstellen.
Obwohl die erfindungsgemäßen Partikel enorm nützlich sind, wenn eine Charge zur Zeit hergestellt wird, sind Verfahren zur Herstellung von Hunderten, Tausenden oder sogar Zehntausenden unterschiedlicher Aromen von Partikeln gleichzeitig möglich. Die erfindungsgemäßen Partikel können mit bestehenden Instrumenten abgelesen werden, z. B. einem Atomkraftmikroskop, optischen Lesegeräten, usw. Instrumente und Software, die speziell zum Identifizieren von Nanobarcodes vorgesehen sind, gehören auch zum Schutzumfang dieser Erfindung.
Ein weiteres unterscheidendes Merkmal von Nanobarcodes ist ihre Stabilität. Wenn sie beispielsweise aus Pt und/oder Au zusammengesetzt sind, zwei der dauerhaftesten und inerten bekannten Metalle, können sie erwärmt, verbrannt, gefroren und so weiter werden, ohne dass sich ihre relevanten physikalischen Eigenschaften ändern. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die Nanobarcodes hohem Druck ausgesetzt oder in ein Vakuum eingebracht (z. B. bei Verwendung in der Massenspektrometrie). Nanobarcodes sind somit verglichen mit den meisten Markierungen (z. B. Fluorophoren) vorteilhaft, bei denen die Umweltbedingungen die Auslesung erheblich stören können. Beispielsweise variiert das Emissionswellenlängenmaximum vieler Fluorophore mit der Polarität des Lösungsmittels. Obwohl dies zur Messung von Umweltbedingungen verwendet werden kann, ist es öfter zutreffend, dass eine derartige Empfindlichkeit die Messungen unnötig verkompliziert. Hohe Photonendurchflüsse können, was noch wichtiger ist, Fluorophore photo bleichen, ebenso wie zu viel Wärme und chemisch reaktive Spezies (Singulett oder Triplett-Sauerstoff, Ozon, usw.). Metall-Nanobarcodes sind gegenüber einer großen Zahl von umweltbedingten Störungen inert, und, was am wichtigsten ist, das unterschiedliche Reflexionsvermögen wird durch Photonenfluss nicht beeinflusst. Das unterschiedliche Reflexionsvermögen benachbarter Streifen ist somit eine bessere Ablesung als jene auf Basis von Photoemission im angeregten Zustand.
Ein einzigartiges Charakteristikum von Nanobarcodes ist die Fähigkeit, ihre Oberflächen unterschiedlich zu modifizieren. In Bezug auf Au/Pt-Nanobarcodes kann jedes Metall selektiv modifiziert werden, wodurch zwei unterschiedliche chemische Wege bereitgestellt wird, die in enger Nähe positioniert sind. Im Fall von Nanobarcodes ist die Fähigkeit gezeigt worden, unterschiedliche Moleküle auf die Pt- und Au-Streifen eines einzelnen Partikels aufzubringen. Die Fähigkeit zur rationalen Modifizierung ausgewählter Paare eines Nanopartikels ist ohnegleichen.
Es ist möglich, Pt-Streifen mit "Chemie A" selektiv zu modifizieren und Au-Streifen mit "Chemie B" zu modifizieren. Diese Fähigkeit führt zu der Möglichkeit, mehrere Sensoren orthogonal auf demselben Partikel zu organisieren und durch das räumliche Fluoreszenzmuster oder jedes andere unterscheidbare Signal unabhängig aus demselben Partikel auszulesen. Zwei separate Sandwich-Immunoassays können beispielsweise (unter Verwendung von fluoreszenz-markierten sekundären Antikörpern) auf einem einzigen Nanopartikel mit Au-Segmenten und Pt-Segmenten durchgeführt werden, die mit unterschiedlichen Antikörpern derivatisiert worden sind, wobei die Fluoreszenzintensität von den Au-Streifen proportional zu einer Antigenkonzentration ist und die Fluoreszenzintensität von den Pt-Streifen der anderen entspricht. Es sei auch darauf hingewiesen, dass ein anderer Partikel mit einem anderen Segmentmuster zwei vollkommen unterschiedliche Sensoren beherbergen kann: Es sind in jedem Fall die Sequenz und Abstände des Bars, die eine spezielle Chemie identifizieren. Es ist zudem auch möglich, kolloidale Stäbe zu erzeugen, die vier oder mehr Typen von Segmenten und mit vier oder mehr orthogonalen chemischen Wegen enthalten. Es ist erfindungsgemäß somit möglich, Multiplex-Assays wirklich auf Einzelpartikeln durchzuführen (zusätzlich zu dem innewohnenden Multiplexing, das durch Barcodezuordnung möglich ist). Als ein signifikantes Beispiel ermöglicht die Verwendung von Nanobarcodes mit vier orthogonalen chemischen Wegen (z. B. vier Segmenttypen, die jeweils eine einzigartige Chemie tragen) die Anordnung von Nukleinsäuren mit jeder möglichen Basensubstitution an einem spezifischen Rest an einem Partikel. Die Verwendung dieser Partikel führt zu rascher Multiplex-Einzel-Nukleotid-Polymorphismus(SNP)-Analyse.
Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Nanobarcodes ist die Fähigkeit, sie durch konventionelle Durchflusszytometrie zu identifizieren. Durch Lichtstreuung kann somit die Gesamtdimension eines Nanobarcodes identifiziert werden, der an einem Laser vorbeifließt, allgemein hängt die Streuung von Metall-Nanopartikeln bekanntermaßen von der Partikelgröße, Partikelform und Partikelzusammensetzung ab. Diese Streuung kann in mehreren Richtungen gemessen werden, um ein integriertes Streuprofil zu erhalten.
Die Wellenlängenabhängigkeit des Reflexionsvermögens des Metalls bietet ein weiteres interessantes und leistungsfähiges Detektierungsformat für Nanobarcodes. Wenn man beispielsweise die Auftragungen von Reflexionsvermögen gegen Wellenlänge von Au und Pt betrachtet, gibt es einen Kreuzungspunkt (2). Es gibt in anderen Worten eine Wellenlänge, bei denen das Reflexionsvermögen der Metalle gleich ist. Dies wird als Isos beste des Reflexionsvermögens bezeichnet. Bei der Isosbeste des Reflexionsvermögens ist das Reflexionsvermögen eines Nanobarcodes einheitlich, selbst wenn es eine Variation der Zusammensetzung entlang seiner Länge gibt. Diese Isosbeste des Reflexionsvermögens kann, was von Bedeutung ist, durch Binden von Partikeln (z. B. Metall oder organisch) an die Nanobarcodeoberfläche oder durch andere Mittel gestört werden. Die Molekülerkennung oder irgendwelche anderen Ereignisse, die zu Binden (oder Lösen der Bindung) von Partikeln an der Oberfläche eines Nanobarcodes führen, können verwendet werden, um jenes Ereignisses mittels Reflexionsvermögen zu detektieren. Beispielsweise betrachten wir 100 unterschiedliche Aromen von Nanobarcodes, die jeweils mit einem anderen Einfang-Antikörper in Lösung assoziiert sind, die 100 entsprechenden sekundären Antikörpern entsprechen, die jeweils mit einem kolloidalen Ag-Nanopartikel markiert sind. Die Partikel werden an der Isosbeste des Reflexionsvermögens untersucht und erscheinen alle einheitlich. Die Einbringung einer Lösung, die ein oder mehrere der Antigene enthält, führt zur Bildung von Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexe an unterschiedlichen Nanobarcodes. An diesen und nur diesen Nanobarcodes werden die Reflexionsvermögenswerte der Metalle gestört (verändert) und sind somit nicht länger Isosbesten, womit gemeint ist, dass diese Nanobarcodes über ihre Segmentmuster identifiziert werden können. Isosbesten des Reflexionsvermögens und das Stören derselben ermöglichen somit rasches Screening in komplexen Multiplex-Assays, da erwartet werden kann, dass ein "Signal" (z. B. ein wahrnehmbares Muster) nur bei einer kleinen Untergruppe der Nanobarcode-Aromapopulation auftritt.
Es sollte erkannt werden, dass über die einfache Identifizierung unter Verwendung der Isosbeste des Reflexionsvermögens hinaus auch die Intensität des unterschiedlichen Reflexions vermögens in dem genannten Beispiel zur Quantisierung verwendet werden kann.
2 zeigt eine graphische Darstellung des Reflexionsvermögens gegen Wellenlänge für Massen-Pt und Au. Wegen des finite Größen-Effekts würde sich die Auftragung für Nanopartikel etwas unterscheiden, die beiden relevanten Punke sind jedoch, dass (a) das Reflexionsvermögen bei den meisten Wellenlängen unterschiedlich ist (wodurch ein Kontrastmechanismus geliefert wird) und (b) sie bei etwa 600 nm dasselbe Reflexionsvermögen haben (eine Isosbeste des Reflexionsvermögens). 6 zeigt Bilder von Gold- und Silber-Nanopartikeln bei 400 nm und 600 nm, die dieses Prinzip zeigen. Es ist wohl bekannt, wie das Massenreflexionsvermögen der dünnen Metallfilme im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums von der Morphologie abhängt, dies trifft insbesondere auf Edelmetalloberflächen zu, bei denen Rauheitsmerkmale im Nanometermaßstab als Streustellen für Oberflächenplasmone wirken können. Dies führt zu wesentlich erhöhter Antigensensitivität. Wenn man dieses Konzept auf Barcodes überträgt, ist die Idee, dass durch Molekülerkennung induzierte Bindung von kolloidalem Au an die Au-Segmente eines kolloidalen Barcodes das Massenreflexionsvermögen verändert wird und somit an der Isosbeste des Reflexionsvermögens ein Kontrast des Reflexionsvermögens entsteht. Man kann die kolloidalen Metall-Nanopartikel somit als Kontrastmittel ansehen. Dieser Reflexionsvermögen-Kontrastmechanismus – der im Wesentlichen ein Lösungsanalogon zur Oberflächenplasmonresonanz ist – birgt das Potential zu außerordentlicher Sensitivität. Es ist gezeigt worden, dass mit kommerziellen Instrumenten die Detektierung eines kolloidalen Au-Partikels mit einem Durchmesser von 40 nm auf 10 μm² leicht erreichbar ist. Weil die Oberfläche des Barcodes viel kleiner als 1 μm² sein kann, wird erwartet, dass das Binden eines ein zigen Partikels an ein einziges Segment detektierbar ist; Verfahren zur Begrenzung der kolloidalen Abdeckung eines interessierenden Biomoleküls auf eins pro Partikel sind ferner möglich.
Ein weiterer sehr signifikanter Aspekt des Detektierungsmechanismus dieser Ausführungsform ist, dass Barcodes, die kolloidales Au binden, Kontrast zeigen, was beim Screening ein enormer Vorteil ist. In Lösung können somit 100 unterschiedliche Typen von Barcodes vorhanden sein, die jeweils mit einem anderen Einfangmolekül und den geeigneten kolloidalen Au-markierten Erkennungselementen derivatisiert sind. Wenn man an der Isosbeste des Reflexionsvermögens abfragt, wären die Stäbe alle ohne Merkmale. Die Einbringung einer Lösung mit einer Unbekannten würde dazu führen, dass nur ein Typ von Barcode aufleuchtet, wobei der Analyt durch den Code identifiziert wird, und dass die Analytkonzentration durch die integrierte Änderung des Reflexionsvermögens definiert ist. Wie bei dem Ansatz des molekularen Leuchtturms, der zum Detektieren längerer Oligonukleotide in der Molekularbiologie durch selektives Unterbrechen von Fluoreszenzquenchen verwendet wird (siehe z. B. Piatek et al., Nature Biochem 16, 359–363 (1998)), vereinzelt dieses Verfahren Partikel, an denen chemische Ereignisse stattgefunden haben, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass das Verfahren vollständig allgemein ist und (unter anderem) auf die folgenden Systeme Oligo-Oligo-, Antikörper-Antigen- und Ligand-Rezeptor-Systeme angewendet werden kann. Obwohl dieser Effekt bereits in Bezug auf kolloidales Au erörtert wurde, ist er auch mit anderen Metallpartikeln wie Ag beobachtet worden. Die Störung der Isosbesten des Reflexionsvermögens kann in der Tat mit einer Anzahl nicht-metallischer Materialien, wie Oxiden, bewirkt werden. Allgemein kann jedes beliebige Material, das an die Oberflächen der Segmente bindet, welche die Isosbe ste ausmachen, und in unterschiedlicher Weise in Wechselwirkung tritt, die Isosbeste stören. An einer Isosbeste zwischen Ag und Au ist beispielsweise zu erwarten, dass ein intensiv absorbierendes Chromophor mit einer maximalen Extinktion bei ungefähr 400 nm (z. B. Cytochrom c) mit Ag stärker in Wechselwirkung tritt als mit Au. Eine derartige Wechselwirkung kann ausreichen, um die Isosbeste des Reflexionsvermögens zu stören.
Ein alternativer Ansatz, um das Reflexionsvermögen zu stören, ist über Differentialbindung. Obwohl in dem vorhergehenden Beispiel die kolloidalen Metallpartikel an den gesamten Nanobarcode gebunden waren, muss dies nicht unbedingt der Fall sein. Wenn auf unterschiedlichen Segmenten unterschiedliche chemische Wege angeordnet sind und die Bindung des Partikels an nur einem Segment stattfindet, wird die Isosbeste des Reflexionsvermögens gestört.
Somit kommen mindestens zwei unterschiedliche Wege für die Analytquantifizierung in Frage, wobei in einem Fall die Quantifizierung auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität, die aus einem speziellen Nanobarcode ausgeht (und aus einem Molekül oder teilchenförmigen Fluoreszenz-Markierung stammen kann), oder aus der Intensität des Differentialreflexionsvermögens erfolgt. In beiden Fällen wird das Reflexionsvermögen auch zum Identifizieren der Nanobarcodes verwendet. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass eine Vielfalt anderer Schemata sowohl für die Analytbestimmung als auch für die Identifizierung des Nanobarcode-Aromas verwendet werden kann. Diese können Fluoreszenz-Markierungen, elektrochemische Markierungen, radioaktive Markierungen, Massen-Markierungen (wie jene, die in der Massenspektrometrie verwendet werden), andere Molekül-Markierungen (wie jene, die in der kombinatorischen Chemie verwendet werden) oder andere teilchenförmige Markierungen zur Analytquantifizierung einschließen, ohne darauf begrenzt zu sein. Nanobarcodes scheinen in der Tat mit allen bekannten Analytdetektierungsmechanismen kompatibel zu sein. Für die Nanobarcode-Identifizierung können in ähnlicher Weise viele verschiedene Detektierungsmechanismen verwendet werden, einschließlich optischen Detektierungsmechanismen (logarithmische Extinktion, Fluoreszenz, Raman, Hyperraman, Rayleigh-Streuung, Hyperrayleigh-Streuung, CARS, Summenfrequenzerzeugung, degeneriertes Vierwellenmischen, Vorwärtslichtstreuung, Rückstreuung oder gewinkelte Lichtstreuung), Rastersondentechniken (Nahfeld-Rasterlichtmikroskopie, AFM, STM, chemische Kraft- oder Lateralkraftmikroskopie und andere Variationen), Elektronenstrahltechniken (TEM, SEM, FE-SEM), elektrische, mechanische und magnetische Detektierungsmechanismen (einschließlich SQUID), ohne darauf begrenzt zu sein. Obwohl sich die obige Erörterung auf das Reflexionsvermögen am Isobestenpunkt bezieht (d. h. jenem, der auf einer optischen Eigenschaft basiert), können Nanobarcode-Assays andere Punkttypen nutzen, die auf anderen physikalischen oder chemischen Eigenschaften basiere, um die gleichen Vorteile zu erreichen (z. B. eine "Isobeste der Leitfähigkeit"). Allgemeiner kann jede Eigenschaft, die sich von Material zu Material ändern kann, in ähnlicher Weise ausgenutzt werden, vorausgesetzt, dass es Mittel zum Manipulieren des Zustands gibt, so dass die Eigenschaft in den vorliegenden Materialien die gleiche ist. Es ist beispielsweise von mehreren Gruppen gezeigt worden, dass die Bindung einer Monoschicht (oder weniger) von Molekülen bei dünnen Au-Filmen die Leitfähigkeit stören kann. Dieses Konzept kann in ähnlicher Weise auf Bindung eines magnetischen Partikels an einen Nanobarcode angewendet werden, wobei unterschiedliche Segmente bei einem magnetischen Feld dieselbe Suszeptibilität und bei einem anderen magnetischen Feld andere Suszeptibilitäten haben.
Obwohl sich viele Ausführungsformen auf Detektierungsschemata auf Antikörperbasis konzentrieren, sollte man erkennen, dass sich diese Prinzipien gleich gut auf die Detektierung von Oligonukleotiden, cDNA, mRNA, Proteinen, Liganden, kleinen Molekülen, Lipiden, Zuckern, anorganischen Anionen und Kationen, Zellen oder Zellkomponenten, Organen, Organsystemen oder sogar ganzen Organismen anwenden lassen. Nanobarcodierung kann in anderen Worten prinzipiell zum Detektieren beliebiger und/oder aller Spezies verwendet werden, die sich in chemischen oder biologischen Systemen befinden und so klein wie Moleküle und so groß wie Organismen sind. Da Nanobarcodes ausreichend klein sind, um in Zellen einzudringen, und prinzipiell ausreichend klein gefertigt werden können, um in Komponenten von Zellen einzudringen (z. B. Mitochondrien, Zellkern, usw.), gibt es für ihre Verwendung in biologischen Systemen keine Einschränkung.
Es sollte darüber hinaus klar sein, dass, obwohl viele Ausführungsformen der Erfindung Quantifizierung betreffen, Nanobarkodieren, wie seine makroskopische Entsprechung, zur Verfolgung, Lokalisierung oder zum Folgen von Material in nicht-quantivativer Weise verwendet werden kann. Diese Partikel können in der Tat zum Markieren, Detektieren, Quantifizieren, Folgen, Verfolgen, Lokalisieren, zur Bestandaufnahme, zum Erkennen, Vergleichen, Identifizieren, Entdecken, Ausmachen, Klassifizieren, Sehen, Kategorisieren, Markieren oder Finden von Materialien von Größen, die so klein wie individuelle Moleküle sind, bis zu Größen von Menschen, Autos, Tanks, Brücken, Gebäuden, usw. verwendet werden.
Es sollte zudem klar sein, dass viele Ausführungsformen der Erfindung die Nützlichkeit in biologischen Systemen betreffen, obwohl Nanobarkodieren in den genannten Weisen gleichermaßen in nicht-biologischen Systemen nützlich ist, ein schließlich, jedoch nicht begrenzt auf Chemikalien, Moleküle, Materialien, Partikel, Farben, Befestigungsmittel, Reifen, Papier, Dokumente, Pillen und so weiter. Die erfindungsgemäßen Partikel können, wenn sie als Markierung oder Kennzeichnung verwendet werden, in beliebiger Weise mit dem Material assoziiert sein, welches markiert wird. Diese spezielle Markierung kann ausgewählt und identifiziert werden, so dass es Informationen hinsichtlich des Materials liefert, mit dem es assoziiert ist. Eine Markierung innerhalb einer Farbe kann beispielsweise das Herstellungsdatum, die in der Farbmischung verwendeten Chemikalien, den Namen des Herstellers, photodynamische Charakteristika der Farbe oder andere Informationseinheiten in beliebiger Zahl kodieren. Wenn wir sagen, dass der Nanobarcode Informationen kodiert, impliziert das nicht, dass die Informationen von dem Teilchen ausgelesen werden können. In den meisten Ausführungsformen zeigt es einen spezifischen Typ von Nanobarcode, und es wird dann auf Datensätze verwiesen, die jenen Typ von Nanobarcode betreffen.
Die Nanopartikel sind in einer Ausführungsform der Erfindung basierend auf ihrer Größe, Form oder Zusammensetzung differenzierbar. In dieser Ausführungsform hat jeder Partikel in einer Anordnung oder Sammlung von Partikeln mindestens eine Dimension, die kleiner als 10 um ist. Die Partikel haben in bevorzugten Ausführungsformen eine Dimension kleiner als 500 nm und insbesondere kleiner als 200 nm.
Eine solche Anordnung von Partikeln, die aus beliebigem Material zusammengesetzt sein können, ist aus mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3 und am meisten bevorzugt mindestens 5 Typen von Partikeln zusammengesetzt, wobei jeder Partikeltyp von einem anderen Partikeltyp unterscheidbar. Da die Typen von Partikeln in der bevorzugten Ausführungsform aus einem Einzelmaterial zusammengesetzt sein können, und da unterschiedli che Typen von Partikeln aus dem gleichen Material wie andere Typen von Partikeln zusammengesetzt sein können, basiert die Unterscheidung der Typen auf der Größe oder Form der Partikeltypen. Eine Anordnung von erfindungsgemäßen Partikeln kann beispielsweise aus 5 unterschiedlichen Typen von goldenen stabförmigen Nanopartikel zusammengesetzt sein. Obwohl jeder Typ von stabförmigem Partikel eine Breite oder einen Durchmesser von weniger als 10 μm hat, sind die unterschiedlichen Typen von Partikeln basierend auf ihrer Länge unterscheidbar. In einem anderen Beispiel bilden 7 Typen von kugelförmigen Silberpartikeln eine Anordnung. Die unterschiedlichen Typen von Partikeln sind basierend auf ihrer relativen Größe unterscheidbar. In einem anderen Beispiel bilden 8 Typen von stabförmigen Partikeln, die alle aus dem gleichen polymeren Material zusammengesetzt sind, eine Anordnung, obwohl jeder Typ von stabförmigen Partikeln dieselbe Länge hat, sind sie basierend auf ihrem Durchmesser und/oder ihrer Querschnittform unterscheidbar.
Die Nanopartikel dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können wie oben beschrieben funktionalisiert und in den gleichen Typen von Anwendungen wie die segmentierten Nanobarcodepartikeln verwendet werden. Bei einer erfindungsgemäßen Anordnung von Partikeln können die Partikeltypen aus demselben Material zusammengesetzt sein, dies ist jedoch nicht unbedingt notwendig.
Ein weiteres Beispiel für eine Anordnung von Nanopartikeln, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fällt, ist eine Anordnung von Partikeln, wobei jeder Typ davon die gleiche Größe und Form (mit mindestens einer Dimension unter 10 μm) haben kann und die Partikeltypen auf Basis ihrer Zusammensetzung unterscheidbar sind. Eine Anordnung von erfindungsgemäßen Partikeln kann beispielsweise aus 5 unterschiedlichen stabförmigen Nanopartikeln mit der gleichen Größe und Form zusammengesetzt sein. In diesem Beispiel werden die unterschiedlichen Typen von Partikeln auf Basis des Materials unterschieden, aus dem sie hergestellt sind. Ein Typ von Nanostab ist somit aus Gold, ein anderer aus Platin, ein anderer aus Nickel, ein anderer aus Silber und der restliche Typ aus Kupfer hergestellt. Alternativ kann jeder Partikeltyp eine andere Menge eines Farbstoffmaterials oder einen anderen Prozentsatz an magnetisierbarem Metall enthalten. In jedem Fall ist ein gegebener Partikeltyp von den anderen Partikeltypen in der Anordnung oder Sammlung unterscheidbar.
Diese Ausführungsform der Erfindung schließt natürlich Anordnungen oder Sammlungen ein, in denen die Kombinationen von Größe, Form und Zusammensetzungen variiert werden. Der kritische Aspekt der Anordnung von Partikeln dieser Ausführungsform ist die Tatsache, dass alle Partikeltypen mindestens eine Dimension kleiner als 10 μm haben, und dass die Partikeltypen mithilfe irgendeines Mittels von den anderen Partikeltypen in der Anordnung unterscheidbar sind. In dieser Ausführungsform können die unterschiedlichen Typen von Partikeln funktionalisiert sein, und die unterscheidbaren Charakteristika des Typs von Partikeln kodieren die Art der Funktionalisierung. Mit Kodieren der Art der funktionalen Einheit ist gemeint, dass die spezifischen identifizierbaren Merkmale des Nanopartikels selektiv an eine bekannte funktionale Einheit gebunden sein können, so dass ein Schlüssel oder Log gehalten werden kann, mit dem die Art der assoziierten funktionalen Einheit bekannt ist, wenn erst einmal der spezifische Partikeltyp identifiziert worden ist.
HERSTELLUNG VON METALLISCHEN SEGMENTIERTEN PARTIKELN
Das bevorzugte Syntheseprotokoll, das zur Herstellung metallischer Nanobarcodes gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, basiert auf der Arbeit von Al-Mawlawi et al. (D. Al-Mawlawi, C. Z. Liu, M. Moskovits, J. Mater. Res. 1994, 9, 1014; C. R. Martin, Chem. Mater. 1996, 8, 1739) über matrizengesteuerte elektrochemische Synthese. In diesem Ansatz werden Metalle elektrochemisch im Inneren einer porösen Membran abgeschieden. Das Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich in mehrfacher Hinsicht von früheren Arbeiten, einschließlich der Folgenden: Erstens erfolgt das Elektroplattieren in einem Ultraschallbad. Zweitens wird die Temperatur mit einem Umlauf-Temperaturbad kontrolliert. Diese ersten beiden Modifikationen erhöhen die Reproduzierbarkeit und Monodispersität der Stabproben, indem der Massentransport von Ionen und Gasen durch die Poren der Membran erleichtert wird. Drittens werden Stäbe mit mehreren Streifen durch sequentielle elektrochemische Reduktion von Metallionen (z. B. Pt²⁺, Au⁺) in den Poren der Membran hergestellt. Weil die Länge der Segmente durch Steuerung der Strommenge, die in jeder Elektroplattierstufe hindurchgeleitet wird, eingestellt werden kann, erinnert der Stab an einen "Barcode" im Nanomaßstab, wobei jede Segmentlänge (und -identität) vorab programmierbar sind. Obwohl die Breite der Stäbe und die Segmentlängen typischerweise Nanometerdimensionen haben, ist die Gesamtlänge so, dass sie in bevorzugten Ausführungsformen direkt in einem Lichtmikroskop visualisierbar sind, wobei das unterschiedliche Reflexionsvermögen der Metallkomponenten genutzt wird.
Es gibt viele Parameter in der Nanostabsynthese, die abstimmbar sind, so dass es theoretisch möglich ist, viele Millionen unterschiedlicher Muster zu erzeugen, die unter Verwen dung von konventioneller Lichtmikroskopie unverwechselbar unterscheidbar sind. Das wichtigste Charakteristikum, das verändert werden kann, ist die Zusammensetzung der gestreiften Stäbe. Die einfachste Form eines Nanopartikels ist eine mit nur einem Segment. Hierfür sind mehrere unterschiedliche Typen dieser massiven Barcodes hergestellt worden. Indem einfach nur eine Plattierlösung während der Herstellung verwendet wird, wird ein massives Nanopartikel produziert.
Um Nanobarcodes aus zwei Segmenten zu erzeugen, können zwei Metalle (z. B. Au, Ag, Pd, Cu, usw.) sequentiell oder simultan elektroplattiert werden, um Legierungen zu bilden. Nanobarcodes können auch unter Verwendung von drei unterschiedlichen Metallen erzeugt werden. Die Synthese eines Au/Pt/Au-Stabs kann mit 1 C Au, 8 C Pt und 1 C Au bewirkt werden. Die nominellen Dimensionen der Segmente sind 1 μm Au, 3 μm Pt, 1 μm Au. Die Nanocodes aus 5 Segmenten, Ag/Au/Ag/Au/Ag, wurden durch sequentielles Plattieren und optionales Spülen des passenden Metalls erzeugt. Es ist in einigen Ausführungsformen möglich, dass alle Metalle in Lösung enthalten sind, wobei zur Steuerung der Abscheidung jedoch der Ladungspotentialstrom variiert wird. Ein Nanobarcode aus neun Segmenten, Au/Ag/Au/Ag/Au/Ag/Au/Ag/Au, der in 3 gezeigt ist, ist auch hergestellt worden. Die Zahl der Segmente kann gemäß gewünschten Spezifikationen verändert werden.
Der nächste kontrollierbare Faktor ist der Durchmesser (hier mitunter als Breite bezeichnet) der individuellen Stäbe. Viele der beschriebenen Nanobarcodes wurden unter Verwendung von Membranen mit einem Porendurchmesser von 250 nm synthetisiert. Durch Veränderung des Porendurchmessers können Stäbe mit unterschiedlichem Durchmesser hergestellt werden. Au-Stäbe sind in einer Membran synthetisiert worden, die Poren mit 10 μm Durchmesser, 40 nm Poren und/oder Poren im Bereich von 200 bis 300 nm aufweist.
Die Enden der Stäbe haben in der Regel abgerundete Enden oder flache Enden. Ein TEM-Bild eines Au-Stabs, das durch Umkehr des Stromflusses (von Reduktion mit –0,55 mA/cm² auf Oxidation mit +0,55 mA/cm²) und Entfernen eines Teil des Golds von der Spitze des Stabs hergestellt war, erzeugte einen Dorn, der sich von der Spitze des Stabs erstreckte. Es können auch verzweigte Enden erzeugt werden. Dies kann typischerweise kontrolliert werden, indem die Menge an Metall kontrolliert wird, die in die Membran plattiert wird. Die Ränder der Membranporen haben eine Neigung zur Verzweigung, was zu diesem Strukturtyp führt.
Ein zusätzlicher Weg zur Veränderung der Enden der Stäbe ist die Kontrolle der Abscheiderate. Goldstäbe (2 C insgesamt, 0,3 μm) wurden mit einer Stromdichte von 0,55 mA/cm² plattiert. Dann wurde die Stromdichte auf 0,055 mA/cm² reduziert, und 0,1 C Au wurde plattiert. Das letzte Segment der Goldabscheidungen ist ein hohles Rohr entlang der Wände der Membran.
Um viele Tausende Aromen von Nanostäben in praktischen Mengen zu produzieren und um Moleküle an den meisten oder allen anzubringen, sind neue kombinatorische Synthesetechniken erforderlich. Zu dem Schutzumfang der Erfindung gehören etliche Syntheseausführungsformen. Jeder Ansatz hat in Abhängigkeit von der speziellen Anwendung und der erforderlichen Zahl von Typen und Gesamtzahl von Nanostäben, die für die Anwendung erforderlich sind, Vorteile und Nachteile.
Drei der Ausführungsformen basieren auf bestehenden Verfahren unter Verwendung von Membranen mit definierten Poren: (i) Die erste Technik erzeugt Hunderte bis vielleicht wenige Tausende Typen von Nanostäben durch Lithographiemusterbildung des Rückseitensilbers, das auf der Membran abgeschieden ist, zu isolierten Inseln, wobei jede Insel einen individuell adressierbaren elektrischen Kontakt bildet. Jede Insel weist beispielsweise eine ausreichende Oberfläche auf, um zwischen 10⁶ und 10⁸ individuelle Stäbe zu enthalten, die alle von demselben Typ sind (es sei darauf hingewiesen, dass mehrere Nanostäbe in jeder Pore synthetisiert werden können, da die Membrandicke und daher die Porenlänge viel größer als die Nanostablänge ist. Jeder Nanostab kann von den anderen in derselben Pore mit einem Silberbolzen getrennt werden, der später aufgelöst wird. Dies kann die Gesamtausbeute um den Faktor 10 erhöhen). Die Membran wird dann unter sorgfältiger Ausrichtung auf einer "Nagelbett"-Vorrichtung positioniert, wobei individuelle, unter Federspannung stehende Stifte jede Elektrode an der Membran kontaktieren. Am Nagelbett angebrachte computergesteuerte Schaltungen können jede Elektrode individuell an- oder abschalten. Während des Elektroplattierverfahrens wird jede Insel mit unverwechselbaren Kombinationen von Metalltypen und -dicken plattiert. Auf diese Weise produziert jede Insel Stäbe mit unterschiedlichen Längen, unterschiedlichen Streifenzahlen und unterschiedlichen Materialkombinationen, wodurch größtmögliche Designflexibilität möglich wird. (ii) Der erste Ansatz ist hinsichtlich der Zahl der Typen von Stäben, die synthetisiert werden können, durch die Zuverlässigkeit und Packdichte der Nagelbettvorrichtung begrenzt. Um diese Einschränkung zu vermeiden, kann die Nagelbettvorrichtung durch einen Flüssigmetallkontakt ersetzt werden. Um das Flüssigkeitsbad daran zu hindern, gleichzeitig jede Elektrode zu kontaktieren, kann die Rückseite der Membran in einem Muster aus einer nicht-leitenden Beschichtung versehen werden. Um die Elektroden während der Synthese individuell zu adressieren, wird das Muster zwischen den Elektroplattierstufen entfernt und ersetzt. Dieser Ansatz ermöglicht eine viel höhere Dichte isolierter Inseln, und daher können mehr Typen von Stäben syn thetisiert werden. Mit Inselabständen von 100 μm, die sich mit Lithographiestrukturierung leicht erreichen ließen, könnten bis zu 10⁵ Typen von Stäben synthetisiert werden. Da die Gesamtanzahl der Poren in jeder Membran konstant ist, gibt es proportional weniger Stäbe jedes Typs. (iii) Die ersten beiden Ansätze verwenden kommerziell erhältliche Aluminiumoxidmembranfilter, die eine Porengröße und Dichte haben, die für Nanostabsynthese geeignet sind. Die Membrandicke ist in der Regel jedoch größer als nötig, was infolge des ungleichförmigen Massentransports in die Poren während des Elektroplattierens zu Variabilität von Stab- und Streifenlängen führen kann. Die in diesen Membranen erhältlichen größten Membranen (und somit die Nanostabbreiten) sind 250 nm, und es wäre für einige Anwendungen erwünscht, Stabbreiten von 1 μm oder mehr zu haben (dies könnte auch für Ausführen mit Breiten von weniger als 1 μm verwendet werden). Um sich dieser Probleme anzunehmen, können Porenmatrizen mit Photolithographietechniken aufgebaut werden, die höchste Kontrolle über die Porendimensionen und -längen ergeben und die Designflexibilität und Qualität der resultierenden Nanostäbe erhöht. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein mit Positiv-Photoresist beschichteter Wafer einem Interferenzlistmuster ausgesetzt, wobei eine ähnliche Technik verwendet wird, wie sie für Lithographie-erzeugte Beugungsgitter verwendet werden. Zwei rechtwinklige Belichtungen und anschließende Entwicklung ergib ein Array vertikaler Löcher in dem Photoresist. Das Elektroplattieren von Metall in die Löcher und die Entfernung des Photoresists ergibt einen neuen Matrizentyp für die matrizen-gesteuerte Synthese. Die Form und der Durchmesser der Nanostäbe können durch Einstellen der Lichtquelle und des resultierenden Musters der stehenden Welle kontrolliert werden. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass die Matrizendicke, die dieselbe wie die Porenlänge ist, gemäß der Länge der Stäbe maßgeschneidert werden kann, wodurch die Gleichförmigkeit der Elektroplattierung über die Membran verbessert wird. Mit dieser Technik können 10¹⁰ bis 10¹² Typen von Nanostäben auf einem Einzelsubstrat konstruiert werden. Die beiden oben beschriebenen Ansätze können zum Synthetisieren vieler Typen von Nanobarcodes aus einem einzigen Wafer verwendet werden. (iv) Ein weiterer Ansatz verwendet die obigen individuell angepassten, lithographiedefinierten Poren und erreicht die höchstmögliche Designflexibilität durch Verwendung von neuem lichtgeführtem Elektroplattieren. Die Matrizenporen werden ebenso wie in dem dritten Ansatz aufgebaut, jedoch oben auf einem lichtempfindlichen Halbleiterwafer. Die Porenseite des Wafers wird in Elektroplattierreagenz getaucht, und die andere Seite wird mit Lichtmustern beleuchtet. Die Lichteinwirkung wird verwendet, um einen Photostrom in dem Wafer zu erzeugen und den Plattierstrom für jede leitende Zone in dem Wafer an- oder abzuschalten. Ein computergesteuerter räumlicher Lichtmodulator beleuchtet selektiv unterschiedliche Zonen zu unterschiedlichen Zeiten, so dass jede Zone einem anderen computergesteuerten Plattierrezept ausgesetzt wird. In Abhängigkeit von der Auflösung des optischen Systems, das den Wafer belichtet, kann dies zu 10⁴ bis 10⁶ separaten Nanostabaromen führen, die auf einem einzigen Wafer synthetisiert werden. Mit 10¹² Gesamtporen pro Wafer können 10⁶ bis 10⁸ Nanostäbe mit jedem Aroma synthetisiert werden.
Die erfindungsgemäß brauchbaren Partikel können auch im Großmaßstab durch Automatisierung des grundlegenden Elektroplattierverfahrens hergestellt werden, das in Beispiel 1 beschrieben ist. Eine Vorrichtung, die eine Reihe von Membranen und separaten Elektroden enthält, kann beispielsweise zur Herstellung einer großen Zahl unterschiedlicher Aromen von Nanopartikeln in einer effizienten computergesteuerten Weise verwendet werden.
Unabhängig von dem verwendeten Syntheseansatz ist eine letzte kritische Stufe erforderlich, um jeden einzigartigen Nanostabtyp zu separieren und alle Nanostäbe in Lösung, zur Oberflächenvorbereitung oder Denaturierung freizusetzen. Jeder der obigen Syntheseansätze kann das gleiche Verfahren zur Nanostabseparierung und -freisetzung verwenden. Es gibt zwei Haupttechniken. (i) Nach der Synthese kann unabhängig davon, ob auf der Membran oder planarem Substrat, Chiptrenntechniken aus der Halbleiterindustrie verwendet werden. Das Substrat wird mit einem flexiblen Klebstoffmaterial kombiniert. Das Substrat wird von einer Dicing-Säge durchtrennt, wodurch der Klebstoff intakt bleibt. Der Klebstoff wird dann gleichförmig gereckt, um für physikalische Separierung zwischen jeder Insel zu sorgen, die dann jeweils automatisch von einem Roboter aufgenommen und in einer separaten Mikromulde positioniert wird. Eine automatisierte Fluidstation wird zur Einbringung der erforderlichen Ätzlösungen verwendet, um jeden Stab in Lösung freizusetzen. (ii) Eine alternative Ausführungsform ist ein passendes Mikromuldensubstrat, das Mulden in dem gleichen Muster wie die individuellen Inseln in der Membran und eine passende Anordnung von Kanälen enthält, durch die Ätzlösungen fließen. Eine Membran oder ein Wafer kann sandwichartig zwischen dem Mikromuldensubstrat und der Kanalanordnung angeordnet werden. Dann wird Ätzfluid in die Kanäle eingebracht, die den Ag-Träger löst und die Nanostäbe in die entsprechende Mulde trägt. Andere Mittel zur Entfernung der Partikel von der Membran sind ebenfalls möglich, einschließlich Laserablation, kontrollierte Säure- oder Basenablation und so weiter.
Ungleichförmiges Plattieren über die Membran oder ungleichförmige Abscheidung auf dem planaren Substrat führt zu Variationen der Streifenlänge und legt der Mindeststreifenlänge somit Grenzen auf. Dies schränkt ab einem gewissen Punkt die Zahl der Streifen und somit die Maximalzahl möglicher Typen für eine gegebene Nanostablänge ein.
Die matrizengesteuerten Synthesetechniken auf Membranbasis sind bevorzugt, weil sie eine sehr große Zahl sehr kleiner Nanostäbe herstellen können. Die Elektroplattierbedingungen können adäquat kontrolliert werden, um viele Typen von Nanobarcodes zu produzieren. Für Anwendungen wie Multiplex Immunoassays, in denen -zig bis viele -hundert Typen erforderlich sind, sind bekannte Techniken adäquat und können einfach im Maßstab vergrößert werden, um die erforderliche Zahl zu liefern. Für Anwendungen wie Proteomsignaturen, in denen viele Tausende Typen erforderlich sind, sind Synthesetechniken mit höherem Durchsatz und die Möglichkeit zur einzigartigen Identifizierung von jedem der Tausende der unterschiedlichen Barcodes erforderlich.
Algorithmen und Techniken aus der Telekommunikations-, Plattenantrieb- und Barcodeindustrie können genutzt werden, um die optimalen Nanostabdesigns zu bestimmen, um die meisten "Informationen" in einer gegebenen Nanostablänge zu ergeben. Die grundlegende Herausforderung beim Kodieren von Informationen in den geräuschbelasteten Kommunikationskanälen und das Detektieren der Informationen mit minimalen Fehlern sind gut bekannt. Lösungen, die in diesen Problemen verwendet worden sind, sind für das Design, die Synthese und Detektierung von Nanostabbarcodes relevant.
DETEKTIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON NANOBARCODES
Im Fall von metallischen Barcodes mit ungefähr 100 nm oder mehr in der Breite und etwa 2 μm bis 15 μm in der Länge können Unterschiede im Reflexionsvermögen des Metallsegments mit konventioneller Lichtmikroskopie visualisiert werden. Das λ/2-Kriterium betrifft das Feststellen der Größe eines Objekts, das mit Licht mit der Wellenlänge λ beleuchtet wird. Es ist recht gut möglich und in der Tat von zahlreichen Gruppen gezeigt worden, dass Merkmale, deren Durchmesser deutlich kleiner als λ/2 ist, visualisiert werden können, selbst wenn eine genaue Bestimmung der Größe nicht möglich ist. In anderen Worten kann man einen Au/Au-Nanobarcode leicht von einem Au/Ag-Nanobarcode unterscheiden, wobei alle Segmente eine Breite von sagen wir 50 nm haben, solange die genaue Größe der Segmente keine notwendige Information ist.
Es ist somit möglich, die Zahl der Stäbe durch visuelle Inspektion zu unterscheiden (und zu quantifizieren), wobei eine derartige Aufgabe automatisiert werden kann. Es ist auch möglich, Segmente mit unterschiedlichen Längen innerhalb individueller Barcodes zu unterscheiden, vorausgesetzt, dass das λ/2-Kriterium erfüllt ist. Es sind Bilder eines 9-streifigen Barcodes (Au/Ag/Au/Ag/Au/Ag/Au/Ag/Au) erhalten worden, bei denen die vier Ag-Segmente auf unterschiedliche Längen gezüchtet worden waren. Siehe 3. Das Bild wurde mit einem Lichtmikroskop im reflektierten Lichtmodus mit einem 400 ± 40 nm Bandpassfilter zur Verbesserung der Auflösung und zur Erhöhung des Bildkontrasts erhalten. Zusätzlich zu den oben beschriebenen visuellen/optischen Verfahren können die Detektierung und Identifizierung nach vielen anderen Verfahren durchgeführt werden.
Das Bild ist in mehrfacher Hinsicht interessant. Er ist erstens klar, dass vier verschiedene leuchtende Bereiche zu sehen sind (die Ag-Segmenten entsprechen). In diesem Bild entspricht die scheinbare Länge (gemäß Mikroskopie) nicht den geschätzten Längen. Das kleinste helle Segment scheint beispielsweise nicht ein Zehntel der Länge des längsten Segments zu haben. Dies kann durch die nicht lineare Strom-gegen-Länge-Beziehung verursacht worden sein, spiegelt wahrscheinlich je doch physikalische Grenzen der Optik wider. Das Bild wurde mit Hellfeldmikroskopie mit reflektiertem Licht erhalten. In diesem Modus ergibt die beugungsbegrenzte Optik eine theoretische Auflösung von etwa 2NA, wobei NA = numerische Apertur (in dem zum Erhalten dieser Bilder verwendeten System ist die Auflösung etwa 400 nm/2 (1,4) = 143 nm). Es ist somit möglich, zwei Merkmale zu unterscheiden, die so nahe wie 143 nm aneinander liegen (Rayleigh-Kriterium). Punkte, die enger zusammen liegen, erscheinen als ein einziges Merkmal. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass ein Ag-Streifen, der kürzer als 143 nm ist, unter dem Mikroskop noch sichtbar ist, da die Au-Abschnitte, die ihn trennen, länger als diese Distanz sind. Bei einem 2,5 μm Barcode kann man sich somit leicht 12 Streifen mit jeweils 200 nm vorstellen, die alle optisch unterscheidbar sind. Es sollte alternativ möglich sein, Barcodestäbe von 2 μm mit 10 Streifen mit fünf Segmenten von 150 nm und fünf Segmenten von 50 nm zu erzeugen und "abzulesen".
Die simultane Barcodedetektierung durch Reflexionsvermögen und Analytquantifizierung durch Fluoreszenz ist möglich. In 4 ist ein Beispiel gezeigt. Ausschnitt C zeigt ein bei 400 nm erhaltenes Reflexionsvermögenbild, das zum Identifizieren jedes Nanostabtyps verwendet wird. In diesem Fall zeigt das Bild eine Mischung gestreifter Nanostäbe. Ausschnitt A, der mit der Wellenlänge der FITC-Emission abgebildet wurde, enthält helle Bilder des ersten Typs von Nanobarcodes und kaum wahrnehmbar Geisterbilder des zweiten Typs von Nanobarcodes, die leicht digital subtrahiert werden. In Ausschnitt B, der mit der Wellenlänge von Texasrot abgebildet wurde, ist der zweite Typ von Nanobarcodes hell gezeigt, während der erste Typ von Nanobarcodes extrem schwach ist.
Die Möglichkeit, Fluoreszenzablesung und Nanobarcode-Identifizierung gleichzeitig durchzuführen, stellt für Multiplex- Assays ein mächtiges Werkzeug zur Verfügung. In einigen Ausführungsformen können Identifizierung und Detektierung mit dem selben Signal erreicht werden. Beispielsweise kann ein Fluoreszenzmuster zur Identifizierung verwendet werden, während die Intensität der Fluoreszenz die Konzentration des Analyten zeigt. Es werden jedoch viele Bioanalysen mit anderen Mitteln als Fluoreszenz durchgeführt. Hiervon ist die Massenspektrometrie besonders bedeutend, die rasch das Mittel der Wahl zur detaillierten Identifizierung und Analyse von Polypeptiden und Proteinen wurde. Es gibt zwei weitverbreitet verwendete Verfahren zur Einbringung biomolekularer Proben in die Massenspektrometrie: Elektrospray und matrizenunterstützte Desorption/Ionisierung (MALDI). Bei MALDI wird der interessierende Analyt in eine feste ultraviolettabsorbierende organische Matrize eingebettet, die bei gepulster Laserbestrahlung verdampft und den Analysten mitträgt (siehe z. B. Karas et al., Anal. Chem. 67, 2299–2301 (1988)). Während dieses Prozesses wird die von der Matrize absorbierte Energie auf den Analyten transferiert, welcher ionisiert wird. Das Gasphasenanalytion wird dann zu dem Flugzeit(Time-Of-Flight; TOF)-Massenanalysegerät geschickt. MALDI-TOF wird derzeit mit Erfolg zur Analyse von Proteinen, Polypeptiden und anderen Makromolekülen verwendet. Obwohl durch die Einbringung einer organischen Matrix zur Energieübertragung auf den Analyten zu erheblichen Fortschritten auf dem Sektor der Desorptions-Massenspektrometrie geführt hat, hat MALDI-TOF dennoch gewisse Grenzen. Die Detektierung kleiner Moleküle ist beispielsweise wegen der Anwesenheit von Hintergrundionen aus der Matrize nicht durchführbar. MALDI-Experimente sind auch inhärent sensibel gegenüber der Wahl der Matrize: Matrizentyp sowie Matrizenmengen müssen oft in Bezug auf die Natur des Analyten maßgeschneidert werden (was für die Analyse komplexer Mischungen eine schwerwiegende Einschränkung ist).
Neuerdings haben Sunner et al. den Begriff SALDI für oberflächenunterstützte Laser-Desorption/Ionisierung (Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization) eingeführt (Sunner et al., Anal. Chem. 67, 4335 (1995)). Diese Technik ist matrizenfrei, ermöglicht die Analyse kleiner organischer Moleküle und ergibt Leistungen ähnlich MALDI. Edelmetall-Nanopartikel sind aus zwei Gründen eine erheblich bessere Wahl für Ionisierung auf Laserbasis. (i) Kolloidale Edelmetall-Nanopartikel zeigen sehr große Extinktionskoeffizienten im sichtbaren Bereich und nahen IR. Dies steht im Gegensatz zu organischen Matrizen. (ii) Die Bestrahlung von Au-Nanopartikeln führt bekanntermaßen zu dramatischen Verbesserungen der elektrischen Feldstärke an der Partikeloberfläche: Dies ist die Basis für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung. Dies führt zu erhöhten Ionisationseffizienten. In Kombination mit der Nanobarcode-Technologie wird SALDI-MS zudem zu einem mächtigen Werkzeug für molekulare Fingerabdrücke.
Konventionelle Lichtmikroskopie ist verwendet werden, um die Nanostäbe abzubilden, und sollte automatisches "Dekodieren" der Barcodesignatur ermöglichen. Fluoreszenzmikroskopie kann außerdem zur Quantifizierung des Bindungsniveaus eines Biomoleküls an dem Stab verwendet werden. Die Detektierung und Auslesung kann auch mit üblichen Instrumentendesigns und hochentwickelter Bildanalysesoftware durchgeführt werden, die den Code jedes Nanobarcodes detektieren und lesen können sowie die Fluoreszenz von an den Nanostab gebundenen Molekülen quantifizieren können. Dieses Detektierungssystem ermöglicht außerdem hochfokussierte Laseranregung mit der geeigneten Wellenlänge, um laserinduzierte Desorption von nicht-kovalent gebundenen Molekülen von der Oberfläche jedes individuellen Nanostabs zu ermöglichen.
Ein System, das diese Anforderungen erfüllt, kann zur Bildgebung von Nanostäben gefertigt werden, die statistisch auf einer Glasoberfläche verteilt sind. Mit einem 63x (NA 0,8) Mikroskopobjektiv, das mit einer 4k×4k Pixel CCD Kamera kombiniert wird, beträgt das Sichtfeld der Kamera etwa 9 x 10⁴ μm² (300 μm am Rand). Jedes Sichtfeld kann etwa 600 Nanostäbe (1% Bedeckung) mit vernünftig niedriger Wahrscheinlichkeit der physischen Überlappung enthalten. Wir gehen konservativ davon aus, dass es erwünscht ist, das Fluoreszenz- oder MS-Signal von etwa 10 Stäben jedes Typs zu detektieren und zu mitteln, eine 1000-Aroma-Messung muss insgesamt 10.000 Nanostäbe identifizieren und messen. Mit 600 Partikeln pro Sichtfeld sind etwa 170 Bildrahmen erforderlich, die eine Gesamtfläche von etwa 20 mm² abdecken. Bei einer Hochgeschwindigkeitskamera dauert jedes Lesen eines Rahmens etwa 2 Sekunden, das ergibt eine Gesamtbildgebungszeit von weniger als 10 Minuten. Es sei darauf hingewiesen, dass die erforderliche Oberfläche ungefähr die selbe wie eine Mulde einer 96 Mulden-Mikroplatte ist, und dass der Gesamtdurchsatz 1000 Assays in 10 Minuten ist, oder etwa 1,7 Sekunden pro Assay.
Es kann Bildanalysesoftware verwendet werden, die in Echtzeit jeden Nanostab lokalisieren, sein Streifenmuster dekodieren und seine Fluoreszenz im Sichtfeld quantifizieren kann. Um Messzeit zu sparen, kann das System zwei CCD-Kameras verwenden, eine zum Einfangen des reflektierten Lichts, um das Streifenmuster zu dekodieren, und die andere zum simultanen Quantifizieren des Fluoreszenzsignals von jedem Nanostab.
Dieses Bildsystem kann nicht nur das Streifenmuster detektieren, sondern kann simultan auch die Fluoreszenzemission von jedem Nanostab messen. Es kann zusätzlich verwendet werden, um einen hochfokussierten Laserspot zu führen, wobei die Spotgröße auf die größte Dimension des Nanostabs bei jedem individu ellen Nanostab abgestimmt wird. Strahlsteuerungsoptik kann verwendet werden, um Proteine und/oder Moleküle von jedem Nanostab sequentiell zu beleuchten und zu desorbieren, die danach in einem Flugzeit-Massenspektrometer beschleunigt werden. Zur massenspektrometrischen Analyse können basierend auf dem detektierten Fluoreszenzsignal individuelle Nanostäbe gewählt werden, wodurch die Messzeit minimiert wird, indem nur jene Stäbe mit signifikanter Bindung analysiert werden.
Wie bereits erörtert wurde, können Änderungen des Reflexionsvermögens selbst ebenfalls mit einem möglicherweise großen Tribut zur Abfühlung verwendet werden, obwohl die bevorzugte Ausführungsform Reflexionsvermögen als Mechanismus für Partikelidentifizierung und Fluoreszenz als Sensorauslesung beinhaltet. Die beiden relevanten Punkte, die durch Pt- und Au-Reflexionsvermögen illustriert werden, sind, dass (a) das Reflexionsvermögen bei den meisten Wellenlängen unterschiedlich ist (was für einen Kontrastmechanismus sorgt) und (b) sie bei etwa 600 nm dasselbe Reflexionsvermögen (eine Isosbeste des Reflexionsvermögens) aufweisen. Bei 450 nm sind die Pt-Streifen heller (stärker reflektierend) als Au, und bei 600 nm trifft das Gegenteil zu. Bei einer dazwischen liegenden Wellenlänge liegt eine Isosbeste des Reflexionsvermögens, bei der kein Kontrast beobachtet werden kann.
Es ist wohl bekannt, wie das Massenreflexionsvermögen der dünnen Metallfilme im sichtbaren Bereich des EM-Spektrums von der Morphologie abhängt, dies trifft insbesondere auf Edelmetalloberflächen zu, bei denen Rauheitsmerkmale im Nanometermaßstab als Streustellen für Oberflächenplasmone wirken können. Kurz gesagt führt antigengeführte Bindung sekundärer Antikörper, die mit kleinen, kugelförmigen, kolloidalen Au-Nanopartikeln markiert sind, an dünne Au-Filme, die mit Einfang-Antikörpern derivatisiert sind, zu enorm verstärkten Verände rungen des Reflexionsvermögens des Au-Films. Dies führt zu wesentlich erhöhter Antigensensitivität. Wenn man dieses Konzept auf Barcodes überträgt, ist die Idee, dass durch Molekülerkennung induzierte Bindung von kolloidalem Au an die Au-Segmente eines kolloidalen Barcodes das Massenreflexionsvermögen verändert wird und somit an der Isosbeste des Reflexionsvermögens ein Kontrast des Reflexionsvermögens entsteht. Man kann die kolloidalen Metall-Nanopartikel somit als Kontrastmittel ansehen. Dieser Reflexionsvermögen-Kontrastmechanismus – der im Wesentlichen ein Lösungsanalogon zur Oberflächenplasmonresonanz ist – birgt das Potential für außerordentliche Sensitivität. Es ist gezeigt worden, dass mit kommerziellen Instrumenten die Detektierung eines kolloidalen Au-Partikels mit einem Durchmesser von 40 nm auf 10 μm² leicht erreichbar ist. Weil die Oberfläche des Barcodes viel kleiner als 1 μm² sein kann, ist das Binden eines einzigen Partikels an ein einzelnes Segment detektierbar; Verfahren zur Begrenzung der kolloidalen Abdeckung eines interessierenden Biomoleküls auf eins pro Partikel sind ferner möglich.
Die erfindungsgemäßen Nanobarcodes haben eine fast unbegrenzte Zahl von Anwendungen in den Biowissenschaften. Hierzu gehören Anwendungen im Genom-, Proteom-, funktionalen Proteom-, metabolischen Profilbereich sowie die Analyse kleiner Moleküle, die Identifizierung kombinatorischer Perlen und Phänotypisierung. Es gibt auch nicht-bioanalytische Anwendungen, wie für traditionelle Anwendungen vom Barcodetyp und Nanodioden. Nachfolgend werden mehrere dieser Anwendungen detailliert beschrieben.
GENOMANWENDUNGEN
Die erfindungsgemäße Nanocodetechnologie ist in mindestens einer Ausführungsform brauchbar, um (i) die Genexpression an beispielsweise 100 Proben gleichzeitig zu überwachen; (ii) Genomanalysen an selbstreferenzierenden Partikeln durchzuführen, und (iii) Einzelnukleotidpolymorphismus-(SNP)-Analyse an 10.000 Partikeln gleichzeitig in Lösung durchzuführen.
Im Genomsektor Tätige streben die globale Überwachung der Genexpression und/oder die Detektierung von genetischen Polymorphismen in einem Organismus an. Bei Menschen kann ein derartiges Werkzeug sowohl in der diagnostischen als auch in der prognostischen Medizin verwendet werden, was teilweise die enorme Marktkapitalisierung von Firmen erklärt, die an der Genchipproduktion beteiligt sind. Selbst Jahre nach der ersten kommerziellen Demonstration von Genchips gibt es jedoch noch etliche fundamentale Probleme mit der Technologie, die gelöst werden müssen. Am bedeutsamsten hiervon ist die Unmöglichkeit, große Zahlen von Proben simultan zu vergleichen, ob zum Zwecke der Überwachung der Genexpression in verschiedenen Teilen einer Anlage oder, wichtiger noch, zum Screening großer Zahlen von Patienten. Das sehr hohe Multiplexingniveau, das die Nanobarcodetechnik bietet, entschärft diese Probleme und lässt preisgünstige Genomanwendungen mit hohem Durchsatz zu einer Realität werden.
Bei cDNA-Array-basierten Analysen der Genexpression, wie sie heutzutage durchgeführt werden, werden Mischungen zweier cDNAs (jeweils mit einer anderen Farbe von Fluoreszenzfarbstoff markiert) auf eine Oberfläche aufgebracht, die eine Zahl unterschiedlicher cDNA-Spots enthält; nach der Hybridisierung ermöglicht die Analyse des Intensitätsverhältnisses der beiden Farben die Bestimmung heraufregulierter, herunterregulierter und unbeeinflusster Gene. Dies könnte theoretisch mit Mischungen von bis zu vier cDNA-Proben durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von jedem der vier Farbstoffe, die zur DNA-Sequenzierung verwendet werden. Ein derartiges Ex periment ermöglicht beispielsweise die Überwachung der Genexpression in unterschiedlichen Teilen eines Organismus (d. h. den Wurzeln, dem Stamm, den Blättern und der Blüte einer Feldfrucht) oder zu unterschiedlichen Zeiten nach dem therapeutischen Eingriff. In der Praxis ist dies nicht im kommerziellen Maßstab gezeigt worden: es gibt offensichtlich genügend Probleme bei Verwendung von nur zwei Farben, so dass die Aussicht, mehr zu verwenden, derzeit nicht machbar erscheint. Es ist zudem einfach nicht möglich, mit derzeitiger Technologie Multiplexing im Großmaßstab vorzunehmen (d. h. Mischungen von -zig bis -hundert DNA-Proben). Im Unterschied dazu wäre ein derartiges Experiment mit Barcodetechnik sehr einfach und würde das rasche Screening großer Populationen ermöglichen, was für die Frühdiagnostik von Erkrankungen weitreichende Folgen hätte.
Oberflächen, die eine willkürlich große Zahl von Spots aus doppelsträngiger (ds) cDNA enthalten, könnten hergestellt werden (z. B. ein Spot für jedes Gen in einem Genom). Zur Veranschaulichung kann jedoch leicht eine Oberfläche hergestellt werden, die 50 bis 100 Spots doppelsträngige (ds) cDNAs aufweist, wenn man sich auf eine Untergruppe interessierender Gene konzentriert, wie jene, die für eine spezielle Erkrankung relevant sind. Gencluster, die hierzu sehr ähnlich sind, sind mittlerweise auf Membran- und/oder Glasträgern im Handel erhältlich. (Es sei darauf hingewiesen, dass der weiße Hintergrund von Membranen einen hervorragenden Kontrast für die Nanocode-Identifizierung liefern würde). Jeder Spot hat eine Größe von ungefähr 400 μm × 400 μm. Wenn jede von 100 Proben isolierter mRNA reverser Transkription zu cDNA unterzogen wird, wird ein unverwechselbares Oligonukleotid-Markierung (15 Basen) an jeden Poly-T-Primer angehängt; alle cDNAs aus jeder Probe haben somit dieselbe (unverwechselbare) Markierung. In einem Beispiel der Erfindung werden fünfzig der Proben aus einer Blutbank kommen, und fünfzig werden von Patienten kommen, die frühe oder chronische Stadien einer Erkrankung aufweisen. Die 100 Proben markierter cDNA werden nach Standardprotokollen gemischt und an die Oberfläche hybridisiert (nachdem die ds cDNA an der Oberfläche denaturiert worden ist). Wenn das Niveau der mRNA-Expression in jeder Probe identisch wäre, würden gleiche cDNA-Anzahlen aus jeder Probe an die Oberfläche binden. Mit einer Bedeckung von 10¹² cDNAs/cm² und einer Hybridisierungseffizienz von 1% (eine zu niedrige Schätzung) entspricht dies 1,6 × 10⁵ jeder unverwechselbaren cDNA auf jedem Spot (insgesamt 1,6 × 10⁷ cDNA-Moleküle). Es wurde bestimmt, dass Proben mit relativ größeren oder kleineren Expressionsniveaus erhöhte beziehungsweise herabgesetzte Zahlen gebundener Moleküle aufweisen.
Die Quantifizierung von relativen Bindungsmengen ergibt sich durch Entwicklung dieser Oberfläche mit einer Mischung von 100 Nanobarcode-Aromen, die jeweils mit einem unverwechselbaren Oligo markiert sind, das zu demjenigen komplimentär ist, das zum Markieren der cDNA-Proben verwendet wurde. Es ist gezeigt worden, dass die Hybridisierung wegen der Rauheit im 5- bis 10 Nanometer-Maßstab entlang der Längen der Stäbe effizienter abläuft, wenn Oligos von der Nanobarcode-Oberfläche weg auf Abstand gehalten werden. Die komplementären Markierungen werden somit mit einem 45-Mer, das 30 Basen einer randomisierten DNA und das 15-Basen-Oligo enthält, an den Partikeln fixiert. Zum Fixieren des 45-Mers an der Oberfläche wird eines der wohl bekannten Verfahren verwendet: eines beinhaltet die Verwendung von Thiol-markierter DNA, und ein anderes verwendet Standard-EDC-Kopplung an amin-terminaler DNA. Es sei darauf hingewiesen, dass bei dem Thiol-markierten Material die Addition des 45-Mers an einen Partikel, der mit Merkaptohexanol vorderivatisiert worden ist, die Neigung der DNA erhöht, normal an die Oberfläche zu binden (und damit die Hybridisierungseffizienz zu erhöhen).
Es sei darauf hingewiesen, dass der dynamische Messbereich um die Größe der Nanobarcodes relativ zu der Größe der Spots reduziert wird: ein 0,1 × 1 μm Barcode bedeckt 1000 cDNA-Moleküle, was bedeutet, dass es nur 1,6 × 10⁴ Barcodes auf jedem Spots oder nur 160 von jedem Aroma gibt, wenn es keine Expressionsunterschiede gibt, wenn der Spot 200 × 200 μm beträgt. Wenn dieser relativ niedrige dynamische Bereich (d. h. 2 Dekaden) nicht ausreicht, kann die Zahl der Proben auf 50 reduziert werden und die Spot-Größe verdreifacht werden, um einen dynamischen Bereich von 3 Dekaden zu ergeben. Dies erfordert keine Verdreifachung des erforderlichen Materials. Verwandte Arbeiten haben gezeigt, dass eine Einzelbindung ausreicht, um die gebundenen Spezies zusammengehalten.
Dieser Typ von Multiplexing auf sehr hohem Niveau (d. h. mehrere Markierungen auf mehreren Spots) kann mit keiner anderen aktuellen Technologie durchgeführt werden. Mit kugelförmigen Partikeln kann man unterschiedliche Aromen erhalten, die Partikel sind verglichen mit Nanobarcodes jedoch so groß, dass nur wenige von jedem Typ an eine Oberfläche binden können. Man kann 100 unterschiedliche cDNAs auf derartige Partikel tun (d. h. einen Typ auf jeden), wodurch das Array effektiv durch Perlen ersetzt werden kann, dann ist eine jedoch auf 3 bis 4 Typen von Fluoreszenz-Markierungen beschränkt. Alternativ können Quantenpunkte in Frage kommen, die viel kleiner als Barcodes sind, die Bindung von mehr Partikeln an jeden Spot ermöglichen, es gibt in der nahen Zukunft jedoch keine Aussicht auf die Herstellung von 100 unterschiedlichen Aromen: Mit einer Fluoreszenzhalbwertsbreite von 25 nm wäre eine Gruppe von Partikeln mit Emissionsmaxima erforderlich, die gleichmäßig von 500 nm bis 3 μm beabstandet sind. Nanobarcodes bieten die einzigartige Ausgewogenheit von geringer Größe und hoher machbarer Auslesung, um diese Anwendung zu ermöglichen.
In dieser Ausführungsform kann auch die Möglichkeit genutzt werden, zwei unterschiedliche chemische Wege auf demselben Au/Pt-Nanobarcode zu positionieren. Dies eröffnet zwei Aussichten, selbstreferenzierende Nanobarcodes und Dual-Assay-Nanobarcodes. Beide Gelegenseiten resultieren aus der Tatsache, dass es, da man kontrollieren kann, welche Gruppierung von Streifen sich innerhalb eines einzigen Nanobarcodes befindet, möglich ist, die Position(en) auf dem Partikel zu kontrollieren, deren Fluoreszenz untersucht wird. Wenn beispielsweise ein Einfang-Antikörper nur auf den Au-Streifen angeordnet ist und ein Sandwich-Immunoassay unter Verwendung eines fluoreszenz-markierten sekundären Antikörpers durchgeführt wird, sollte von den Pt-Streifen keine Fluoreszenz ausgehen: Die Pt-Streifen wirken als interner Standard. Jegliche aus dem Pt kommende Fluoreszenz muss somit der unspezifischen Bindung zugeschrieben werden und kann digital subtrahiert werden. Dieses Prinzip kann unter Verwendung von passenden und nicht-passenden Einfang-Oligonukleotiden an den unterschiedlichen Metallen gezeigt werden. Dies wird ein selbstreferenzierendes Nanopartikel. Nanobarcodes mit vier Typen von Segmenten mit vier orthogonalen chemischen Wegen ermöglichen, wie bereits erwähnt, das Positionieren von Nukleinsäuren mit jeder möglichen Basensubstitution an einem spezifischen Rest auf einem Partikel. Die Verwendung dieser Partikel führt zu rascher Multiplex-Analyse des Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP).
Eine weitere Schlüsselanwendung, die unterschiedliche Streifenmodifikation nutzt, ist die Eliminierung von falsch positiven Werten in der Bioanalyse. Nur 25% der Blutproben, die positiv auf Hepatitis C markiert sind, sind beispielsweise in Wirklichkeit positiv kontaminiert. Die FDA sieht demnach mittlerweile Nukleinsäuretesten von Blut als genaueres Verfahren an. Ein positives Signal von Tests auf sowohl Antikörper- als auch Nukleinsäurebasis wäre idealerweise zur zweifelsfreien Identifizierung erforderlich, insbesondere wenn die Konsequenzen von falsch-positiv lebensbedrohlich sind. Hierfür suchen die Regierungsstellen nach aktiv verfolgenden komplementären Techniken zur Identifizierung biologischer Waffen. Die simultane Detektierung von Antigenen und Nukleinsären von Anthrax (Milzbrand) kann auch unter Verwendung von Partikeln bewirkt werden, die auf einer Gruppierung von Streifen mit Antikörpern derivatisiert sind und auf einem anderen mit Oligos derivatisiert sind (sowohl die Oligos als auch die Antikörper sind von Tetracore LLC, Rockville, MS, USA erhältlich). Der DNA-Assay wird im "Sandwich"-Modus durchgeführt. Nur wenn die gesamte Nanobarcodeoberfläche Licht emittiert (d. h. beide Analyte vorhanden sind), erfolgt eine positive Identifizierung. Dies kann prinzipiell mit mehreren mutmaßlichen Kampfstoffen durchgeführt werden, wobei die geeigneten Reagenzien simultan auf unterschiedlichen Aromen von Nanobarcodes immobilisiert sind.
Mit sehr großen Zahlen von Barcodes werden andere Ausführungsformen zur Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel verfügbar. Mit 1000 bis 10.000 Barcodearomen steht beispielsweise genügend Nanobarcodevielfältigkeit zur Verfügung, um vollständige genotypische Analysen in Lösung durchzuführen, einschließlich Einzelnukleotidpolymorphismus-(SNP)-Kartierung, ohne die Kompliziertheit (und Kosten) von Genchips oder immobilisierter DNA. In dieser Ausführungsform ist jedes Nanobarcodearoma ein exakter Ersatz für eine räumliche Position eines Gen-Arrays. Das Experiment wird zudem in identischer Weise durchgeführt, außer dass die Oligonukleotide chemisch (d. h. durch kovalente Adsorption von Thiolen, wie oben beschrieben) anstelle durch Photolithographie-getriebene Reaktionen gebunden werden.
Es ist für diese Experimente lehrreich, die Menge der Oberflächen in Arrays und Nanobarcodes (0,2 × 3 μm) zu vergleichen. Ein runder Spot mit einem Durchmesser von 50 μm entspricht einer Fläche von 2000 μm². Wenn die Synthese auf einer Membran mit 3" Durchmesser durchgeführt wird und 1536 Nanobarcodes/Membran mit nur einem Nanobarcode pro Pore und einer Porendichte von 30% der Gesamtmembranfläche hergestellt werden, produziert jede Synthese etwas mehr als 28 Millionen Nanobarcodes. Jeder 0,2 μm × 5 μm Barcode hat eine Fläche von 3 μm². Nehmen wir an, dass die Effizienz der Fluorphordetektierung an einem immobilisierten Nanobarcode die gleiche wie in einem ähnlich bemessenen Spot auf einem planaren Array ist. Nehmen wir konservativ an, dass nur 1/3 der Fluorophore an einem immobilisierten Nanobarcode detektiert werden können (nehmen wir an, dass sich die anderen 2/3 auf dem Boden oder an den Seiten befinden), wobei die effektive Detektierungsfläche pro Partikelfläche 1 μm² ist, so dass die gesamte verfügbare Oberfläche (für jedes Aroma des Partikels) 28 Millionen Quadratmikrometer beträgt, verglichen mit 2000 μm² für einen Genchip. Wenn alles andere gleich ist, erzeugt jede Synthese von Nanobarcodes genug von jedem Aroma für das Äquivalent von 14.000 Gen-Array-Experimenten. (Es sei darauf hingewiesen, dass sieben unterschiedliche Synthesen von 1536 Nanobarcodes durchgeführt werden müssten, um 10.000 unterschiedliche Aromen zu erhalten, wie sie typischerweise in einem Genotypisierungsexperiment zur Verfügung stehen).
Die Erfinder haben gezeigt, dass selektive Oligonukleotidhybridisierung an Nanobarcodeoberflächen durchgeführt werden können. Wenn ein Oligonukleotid mit der Sequenz A an der Ober fläche fixiert wird, bindet eine Sequenz A' (wobei A' vollständig zu A komplementär ist) und bleibt beim Erwärmen nicht-kovalent gebunden, bis die Schmelztemperatur des Duplex erreicht ist. In einem Kontrollexperiment bleibt, wenn Oligonukleotid B (das zu A nicht-komplementär ist) mit dem A auf einem Nanobarcode umgesetzt wird, keines nach dem Waschen und/oder Erwärmen auf eine Temperatur unter dem Schmelzpunkt gebunden. Das Binden von A' kann (zusammen mit dem fehlenden Binden von B) experimentell durch Verwendung von fluoreszenz-markierter DNA verifiziert werden: Die Reaktion mit fluoreszenz-markierter A', gefolgt von Waschen und Erwärmen, führt zu einem Fluoreszenzbild, das A' nur an die Nanobarcodes gebunden zeigt (d. h. nicht in Lösung). Die Reaktion mit fluoreszenz-markiertem B unter identischen Bedingungen führte zu Bildern ohne erkennbare Fluoreszenz. Die weitere Bestätigung dieses Ergebnisses ergibt sich aus Massenspektraldaten, in denen gebundenes A' direkt unter Verwendung von MALDI-TOF der Nanobarcodes identifiziert wurde.
Dieses Ergebnis ermöglicht die Durchführung von SNP-Analyse sowie "Genchip"-Experimenten in Lösung. Ein "Genchip"-Experiment wird beispielsweise in der Regel wie folgt durchgeführt. Eine DNA-Probe wird verdaut, mit Fluoreszenzsonden umgesetzt und mit einem Array bekannter Oligonukleotide umgesetzt, die in bekannten Positionen an einer Oberfläche fixiert sind. Die Kartierung des Fluoreszenzbilds von der Oberfläche (nach scharfen Wäschen/Erwärmen) zeigt die Abwesenheit/Anwesenheit spezieller Oligonukleotide. Dieses Experiment kann in genau der gleichen Weise mit Nanobarcodes durchgeführt werden, außer dass die Identität des oberflächengebundenen Oligos nun durch die Nanobarcode-Identität statt durch seine Position auf einem Chip bestimmt wird. Dieser Ansatz ermöglicht, was wichtig ist, das Stattfinden der Hybridisierung in Lösung (wo die Nanobarcodes frei dispergieren können), was zu einer viel rascheren Gleichgewichtseinstellung führt. Die Zugabe oder das Weglassen eines speziellen Oligos (oder mehrerer Oligos) zu bzw. aus dem Assay lässt sich außerdem leicht bewerkstelligen. Es sollte für einen Fachmann offensichtlich sein, dass es Dutzende ähnlicher Formate von Experimente unter Beteiligung von Nukleinsäuren gibt, die in im Wesentlichen identischer Weise durchgeführt werden können. Die Identität des oberflächengebundenen Moleküls wird jeweils durch die Identität des Nanobarcodes bestimmt. In ähnlicher Weise können Experimente durchgeführt werden, bei denen das Binden von anderen Molekülen als Nukleinsäuren detektiert werden kann (z. B. Transkriptionsfaktoren). Das gebundene Molekül kann eine DNA mit voller Länge, eine RNA mit voller Länge oder Doppelstränge von Nukleinsäuren sein.
Es gibt zahlreiche unterschiedliche biochemische Ansätze zur Detektierung von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs). Jeder kann in Multiplexweise an Nanobarcodes durchgeführt werden. Hier ist die einzigartige Fähigkeit von Nanobarcodes, außerordentlich große Zahlen unterscheidbarer Partikel zu produzieren, unentbehrlich, da geschätzt wird, dass das menschliche Genom in der Größenordnung von 100.000 SNPs enthält.
ANALYSE KLEINER MOLEKÜLE
Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nanopartikel ist kombinatorische selbstorganisierte Monoschichtchemie an Nanobarcodes, wodurch ein SALDI-TOF-Spektrum eines Moleküls erhalten werden kann, das an einem SAM-beschichteten Nanobarcode adsorbiert wird, und kombinatorische Trennung/SALDI-Analyse mit einem komplexem biologischen Fluid durchgeführt werden kann.
Biowissenschaftler sind zunehmend an der Erzeugung vollständiger Profile von Proteinen und Peptiden aus Patientenproben interessiert, was der Erzeugung auf dem Sektor der Proteome Auftrieb verleiht. Diesen Bemühungen liegt die Idee zugrunde, dass Veränderungen der Proteinexpression innerhalb von Proben einer erkrankten Kohorte einen Biomarker (oder mindestens eine Komponente eines Biomarkers) für jene Erkrankung enthalten können. Das vollständige Profil kleiner Moleküle wäre mindestens ebenso interessant: Immerhin sind zwei der wichtigsten bislang bekannten Biomarker Cholesterol und einfache Blutzucker, die beide Molekulargewichte deutlich kleiner als 1000 aufweisen. Leider gibt es neben Bemühungen bei sequentiellen Trennungen (d. h. LC-CE oder CE-CE), die innewohnende theoretische Grenzen haben, keine rationalen Ansätze für 2-D-Trennung kleiner Moleküle.
Es ist in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung möglich, Verbindungstrennungen an der Oberfläche von Nanopartikeln durchzuführen. Das Prinzip dieses Verfahrens ähnelt der Technologie, die in Festphasen-Mikroextraktions-(SPME)-Techniken verwendet wird. Die selektive Absorption/Desorption von Verbindungen kann in einem lösungsmittelfreien System erfolgen. Konventionelle SPME ist nicht erweitert worden, so dass eine große Vielfalt unterschiedlicher Materialien eingeschlossen ist, in denen die selektive Absorption/Desorption von Spezies bewirkt werden soll.
Die Strategie der selektiven Bindung einer Spezies aus einer Mischung an eine funktionalisierte Oberfläche führt zu ihrer Anreicherung auf der Oberfläche, was einen möglichen Weg zur Detektierung mit höherer Empfindlichkeit aufzeigt. Oberflächen-angereicherte Laser-Desorptions-Ionisierung (SELDI), eine Variante von MALDI, basiert auf diesem Prinzip (siehe z. B. Weinberger, Electrophoresis, 6, 1164–1177 (2000)). Es können fünf bis sechs unterschiedliche Oberflächen erhalten werden, auf die Protein und/oder kleine Moleküle aufgebracht werden und dann mit zunehmender Schärfe gewaschen werden. Da jede Oberfläche/Schärfe-Kombination zu einem anderen Adsorptionsprofil führt, liefert die Technik ein Mittel zur Analyse einer komplexen Mischung. Die Ausführungsform der Erfindung erweitert diesen Ansatz exponentiell durch Erzeugung von Tausenden von unterschiedlichen Oberflächenchemiearten auf Nanobarcodes. Jede Chemie wird durch ihre Nanobarcode-Identität identifiziert; die nachfolgende SALDI-Analyse führt zu einer wesentlich verbesserten Analyse komplexer Mischungen.
Oberflächen mit kombinatorischem Design, um mehrere Analyte simultan auf charakteristisch kodierten Partikeln aus biologischen Proben zu kodieren, sind in den Trennwissenschaften oder dem Sektor der klinischen Chemie ohnegleichen. In einer Ausführungsform können zur Erzeugung dieser Oberflächen selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) verwendet werden, die mit reaktiven funktionalen Gruppen enden und mit Bibliotheken von Reagenzien derivatisiert sind, um Nanobarcodes mit einer außergewöhnlichen Vielfalt an Oberflächenchemie zu ergeben. Die Nanopartikel können außerdem magnetisch gemacht werden, was ein direktes Verfahren zum Extrahieren derselben aus der Lösung, Probe oder dem Organismus ergibt, in die (bzw. den) sie eingebracht worden sind.
Wie Fachleute erkennen werden, gibt es umfangreiche Literatur über Verfahren, die verwendet werden können, um Oberflächenchemiewege oder Beschichtungen auf Nanobarcodes aufzubringen. Ein derartiges Verfahren ist mittels SAMS. SAMS können auf viele Weisen gebildet werden, die Fachleuten bekannt sind. SAMS, die aus ω-carboxysubstituierten Alkanthiolen auf der Oberfläche von Gold gebildet worden sind, sind als Modelloberflächen verwendet worden, um die Wechselwirkungen von Protei nen mit Oberflächen zu untersuchen. Die Chemie beinhaltet Verkappen, beispielsweise mit wasserlöslichen Merkaptoderivaten, in der Regel Merkapto-Carbonsäuren oder -Amine. Das Carboxyl oder die Amine werden anschließend verwendet, um Proteine, Peptide oder Nukleinsäuren kovalent zu markieren, um biomolekulare Konjugate dieser Partikel zu ergeben, die in biologischen Assays verwendet werden können. Andere haben gemischte SAMS verwendet, um die Adsorption von Fibrinogen, Lysozym, Pyruvatkinase, RNAse und Carbonatdehydratase.
Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nanostäbe synthetisiert, die SAMS mit endständiger Carboxylfunktionalität aufweisen, indem die Stäbe mit ω-Carboxyalkanthiolen umgesetzt werden. Die Carboxylfunktionalität wird dann zur weiteren Umsetzung mit einer weiten Vielfalt von Aminen mit diversen funktionalen Gruppen zu einem Anhydrid aktiviert. Eine weitere Klasse von Derivaten, die aminreaktive Funktionalitäten sowie unspezifische Wechselwirkungen mit Proteinen liefern, sind Dextranlactone, die leicht aus Carboxymethyldextran hergestellt werden. Die anfängliche Derivatisierung der Nanostäbe kann mit 3-Merkaptopropyl(tri-methoxy)silan erfolgen, und das Silanalkoxy wird dann mit den freien Hydroxylen eines von Carboxymethyldextran abgeleiteten Lactons ausgetauscht. Die nachfolgende Spaltung des Lactons mit Aminen, die diverse funktionale Gruppen tragen, ergibt eine Bibliothek von λ-Hydroxyamiden von dextranbeschichteten Nanopartikeln. Diese Verfahren liefern ein gemeinsames reaktives Intermediat, das leicht hergestellt werden kann. Die dextranbeschichteten oder hydrophilen SAMs liefern gleichzeitig eine Oberfläche, die gegenüber unspezifischer Wechselwirkung zwischen den Nanostäben und Proteinen mit einem weiten Bereich von Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten resistent ist. Durch geeignete Auswahl und geeignetes Design strukturell unterschiedlicher Aminreaktant-Cocktails für die Derivatisierung kann eine riesige Bibliothek von Oberflächen erzeugt werden. Diese kombinatorisch abgeleiteten Nanopartikel bieten Oberflächen mit variierender Avidität zur Bindung an die weite Vielfalt von Molekülen, die in einer biologischen Probe vorhanden sind, mit viel größerer Effizienz, als für SELDI beschrieben wurde.
Die Affinitäts-Einfang-Techniken mit diesen Nanostäben können im Unterschied zu den Systemen auf Chipbasis offline-Inkubationsstufen zum Einfangen der Analyte verwendet. Ein derartiger Ansatz ist nicht nur unter dem kinetischen Aspekt inhärent besser (rasches Einfangen von Analyten), sondern auch gemäß den Massenwirkungsgesetzen vorteilhaft, um die Bindung anzutreiben, da die Dichte der Bindungsdeterminanten variiert werden kann, um sich einem weite Bereich von Analytkonzentrationen anpassen zu können, die in einem biologischen Fluid vorkommen. Von Kohlenhydrat abgeleitete SAMs mit variierenden Dichten sind verwendet worden, um Probleme anzusprechen, die Zelloberflächen-Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen beinhalten. Die erfindungsgemäßen Oberflächen können maßgeschneidert werden, um freie Saccharide zu erkennen, und können gleichzeitig mit einem solches Design versehen werden, dass sie beispielsweise Mehrfachbindungsdeterminanten für Kohlenhydrate in Glykoproteinen vorteilhaft nutzen. Dieser Ansatz liefert Oberflächen, die an ein weites Spektrum von Molekülen, von organischen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht bis zu großen Proteinen, binden können, die adressierbar und der Analyse zugänglich sind. Biologische Quellen enthalten oft eine komplexe Mischung von anorganischen Salzen, Puffern, Chaotropen, Konservierungsmitteln und anderen Additiven – oft in höheren Konzentrationen als die interessierenden Moleküle – von denen einige für MALDI MS schädlich sind. Diese Ausführungsform der Erfindung kann Anzahlen von Oberflächen derselben Größenordnung wie die Anzahl der Moleküle erzeugen, die in einer biologischen Probe vorhanden sind. Gleichzeitig wird die Bindung der interessierenden Moleküle zur Analyse mittels Massenspektroskopie möglich. Gleichzeitig liefert sie einen sehr brauchbaren und effizienten Modus der Probenvorbereitung vor der Analyse.
Den Erfindern ist bislang keine aktuelle Technologie zur simultanen Abfrage von organischen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, Peptiden und größeren Proteinen in einer Mikrovolumen-Multiplexanalyse bekannt. Die riesige Bibliothek von oberflächenmodifizierten Nanostäben mit variierenden Affinitäten zu unterschiedlichen Molekülen wird einer biologischen Probe zugegeben, inkubiert, gewaschen und mittels SALDI MS analysiert, wobei jeder Nanostab ein spezielles Molekül oder eine spezielle Gruppe von Molekülen repräsentiert, wobei das gesamte Ensemble dadurch einen Fingerabdruck der analysierten Probe ergibt.
FUNKTIONALE PROTEOMIK
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Nanocodetechnologie verwendet werden, um (i) hochempfindliche Multiplex-Immunoassays oder andere Assayformen für bekannte Proteine zu entwickeln; (ii) Verfahren zur Identifizierung von posttranslationalen Modifikationen zu entwickeln, und (iii) Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Das Hauptziel der Proteomanalyse (auch als Proteomik bekannt) ist die rasche Charakterisierung von Genprodukten (Proteinen). Der Stand der Technik der Proteomiktechnologie basiert auf zweidimensionaler (2-G) Gelelektrophorese, die die Trennung von komplexen Proteinmischungen ermöglicht, die auf der Ebene der ganzen Zellen, Gewebe oder ganzen Organismen exprimiert werden. Nach 2-D-Gelelektrophorese und Gelfärben werden die sichtbar gemachten Proteinspots angeregt, aus dem Gel extrahiert und enzymatischer Verdauung unterzogen. Die resultierenden Peptidfragmente werden dann durch Massenspektrometrie charakterisiert (MALDI-TOF MS oder ESI-MS). Die ursprüngliche Proteinstruktur kann rekonstruiert werden, indem die Peptidmassen gegen theoretische Peptidmassen bekannter Proteine abgeglichen werden, die man in kommerziell erhältlichen Datenbanken (z. B. SWISS-PROT) findet. Die fehlende Reproduzierbarkeit des 2-D-Gelverfahrens, Schwierigkeiten bei der Proteinquantifizierung und Komplexitäten, die mit der Probenextraktion zusammenhängen, sind einige der Probleme mit dieser Technologie. 2-D-Gele leiden auch an einem systematischen Trennfehler bei Proteinen mit sehr niedrigem und sehr hohem Molekulargewicht. 2-D-Gele können zudem kein zuverlässiges Profil von kleinen organischen Molekülen, Metaboliten, DNA, RNA und, worauf es ankommt, Proteinen unter 15 kDa liefern.
Ein weiterer Ansatz für Proteomik beinhaltet das Begrenzen der Analyse auf bekannte Proteine (d. h. jene, für die Antikörper im Handel erhältlich sind). Die beste Technik zur Durchführung von Proteomik auf Grundlage dieser Technologie verwendet Mikrokugeln als fester Träger, derzeit sind 100 verschiedene Perlensätze erhältlich. Jeder Perlensatz kann prinzipiell einen separaten Immunoassay trägern. Die Datenerfassung erfolgt durch ein Instrument, das einem konventionellen Durchflusszytometer ähnlich ist. Mit dieser Technologie ist die simultane Quantifizierung von 15 Zytokinen gezeigt worden. Eine Haupteinschränkung dieses Ansatzes liegt darin, dass der Frequenzraum der Molekülfluoreszenz, die sowohl für das Mikrokugel-Markieren als auch für die Detektierung verwendet wird, nicht breit genug ist, um nahezu so viele Aromen wie Nanobar codes (im Raum des unterschiedlichen Reflexionsvermögens) unterzubringen. Dies bietet eine Gelegenheit, nicht zur lineare Fortschritte in diesem Ansatz zu erreichen, sondern die besten Aspekte des Multiplexing mit den besten Aspekten von MALDI zu kombinieren, um einen bahnbrechenden Fortschritt in der Proteomik zu erreichen.
Auf dem Sektor der Proteomik besteht ein Bedarf an massiv paralleler Analyse der exprimierten Proteine. Die Kombination der Nanobarcodetechnologie, SALDI und fluoreszenzbasierten Immunoassays zu einer Plattform ermöglicht, wie nachfolgend beschrieben, die Erzeugung von hochempfindlichen und quantitativen Multiplex-Immunoassays für bekannte Proteine. Es ist möglich, Selektivität, Empfindlichkeit, Multiplexing, Quantifizierung und Massenanalyse in derselben Messung zusammenzuführen, was unter anderen Vorteilen einen mindestens 100-fachen Anstieg der Empfindlichkeit bietet.
Erstens hängt ein spezifischer Immunoassay über Bindung eines spezifischen Einfang-Antikörpers mit jedem Aroma des Nanobarcodes zusammen. Der Analyt wird an den antikörperbeschichteten Nanostab gebunden und mit einem zweiten Antikörper detektiert, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der ein anderes Epitop auf dem Analyten erkennt.
Dieses Verfahren kann in einer einzigen Probe für so viele Proteine erfolgen, wie sowohl Einfang- als auch Detektierungsantikörper zur Verfügung stehen; momentan sind mehrere hundert Paare von Antikörpern erhältlich, und diese Zahl wird in Zukunft ansteigen. Andere Ansätze für Proteinassays (wie Aptamertechnologie und Phagen-Display) sind außerdem momentan in Entwicklung und Weiterentwicklung. Das Verfahren hat somit die Fähigkeit, gleichzeitig die biologische Probe auf Anwesenheit aller bekannter Proteine abzufragen, für die es eine geeignete selektive Bindungschemie gibt (oder geben wird). Ein Vorteil dieses Systems ist, dass mit zwei oder mehr Fluorophoren sogar noch größeres Multiplexing möglich ist.
Posttranslational modifizierte Proteine (gute Kandidaten für neue Krankheits-Marker) können unter Verwendung derselben Plattform detektiert werden. Jedes Protein kann co- und posttranslationalen Modifikationen unterzogen werden. Diese Modifikationen haben einen Einfluss auf die Ladung, Hydrophobizität, Konformation des "Stammproteins", und können in unterschiedlichen Ebenen auftreten. Modifikationen, wie Acetylierung, Phosphorylierung, Methylierung, Hydroxylierung, N- und O-Glykosylierung können auf zellulärer Ebene sowie in den extrazellulären Fluids stattfinden. Es gibt mittlerweile über 100 bekannte post-translationale Modifikationen.
Zur Detektierung der post-translationalen Modifikation werden polyklonale Antikörper, die gegen ein Protein gebildet wurden, mit einem spezifischen Barcodearoma konjugiert. Der polyklonale Antikörper fängt nicht nur das Protein ein, gegen das er gebildet worden ist, sondern auch Proteinisoformen (die ähnliche Epitope aufweisen, jedoch an unterschiedlichen Stellen modifiziert sind). Wenn die Isoform durch die Detektierungsantikörper erkannt wird, wird sie zusammen mit dem "Stammprotein" quantifiziert (d. h. durch den Fluoreszenz-Immunoassay). Wenn post-translationale Modifikation das Epitop beeinflusst hat, welches durch den Detektierungs-Antikörper erkannt wird, wird die Isoform nicht durch Fluoreszenz quantifiziert. Wenn sowohl der Einfang-Antikörper als auch der Detektierungs-Antikörper polyklonale Antikörper sind, besteht eine recht große Wahrscheinlichkeit dafür, dass eine große Anzahl der modifizierten Proteine quantifiziert wird. Nach der Fluoreszenzmessung werden die Nanostäbe Massenspektrometrie-Analyse unterzogen, SALDI-MS wird zur Charakterisierung des Proteins und zur Identifizierung der verschiedenen posttrans lationalen Modifikationen verwendet. Die SALDI-MS-Laserenergie zerreißt alle nicht-kovalenten Bindungen, wodurch die Detektierung von jeglichem Molekül ermöglicht wird, das an dem Nanostab komplexiert wird, einschließlich sogar des Proteins, das sandwichartig zwischen zwei Antikörpern liegt.
Das Markieren eines Assays mit einem spezifischen Nanobarcode ist für den Erfolg dieses Verfahrens kritisch. Der Code auf dem Stab ist mit einem spezifischen festgelegten Protein mit einem spezifischen Molekulargewicht assoziiert. Wenn anstelle einer vollständigen Scan-Analyse dieser Nanostab analysiert wird, kann das Massenspektrometer mit einer als Single Ion Monitoring (SIM, Überwachung eines Einzelions) bezeichneten Technik abgestimmt werden, so dass es sich auf eine spezielle Masse konzentriert. Der SIM-Modus ermöglicht eine raschere Datenerfassung und erhöht die analytische Sensitivität (bis zu einer 1000-fachen Steigerung der Detektierung eines Ions im SIM-Modus, verglichen mit der Detektierung desselben Ions im vollständigen Scan-Modus). Der SIM-Modus ermöglicht die raschere Erfassung von Daten und Erhöhungen der analytischen Empfindlichkeit (bis zu 1000-fache Erhöhung der Detektierung eines Ions im SIM-Modus gegenüber der Detektierung desselben Ions im vollständige Scan-Modus). Bei Kenntnis der erwarteten Masse (und der Sequenz) des Analyten kann das Massenanalysegerät auf einen Massenbereich fokussiert werden kann, wodurch die Detektierung aller möglichen Isoformen in Bezug auf das Stammprotein möglich ist. Der Überwachungsbereich könnte beispielsweise auf das Molekulargewicht der Stammverbindung ± 500 Da eingestellt werden. Die Bestimmung des Molekulargewichts der Isoform zeigt sofort die Modifikationen, die das Stammprotein durchlaufen hat. Die Kombination der Nanostäbe und polyklonalen Antikörper hat den Vorteil, dass die Stammproteine sowie die entsprechenden Isoformen auf einem Aroma der Nano stäbe lokalisiert ist. Die Nanostäbe ermöglicht ein Bindeglied zwischen dem "Stammprotein" und den entsprechenden Isoformen. Dies trifft auf die 2 D-Gelelektrophorese nicht zu, in der das posttranslational modifizierte Protein an einer anderen Stelle des Gels "auftauchen" kann, wenn sich die Ladung geändert hat (beispielsweise nach der Phosphorylierung). Kurz gesagt erfordert 2D-Gel erheblichen weiteren Aufwand (d. h. Sequenzbestimmung) zur Identifizierung des modifizierten Proteins, da das Bindeglied zwischen Proteinen derselben Familie fehlt.
Andere Ansätze zum Detektieren von posttransitionalen Modifikationen sind auch möglich. Es können beispielsweise chemische Wege entwickelt werden, die alle posttransitionalen Modifikationen eines verschiedenen Typs erkennen, beispielsweise kann ein Nanobarcode funktionalisiert werden, um alle Proteine zu erkennen, die myristyliert worden sind, ein weiterer kann sich an alle glycosylierten Spezies binden, usw. Die Sammlung oder Anordnung dieser Nanopartikel kann somit eine Sonde der gesamten posttranslationalen Modifikation sein. Die Analyse der absorbierten Spezies an jedem Nanobarcode kann mit jedem geeigneten Mittel einschließlich Massenspektrometrie durchgeführt werden. Wichtig ist, dass es wertvoll ist, die Gesamtmenge der posttranslationalen Modifikationen zu kennen, selbst wenn die genaue chemische Natur der individuellen Spezies nicht gesichert ist. Die Menge der posttranslationalen Modifikationen kann ein Maß für Stress und daher die Gesamtgesundheit sein.
Protein-Protein-Wechselwirkungen werden erfindungsgemäß untersucht, indem spezifische Proteine an Nanostäbe gebunden werden, um ein Screening der biologischen Probe auf potentielle Entitäten durchzuführen, die zur molekularen Erkennung in der Lage sind. Nanostabtechnologien in Kombination mit fluoreszenzbasierter Quantifizierung und massenspektrometerbasier ter Identifizierung ermöglichen die Erforschung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es werden unterschiedliche Assayformate verwendet, um die biologische Probe auf Anwesenheit des freien Analyten A oder auf Anwesenheit des freien Rezeptors R für den Analyten A abzufragen. Diese beiden Formate sind bereits beschrieben worden. Ein weiterer Satz von Nanostäben, die mit gegen A gerichteten Antikörpern markiert sind, können zur Quantifizierung des Analyten A verwendet werden, der an seinen Rezeptor R gebunden ist, indem ein gegen den Rezeptor gerichteter Detektierungskörper verwendet wird. Ähnliche Assays können aufgebaut werden, in denen freie Autoantikörper und Analyt A bindende Antiantikörper unter Verwendung von beispielsweise einem fluoreszierenden Anti-Fc-Antikörper quantifiziert werden können.
Die Nanostäbe werden, wie bereits beschrieben, mittels SALDI-TOF MS analysiert, um die Identifzierung der unterschiedlichen vorhandenen Isoformen zu ermöglichen. Wenn keine Detektierungs-Antikörper zur Verfügung stehen, ist SALDI-TOF noch in der Lage, die unterschiedlichen Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Quantifizierung durch Fluoreszenz fehlt, die Identifizierung des eingefangenen Analyten durch Massenspektrometrie ist jedoch möglich. Alternativ kann ein mit einem beliebigen Protein markierter Nanostab verwendet werden, um die biologische Probe einem Screening auf Anwesenheit eines Proteins oder beliebiger anderer Entität mit irgendeiner Affinität zu dem nanostab-konjugierten Protein zu unterziehen. Die Anwesenheit des gebundenen Proteins werden durch massenspektrometrische Analyse detektiert.
Praktisch alle vorstellbaren Liganden, die in der Affinitätschromatographie verwendet worden sind, alle stationären Phasen, die in der Dünnschichtchromatographie verwendet werden, Chromatographieelektrophorese (und Derivate davon), HPLC oder Gaschromatographie können zum Markieren von Nanostäben verwendet werden, und alle können in einem einzigen Röhrchen kombiniert werden, das ein minimales Volumen an biologischer Probe enthält. Wegen der Größe des Nanostabs wird die Probengröße deutlich verringert, verglichen mit derzeit entwickelten Protein-Arrays. Die folgende Tabelle führt Beispiele für Liganden auf, die für Nanostab-Derivatisierung verwendet werden können, um spezifische Moleküle (Gegenliganden) aus der biologischen Probe einzufangen (zu extrahieren).

Beispiele für Liganden-/Gegenliganden-Paare, die für Nanostabeinfang verwendet werden

LIGAND	GEGENLIGAND
Cofaktoren	Enzyme
Lectine	Polysaccharide, Glykoproteine
Nukleinsäure	Nuldeinsäurebindungsprotein (Enzym oder Histon)
Biomimetische Farbstoffe	Kinasen, Phosphatase, Dehydrogenasen, usw.
Protein A, Protein G	Immunglobuline
Metallionen	die meisten Proteine können mit Metallionen Komplexe bilden
Enzyme	Substrat, Substratanaloga, Inhibitor, Cofaktoren
Phagen-Displays	Proteine, Peptide, jeglicher Proteintyp
DNA-Bibliotheken	komplementäre DNA
Aptamere	Proteine, Peptide, jeglicher Proteintyp
Antikörperbibliotheken	jeglicher Proteintyp
Kohlenhydrate	Lectine
ATP	Kinasen
NAD	Dehydrogenasen
Benzamid	Serinprotease
Phenylboronsäure	Glykoproteine
Heparin	Koagulierungsproteine und andere Plasmaproteine
Rezeptor	Ligand
Antikörper	Virus

Es sei letztendlich darauf hingewiesen, dass dieses Verfahren eine signifikante Reduktion der Probengröße ermöglicht, indem Tausende unterschiedlicher Aromen von Nanobarcodes zu wenigen Mikrolitern oder weniger von einer biologischen Probe gegeben werden. Dies ist gegenüber der Verwendung von Biochips oder Arrays von Vorteil, in denen Antikörper oder Proteine auf einer flachen Oberfläche im Raum angeordnet werden. Im letzteren Fall ist ein viel höheres Probenvolumen erforderlich, um den ganzen Chip zu kontaktieren. Wenn der Nanopartikel ein magnetisches Metall aufweist, können sie außerdem durch magnetische Wechselwirkung aus der Lösung gezogen werde.
Für Proteine mit einer Masse bis zu 13 kDa ist SALDI-Massenauflösung MALDI ähnlich. Zwischen 17 und 30 kDa sinkt die Massenauflösung bei SALDI um einen Faktor von 2 bis 3. Nanobarcodes haben die erforderlichen Spektraleigenschaften, um den richtigen Energietransfer auf die adsorbierten Proteine zu ermöglichen. Indem die Attribute auf den Nanobarcodesegmenten (z. B. Länge, Breite, Zusammensetzung und so weiter) variiert werden, können die Spektraleigenschaften des Nanobarcodes eingestellt werden, um die optimale Proteindesorptions- und -ionisierungsenergie abzugeben.
PHÄNOTYPISIERUNG
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können als Plattform für Multiplex-Assays in sehr kleinen Volumina von biologischen Proben verwendet werden. Diese Plattform ermöglicht die simultane Messung von über vielen Hunderten oder Tausenden von Assays aus ultrakleinen Volumina von biologischen Proben.
Heutzutage wird eine große Zahl von unabhängigen und unterschiedlichen Messtechniken zur Charakterisierung des Metabolismus und der Physiologie von Menschen oder großen Tieren verwendet. Das Phänotypisieren kleiner Tiere ist wegen der begrenzten Verfügbarkeit großer Gewebevolumina praktisch unmöglich. Die vorliegende Erfindung hat die einzigartige Fähigkeit, nicht nur viele dieser Messungen auf einer Plattform zu kombinieren, sondern auch alle dieser Messungen beschränkt auf dasselbe winzige Probenvolumen durchzuführen. Hierdurch wird diese Plattform zur Messung mehrerer Analyte in raren biologischen Proben (d. h. Plasma von kleinen Tieren) extrem attraktiv.
Diese Ausführungsform der Erfindung konzentriert sich speziell auf:

1) Die Entwicklung einer Plattform, die optisches Abfragen der Nanostäbe ermöglicht.
2) Das Auslesen von Multiplex-Immunoassays und die Machbarkeit des Phänotypisierens der Maus.

Zylindrisch geformte, erfindungsgemäße, kolloidale Metall-Nanopartikel werden verwendet, wobei die Metallzusammensetzung entlang der Länge alterniert werden kann (z. B. Pt/Au/Pt/Au/Pt) und wobei die Länge der Metallelemente eingestellt werden kann. Diese Nanobarcodes dienen als Festphasen-Identitäts-Markierungen für die zu entwickelnden Immunoassays. In einem typischen Sandwich-Immunoassay wird der Einfang-Antikörper an einen spezifischen Nanobarcode konjugiert, und der entsprechende Detektierungs-Antikörper wird mit einem Fluorophor markiert.
Es kann ein Lesegerät verwendet werden, das die innewohnenden Unterschiede des Reflexionsvermögens der Metallsegmente in individuellen Stäben durch konventionelle Lichtmikroskopie Bildverarbeitung unterziehen kann. Diese Messung des Reflexionsvermögens ermöglicht die Nanobarcode-Identifizierung, während die mit dem entsprechenden Nanostab assoziierte Fluoreszenzintensität über Bindung des Detektierungs-Antikörpers die Konzentration des Analyten bestimmt. Es kann Software verwendet werden, die Bilder des Reflexionsvermögens automatisch analysieren und Nanobarcodes identifizieren sowie Fluoreszenzbilder automatisch analysieren und Nanobarfluoreszenz quantifizieren kann. Die Entwicklung der Sandwich-Immunoassays zeigt die parallele Erfassung der Daten des Reflexionsvermögens und der Fluoreszenzdetektierungsdaten.
In einem sehr kleinen Plasmavolumen (50 Mikroliter oder weniger) kann schließlich Assay-Multiplexing für ein großes Feld von Proteinen gezeigt werden, die für die physiologische Charakterisierung eines Organismus relevant sind. Die Fähigkeit, eine große Zahl aus einem Probenvolumen durchzuführen, ist in vielen Tierstudien entscheidend, insbesondere für die oft verwendeten Mäusestudien. Von einer Maus können risikolos 50 Mikroliter Plasma gewonnen werden, um mehrere über die Länge verteilte Blutentnahmen und wiederholte Messungen während der Lebensdauer der Maus zu ermöglichen. Dieses Protokoll ermöglicht beispielsweise die vollständig automatisierte, integrierte und simultane Messung von Zytokin, Autoantikörper, allgemeinen Protein- und Hormonprofilen in derselben Gewebeprobe.
Phänotypisierung erfolgt mit besonderer Relevanz in Bezug auf Tiermodelle für menschliche Krankheiten. Ob das Modell der Zebrafisch, das Kaninchen oder die Maus ist, die Fähigkeit zum Einschalten oder Ausschalten individueller Gene oder Gensätze ist ein leistungsfähiger Ansatz für die Erzeugung von Stämmen, die gentechnisch verändert sind, um die Progression der Erkrankung zu untersuchen. In ähnlicher Weise sind Tiermodelle ein bequemes Vehikel zur Überwachung des Ansprechens auf die Therapie. Gleichzeitig ist das Phänotypisieren an Tiermodellen eine außerordentliche bioanalytische Herausforderung: Zusätzlich zu dem Bestreben, "alles" zu messen, ist die Menge an Gewebe, die für diese Untersuchungen zur Verfügung steht, klein. Man kann beispielsweise lediglich erwarten, aus dem Bluten eines Mäuseschwanzes etwa 200 Mikroliter Blut zu erhalten. Obwohl PCR-Amplifizierung verschwindend geringe DNA-Mengen in analytisch brauchbare Mengen umwandelt, erfordern Techniken, die derzeit für Proteomik üblich sind, einschließlich 2-D-Gelelektrophorese und den Verfahren auf Oberflächenaffinitätsbasis, sehr erhebliche Probemengen und führen zudem nicht zu hochauflösenden Trennungen. Bei Kleinmolekül-Assays sind keine Verfahren mit kleinem Volumen zur Profilbildung einer weiten Vielfalt metabolisch relevanter Spezies gezeigt worden: Im Gegenteil lag der Fokus pharmakokinetischer Studien im pharmazeutischen Bereich fast ausschließlich auf dem Schicksal von einer oder nur wenigen Spezies.
Die Lösung dieses Problems ist die simultane Durchführung mehrerer Messungen mit hoher Empfindlichkeit, und weit verbreitet wurden zwei Ansätze verwendet: Arraybildung beinhaltet die räumliche Trennung der verschiedenen chemischen Wege, welche untersucht werden, an unterschiedlichen Positionen, die individuell sondiert werden können. Der Genchip bietet dies für Oligonukleotide (siehe z. B. Michael et al., Anal. Chem., 70, 1242–1248 (1998)), und dieselbe Strategie wird auf sehr rudimentärem Niveau für Proteine durchgeführt. Multiplexing bezieht sich auf die Durchführung mehrerer unabhängiger Messungen zur gleichen Zeit und/oder in derselben räumlichen Region und/oder unter Verwendung derselben Materialien. Dies kann auf einem Chip erfolgen, wie bei aktuellen Ansätzen zur Analyse der Genexpression, wobei die relativen Expressionsniveaus von cDNA von zwei Proben von DNA-Markierungen mit unterschiedlichen Fluorophoren gemessen werden kann. Diese Strategie ist an Proteomik angepasst worden, indem zwei Proteinproben mit unterschiedlichen Fluorophoren derivatisiert wurden und vor der Trennung durch 2-D-Gelelektrophorese gemischt wurden. In diesen Fällen ist das Multiplexing-Niveau nur zwei, was minimale Effizienzsteigerungen ergibt. Mit den erfindungsgemäßen Nanobarcodepartikeln können jegliche chemischen Wege zum Einfangen verwendet werden, die Fachleuten bekannt sind. Dies liefert Multiplexing, das in einem unerreichten Maßstab vorgenommen werden kann. Zusätzlich zu der Proteomik kann dieselbe Strategie auf Genomik (z. B. SNP-Kartierung) und andere Phänotypisierungs-Assays angewendet werden, wie klinische Chemie (z. B. Glukose, Lipoprotein hoher Dichte, Lactat, Lactatdehydrogenase, Triglyceride, Harnstoff, SGOT, SGPT, Bilirubin und alkalische Phosphatase), Zelluntersuchungen (z. B. Zellzählungen und Oberflächenmarker) und Bestimmung anorganischer Ionen angewendet werden. Wie Fachleute erkennen werden, ist möglicherweise eine gegebene Größe von Nanobarcodes für bestimmte Anwendungen besser geeignet als für andere. Größere Nanobarcodes können beispielsweise bevorzugt sein, wobei die zusätzliche Oberfläche wegen der Größe des Analyten, der Stärke des erwünschten Detektierungssignals, usw. nützlich wäre. Die Größe und Form des Nanobarcodes kann auch einen Einfluss auf den gewählten Auslesetyp haben.
NICHT-BIOANALYTISCHE ANWENDUNGEN DES BARKODIERENS
In den fünfundzwanzig Jahren seit der Einführung von Barkodieren haben die meisten Hauptindustriezweige weltweit die Vorteile der Technologie erkannt, und ihre Verwendung hat zugenommen. Die Nahrungsmittelindustrie hat sich beispielsweise über das Scannen am Verkaufpunkt weiterentwickelt und verwendet Barkodieren mittlerweile in der gesamten Lieferkette von der Herstellung über Distributions- und Verkaufsprozesse, bis die Ware den Verbraucher erreicht hat. Obwohl die Industrien auf spezifische Vorteile achten, gehören zu den allgemeinen Vorteilen von Barkodieren erhöhte Genauigkeit, verbesserte Produktivität, verbesserte Qualität und Kosteneinsparungen. Der Verkauf an Barkodiergeräten ist in den Vereinigten Staaten allein ein Markt von 4 Milliarden US-Dollar pro Jahr, der Wert des barkodierten Materials liegt jedoch weit darüber. Trotz vermehrter Verwendung und Verbesserungen der Technologie kön nen viele Industriezweige die Barcodetechnologie wegen physikalischer oder ökologischer Zwänge nicht nutzen. Beispiele hierfür sind die geringe Größe der mit Barcode zu versehenden Waren (z. B. Befestigungselemente), das Material, auf das Barcodes aufgebracht werden müssen (z. B. gekrümmte metallische Oberflächen), Stellen, an denen Barcodes die Ware oder deren Funktion oder Verwendung stören (z. B. Kunstwerke), oder die Verfahren (z. B. extreme Wärme oder extreme Kälte), die eine Ware während der Herstellung oder Distribution des Produkts oder in der eigentlichen Verwendung (z. B. Farbe) durchläuft. Nanobarcodes führen in vielen dieser Bereiche zu neuen Möglichkeiten. Es sollte jedoch betont werden, dass die Dauerhaftigkeit (und chemische Inertheit) dieser Materialien in deutlichem Gegensatz zu anderen Typen von Papier- oder Kunststoff-Markierungen steht.
Die Verwendung von Nanobarcodes als Markierungen oder Etiketten kann ferner durch die Verwendung von mehreren Partikeln als Etikett erweitert werden. Indem mehrere Markierungen zum Etikettieren eines Materials verwendet werden, kann die Zahl der unterschiedlichen Typen von Nanobarcode-Partikeln, die hergestellt werden muss, reduziert werden, während dennoch dieselben großen Zahlen an getrennt identifizierbaren Kombinationen von Nanopartikeln bereitgestellt werden
Einheitsdosismedikamente in der Gesundheitsindustrie. Der Gesundheitssektor ist eine globale Industrie mit ähnlichen Problemen und Bedürfnissen in jedem Land. Die Industrie steht weltweit unter extremem Kostendruck. In den Vereinigten Staaten allein betrugen die Ausgaben im Gesundheitsbereich 1995 insgesamt 1,5 Billionen US-Dollar. Der 1996 veröffentlichte Efficient Healthcare Consumer Response (EHCR) folgerte, dass durch Barkodieren und Automatisierung 11 Milliarden US-Dollar pro Jahr in drei Produktkategorien eingespart werden könnten: nicht-kapitale medizinische/chirurgische Verbrauchsmaterialien, nicht-kapitale Diagnostika und verschreibungspflichtige pharmazeutische Produkte, die nicht über den Einzelhandel gehen. Die Industrie hat beim Etikettieren von Kartons und Schachteln für Produkte gute Fortschritte gemacht, kämpft jedoch noch mit kleinen Waren, wie Einheitsdosenmedikamenten. Das Barkodieren dieser Waren ist besonders wichtig, wenn man berücksichtigt, dass das Institute of Medicine vor kurzem darauf hingewiesen hat, dass 44.000 bis 98.000 Menschen pro Jahr durch medizinische Fehler sterben, die sich in US-Krankenhäusern ereignen.
Befestigungsmittelindustrie. Die Vereinigten Staaten importieren jährlich für ungefähr 7 bis 8 Milliarten US-Dollar Befestigungsmittel (Muttern, Metallschrauben, Schrauben, Nieten, Dichtungsringe, usw.). Diese Produkte werden dann umverpackt und mittels unterschiedlicher Distributionsverfahren an mehrere Industriezweige verkauft, wie Raumfahrt, Automobilindustrie, Nuklearindustrie, Handel und Elektro, wodurch ein Markt von schätzungsweise 30 bis 40 Milliarden US-Doller entsteht. Im Verlauf der letzten Jahre wurden die Produktpackungen mit Barcodes versehen. Individuelle Befestigungsmittel sind dies jedoch nicht.
Auf die Industrie ist vor einigen Jahren ein schwerwiegendes Sicherheits- und Schadensersatzproblem zugekommen, als gefälschte Befestigungsmittel minderer Qualität auf den Markt drängten. Um dieses Problem zu bekämpfen, wurde Barkodieren auf Produktpackungen eingeführt und der Fastener Quality Act (Erlass über die Qualität von Befestigungsmitteln) erlassen. Dieser Erlass wurde im Dezember 1999 zum Abschluss gebracht. Dort sind Anforderungen an Befestigungsmittel festgelegt, die in "kritischen Anwendungen" verwendet werden, einschließlich Einhalten von Laborteststandards der Härtung durch Wärmeverar beitung. Es gibt jedoch noch ein Problem damit, dass individuelle Befestigungsmittel nicht markiert werden können, während Verpackungen von Befestigungsmitteln etikettiert werden können. Nanobarcodes auf Befestigungsmitteln gibt der Industrie ein Mittel zur Konformität mit dem Fastener Quality Act in die Hand und verbessert die Sicherheits- und Zuverlässigkeitsergebnisse für Menschen deutlich.
Reifen. Die Industrie hat lange nach einer Lösung zum Rückverfolgen individueller Reifen gesucht. Dies trifft insbesondere auf die kommerzielle (Lastwagen)-Reifenindustrie zu. Lastwagenreifen werden oft zwei oder drei Mal runderneuert und auf einer anderen Achse des Lastwagens montiert. Obwohl die wirtschaftlichen und Sicherheitsanreize bestehen, gibt es heute keine leichte oder kostengünstige Weise zum Identifizieren eines einzelnen Reifen, so dass Gebrauch und Wartung überwacht werden können. Kommerzielle Reifen sind ein Geschäft von ungefähr 6 bis 8 Milliarden US-Dollar/Jahr (neue Reifen kosten ungefähr 300 US-Dollar, Runderneuern kostet ungefähr 90 US-Dollar pro Reifen). Es gibt ungefähr 7 Millionen Reifen, die als Neuausstattung verkauft werden, 14 bis 14,5 Millionen, die als Ersatzreifen verkauft werden, und weitere 15 Millionen runderneuerte Reifen pro Jahr. Mit Nanobarcodes können Datensätze für jede Reifen gepflegt werden, wodurch sichergestellt wird, dass Reifen in einer Weise gewartet und verwendet werden, dass die Sicherheit gewährleistet ist. Die erfolgreiche Anwendung von Nanobarcodes in der kommerziellen Reifenindustrie führt wahrscheinlich auch zur Eroberung des Automobilreifengeschäfts.
Verfolgung von Waffen. Es gibt viel Kontroversen über die Kontrolle von Handfeuerwaffen. Ein Streitpunkt beinhaltet ein praktisches Verfahren, um Handfeuerwaffen verfolgbar zu machen. Nanobarcodes können das Identifizieren einer einzelnen Waffe, des Ladestreifens, des Schlagbolzens und sogar des Geschossmantels ermöglichen. Dies könnte die Verfolgbarkeit signifikant verbessern und das Einhalten der staatlichen und Bundesgesetzgebung leichter durchführbar machen sowie Fremdidentifizierung, Untersuchungen und das Durchsetzen von Gesetzen unterstützen. Das Verfolgen von Explosivstoffen kann in ähnlicher Weise durch Einbringen von Barcodes erfolgen. Derzeit hat das Department of Energy ein Explosivstoffe-Klassifizierungs-Verfolgungssystem (http://faxback.wmnsnw.com/ects/summsrch.asp), jedoch kein Mittel zum direkte Verfolgen der Tausende von bekannten Explosivstoffen. Es ist signifikant, dass Nanobarcodes alle Kriterien zu erfüllen scheinen, die im National Academy of Science's Committee on Marking, Rendering Inert, and Licensing of Explosive Materials aufgeführt sind. Zu diesen Kriterien gehören Sicherheit in Herstellung und Anwendung, Wirkung auf die Leistung von Explosivprodukten, Einsatzmöglichkeit für das Durchsetzen der Gesetze, forensische und gerichtliche Anwendbarkeit, Explosionsbeständigkeit, ökologische Verträglichkeit, Kosten und universale Anwendbarkeit.
Geld und rechtsrelevante Dokumente. Obwohl viele Schritte unternommen wurden, um zu gewährleisten, dass Geld und Dokumente, wie Pässe und Visas, nicht gefälscht werden können, können (für das bloße Auge) unsichtbare Nanobarcodes in dem Papier verwendet werden, um die Authentizität des Dokuments zu gewährleisten. Konventionelle Barcodes können zudem als Positionsindikatoren von Nanobarcodes verwendet werden. In anderen Worten könnten Dokumente mit Nanobarcodes an speziellen Positionen imprägniert werden, die durch Abfragen der makroskopischen Barcodes offenbart werden. Dies ermöglicht eine rasche Verifizierung der Authentizität eines Dokuments. Die gleiche Strategie kann man auf wertvolles individuelles Eigentum, persönliche Inhalte oder unersetzliche Erbstücke anwenden.
Farbe. Barcodieren von Farben, ein Geschäft von 16 Milliarden US-Dollar/Jahr in den Vereinigten Staaten 1997, bietet drei ausgezeichnete Gelegenheiten. (1) Farbe für den Außenarchitekturbereich. Wegen der fehlenden Dauerhaftigkeit, und weil ihre Größe die Formulierung nachteilig beeinflusst, können keine traditionellen Barkodierformen verwendet werden. Die Einführung von Nanobarcodes in Außenbereichfarben ermöglicht das Verfolgen des Farbalters, und im öffentlichen Raum erlauben rostempfindliche Strukturen (wie Brücken) die präventive Wartung (das gleiche lässt sich über Nanobarcodes in Beton und Straßenpflaster sagen). (2) Farben für den Innenarchitekturbereich. Ein Problem, mit dem viele Hausbesitzer konfrontiert werden, ist die fehlende Verfolgbarkeit zuvor aufgebrachter formulierter (d. h. abgemischter) Farben: Es ist in der Regel unmöglich, diese Mischungen genau zu reproduzieren. Anbieter von Farben, die ein barkodiertes Produkt anbieten, das die genaue Herstellung dieser Formulierung viele Jahre nach der Originalformulierung ermöglicht, haben einen großen Wettbewerbsvorteil. (3) Nanobarkodieren unbezahlbarer Kunstwerke macht das Erkennen von Fälschungen einfach. Individuelle Künstler möchten in der Tat möglicherweise ihre eigenen "individualisierten" Barcodes in alle ihre Produkte einbringen, um Langzeitauthentizität zu garantieren.
Öl. Raffiniertes Öl ist zu eine zunehmend wichtigen Handelsware in industrialisierten Ländern geworden. Da frühere Rohölquellen versiegen, müssen weitere Quellen gefunden werden, um sie zu ersetzen. Die Suche hat zu der Entdeckung von Öl in einigen recht abgelegenen Landesteilen geführt, in denen der einzige mögliche Weg zum Transportieren des Rohöls über Land mittels einer Pipeline ist (z. B. Transalaska-Pipeline).
Die Kosten des Baus einer derartigen Pipeline sind enorm, und mehrere Ölfirmen müssen sich unvermeidlicherweise dieselbe Pipeline teilen. Es kann infolgedessen schwierig sein, zu bestimmen, welcher Firma das Rohöl gehört, das gerade transportiert wird. Unverwechselbare Nanobarcodes könnten von den Ölfirmen zur Identifizierung ihres Rohöls verwendet werden. An irgendeinem Punkt der Pipeline könnte eine Probe des Rohöls erhalten und analysiert werden – die Nanobarcodes werden durch Filtration, magnetische Mittel oder anderes Verfahren hervorgeholt – so dass die Quelle des Öls bestimmt werden kann. Wenn restliche Nanobarcodes die Endanwendung des Rohöls stören können, können sie während des Raffinierungsprozesses entfernt werden.
Identifizierung lebender oder verstorbener Organismen. Die Stabilität und Inertheit von Nanobarcodes ermöglichen ihnen die Verwendung zum Markieren von Organismen in unauffälliger Weise. Kleine Tiere, die in der Wildnis freigesetzt werden, können beispielsweise mit Nanobarcodes markiert werden wodurch sie zweifelsfrei identifiziert werden können, wenn sie später eingefangen werden. Eine solche Anwendung könnte besonders nützlich sein, wenn die Zahl der zu verfolgenden Organismen groß ist. Nanobarkodieren individueller Pflanzen oder Samen könnte beispielsweise genutzt werden, um die Feldfruchtspezifikation zu verfolgen. Theoretisch könnten Nanobarcodes zum zweifelsfreien Identifizieren von Resten von Tieren und sogar Menschen verwendet werden.
ELEKTRONISCHE VORRICHTUNGEN
Eine einfache Weiterführung der Herstellung barkodierter Multimetallstäbe ist die Herstellung aktiver und passiver elektronischer Vorrichtung, die als Komponenten von elektronischen Schaltkreisen und Speichern im Nanomaßstab und Mikromaß stab wirken können. Diese Strukturen können Standardelektronikvorrichtungen wie Drähte, Widerstände, Kondensatoren, Dioden und Transistoren einschließen. Sie können auch Vorrichtungen mit komplexeren elektronischen Funktionen sein, wie Vorrichtungen mit negativem differentiellen Widerstand (NDR), Resonanztunneldioden, ferroelektrische Schalter, Verschiebungsregister und Verzögerungsleitungen.
Widerstände können hergestellt werden, indem eine Widerstandkomponente (z. B. ein Polymer) zwischen zwei leitenden Metallstreifen (z. B. Gold, Kupfer oder Silber) gezüchtet wird. Polymere Moleküle dieses Typs schließen leitende Polymere, wie Poly(pyrrol), Poly(anilin) und Poly(thiophen) und dielektrische Polymere, wie Poly(allylaminhydrochlorid) und Poly(dimethyldiallylammoniumchlorid) ein. Dünnere Streifen aus Materialien mit höherem Widerstand, wie selbstoganisierende Monoschichten, die typischerweise monomere organische Moleküle sind, die an einem Ende mit einer Thiol-, Isonitril-, Carboxylat- und anderen Ligandengruppen funktionalisiert sind, können auch als Widerstandselemente wirken.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Synthese von Nanopartikeln, die in Diodenstrukturen sowie Strukturen mit negativem differentiellen Widerstand verwendet werden können.
A. Metall-Halbleiter-Metall-Vorrichtungen. Diese Vorrichtungen bestehen aus einem Multikomponentenstab mit Metallenden und einem Halbleiterpartikel in der Mitte. Die Metallenden können durch konventionelles Elektroplattieren oder durch stromloses Plattieren hergestellt werden, und der Halbleiter kann ein Reinelement sein, wie Silicium, Germanium, Zinn oder Selen, oder ein Verbindungshalbleiter, wie ein Metalloxid, Metallsulfid, Metallnitrid, Metallphosphid oder Metallarsenid. Es sind Stäbe mit Durchmessern hergestellt worden, die zwischen 70 und 200 nm variieren, die Oxidhalbleiter (Titandioxid oder Zinkoxid) und Chalcogenid-Halbleiter (Cadmiumselenid) zwischen zwei Metallenden enthalten. Der Durchmesser des Halbleiter-"Streifens" ist in der Regel derselbe wie der Rest des Stabs, und seine Breite variiert von wenigen Nanometern bis 1 bis 2 Mikrometern. Die bisher in Diodenstäben verwendeten Metalle shließen Gold, Silber, Platin und Nickel ein, können prinzipiell jedoch jegliches der Metalle sein, die an anderer Stelle in dieser Erfindung beschrieben sind. Die Halbleiter können durch Adsorption von Kolloidpartikeln oder durch elektrochemisches Züchten in die Membranporenmatrize eingebracht werden. Der obere Metallkontakt wird durch elektrochemische Abscheidung und stromlose Abscheidung hergestellt. Solche Dioden erzeugen eine asymmetrische Strom-Spannungs-Kurve. Es ist von beiden symmetrischen Strukturen (z. B. Gold-Cadmiumselenid-Gold) und asymmetrischen Strukturen (Gold-Silber-Zinkoxid-Gold) gefunden worden, dass sie gleichrichtende Strom-Spannungs-Charakteristika haben.
B. Metall-Molekül-Metall-Vorrichtungen. Statt ein Halbleiterpartikel in eine gestreifte Stabstruktur einzubauen, kann eine Molekülschicht verwendet werden, die entweder elektrochemisch oder durch Selbstorganisation abgeschieden werden kann. Diese Molekül kann ein leitendes oder dielektrisches Polymer wie oben beschrieben sein. Andere Beispiele schließen selbstorganisierende Monoschichten ein. Die Grenzfläche zwischen dem Molekül und dem Metall kann gleichrichtend wirken oder andere elektronische Charakteristika aufweisen, wie negativen differentiellen Widerstand. Wir haben beispielsweise gezeigt, dass Gold-Molekül-Nickel-Vorrichtungen, in denen das Molekül 16-Merkaptohexadecansäure ist, Stromgleichrichtercharakteristika haben. Molekül I mit negativem differentiellen Widerstand ist auch in eine derartige Struktur eingebaut worden. Die Molekülschicht ist typischerweise sehr dünn (0,5 bis 3 nm) und kann durch Adsorption auf das untere Metall eingeführt werden, gefolgt von elektrochemischer oder stromloser Abscheidung des oberen Metalls. Alternativ kann ein gestreifter Stab, der eine geeignet dünne Opfermetallschicht (wie Kupfer oder Silber) enthält, auf einer Oberfläche oder in einem Schaltkreis immobilisiert und dann chemisch oder elektrochemisch geätzt werden, um eine Lücke zwischen den Endmetallen zu hinterlassen. Die Lücke kann dann durch elektrochemische Abscheidung oder Absorbieren eines polymeren oder monomeren Moleküls aus Lösung oder thermisches Verdampfen eines flüchtigen Moleküls gefüllt werden.
Durch Anlagen eines Gate-Draht an eine der oben beschriebenen Diodenvorrichtungen kann eine Vorrichtung hergestellt werden, die als Transistor wirkt. Ein solcher Draht kann in einer Querbalkenstruktur (Crossbar-Struktur) verwendet werden, die durch vom elektrischen Feld angetriebene Montage (Organisation) oder Selbstorganisation gefertigt werden kann.
Ein Stab mit hohem Aspektverhältnis, der mehrere Streifen aus leitenden Metallen und anderen Materialien (Polymeren, Halbleitern oder anorganischen oder organischen Dielektrika) enthält, könnte als Verzögerungsleitung oder Schieberegister wirken, wenn eine Kette von Hochspannungs- und Niederspannungspulsen an einem Ende angelegt wird. Wenn die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Spannung von einem Ende des Stabs zu dem anderen verglichen mit der Uhrfrequenz des Schaltkreises, die zum Anlegen der Spannungspulse verwendet wird, langsam ist, dann kann das Signal am anderen Ende als Zeichenkette von Nullen und Einsen gelesen werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um Fachleuten Zugang zu Informationen über verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu geben, und sollen in keinerlei Weise den Schutzumfang der Erfindung einschränken.
BEISPIEL 1

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die matrizengelenkte Synthese mehrerer Aromen von Nanobarcodes für Multiplex-Assays. Es ist für diese Anwendung erwünscht, eine Vielfalt unterschiedlicher Aromen aufzubauen, die sich durch Lichtmikroskopie leicht unterscheiden lassen. Beispielsweise wurden 10 unterschiedliche Aromen von Nanobarcodes gemäß der folgenden Tabelle unter Verwendung von Gold- und Silbersegmenten synthetisiert. Es sei darauf hingewiesen, dass das Beschreibungsfeld der Tabelle die Zusammensetzung jedes Nanobarcodes durch Segmentmaterial und Länge (in μm) in Klammern zeigt. Aroma Nr. 1 ist beispielsweise 4 μm langes Gold, und Aroma Nr. 2 ist 2 μm Gold, gefolgt von 1 μm Silber, gefolgt von 2 μm Gold.

Aroma Nr.	Beschreibung	Anzahl der Segmente	Länge
1	Au(4)	1	4 μm
2	Au(2), Ag(1), Au(2)	3	5 μm
3	Au(1), Ag(1), Au(1), Ag(1), Au(1)	5	5 μm
4	Au(2), Ag(2)	2	4 μm
5	Ag(1), Au(1), Ag(1), Au(1), Ag(1)	5	5 μm
6	Ag(1), Au(4)	2	5 μm
7	Ag(4)	1	4 μm
8	Ag(1), Au(2), Ag(1)	3	4 μm
9	Ag(1), Au(1), Ag(1), Au(2)	4	5 μm
10	Ag(2), Au(1), Ag(1), Au(1)	4	5 μm

Es folgt eine detaillierte Beschreibung der Synthese von Aroma Nr. 4 (alle anderen Aromen wurden durch geringfügige und offensichtliche Veränderungen dieses Protokolls synthetisiert).
25 mm Durchmesser Whatman Anopore Scheiben mit Poren mit 200 nm Durchmesser wurden für matrizengelenkte Nanobarcodesynthese verwendet. Die elektrochemische Metallabscheidung wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Gold- (Technic Orotemp 24) und Silber-(Technic ACR 1025 SilverStreak Bath)Plattierlösungen durchgeführt. Alle der nachfolgend beschriebenen Elektroplattierstufen wurden in einer elektrochemischen Zelle durchgeführt, die in ein Schallbad tauchte, dessen Temperatur auf 25°C geregelt war.
Die Synthese von Nanobarcode Aroma Nr. 4 wurde wie folgt durchgeführt. Die Membran wurde durch Aufdampfen von etwa 50 nm Silber auf ihre Verzweigungsseite vorbehandelt. Um die Poren auf dieser Seite vollständig zu füllen, wurden ungefähr 1 C Silber auf das aufgedampfte Silber elektroplattiert, wobei ungefähr 15 Minuten lang 1,7 mA Plattierstrom verwendet wurden. Dann wurde ein weiteres 1 C Silber von der Seite gegenüber dem aufgedampften Silber unter Verwendung von 1,7 mA Plattierstrom für ungefähr 15 Minuten in die Poren der Membran elektroplattiert. Diese Silberschicht wurde zum Auffüllen des etliche Mikrometer dicken "verzweigtporigen" Bereichs der Mem bran verwendet. Die Silberplattierlösung wurde durch serielle Verdünnungen mit Wasser entfernt und durch die Goldplattierlösung ersetzt. Dann wurden die 2 μm langen Goldsegmente unter Verwendung von 1,7 mA Plattierstrom ungefähr 30 Minuten abgeschieden. Die Goldplattierlösung wurde durch serielle Verdünnungen mit Wasser entfernt und durch die Silberplattierlösung ersetzt. Dann wurde das letzte 2 μm lange Silbersegment unter Verwendung von 1,7 mA Plattierstrom ungefähr 30 Minuten abgeschieden. Die Membran wurde aus der Vorrichtung entfernt, und die aufgedampfte Silberschicht (und das elektroabgeschiedene Silber in den verzweigten Poren) wurden durch Auflösen in 6 M Salpetersäure entfernt, wobei darauf geachtet wurde, nur die verzweigtporige Seite der Membran der Säure auszusetzen. Nach dieser Stufe wurden die Nanobarcodes aus der Aluminiumoxidmembran freigesetzt, indem die Membran in 0,5 M NaOH gelöst wurde. Die resultierende Suspension der Nanobarcodes wurde dann mehrfach zentrifugiert und mit Wasser gewaschen.
BEISPIEL 2
Es ist ein wichtiges Ziel, die Fähigkeit zu zeigen, eine große Zahl von Materialien in den erfindungsgemäßen Nanobarcodes zu verwenden. Bislang schließen durch elektrochemischen Abscheidung in einer Membranmatrize gebildete Stabstrukturen (Aluminiumoxid oder Spurenätzpolycarbonat) Ag, Au, Pt, Pd, Cu, Ni, CdSe und Co ein. Die Aluminiumoxidmembranen mit 200 nm Durchmesser sind vorwiegend aus Gründen der Bequemlichkeit verwendet worden. Viele der Materialien werden nun auch in den Polycarbonatmembranen mit kleinerem Durchmesser verwendet.
CdSe wird derzeit über ein Potentialdurchlaufverfahren aus einer Lösung von CdSO₄ und SeO₂ plattiert. An der Metall:CdSe-Grenzfläche sind mechanische Stabilitätsprobleme aufgetreten: sie brachen bei Schallbehandlung während des Entfernungsprozesses von der Membran. Dies wurde durch Zugabe einer 1,6-He xandithiolschicht zwischen jeder Oberfläche geheilt. Das Cu und Ni wurden mit einer kommerziell erhältlichen Plattierlösung plattiert. Es wurde beim Betreiben unter ähnlichen Bedingungen wie die Ag- und Au-Lösungen gefunden, dass diese Metalle ungefähr mit der gleichen Rate plattierten, etwa 3 μm/Stunde. Das CO wurde aus einer CoSo₄-Citrat-Lösung plattiert. Diese Stäbe schienen recht monodispers zu wachsen, sie wuchsen jedoch vergleichsweise langsam, etwa 1,5 μm/Stunde.
BEISPIEL 3
Die orthogonale Funktionalisierung von Cu- und Ni-Nanobarcodes wurde unter Verwendung von Benzothiazol und Butylcarbamat auf dem Cu und Dimethylglyoxim und Hydrochinon auf dem Ni bewirkt. Die Stäbe sind aus Au-Enden mit Cu- oder Ni-Mittelstücken zusammengesetzt. 1,6-Hexandithiol und 2-Merkaptoethylamin wurden zum Funktionalisieren der Enden der Stäbe verwendet. Benzotriazol ist eine Verbindung, die typischerweise zur Korrosionsinhibierung für Kupfer verwendet wird, das heißt, dass sie effektiv an den Kupferabschnitt des Stabs binden können sollte. Butylcarbamat ist ein Molekül mit einer endständigen Carbonyl- und Amingruppe an demselben Ende, die beide gut Chelate mit Cu bilden. Das Glyoxim und das Hydrochinon sind auch für Chelate mit Ni bekannt, wodurch sie gute funktionale Gruppen für die Monoschichtbildung sind. Diese werden in verschiedenen Weisen kombiniert, um die besten Ergebnisse für orthogonale Funktionalisierung zu erzeugen. Es ist möglich, die unterschiedlichen Bindungskonstanten und Größenordnungen der Einwirkung zu nutzen, um eine große Vielfalt von orthogonal funktionalisierten Segmenten zu erzeugen. Die Stäbe werden danach mit Rhodamin oder Fluoreszin funktionalisiert, um die Anwesenheit der freiliegenden funktionalen Aminbeziehungsweise Thiolgruppen zu bestimmen. In Abhängigkeit von dem Farbstoff und der Oberflächenfunktionalisierung können verschiedene Teile der Stäbe zum "Aufleuchten" gebracht werden.
BEISPIEL 4
Ein Sandwich-Immunoassay auf Lösungsbasis wurde zur Verwendung auf Barcodes entwickelt, die Lichtmikroskopie-Fluoreszenz-Detektierung verwenden. Der Assay wurde mit Au, Au/Ag und Au/Ni-Stäben mit unterschiedlichen Segmentmustern durchgeführt. Der Nanobarcode wurde basierend auf Unterschieden des Reflexionsvermögens der Metalle bei unterschiedlichen Wellenlängen abgelesen. 4 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments.
Am Anfang wurde der Sandwich-Immunoassay wurde mit zwei Typen von Stäben, Au/Ag und Au-Stäben, unter Verwendung des folgenden Systems durchgeführt. Anti-Kaninchen-IgGFc/Kaninchen IgG/Anti-Kaninchen IgGH&L, markiert mit Texasrot. Es wurden Fluoreszenzbilder mit Filtern für FITC an einer Mischung von Stäben genommen, und die Stäbe schienen mit einem 600 nm Bandpassfilter dieselbe Metallzusammensetzung zu sein, der Wechsel zu einem 400 nm Bandpassfilter zeigte jedoch die Barcode-ID.
Danach wurden zwei unterschiedliche Sandwich-Immunoassays mit zwei unterschiedlichen Typen von Barcodestäben durchgeführt. Für dieses Experiment wurde derselbe Texasrot-(TR)-Assay wie bereits erwähnt zusammen mit dem folgenden System verwendet: Anti-Human-IgGFc/HIgG/Anti-Human-IgGg-spezifisch. Die FITC-Bilder wurden zuerst genommen, da dieses Fluorophor viel rascher als TR durch Licht ausbleicht. Da man erkannte, dass mindestens zwei Fluorphore unterschieden werden konnten, wurde als nächstes ein Simultan-Assay auf Lösungsbasis verwendet. Die Stäbe wurden mit dem Einfang-Antikörper in separaten Röhrchen derivatisiert, danach wurden sie zum Abschluss des Assays miteinander gemischt, um die in Serumproben vorhandenen Bedingungen zu imitieren. Es waren zwei Fluorophore notwendig, um die Menge an unspezifischer Bindung sowie Kreuzreaktivität zu bestimmen. Anfangs gab es eine signifikante Menge an Kreuzreaktivität zwischen den beiden Systemen sowie etwas Unspezifizität an der Staboberfläche. Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein PEG mit Aminoenden verwendet, wodurch die Unspezifizität erheblich reduziert wurde, und BSA wurde verwendet, um der Kreuzreaktivität abzuhelfen. Der simultane Zweisystem-Sandwich-Immunoassay auf Lösungsbasis wurde erfolgreich abgeschlossen. 4 μm Au/Ag/Au-Stäbe wurde mit a-Human-IgG, (FITC) derivatisiert, und 8 μm Au/Ni/Au wurden mit a-Kaninchen IgG (TR) derivatisiert. Die Au-Abschnitte der Au/Ni/Au-Stäbe wurden selektiv derivatisiert, wie durch das Fehlen von Fluoreszenz an Ni–Abschnitten deutlich wurde. Ag schien ferner die Fluoreszenz von FITC zu erhöhen.
Um die Steigerungsfaktoren von Ag mit FITC zu untersuchen, wurde ein Sandwich-Assay mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren mit demselben Stabtyp durchgeführt. Es wurden das Human-IgG-FITC-System und ein neues System aus dem Folgenden: Anticytochrom c/biotinyliertes Cc/Streptavidin-Phycoerythrin (PE) verwendet. Wie bei dem humanen IgG-System gab es an den Abschnitten des Stabs, die den Ag-Abschnitten entsprachen, eine hellere Fluoreszenz, wie in dem Bild des Reflexionsvermögens gezeigt wird. Es wurde in dem PE-System jedoch keine Steigerung aus Ag gesehen. Es ist somit wahrscheinlich, dass die Steigerung ein wellenlängenspezifisches Phänomen ist, sowohl in Bezug auf die dekadische Extinktion des Fluorophors als auch auf die Extinktion des Nanobarcodes (dekadische Extinktion und Streuung).
BEISPIEL 5
Durchflusszytometrieexperimente wurden zur Quantifizierung der Fluoreszenz aus Immunoassays oder Nanobarcodes verwendet. Es wurden sowohl Human-IgG- als auch biotinylierte Cc-Systeme verwendet. Von dem Kaninchen-IgG-System ging man auf das biotinylierte Cc-System über, weil TR in dem Durchflusszytometrieinstrument nicht mit 488 nm angeregt werden konnte. Für die Human-IgG- und biotinylierten Cc-Systeme auf Au/Ag-Nanobarcodes wurden Titrationskurven hergestellt. Aus den graphischen Darstellungen geht hervor, dass die Titrationskurve für Human-IgG einen Wendepunkt enthält, während dies bei dem biotinylierten Cc-System nicht der Fall ist. Es erreicht stattdessen ein Maximum und scheint sich zu stabilisieren. Die Form der Kurve für das Human-IgG-System kann aus der Ag-Steigerung des FITCs resultieren. Durchflusszytometrieexperimente können durchgeführt werden, um die Menge der Antikörperbindungskapazität (ABC) sowie die Konzentration der Einfang-Antikörper zu bestimmen, die zur Optimierung des Systems erforderlich sind.
BEISPIEL 6
Die Verwendung von kolloidalem Au oder Ag ist zur Detektierung von Bioassays untersucht worden. Dies betrifft die Unterschiede des Reflexionsvermögens von Metallen bei unterschiedlichen Wellenlängen. Theoretisch wäre die Barcode-ID oder Teile davon bei der Isosbeste des Reflexionsvermögens nicht sichtbar, d. h. etwa 600 nm für Au und Ag. Die selektive Positionierung kolloidaler Partikel auf allen oder einem Teil des Barcodes würde jedoch zu einer Änderung des Reflexionsvermögens führen, somit zu einem Kontrast des Reflexionsvermögens. Kolloidale Au-Partikel sind für diesen Aspekt am besten, da sie leichter monodispers herzustellen, zu derivatisieren und bioverträglich zu machen sind. Ein Vorexperiment hat gezeigt, dass die Adsorption einer Schicht von Ag-Kolloid das Reflexionsvermögen von Au/Ag-Stäben ändern kann. Dies wurde durch Adsorbieren einer Monoschicht von 1,6-Hexandithiol auf den Stäben und anschließende Einwirkung von Ag-Kolloid be wirkt. TEM-Daten bestätigen das Binden von kolloidalem Ag an die Nanobarcodes. Bei 400 nm ist das charakteristische Streifenmuster des Reflexionsvermögens mit oder ohne Zusatz von kolloidalem Ag zu sehen. Bei 600 nm ist das Streifenmuster in Abwesenheit von Ag-Nanopartikeln jedoch nicht zu sehen, kann in Gegenwart von Ag-Nanopartikeln jedoch gesehen werden.
Diese Daten zeigen, dass es eine unterschiedliche elektromagnetische Wechselwirkungen zwischen den Ag-Nanopartikeln und den Ag- und Au-Segmenten des Nanobarcodes gibt, da die TEM-Daten eine gleichförmige Verteilung des Ag-Materials über die Oberfläche des Nanobarcodes zeigen. Es sei darauf hingewiesen, dass an den Änderungen des Reflexionsvermögens keine Isosbeste beteiligt sein muss (d. h. von keinem unterschiedlichem Reflexionsvermögen zu unterschiedlichem Reflexionsvermögen oder anders herum). Es ist lediglich ein chemisches oder biochemisches Ereignis erforderlich, das an eine Änderung des Reflexionsvermögens gekoppelt ist. Diese Änderung des Reflexionsvermögens muss sich zudem für die verschiedenen Segmente nicht unterscheiden. Die allgemeinste Implementierung beinhaltet somit eine durch molekulare Bindungsbildung/Lösen der Bindung induzierte Änderung des Reflexionsvermögens von einem oder mehreren Segmenten für den gesamten Nanobarcode. Eine spezifischere Ausführungsform beinhaltet Veränderungen des Reflexionsvermögens, die zu Eliminierung (oder Erzeugung) einer Isosbeste des Reflexionsvermögens führen.
BEISPIEL 7
Barcodestäbe sind für Assayverfahren auf Lösungsbasis zur Detektierung von DNA-Hybridisierung oder -Dehybridisierung nützlich. Anfangs wurden Oligos zur Entwicklung des Verfahrens verwendet, die Technologie kann jedoch leicht auf cDNAs erweitert werden. Bis heute wurde die Bindung kurzer Oligos (12-Mere) an Stäbe unter Verwendung von Fluoreszenz (FITC) zur De tektierung bewirkt. Zwei Bindungsverfahren, die beide aminomodifizierte Oligos verwenden, sind durchgeführt worden. Ein Verfahren verwendet ein bifunktionales Vernetzungsmittel, 1,4-Phenylendiisothiocyanat (PDITC), um das aminomodifizierte Oligo an eine Schicht aus PEG mit endständigem Amino zu linken. Das zweite Verfahren verwendet traditionelle Carbodiimid-Kopplung, um das aminomodfizierte Oligo an eine adsorbierte Schicht von "Aminosäure"-PEG (HCl·NH₂-PEG-COOH) zu binden. Traditionelle Carbodiimidkopplung ergibt eine größere Bindungsmenge als das bifunktionale Vernetzungsverfahren. Carbodiimidkopplung lässt sich ferner leichter bewerkstelligen, kann vollständig in wässriger Lösung durchgeführt werden und ist besser reproduzierbar. Es kann auch jede weitere Bindungsform verwendet werden, die Fachleuten bekannt ist.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel betrifft die DNA-basierte Montage von Edelmetall-Nanostäben mit dem letztendlichen Ziel, DNA zur Montage der Partikel zu funktionalen sublithographischen elektronischen Vorrichtungen zu verwenden. Es ist wichtig, dass man versteht, wie Thiol-funktionalisierte DNA sich an kolloidale Sole dieser Stäbe bindet, und wie dieses Wissen auf die Montage der Stäbe anzuwenden ist.
Viele dieser Bemühungen konzentrieren sich auf die Verwendung von DNA zur Montage von Au-Partikeln im Nanometermaßstab. Bevor diese Partikel unter Verwendung von DNA montiert werden können, muss man das fundamentale Verfahren der Derivatisierung von Partikeln mit DNA verstehen. Die Adsorptionsthermodynamik von DNA auf diesen Partikeln und die Hybridisierungseffizienz der DNA, nachdem sie auf den Oberflächen dieser Partikel montiert worden ist, ist untersucht worden. Es wurde eine Langmuir-Adsorptionsisotherme zur Adsorption von thiolierter und nicht-thiolierter DNA (36 Basen Länge) auf einem kolloida len Sol von Au-Nanostäben (200 nm × 3 μm) hergestellt. Mit diesen Plots können ΔG-Werte für die Adsorption von sowohl thiolierter als auch nicht-thiolierter DNA auf den Partikeln berechnet werden, –1,83 × 10⁵ J/Mol beziehungsweise –2,51 × 10⁴ J/Mol.
Das letztendliche Ziel dieser Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von DNA zur Montage von Nanostäben auf gemusterten (strukturierten) Oberflächen, um eine Speichervorrichtung zu bilden. Bevor die Montage auf einer gemusterten Oberfläche beginnen kann, ist es wichtig, die Montage auf einem einfacheren System zu verstehen, beispielsweise auf Au-Filmen. Es sind viele Parameter untersucht worden, um ihren Einfluss auf die Montage von Stäben zu untersuchen, einschließlich Salzkonzentration, Temperatur, Blockiermitteln und drei Oligosystemen, verglichen mit zweien. Die besten Ergebnisse ergaben sich aus der Derivatisierung der Stäbe mit thiolierter DNA, gefolgt von Eintauchen in 6-Merkaptohexanol. Dann wurde ein Au-Film in thiolierter DNA, gefolgt von Octanthiol, derivatisiert. Die Stäbe wurden dann in einem Puffer suspendiert, der 10 mM Phosphat (pH = 7), 0,5% Blott-Blockiermittel, 1 mM Natriumdodecylsulfat und 50 μm Ramsch-Oligonukleotid war. Die Au-Filme wurden dann in diese Lösung getaucht und über Nacht getaumelt. Mit diesem System wurde die Zahl der montierten Stäbe wesentlich erhöht, während die unspezifisch montierte Zahl abgenommen hatte.
Eine alternative Derivatisierung beinhaltet die Verwendung funktionalisierter PEGs, um die DNA an die Oberfläche von entweder dem Nanostab oder die Au-Oberfläche oder an beide zu binden. Diese Technik beinhaltet das Anordnen des Stabs oder der Au-Oberfläche in den folgenden Lösungen: 16-Merkaptohexadecansäure, EDC/NHS, aminiertes PEG, 1,4-Phenylendiisothiocyanat, aminierte DNA. Diese Derivatisierungsstrategie un ternimmt wenig zur Verbesserung der Montage von Au-Stäben auf Au-Filmen, verbessert ihre Montage auf gemusterten Au-Oberflächen auf Si jedoch dramatisch, insbesondere wenn ein bernsteinsäureanhydridfunktionalisiertes Silan zum Derivatisieren der Si-Oberfläche verwendet wurde. Das Bernsteinsäureanhydrid kann dann mit Wasser behandelt werden, wodurch negativ geladene Carboxylatgruppen auf der Si-Oberfläche zurückbleiben, die die anodisch DNA-beschichteten Nanostäbe abstoßen.
BEISPIEL 9
Die meisten Stabexperimente wurden unter Verwendung von Stäben mit 200 nm Durchmesser durchgeführt, die in kommerziell erhältlichen Aluminiumoxidmembranen gezüchtet wurden. Es hat auch Bemühungen zur Verwendung von Polycarbonatmembranen mit kleinerem Durchmesser gegeben. Der Grund hierfür ist, dass bestimmte optische Eigenschaften oder magnetische Eigenschaften oder physikalische oder chemische Eigenschaften oder Montagechemiewege zur Verwendung mit kleineren Partikeln besser geeignet sind. Stäbe, die Au- und Ni-Streifen enthalten, sind mit Ni-Chelatbildnern (Dimethylglyoxim oder 8-Hydroxychinolin) derivatisiert worden. Die Stäbe können dann in eine interessierende Thiollösung eingetaucht werden, und die Thiole werden nach Wunsch auf dem Au montiert, während die Ni-Streifen effektiv für das Thiol "blockiert" sind. Die Stäbe wurden mit Dimethylglyoxim, gefolgt von thiolierter DNA derivatisiert. Die Stäbe wurden dann mit YOYO behandelt, einem DNA-Interkalationsfarbstoff, der auch an einsträngige DNA bindet. Diese Daten zeigen, dass orthogonale Derivatisierung erweitert werden kann, um Au/Ni (sowie Pt/Au, wie bereits erörtert) einzuschließen. Nanobarcodes, die Au/Ni/Pt enthalten, sollte das Anordnen dreier unterschiedlicher chemischer Wege auf demselben Nanopartikel ermöglichen. Es ist wahrscheinlich, dass se lektive chemische Wege für Kupfer entwickelt werden können (z. B. durch Verwendung von Dithiocarbamaten). Es sollte somit beispielsweise möglich sein, vier unterschiedliche Oligonukleotide an einen einzigen Nanopartikel zu binden, die sich jeweils in einem Basenrest unterscheiden. Ein derartiges System würde die SNP-Analyse wesentlich vereinfachen. Mit vier Typen von chemischen Wegen des Segmentmaterials in Kombination mit Enden- oder Spitzenderivatisierung könnte ein einziger Nanobarcode mit mindestens sechs unterschiedlichen chemischen Wegen in spezifischen Positionen derivatisiert werden.
BEISPIEL 10
Elektrische Felder sind mit Erfolg zum Ausrichten von Partikeln verwendet worden. In diesem Experiment werden die Auswirkungen dieser Feldausrichtung auf die Oberflächenchemie der ausgerichteten Stäbe untersucht. Die Stäbe wurden mit Merkaptoethylamin derivatisiert und danach durch elektrisches Feld ausgerichtet. Sie wurden danach zurückgegeben und in eine Lösung von Rhodamin B-Isothiocyanat getaucht. Die Oberflächen wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop Bildgebung unterzogen. Mehrere Ausrichtungspotentiale und Frequenzen wurden untersucht, bis man gefunden hat, dass sie die Thiole nicht von der Oberfläche der Stäbe wegoxidieren.
BEISPIEL 11
Es sind Anstrengungen unternommen worden, um geordnete zweidimensionale Strukturen von Metall-Nanostäben zu manipulieren. Es werden machbare Mittel zur Montage diskreter Stabpakete gesucht. Zweidimensionale Montagen von vier oder mehr Stäben (deren Breite kürzer als die Länge der Stäbe ist, die in einer gegebenen Montage verwendet werden) sollen in definierten (oder zugänglichen) Positionen erzeugt und angeordnet werden. Dieser Montagetyp kann dann als unteres Drittel einer Querbalkenstruktur dienen und die Montage von oberen Schichten unterstützen. Die zweite Schicht ist ein elektronisch definierbares Speicherelement, und die dritte ist eine weitere zweidimensionale Stabanordnung, die in Bezug auf die erste um 90° gedreht ist. Die erste Schicht kann den Aufbau der andere beiden Schichten unterstützen, indem Multimetallstreifenbildung und komplementäre Oberflächenchemie verwendet wird.
AN GRENZFLÄCHEN GEBILDETE STABBÜNDEL
Es wurden Stab-Floßbildungstechniken verwendet, die chemisches Modifizieren von Au-Stäben (250 nm Durchmesser) verschiedener Länge mit Polyelektrolyten oder Thiolen beinhalteten. Die modifizierten Stäbe waren typischerweise in Wasser, und wurden dann mit einem unähnlichen Lösungsmittel, wie Hexan, gemischt. Stab-Flöße aus verschiedenen Organisationen organisierten sich dann in dem Grenzflächenbereich der beiden Lösungsmittel. Diese Flöße können dann von der Grenzfläche entfernt und zur weiteren Analyse und Manipulation auf einem festen Substrat angeordnet werden.
In einem Versuch, kleinere Gruppen von Stäben zu bilden, wurde die Konzentration der Stäbe in der wässrigen Phase vermindert sowie unterschiedliche Lösungsmittel zur Erzeugung von Grenzflächen verwendet. Die Oberflächenmodifikation, die am vielversprechendsten zu sein schien, war Au-Stäbe, modifiziert mit Merkaptoethansulfonsäure (MESA) und dem Polyelektrolyt Polyallylaminhydrochlorid (PAH). Es wurden kleinere Stabpakete gebildet, es waren jedoch viele Einzelstäbe und disorganisierte Gruppen vorhanden. Mehrere kleine Bündel von PAH-Stäben in Wasser/Hexan wurden mit relativ wenigen Einzelstäben gebildet. Diese spezielle Probe wurde auf eine Glasoberfläche überführt. Es wurde weiteres Überschichten von Polyelektrolyt (Polystyrolsulfonat (PSS) und PAH) verwendet, um die Stabpakete zu fe stigen. Die Stäbe wurden darin von der Oberfläche entfernt und in Lösung überführt. Die Stabpakete wurden dann in Ausrichtungsexperimenten im elektrischen Feld verwendet.
ANORDNUNGSBILDUNG VON STÄBEN AN LITHOGRAPHISCH DEFINIERTEN OBERFLÄCHEN
Es sind Substrate zur Montage (Organisation) von Stäben verwendet worden, die aus Array-Grübchen bestehen. Die Grübchen haben Au-Böden und sind entweder 400 nm tief (für größere Stäbe) oder 100 nm tief (für Stäbe mit 70 nm Durchmesser) × 2 μm × 8 μm beziehungsweise 5 μm. Das umgebende Material ist ein polymerisiertes Benzylcyclobuten, das Si enthält. Dieses Polymer wird dann in Sauerstoffplasma geätzt, wodurch eine SiO₂-artige Oberfläche zurückbleibt.
In einem erste Versuch, Stäbe in den Grübchen anzuordnen, wurden Au-Stäbe (etwa 8 μm) nackt gelassen, und die Au-Grübchenböden wurden mit 1,4-Butandithiol derivatisiert. Die nackten Stäbe wurden in Ethanol suspendiert, und das Substrat wurde in dieser Lösung angeordnet. Das noch feuchte Substrat wurde, nachdem es reagieren gelassen wurde, unter einem Lichtmikroskop betrachtet. Als die Lösungsmittelfront zurückging, wurden die Stäbe über die Oberfläche der lithographischen Struktur bewegt. Es wurde beobachtet, dass sich die Stäbe in die Grübchen bewegten und dort untergebracht wurden, selbst wenn die Lösungsmittelfront über sie hinwegging. In einem anderen Ansatz zur Bildung von Stabstrukturen in Grübchen wurde die BCB-Oberfläche mit einem perfluorierten Silan behandelt, um sie hydrophob und relativ "nicht-klebrig" zu machen, und die Au-Grübchenböden wurden mit MESA behandelt. Au-Stäbe (etwa 8 μm) wurden mit MESA beschichtet, gefolgt von Polydimethyldiallylammoniumchlorid (PDAC), um ihnen eine permanent positive Ladung zu verleihen und sie für die negativ geladenen Grüb chenböden attraktiv zu machen. Es wurde beobachtet, dass die Stäbe in die Grübchen eintraten, es schienen sich jedoch trotz der Perfluorierung viel mehr Stäbe durch Physisorption an die Oberfläche zu binden. In einem anderen Versuch zur Erzeugung einer anziehenden Wechselwirkung zwischen Stäben und den Grübchen wurden sowohl die Grübchenböden als auch die Au-Stäbe mit Polyethylenglykol (PEG) behandelt und reagieren gelassen. Es zeigte sich keine brauchbare Stab-Grübchen-Wechselwirkung.
Indem die Perfluorierung des BCB weggelassen wurde und MESA-Grübchen und MESA/PDAC-Stäbe wieder miteinander in Wechselwirkung treten gelassen wurden, zeigte sich ein Anstieg der Stäbe in Grübchen. Obwohl die Perfluorierung eine hydrophobe Oberfläche lieferte, die für die wässrigen hydrophilen Stäbe abstoßend sein sollte, war es letztendlich eher so, dass das Polymer anstelle des Wassers die Stäbe beschichtete. Dieser Faktor schien dazu geführt zu haben, dass die Stäbe von der perfluorierten Oberfläche relativ angezogen wurden. Indem das BCB unbehandelt gelassen wurde, wurden PDAC-Polymer-beschichtete Stäbe relativ stärker von den MESA-behandelten Grübchen angezogen.
Die Oberfläche wurde in einer anderen Ausführungsform mit Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS), gefolgt von PDAC, und eine über Nacht erfolgende Behandlung mit Merkaptoethylamin (MEA) behandelt. Es wurden wieder MESA/PDAC-Stäbe verwendet. Die Stäbe und Oberflächen wurden über Nacht reagieren gelassen. Es wurde ein relativ hoher Prozentsatz an Stäben in den Grübchen gefunden, und andere lithographisch definierte Au-Strukturen wiesen eine hohe Stabdichte auf.
Ni-Stäbe (etwa 3 μm) mit Au-Spitzen, die mit MESA/PAH derivatisiert waren, wurden auf MESA-derivatisierten Oberflächen angeordnet. Die Ni-Stäbe sind magnetisch und konnten im magnetischen Feld ausgerichtet und bewegt werden. Die Oberflächen wurden mehrere Stunden oder über Nacht mit den Stäben reagieren gelassen, und die noch feuchten Substrate wurden einem magnetischen Feld ausgesetzt. Die Stäbe und Stabbündel richteten sich mit dem Feld aus. Längere magnetische Stäbe standen zur Verfügung, sie richteten sich jedoch nicht mit dem magnetischen Feld aus, während sie sich auf der Oberfläche befanden.
BEISPIEL 12
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die matrizengelenkte Synthese von elektronischen Vorrichtungen im Nanomaßstab, insbesondere Dioden. Ein Ansatz kombiniert die Membranreplikation-elektrochemische Plattierung stabförmiger Metallelektroden mit der stromlosen schichtweise erfolgenden Selbstorganisation von Nanopartikel-Halbleiter/Polymerfilmen, die sandwichartig zwischen den Elektroden angeordnet sind. Nachfolgend wird die schichtweise Nass-Selbstorganisation von mehrschichtigem TiO₂/Polyanilin-Film oben auf einem Metall-Nanostab im Inneren von 200 nm Poren einer Aluminiumoxidmembran beschrieben.
1. Materialien
Für die matrizengeführte Diodensynthese wurden Whatman Anoporedisks (Al₂O₃-Membranen) mit 200 nm Porendurchmesser verwendet. Elektrochemische Metallabscheidung wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Gold- (Technic Orotemp 24), Platin-(Technic TP) und Silberplattierlösungen durchgeführt. Titantetraisopropoxid [Ti(ipro)₄], Merkaptoethylaminhydrochlorid (MEA), Ethyltriethoxysilan, Chlortrimethylsilan wurden von Aldrich erworben. Alle Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Alle anderen Chemikalien hatten Reagenzqualität und wurden von kommerziellen Quellen erhalten.
TiO₂-Kolloid wurde wie folgt hergestellt. Ti(ipro)₄ wurde unter Kühlen und Rühren in 2-Methoxyethanol gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren gehalten, bis sie leicht gelb wurde, danach wurde eine weitere Portion 2-Methoxyethanol enthaltende HCl zugegeben. Das Molverhältnis der Komponenten in der hergestellten Lösung war Ti(ipro)₄:HCl:2-Methoxyethanol = 1:0, 2:20. Diese Lösung wurde mit Wasser verdünnt, um die TiO₂-Konzentration auf 1% einzustellen und 3 Wochen altern gelassen. Das resultierende opaleszierende Sol wurde bei 60°C am Rotationsverdampfer eingeengt, um ein schimmerndes Xerogelpuler zu erhalten, das 75% (Gew./Gew.) Titandioxid enthielt. Dieses Xerogel wurde als Vorläufer für die Herstellung von wässrigem TiO₂-Vorratssol mit einer TiO₂-Konzentration von 23 Gew.-% (0,9 M) und pH 3 verwendet, die über mehrere Wochen stabil war. XRD-Untersuchungen des Titandioxid-Xerogels ermöglichten das Schätzen der durchschnittlichen Größe der kolloidalen Anatasekristalle auf 6 nm. Ein TEM-Bild des Vorrats-TiO₂-Sols zeigte Partikel mit 4 bis 13 nm Durchmesser.
Die Emeraldinbasen-(EB)-Form von Polyanilin (PAN) wurde auch hergestellt. Als Vorratslösung für die Filmsynthese wurde eine dunkelblaue Lösung von PAN in Dimethylformamid (0,006 Gew.-%) verwendet.
2. Synthese stabförmiger Dioden.
Die Synthese stabförmiger Dioden wurde wie folgt durchgeführt. Metallelektroden wurden elektrochemisch im Inneren der porösen Membran gezüchtet. Die Membran wurde kurz gesagt durch Aufdampfen von etwa 150 nm Silber auf ihre Verzweigungsseite vorbehandelt. Um die Poren auf dieser Seite zu füllen, wurde 1 C Silber auf das aufgedampfte Silber elektroplattiert. Diese Ag-"Bolzen" wurden als Fundament verwendet, auf das elektrochemisch eine Bodenelektrode gezüchtet wurde. Die Bodengoldelektrode der erwünschten Länge wurde mit Schallbehandlung elektroplattiert. Die Plattierlösung wurde durch Einweichen der Membran in Wasser und Trocknen im Ar-Strom entfernt. Das Grundieren der unteren Elektrodenoberfläche mit MEA ging der Abscheidung des mehrschichtigen TiO₂/PAN-Films voraus. Dies wurde durch 24-stündige Adsorption von ethanolischer MEA (5%)-Lösung erreicht. Der mehrschichtige Film wurde durch wiederholtes aufeinanderfolgendes Eintauchen der Membran in wässrige TiO₂-Lösung und PAN-Lösung in DMF für eine Stunde gezüchtet. Jeder Adsorptionsstufe folgte das Entfernen der überschüssigen Reagentien, indem die Membran eine Stunde in mehreren Portionen eines geeigneten Lösungsmittels (0,01 M wässrige HCl oder DMF) eingeweicht und im Ar-Strom getrocknet wurde. Schließlich wurde eine obere Elektrode (Ag oder Pt) der gewünschten Länge durch Elektroplattieren ohne Schallbehandlung oben auf die TiO₂/PAN-Mehrfachschicht elektroplattiert. Danach wurden das aufgedampfte Silber, die Ag-"Bolzen" und die Aluminiumoxidmembran durch Auflösen in 6 M Salpetersäure beziehungsweise 0,5 M NaOH entfernt (2 bis 4 C Au wurden immer oben auf die Ag-Elektrode elektroplattiert, um Auflösen der letzteren in der Salpetersäure zu verhindern. Vorexperimente zeigten auch, dass der auf planarem Au(MEA)-Substrat selbstorganisierte TiO₂/PAN-Film in der 0,6 NaOH nicht zerstört wurde). Die resultierenden stabförmigen Dioden wurden wiederholt zentrifugiert und mit Wasser gewaschen.
In den meisten Experimenten wurde chemische Passivierung von Al₂O₃-Membranporenwänden unter Verwendung von Behandlungen mit Propionsäure (20 hatten Sorption von 0,0013 M wässriger Lösung) oder Alkylsilanderivaten verwendet. Im letzteren Fall wurde eine Membran nacheinander eine Stunde in absolutem Ethanol und wasserfreiem Toluol oder Dichlorethan eingeweicht, danach wurde sie 15 Stunden in Ethyltriethoxysilanlösung in wasserfreiem Toluol (2,5 Vol.%) oder einer Chlortrimethylsilanlösung in wasserfreiem Dichlorethan (2,5 Vol.%) eingeweicht. Danach wurde die Membran nacheinander eine Stunde in dem geeig neten wasserfreien Lösungsmittel, einer Mischung (1:1) des Lösungsmittels und absolutem Ethanol, dem absoluten Ethanol eingeweicht und schließlich im Ar-Strom getrocknet. Das Benetzen der so behandelten Membranen mit Wasser zeigte hydrophobe Eigenschaften auf ihrer äußeren Oberfläche. Transmissions-IR-Spektren der mit Ethyltriethoxysilan oder Propionsäure behandelten Membran zeigte das Erscheinen schwacher Banden bei 2940, 2865, 2800 cm^–1, die C-H-Streckschwingungen von Alkyl- und Alkoxygruppen zugeordnet werden können.
3. Charakterisierung
Transmissionselektronenmikroskop-(TEM)-Bilder wurden mit einem JEOL 1200 EXII mit 120 kV Beschleunigungsspannung und 80 mA Filamentstrom erhalten. Lichtmikroskop-(OM)-Bilder wurden aufgezeichnet. Transmissions-IR-Spektren wurden mit einem Specord M-80 Spektrometer (Carl Zeiss, Jena) aufgezeichnet, die I-V-Charakterisierung stabförmiger Dioden wurden in Luft bei Umgebungstemperatur gemessen.
TEM-Bilder einiger typischer "gestreifter" bimetallischer Au/Pt/Au-Nanostäbe, die elektrochemisch im Inneren der porösen Aluminiumoxidmembran gezüchtet worden waren, zeigten, dass die beiden Stabenden sich in ihrer Topographie unterschieden – eines der Stabenden schien gewölbt oder abgerundet zu sein, während das andere Stabende eine scheinbare hohle Mitte aufwies. Diese Unterschiede im Aussehen des Stabendes können durch Adsorption einer gewissen Menge an Metallionen an Porenwänden, Fördern des Wachstums von Metall (z. B. Ag) in dem glatten Wandraum und Herbeiführen der Hohlstellenbildung in dem Porenmittelraum erklärt werden. Während des Elektroplattierens eines zweiten Metall-"Streifens" (z. B. Au) folgt das wachsende Metall der Oberfläche des Bodenstabs und füllt den Hohlraum, wodurch das abgerundete Ende gebildet wird. Weiteres Stabwachstum führt infolge der Metalladsorption an den Porenwänden zu einem schalenartigen Ende. Jedes sequentielle Metallsegment wächst in derselben Weise in dem Ende des darunter befindlichen Segments.
Es ist unwahrscheinlich, dass die relativ raue Oberfläche an dem oberen Ende eines Stabs vollständig mit dem ultradünnen TiO₂/PAN-Film bedeckt werden kann, wodurch sofortige Kontakte zwischen unteren und oberen Metallelektroden verhindert werden. In Vorexperimenten an planaren Au-Substraten wurde gefunden, dass die mehrschichtigen TiO₂/PAN-Filme, die auf glatteren Oberflächen gezüchtet wurden, bessere Reproduzierbarkeit in ihre Gleichrichteverhalten zeigten. Die Passivierung (Hydrophobierung) von Oberfläche mit endständigem Al₂O₃ von Porenwänden mit Propionsäure oder Alkylsilanderivaten, wie Ethyltriethoxysilan oder Chlortrimethylsilan, wurde ausprobiert, um die Oberfläche des oberen Stabendes zu glätten, indem die Metalladsorption auf den Porenwänden reduziert wurde. Es ist auch zu erwarten, dass die Hydrophobierung von Porenwänden die Adsorption von TiO₂-Partikeln an der Wandoberfläche statt an der Metalloberfläche, die sich in der Tiefe (etwa 65 mm) der Pore befindet, verhindert. Es wurde gezeigt, dass die TiO₂-Partikel auf einem planaren Al/Al₂O₃-Substrat leicht eine dicht gepackte Schicht bildeten. Ein typisches höheraufgelöstes Bild des oberen Teils des Stabs bestätigte, dass sich die schalenartigen Enden im oberen Bereich der Stäbe befanden, und zeigte, dass die Wandpassivierung in gewissem Ausmaß zu Glätten der Oberfläche der Stabenden führte.
Ein Lichtmikroskopbild von Au/(TiO₂/PAN)₁₀/Ag/Au-Stäben, die unter Verwendung der mit Ethyltriethoxysilan derivatisierten Membran hergestellt wurden, zeigte Nanostäbe mit gleichförmiger Länge, in denen eindeutig ein Silbersegment zwischen zwei Goldenden zu sehen ist. TEM-Bilder dieses Stabs, die in den ersten Sekunden aufgezeichnet wurden, zeigten keine sicht baren Zeichen einer Metall/Film/Metall-Heteroübergangs innerhalb des Stabs. Nachdem der Elektronenstrahl jedoch einige Zeit (in der Regel Zehntel Sekunden) auf diesen Stab fokussiert war, erschien ein Bruch in dem Stab, und die Metallsegmente wurden möglicherweise infolge von strahlinduziertem Schmelzen des Metalls in der Nähe des Au/TiO₂/Au-Heteroübergangs getrennt. In höheraufgelösten TEM-Bildern dieses Bruches wurden Partikel mit 5 bis 10 nm Durchmesser beobachtet, die an beiden Metallenden hafteten. Scheinbar waren TiO₂-Nanopartikel zwischen zwei elektroplattierten Metallen vorhanden. Die OM- und TEM-Daten legen nahe, dass die Selbstorganisation von mehrschichtigem TiO₂/PAN-Film oben auf dem Au-Stab im Inneren der Membranporen realisiert werden kann, und dass der selbstorganisierte Film das Elektroplattieren des Ag-Stabs oben auf dem Film nicht verhindert. Es sei darauf hingewiesen, dass TEM-Bilder wahrscheinlich kein wahres Bild des mehrschichtigen TiO₂/PAN-Films im Inneren des Stabs zeigen, weil die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung des mechanischen Films hoch ist, während teilweise geschmolzene Metallstabenden getrennt werden. Längere Einwirkung des Elektronenstrahls auf den Stab führt zu vollständiger Zerstörung des Heteroübergangs und Auftauchen von zwei individuellen Nanostäben, an deren Enden Nanopartikel stecken.
Um mehrschichtigen TiO₂/PAN-Film zu untersuchen, der sandwichartig zwischen Au- und Ag-Stäben lag, wurden Au/(TiO₂/PAN)₆/Ag-Nanostäbe hergestellt und ihre obere Ag-Elektrode in Salpetersäure gelöst. Die restlichen 2C Au-Stäbe mit dem oben abgeschiedenen (TiO₂/PAN)₆-Film wurden mit TEM analysiert. Vorläufige Studien zeigen, dass die ellipsometrische Dicke des mehrschichtigen TiO₂/PAN-Films, der auf dem planaren Au(MEA)-Substrat selbstorganisiert worden war, nach Eintauchen von 6 M HNO₃ für 30 Minuten nicht abnahm, was Stabilität des Films in dem sauren Medium nahe legt. Ähnlich den oben beschriebenen Au/(TiO₂/PAN)₁₀/Ag/Au-Stäben zeigte das in den ersten Sekunden genommene TEM-Bild von Au/(TiO₂/OAB)₆ keine Partikel. Während längerer Einwirkung des Elektronenstrahls schmolz jedoch Gold, wodurch Nanopartikelfilm oben an dem Stab zum Vorschein kam. Es ist zu sehen, dass die obere Konturlinie des Films vor dem Schmelzen sehr nahe an derjenigen des Au-Stabs lag. Diese Tatsache stimmt mit dem schalenförmigen oberen Bereich der Metallstäbe überein. Der mehrschichtige Film wächst auf der Oberfläche sowohl auf dem Schalenboden als auch auf den Schalenwänden und behält die Schalenform näherungsweise, nachdem die dünnen Wände geschmolzen sind. Diese Erklärung stimmt mit der beobachteten Filmhöhe von etwa 100 nm überein, wodurch eher die Schätzung der Goldschalentiefe als diejenige des (TiO₂/PAN)₆-Films ermöglicht wird. Die ellipsometrische Dicke des (TiO₂/PAN)₆-Films, der auf einem planaren Au(MEA)-Substrat selbstorganisiert wurde, wird auf etwa 10 nm geschätzt.
I-V-Charakteristika der stabförmigen Pt/(TiO₂/PAN)₃-TiO₂/Au-Vorrichtung zeigt Stromgleichrichteverhalten. Die Vorwärts- und Rückwärts-Vorspannungsschaltpotentiale betragen –0,2 beziehungsweise –0,9 V.

Claims

Verwendung eines freistehenden Partikels, der 2 bis 50 Segmente enthält, wobei der Partikel eine Länge von 10 nm bis 50 μm und eine Breite von 5 nm bis 50 μm hat und wobei mindestens ein Segment aus einem Metall gebildet wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Silber, Gold, Kupfer, Nickel, Palladium, Platin, Kobalt, Rhodium und Iridium besteht, zum Kodieren von Information über ein Material oder Produkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Partikel eine Länge von 500 nm bis 30 μm hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Partikel eine Länge von 1 bis 15 μm hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Partikel eine Breite von 10 nm bis 2 μm hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Partikel eine Breite vom 30 nm bis 500 nm hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Partikel aus 2 bis 10 unterschiedlichen Typen von Segmenten gebildet wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Länge der Segmente von 1 nm bis 50 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Länge der Segmente von 50 nm bis 15 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Partikellänge von 1 bis 15 μm beträgt, die Partikelbreite von 30 nm bis 2 μm beträgt und die Länge der Segmente von 50 nm bis 15 μm beträgt.
Verwendung eines freistehenden Partikels, der 2 bis 50 Segmente enthält, wobei der Partikel eine Länge von 10 nm bis 50 μm und eine Breite von 5 nm bis 50 μm hat und wobei mindestens eines der Segmente aus einer superparamagnetischen Verbindung gebildet wird, zum Kodieren von Information über ein Material oder Produkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der Segmente funktionalisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Funktionalisierung eine organische Substanz, eine anorganische Substanz, einen anorganischen Koordinationskomplex und/oder einen organometallischen Komplex umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Funktionalisierung eine organische Substanz umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die organische Substanz ein organisches Material ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das organische Material Kohlenstoff, Kohle, Diamant oder Polystyrol enthält.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die organische Substanz ein organisches Molekül ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das organische Molekül einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, ein Oligonukleotid, ein Aptamer, einen Rezeptor, ein Enzym, ein Pro tein, einen Katalysator, einen katalytischen Antikörper, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, ein Polysaccharid, eine Aminosäure oder ein Peptid enthält.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Funktionalisierung einen anorganischen Koordinationskomplex umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der anorganische Koordinationskomplex 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 9-fach koordinierte Komplexe enthält.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Funktionalisierung einen organometallischen Komplex umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei der organometallische Komplex eine Spezies enthält, die durch eine oder mehrere Metall-Kohlenstoff-, Metall-Silicium- oder Metall-Stickstoffbindungen gebildet wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Funktionalisierung ein anorganisches Material umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das anorganische Material durch Glas, Phosphor, Zeolith oder Oxide gebildet wird.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Funktionalisierung eine detektierbare Markierung oder ein Material umfaßt, das an eine detektierbare Markierung bindet.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Markierung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer fluoreszierenden Markierung, einer isotopischen Markierung, einer radioaktiven Markierung, einer partikulären Markierung, einer Oligonukleotid-basierten Markierung, einer molekularen Markie rung, einer Raman-basierten Markierung, einer infraroten Markierung, einer massenspektroskopischen Markierung und einer elektrochemischen Markierung besteht.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Funktionalisierung einen kolloiden Partikel, ein Polymer, ein Glas, eine molekulare Monoschicht, eine molekulare Mehrfachschicht oder einen Film umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei mindestens zwei Segmente unterschiedlich funktionalisiert sind.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei sich die Funktionalisierung an einer oder beiden Spitzen des Partikels befindet.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Spitzen des Partikels unterschiedlich funktionalisiert sind.
Verwendung einer Anordnung von Partikeln, die eine Vielzahl von Partikeltypen enthält, wobei jeder Partikel eine Länge von 10 nm bis 50 μm hat und durch 2 bis 50 Segmente gebildet wird, und wobei mindestens ein Segment durch ein Metall gebildet wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Silber, Gold, Kupfer, Nickel, Palladium, Kobald, Rhodium und Iridium besteht, und wobei jeder dieser Partikel einen Informationsgehalt aufweist, der auf der Zusammensetzung des Partikels basiert, und wobei die Partikeltypen unterscheidbar sind, zum Kodieren von Information über ein Material oder ein Produkt.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Partikeltypen aufgrund von Unterschieden in der Länge, der Breite oder der Form der Partikel und/oder der Zahl, Zusammensetzung, Länge oder Muster der Segmente unterscheidbar sind.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Partikeltypen durch optische Mittel, elektrische Mittel, physikalische Mittel, chemische Mittel oder magnetische Mittel unterscheidbar sind.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Partikeltypen durch optische Mittel unterscheidbar sind.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Partikeltypen durch unterschiedliches Reflexionsvermögen unterscheidbar sind.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei jeder dieser Partikel 2 bis 50 Segmente enthält und wobei die Länge jedes Partikels von 1 bis 15 μm, die Breite jedes Partikels von 30 nm bis 2 μm und die Segmentlänge von 50 nm bis 10 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 30, umfassend funktionalisierte Partikel.
Verwendung nach Anspruch 30, umfassend Partikeltypen, die unterschiedlich funktionalisiert sind als andere Partikeltypen.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Funktionalisierung eine organische Substanz, eine anorganische Substanz, einen anorganischen Koordinationskomplex und/oder einen organometallischen Komplex umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Funktionalisierung eine detektierbare Markierung oder ein Material umfaßt, das eine detektierbare Markierung bindet.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei die detektierbare Markierung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer fluoreszierenden Markierung, einer isotopischen Markierung, einer radioaktiven Markierung, einer partikulären Markierung, einer Oligonukleotid-basierten Markierung, einer molekularen Markierung, einer Raman-basierten Markierung, einer infraroten Markierung, einer massenspektroskopischen Markierung und einer elektrochemischen Markierung besteht.
Verwendung einer Zusammensetzung, die aus einem Partikel und einer Funktionseinheit gebildet wird, wobei der Partikel eine Vielzahl von Segmenten aufweist und eine Länge von 10 nm bis 50 μm hat, zum Kodieren von Information über ein Material oder ein Produkt.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Beschaffenheit der Partikel von 500 nm bis 30 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Länge der Partikel von 1 bis 15 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Beschaffenheit der Funktionseinheit durch die Partikel kodiert wird.
Verwendung nach Anspruch 44, wobei die Beschaffenheit der Funktionseinheit durch die Länge, Breite oder Form der Partikel und/oder die Zahl, Zusammensetzung, Länge oder das Muster der Segmente kodiert wird.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Funktionseinheit eine analytspezifische Spezies enthält.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Funktionseinheit eine organische Substanz, eine anorganische Substanz, einen anorganischen Koordinationskomplex und/oder einen organometallischen Komplex enthält.
Verwendung einer Anordnung von Partikeln, die eine Vielzahl von Partikeltypen enthält, wobei jeder Partikel 2 bis 50 Segmente und mindestens eine Dimension von weniger als 10 μm aufweist und wobei die Partikeltypen unterscheidbar sind, zum Kodieren von Information über ein Material oder ein Produkt.
Verwendung nach Anspruch 48, wobei jeder Partikel mindestens eine Dimension von weniger als 500 nm hat.
Verwendung nach Anspruch 48, wobei jeder Partikel mindestens eine Dimension von weniger als 200 nm hat.
Verwendung nach Anspruch 48, umfassend mindestens 3 Partikeltypen.
Verwendung nach Anspruch 48, umfassend mindestens 5 Partikeltypen.
Verwendung nach Anspruch 48, wobei die Partikeltypen durch Unterschiede in der Länge, der Breite, der Form und/oder der Zusammensetzung der Partikel unterscheidbar sind.
Verwendung nach Anspruch 48, umfassend funktionalisierte Partikel.
Verwendung nach Anspruch 54, umfassend Partikeltypen, die unterschiedlich funktionalisiert sind als andere Partikeltypen.
Verwendung nach Anspruch 54, wobei die Funktionalisierung eine organische Substanz, eine anorganische Substanz, einen anorganischen Koordinationskomplex und/oder einen organomemtallische Komplex umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 54, wobei die Funktionalisierung eine nachweisbare Markierung oder ein Material umfaßt, das eine nachweisbare Markierung bindet.
Verwendung einer Zusammensetzung, die durch einen Partikel und eine Funktionseinheit gebildet wird, wobei der Partikel 2 bis 50 Segmente und mindestens eine Dimension von weniger als 10 μm aufweist und wobei die Beschaffenheit der Funktionseinheit durch den Partikel kodiert wird, zum Kodieren von Information über ein Material oder ein Produkt.
Verwendung nach Anspruch 58, wobei der Partikel mindestens eine Dimension von weniger als 500 nm hat.
Verwendung nach Anspruch 58, wobei der Partikel mindestens eine Dimension von weniger als 200 nm hat.
Verwendung nach Anspruch 58, wobei die Beschaffenheit der funktionellen Gruppe durch die Länge, Breite, Form und/oder Zusammensetzung des Partikels kodiert wird.
Verfahren zum Kodieren von Information über ein Material in dem Material, bei dem man einen freistehenden Partikel in das Material einarbeitet oder an das Material bindet, der Information betreffend das Material kodiert, wobei der Partikel eine Vielzahl von Segmenten aufweist, wobei die Länge des Partikels von 10 nm bis 50 μm und die Breite des Partikels von 5 nm bis 50 μm beträgt und wobei die kodierte Information auf der Länge, der Breite oder der Form des Partikels und/oder der Zahl, Zusammensetzung, Länge oder dem Muster von Segmenten basiert.
Verfahren nach Anspruch 62, wobei die kodierte Information die Zusammensetzung des Materials betrifft.
Verfahren nach Anspruch 62, wobei die kodierte Information die Vorgeschichte des Materials betrifft.
Verfahren nach Anspruch 62, wobei mindestens eines der Segmente durch ein Material gebildet wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Metall, einem beliebigen Metallchalcogenid, einem Metalloxid, einem Metallsulfid, einem Metallnitrid, einem Metallphosphid, einem Metallselenid, einem Metalltellurid, einem Metallantimonid, einer Metalllegierung, einem Halbleiter, einem Halbmetall, einer beliebigen organischen Verbindung oder einem beliebigen organischen Material, einer beliebigen anorganischen Verbindung oder einem beliebigen anorganischen Material, einer beliebigen organometallischen Verbindung oder einem beliebigen organometallischen Material, einer partikulären Schicht oder einem partikulären Material und einem Kompositmaterial besteht.
Verfahren zur Durchführung eines Tests auf einen Analyten, bei dem man eine Lösung, die den Analyten enthalten kann, mit einer Zusammensetzung in Kontakt bringt, die eine Spezies, die den Analyten binden kann, und einen Partikel enthält, der einen Vielzahl von Segmenten aufweist, wobei der Partikel eine Länge von 10 nm bis 50 μm und eine Breite von 5 nm bis 50 μm aufweist, und man ermittelt, ob eine Wechselwirkung zwischen der Spezies und dem Analyten stattgefunden hat.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei der Partikel die Beschaffenheit der Spezies kodiert.
Verfahren nach Anspruch 67, wobei die Beschaffenheit der Spezies durch die Länge, Breite oder Form des Partikels und/oder die Zahl, Zusammensetzung, Länge oder das Muster der Segmente kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 66, bei dem die Spezies einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, ein Oligonukleotid, ein Aptamer, einen Rezeptor, ein Enzym, ein Protein, einen Katalysator, einen katalytischen Antikörper, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, ein Polysaccharid, eine Aminosäure oder ein Peptid enthält.
Verfahren nach Anspruch 66, bei dem mindestens eines der Segmente ein Material ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Metall, einem beliebigen Metallchalcogenid, einem Metalloxid, einem Metallsulfid, einem Metallnitrid, einem Metallphosphid, einem Metallselenid, einem Metalltellurid, einem Metallantimonid, einer Metalllegierung, einem Halbleiter, einem Halbmetall, einer beliebigen organischen Verbindung oder einem beliebigen organischen Material, einer beliebigen anorganischen Verbindung oder einem beliebigen anorganischen Material, einer beliebigen organometallischen Verbindung oder einem beliebigen organometallischen Material, einer partikulären Schicht oder einem partikulären Material und einem Kompositmaterial besteht.
Verfahren nach Anspruch 66, bei dem die Ermittlung durch optische Mittel, physikalische Mittel, chemische Mittel, elektronische Mittel oder magnetische Mittel erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 66, bei dem der Partikel an eine Vielzahl von Spezies gebunden ist, die unterschiedliche Analyte binden können.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei der Analyt ein Protein oder ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei der Analyt ein Oligonukleotid ist.
Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung einer Vielzahl von Tests auf eine Vielzahl von Analyten, bei dem man eine Lösung, welche die Analyte enthalten kann, mit einer Vielzahl von Zusammensetzungen in Kontakt bringt, wobei jede Zusammensetzung eine Spezies, die einen der Analyte binden kann, und einen Partikel enthält, der eine Vielzahl von Segmenten aufweist, wobei die Länge des Partikels von 10 nm bis 50 μm und die Breite des Partikels von 5 nm bis 50 μm beträgt und wobei die Beschaffenheit jeder Spezies durch den Partikel kodiert wird, an den sie gebunden ist, und man ermittelt, welche Wechselwirkungen stattgefunden haben.
Verfahren nach Anspruch 75, wobei mindestens eine der Spezies ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist.
Verfahren nach Anspruch 75, wobei mindestens eine der Spezies ein Oligonukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 75, wobei mindestens eines der Segmente von jedem der Partikel durch ein Material gebildet wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Metall, einem beliebigen Metallchalcogenid, einem Metalloxid, einem Metallsulfid, einem Metallnitrid, einem Metallphosphid, einem Metallselenid, einem Metalltellurid, einem Metallantimonid, einer Metalllegierung, einem Halbleiter, einem Halbmetall, einer beliebigen organischen Verbindung oder einem beliebigen organischen Material, einer beliebigen anorganischen Verbindung oder einem beliebigen anorganischen Material, einer beliebigen organometallischen Verbindung oder einem beliebigen organometallischen Material, einer partikulären Schicht oder einem partikulären Material und einem Kompositmaterial besteht.
Verfahren nach Anspruch 75, wobei die Beschaffenheit von jeder Spezies durch die Länge, die Breite oder Form des Partikels und/oder die Anzahl, Zusammensetzung, Länge oder das Muster von Segmenten kodiert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Länge des Partikels von 1 bis 15 μm, die Breite des Partikels von 2 μm bis 50 μm und die Länge der Segmente von 50 nm bis 15 μm beträgt.
Verwendung eines freistehenden segmentierten Partikels, der durch das Abscheiden einer Vielzahl von Materialien in Matrize hergestellt ist, umfassend das Verfahren, bei dem man (a) das Abscheiden eines ersten Materials in den Poren der Matrize bewirkt; (b) man das Abscheiden eines zweiten Materials in den Poren der Matrize bewirkt, wobei das Abscheiden von mindestens einem des ersten Materials und des zweiten Materials durch elektrochemisches Abscheiden erfolgt, und (c) man den segmentierten Partikel aus der Matrize befreit, um einen selbsttragenden segmentierten Partikel bereitzustellen, der eine Länge von 10 nm bis 50 μm und eine Breite von 5 nm bis 50 μm hat, wobei der Partikel einen gewöhnlich kreisförmigen Querschnitt entlang seiner Länge hat, wobei die Segmentübergänge gewöhnlich senkrecht zur Länge sind, und wobei der Partikel 50 oder weniger Segmente aufweist und wobei mindestens eines der Segmente eine Länge von mindestens 10 nm hat, zum Kodieren von Information über ein Material oder ein Produkt.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Länge des Partikels von 500 nm bis 30 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Länge des Partikels von 1 bis 15 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Breite des Partikels von 10 nm bis 2 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Breite des Partikels von 30 nm bis 500 nm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 81, gebildet durch 2 bis 10 verschiedene Segmenttypen.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Länge der Segmente von 1 nm bis 50 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Länge von mindestens einem der Segmente von 50 nm bis 15 μm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 81, wobei die Länge des Partikels von 1 bis 15 μm, die Breite des Partikels von 30 nm bis 2 μm und die Länge von mindestens einem der Segmente von 50 nm bis 15 μm beträgt.