DE60035681T2 - Optische sonden und assays zur messung der proteinphosphorylierung - Google Patents

Optische sonden und assays zur messung der proteinphosphorylierung Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Gebiete der Chemie und Biologie. Im Besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf optische Sonden für Proteinphosphorylierungsaktivitäten, wie Phosphorylierung und Verfahren für ihre Verwendung.
  • EINFÜHRUNG
  • Systeme und Verfahren für das schnelle Identifizieren von Chemikalien mit biologischer Aktivität in Proben, insbesondere kleine flüssige Proben, sind von besonderer Relevanz in den agrochemischen und pharmazeutischen Gebieten. Typischerweise werden verschiedene Strategien eingesetzt, um die Verarbeitungszeiten und damit verbunden Kosten für das Screenen von großen Anzahlen an chemischen Einheiten zu reduzieren; dazu zählen vereinfachte Ausgestaltung von Assays, Automatisierungstechniken, Robotertechnik und Miniaturisierung der Probengröße. Das Aufkommen von Hochdurchsatzanalysen und die gestiegene Verwendung von miniaturisierten Formaten führten zur Entwicklung von Plattenformaten mit hoher Dichte. Dazu zählen zum Beispiel solche, die 384, 864 und 3456 Wells enthalten, wie in der jetzt anhängigen US Patentanmeldung Nr. 08/868,049 mit dem Titel "Low Background Multi-Well Plates with greater than 864 Wells for Fluorescence Measurements of Biological and Biochemical Samples", die am 3. Juli 1997 eingereicht wurde, beschrieben. Systeme zur Bearbeitung von Proben mit noch höherer Dichte, die zum Beispiel Chips verwenden, die miniaturisierte mikrofluidische Vorrichtungen enthalten, befinden sich in Entwicklung (siehe zum Beispiel R & D Magazine, November 1998, Seiten 38 bis 43 mit dem Titel "Lab-on-a Chip: Biotech's next California Gold Rush").
  • Platten mit höherer Dichte ermöglichen schnellere Analyse und die Behandlung von größeren Proben- oder chemischen Bibliotheken, wie in automatisierten Screeningsystemen, bedeuten aber deutliche Einschränkungen für jene Assays, die erfolgreich im Zusammenhang mit diesen Systemen verwendet werden können. Insbesondere besteht ein Bedarf, Assays zu entwickeln, die mit miniaturisierten Systemen kompatibel sind und zu akkuraten und reproduzierbaren Assay-Ergebnissen führen. Im Mittelpunkt dieser Anforderung steht ein Bedarf für hochsensible Assays basierend auf optischer Analyse, wie Fluoreszenz oder Lumineszenz, für die keine Waschschritte nötig sind (z.B. "Addition only"-Assays).
  • Eine der größten und wichtigsten Klassen an intrazellulären Aktivitäten, für die Medikamente besonders wertvoll sein können, sind jene, die bei posttranslationalen Modifikationen eine Rolle spielen. Diese Aktivitäten sind typischerweise auf die Modifikation von Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb von lebenden Zellen gerichtet, mit dem Ziel, Änderungen bei der biologischen Aktivität und Funktion dieser Moleküle zu bewirken. Die Hauptmethoden von posttranslationaler Protein- oder Polypeptidmodifikation schließen Proteinphosphorylierung, Methylierung, Prenylierung, Glycosylierung, Ubiquitinierung Sulfatierung und Proteolyse (siehe im Allgemeinen Cells. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998) review). Hauptverfahren der Nukleinsäuremodifikation schließen Methylierung, ADP-Ribosylierung und Restriktionsverdau ein. Eine Vielzahl von Umweltreizen, wie die Anwesenheit von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Änderungen im Zellzyklus und Toxine können vorübergehend den posttranslationalen Zustand vieler intrazellulärer Komponenten modulieren. Die schnelle Entwicklung von spezifischen und effektiven Inhibitoren für eine bestimmte posttranslationale Aktivität macht die Entwicklung von geeigneten Assays, die diese Aktivitäten zuverlässig und genau in einem Hochdurchsatz-Screeningsystem detektieren können.
  • Trotz deren großer potentieller Wichtigkeit gibt es nur wenige existierende Verfahren für das Messen solcher Aktivitäten, die homogen, nicht radioaktiv und empfindlich genug sind, um akkurat und reproduzierbar in Hochdurchsatz- oder Ultrahochdruchsatz-Screeningsystemen zu arbeiten. Solche Assays können durch Reduzieren der Zeit, die für die Identifizierung und Entwicklung von nützlichen Chemikalien benötigt wird drastisch den Wert eines neuen Medikaments dadurch erhöhen, dass dessen Patentierbarkeit ermöglicht wird und der Zeitraum, während dem es Exklusivrechte auf dem Mark genießt, verlängert wird.
  • Beispiele für solche posttranslationalen Aktivitäten schließen unter anderem Proteinmethylierung und Prenylierung ein. Proteinprenylierung beinhaltet das Hinzufügen von Isoprenoidgruppen wie Farnesyl und Geranyl zu Proteinen und ist ein Hauptmechanismus der posttranslationalen Modifikation für viele Membranassoziierte Proteine. (Clark, 1992 Protein isoprenylation and methylation at carboxyl-terminal cysteine residues. Annu. Rev. Biochem. 61 355–386). In den meisten Fällen handelt es sich bei der mit dem Isoprenoid derivatisierten Aminosäure um ein Cystein oder um Cysteine, die sich in der Nähe des Carboxyl-Terminus des Proteins befinden. Vorhandene Verfahren für das Messen der Proteinprenylierung und -methylierung beinhalten typischerweise das Markieren von Zellen mit radioaktiven Vorläufern wie [3H]-Mevalonat oder [3H]-S-Adenosylmethionin, Isolierung des Proteins von Interesse und Messen von radioaktivem Einbau. Es besteht somit ein Bedarf für Assays für diese Aktivitäten, die empfindlich, einfach zu verwenden, nicht radioaktiv und auf Hochdurchsatz-Screeningverfahren anpassbar sind.
  • Ein weiteres wichtiges Beispiel für posttranslationale Modifikation ist Proteinglykosylierung, die eine überaus wichtige Rolle bei der Funktion einer signifikanten Anzahl an Proteinen spielt (Varki, 1993, Biological roles of oligosaccharides. Glycobiology 3 97–130). Im Gegensatz zu den meisten anderen Typen der posttranslationalen Modifikation stellt die Proteinglykosylierung auf Grund des Potentials zur Verzweigung nach dem Hinzufügen des ersten Zuckerrestes eine große Vielfalt bei den Oligosacchariden, die zu einem Protein hinzugefügt werden, bereit. Vorhandene Methoden zum Messen der Glykosylierung beinhalten typischerweise die Bestimmung des radioaktiven Einbaus eines Vorläufer-Oligosaccharids in ein Protein, das Isolieren des Proteins und anschließend das Messen des spezifischen radioaktiven Einbaus in ein Protein. Es besteht somit ein Bedarf für Assays, die auf Fluoreszenz oder Lumineszenz beruhen und die für Hochdurchsatz-Screeningverfahren anpassbar sind, zur Analyse dieser Aktivitäten. Es ist eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung, optische Sonden und Verfahren zu deren Verwendung, die diese Ansprüche erfüllen, zur Verfügung zu stellen.
  • Proteinkinasen und -phosphatasen sind im Allgemeinen als einer der wichtigeren Mechanismen bei der Regulierung der Proteinfunktion anerkannt. Eine kürzlich stattgefundene Besprechung und Analyse von Krankheiten, die mit genetischen Defekten in Proteinkinasen assoziiert werden (www.nih.go.jp/mirror/pkr/pk medicine.html) listet mehr als 400 spezifische Krankheitszustände auf, die alleine mit diesen Aktivitäten assoziiert werden. Proteinkinasen wirken auf Proteine über das Hinzufügen von Phosphatgruppen (Phosphorylierung), primär auf die Aminosäuren Tyrosin, Serin oder Threonin. Im Gegensatz dazu wirken Proteinphosphatasen dergestalt, dass sie diese Phosphatgruppen entfernen und damit die Wirkung der Phosphorylierung umkehren. Veränderungen im Phosphorylierungsstadium von Proteinen können die enzymatischen Aktivitäten, Proteinlokalisierung und Protein-Protein-Interaktionen eines bestimmten Proteins innerhalb einer Zelle regulieren. Solche Veränderungen können daraufhin zur Modulation von praktisch jedem Aspekt des Zellstoffwechsels, der Zellregulierung, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung führen. Das Gesamtgleichgewicht zwischen Kinase- und Phosphatase-Aktivitäten in einer Zelle ist eine primäre Determinante für das Stadium der Phosphorylierung eines Proteins zu einem beliebigen Zeitpunkt.
  • Die gängigen Verfahren für das Bestimmen von Proteinkinasen haben jedoch zahlreiche Nachteile, was dazu führt, dass entweder keine Möglichkeit für schnelles Screenen auf Medikamente, die miniaturisierte, automatisierte Formate von vielen tausenden Verbindungen verwenden, besteht, oder diese Möglichkeit erschwert wird.
  • Zum Beispiel beruhen viele gängige Verfahren zum Bestimmen ihrer Aktivität auf dem Einbau und der Bestimmung von 32P in die Proteinsubstrate von Interesse. In ganzen Zellen macht dies die Verwendung von hohen Radioaktivitätsniveaus erforderlich, um den zellulären ATP-Pool wirkungsvoll zu markieren und zu gewährleisten, dass das Zielprotein wirkungsvoll radioaktiv markiert ist. Nach der Inkubation mit zu untersuchenden Medikamenten müssen die Zellen lysiert und das Protein von Interesse gereinigt werden, um den jeweiligen Grad der Phosphorylierung zu bestimmen. Für dieses Verfahren sind große Anzahlen an Zellen, lange Vorinkubationszeiten, vorsichtige Manipulierung und Waschschritte erforderlich, als Artefakt erscheinende Phosphorylierung oder Dephosphorylierung vermieden wird. Des Weiteren ist für diesen Ansatz eines Kinase-Assays die Reinigung des Zielproteins nötig und schließlich ist der radioaktive Einbau in Zielproteine ist üblicherweise sehr gering, was dazu führt, dass der Assay lediglich geringe Empfindlichkeit aufweist. In Hochdurchsatz-Screeningverfahren werden für diesen Ansatz hohe Mengen an Radioaktivität benötigt, was eine Gefahr für Umwelt und Gesundheit darstellen kann.
  • Alternative Verfahren für Kinase-Assays, wie jene, die auf für Phosphorylierung spezifischen Antikörpern beruhen und die Ansätze, die ELISA-Verfahren ähneln, verwenden, haben die schwierige Aufgabe, Antikörper herzustellen, die zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Proteinen unterscheiden können.
  • Des Weiteren bedarf es für die meisten Messungen von Kinase einer Zelllyse, mehrere Inkubationen und Waschphasen, wobei diese Schritte zeitaufwendig und schwer automatisierbar sind und potentiell Artefakte bilden.
  • WO 98/11251 offenbart ein Verfahren, das verwendet werden kann, um eine harzgebundene oder eine Lösungsphase Phosphotyrosin-Peptidbiblitohek durch eine ausgewählte Proteintyrosinphosphatase oder -Kinase auf Substanzumsatzrate untersucht.
  • Es besteht somit ein Bedarf für Assays für Enzyme, wie jene, die bei der posttranslationalen Modifikation eine Rolle spielen und die empfindlich, einfach zu verwenden, bei praktisch jeder Aktivität anwendbar sind und für Hochdurchsatz-Screeningverfahren anpassbar sind. Vorzugsweise verwenden solche Assays keine radioaktiven Materialien, so dass die Assays sicher sind und keine gefährlichen Abfallstoffe anfallen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderungen und sieht zusätzlich weitere Vorteile vor.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung sieht ein fluoreszierendes oder biolumineszentes Substrat vor, das als eine optische Sonde oder ein optischer Sensor von Proteinphosphorylierung, wie Phosphorylierung, verwendet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Polypeptidgruppe, die ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Proteasestelle, die an eine Sondengruppe gekoppelt ist, enthält. Typischerweise ändert die Anwesenheit einer Modifikation an dem Erkennungsmotiv die Proteaseaktivität an der Proteasestelle, was zu einer Modulation der Spaltungsgeschwindigkeit der Protease führt. Die Spaltung wird durch eine messbare Veränderung bei mindestens einer optischen Eigenschaft der optischen Sonde nach Spaltung an der Proteasestelle, 1, bestimmt.
  • In einer Ausführungsform ist die Sonde eine fluoreszierende oder lumineszierende Gruppe.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst die Erfindung des Weiteren einen fluoreszierenden Quencher, der an dasjenige Polypeptid gekoppelt ist, das die Emission von der ersten Sondengruppe löscht. In dieser Ausführungsform sind die erste Sondengruppe und die Quenchergruppe so an das Polypeptid gekoppelt, dass das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle sich zwischen ihnen befinden (1). In diesem Fall führt die Spaltung des Polypeptids durch eine Protease zu einer Änderung bei der Fluoreszenzemission der ersten Sondengruppe, die verwendet werden kann, um Proteinphosphorylierungsaktivität zu bestimmen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die optische Sonde des Weiteren eine zweite Sondengruppe umfassen, die an dasjenige Polypeptid gekoppelt ist, das am Energietransfer mit der ersten Sondengruppe beteiligt ist. In dieser Ausführungsform sind die erste Sondengruppe und die zweite Sondengruppe so an das Polypeptid gekoppelt, dass das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle sich zwischen ihnen befinden. In diesem Fall führt die Spaltung des Polypeptids durch eine Protease zu einer Änderung beim Energietransfer zwischen der ersten Sondengruppe und der zweiten Sondengruppe, die verwendet werden kann, um Proteinphosphorylierungsaktivität zu bestimmen.
  • Die Erfindung sieht auch Verfahren zur Verwendung der optischen Sonden der Erfindung vor, um zu bestimmen, ob eine Probe eine Proteinphosphorylierungsaktivität wie Proteinphosphorylierung enthält. Das Verfahren besteht aus: i) Kontaktieren der optischen Sonde mit einer Probe, die üblicherweise eine Proteinphosphorylierungsaktivität enthält oder von der angenommen wird, dass sie eine solche enthält; ii) Kontaktieren der Probe und optischen Sonde mit einer Protease; und iii) Bestimmen von mindestens einer optischen Eigenschaft der optischen Sonde oder des Produkts derselben.
  • In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung Verfahren zur Verwendung der optischen Sonden der Erfindung vor, um zu bestimmen ob eine Testchemikalie die Aktivität einer Proteinphosphorylierungsaktivität moduliert.
  • Gemäß einem anderen Aspekt sieht die Erfindung eine Bibliothek an optischen Sonden vor, von denen jede eine einzigartige Sequenz zur Verwendung beim Auswählen einer optimalen Sequenzspezifität einer Proteinphosphorylierungsaktivität aufweist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt zahlreiche Systeme für spektroskopische Messungen ein. In einer Ausführungsform schließt das System typischerweise mindestens ein Reagens für einen Assay und eine Vorrichtung ein, wobei die Vorrichtung einen Behälter und eine Plattform umfasst. Der Behälter kann die optischen Sensor-Verbindungen der vorliegenden Erfindung und zusätzliche für die Proteinphosphorylierungsaktivität notwendigen Reagenzien einschließen. Das Hinzufügen einer Probe in den Behälter gefolgt von dem Hinzufügen einer Protease nach einer gegebenen Zeit führt zu einer Änderung bei mindestens einer fluoreszierenden Eigenschaft der optischen Sonden der vorliegenden Erfindung, die verwendet werden kann, um die Proteinphosphorylierungsaktivität der Probe zu bestimmen.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das System ein mikrofluidisches, spektroskopisches System einschließen, das mindestens eine Flüssigkeit enthaltende Struktur mit mindestens einem elektro-osmotischen oder elektrophoretischen System zur Kontrolle von Flüssigkeitsbewegungen innerhalb dieser Struktur aufweist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die begleitenden Zeichnungen, die in die Beschreibung inkorporiert sind und einen Teil dieser darstellen, dienen lediglich der Illustration von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Gemeinsam mit der restlichen Beschreibung sollen sie der Erläuterung von bestimmten Grundlagen der Erfindung für den Fachmann dienen.
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung einiger unterschiedlicher Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. In 1 ist eine erste Sondengruppe 1 an ein Polypeptid 5 gebunden, das eine posttranslationale Modifikations-Erkennungsstelle für eine Aktivität 6, (in 1 schraffiert dargestellt) und eine Proteasestelle für eine Protease, 7, (in 1 schwarz dargestellt) umfasst. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die optische Sonde an eine feste Oberfläche, 4, wie zum Beispiel ein Kügelchen, gebunden sein. In einer anderen Ausführungsform kann die optische Sonde des Weiteren einen Quencher 2 umfassen, der durch das Polypeptid 5 von der ersten Sondengruppe 1 getrennt ist. In einer weiteren Ausführungsform kann die optische Sonde eine zweite Sondengruppe 3 umfassen, die ebenfalls durch das Polypeptid 5 von der ersten Sondengruppe 1 getrennt ist.
  • 2 zeigt Fluoreszenzemissionsspektra von gespaltenen und nicht gespaltenen Sonden von gewissen optischen Sonden der vorliegenden Erfindung. Gepunktete Linien stehen für die Spektren der gespaltenen optischen Sonde und gestrichelte Linien stehen für die nicht gespaltene Sonde.
  • 3 zeigt die Abhängigkeit von 460/530 nm Emissionsspektra-Verhältnissen von gewissen optischen Sonden (+/– Kinasebehandlung) der vorliegenden Erfindung nach Inkubation mit steigenden Konzentrationen einer Protease (Chymotrypsin). Nicht ausgefüllte Symbole stehen für Kontrollproben, ausgefüllte Symbole stehen für phosphorylierte Proben, Quadrate stehen für das Src-1-Substrat, Dreiecke stehen für das Src-2-Substrat und Kreise stehen für das Abl-Substrat.
  • 4 zeigt den Vergleich von Veränderungen bei der Fluoreszenz hervorgerufen durch gewisse optische Sonden der vorliegenden Erfindung zu 32P-Einbau für die Detektion von Inhibitoren der Tyrosinkinase-Aktivität. Dreiecke stehen für Messungen mit optischen Sonden, Quadrate stehen für Messungen mittels 32P-Einbau.
  • 5 zeigt die Detektion einer Inhibitor-Aktivität von Proteintyrosinphosphatase-Aktivität durch Orthovanadat unter Verwendung gewisser optischer Sonden der vorliegenden Erfindung.
  • 6 zeigt eine Hochdurchsatz-Screening-Bewertung in Form einer Negativkontrolle, um nachzuweisen, dass die vorliegende Erfindung für die Identifizierung von Inhibitoren der Aktivität von Serin-/Threoninkinase verwendet werden kann.
  • 7 zeigt die durch Caspase-3 vermittelte Spaltung von phosphorylierten (ausgefüllte Symbole) und nicht-phosphorylierten (nicht ausgefüllte Symbole) optischen Sonden der vorliegenden Erfindung mit Spezifität für ERK-Kinase.
  • 8 zeigt die Hemmung von ERK-Kinase-Aktivität durch Roscovitin unter Verwendung gewisser optischer Sonden der vorliegenden Erfindung.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung erkennt an, dass optische Sonden so ausgestaltet sein können, dass sie durch die Bildung von modifizierten Molekülen als optische Sensoren der Proteinphosphorylierungsaktivitäten wirken können. In der vorliegenden Erfindung führt die Modifikation durch Proteinphosphorylierung eines Polypetids zur Modulation der Geschwindigkeit und Effizienz der Spaltung des modifizierten Polypetids im Vergleich zu dem nicht modifizierten Peptid. Die Bindung von mindestens einer Sondengruppe an das Peptid koppelt die Spaltung der optischen Sonde an eine Veränderung in einer Fluoreszenzeigenschaft des Substrats, die verwendet werden kann, um die Höhe der Proteinphosphorylierungsaktivität in einer Probe, 1 zu bestimmen.
  • Abkürzungen
    • t-Boc, tert. Butyloxycarbonyl
    • Bzl, Benzyl;
    • CaMK, Calmodulin-abhängige kinase
    • CKI, Caseinkinase 1;
    • PDGF, Platelet Derived Growth Factor;
    • Fmoc, Fluorenylmethoxycarbonyl;
    • EGF, Epidermaler Wachstumsfaktor;
    • ELISA, Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest;
    • FGF, Fibroblastenwachstumsfaktor;
    • HF, Hydrogenfluorid;
    • HOBT, N-Hydroxybenzotriazol;
    • PyBop, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidin-phosphoniumhexafluorphosphat;
    • TFA, Trifluoressigsäure.
  • Definitionen
  • Im allgemeinen entsprechen die hierin verwendete Nomenklatur und viele der Fluoreszenz-, Computer-, Detektion-, Chemie- und Laborverfahren die im Folgenden beschrieben werden, jenen, die hinreichend bekannt sind und üblicherweise im Stand der Technik eingesetzt werden. Für die chemische Synthese, Fluoreszenz, Optik, Molekularbiologie, Computer Software und Integration werden üblicherweise Standardtechniken verwendet. Im Allgemeinen werden chemische Reaktionen, Zellassays und enzymatische Reaktionen, wenn angebracht, gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Die Techniken und Verfahren werden im Allgemeinen gemäß herkömmlicher Methoden aus dem Stand der Technik und gemäß zahlreichen allgemeinen Angaben durchgeführt. (Lakowicz, J.R. Topics in Fluorescence Spectroscopy, (3 Bände) New York: Plenum Press (1991), und Lakowicz, J. R. Emerging applications of fluorescence spectroscopy to cellular imaging: lifetime imaging, metal-ligand grobes, multi-photon excitation and light quenching. Scanning Microsc Suppl. Bd. 10 (1996) Seiten 213–24, für Fluoreszenztechniken; Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., für Verfahren der Molekularbiologie; Cells: A Laborstory Manual, 1. Auflage (1998) Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., für Verfahren der Zellbiologie; Optics Guide 5 Melles Griot® Irvine CA, and Optical Waveguide Theory, Snyder & Love veröffentlicht von Chapman & Hall für allgemeine Verfahren aus der Optik).
  • In der gesamten Offenbarung haben die folgenden Begriffe, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen:
    Der Begriff „Akzeptor" bezieht sich auf einen Quencher, der über Energietransfer wirkt. Akzeptoren können die transferierte Energie in Form von Fluoreszenz wieder abgeben und sind „fluoreszierende Akzeptorgruppen". Beispiele für Akzeptoren schließen Coumarine und verwandte Fluorophoren, Xanthene wie Fluoresceine, fluoreszierende Proteine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanine, Difluorbordiazaindacene und Phthalocyanine ein. Andere chemische Klassen von Akzeptoren geben die transferierte Energie im Allgemeinen nicht wieder ab. Die Beispiele hierfür schließen Indigos, Benzochinone, Anthrachinone, Azoverbindungen, Nitroverbindungen, Indoaniline und Di- und Triphenylmethane ein.
  • Der Begriff „Kügelchen" bezieht sich auf ein im Wesentlichen kugelförmiges Partikel, wie eine Kugel oder eine Mikrokugel. Kügelchen können innerhalb eines breiten Größenbereichs verwendet werden. Bevorzugte Kügelchen liegen typischerweise im Bereich von 0,01 bi 100 μm im Durchmesser. Kügelchen können aus jedem beliebigen Material zusammengesetzt sein und können im Wesentlichen inert sein oder fluoreszierende, lumineszierende, elektrolumineszierende, chemolumineszierende, magnetische oder paramagnetische Sonden enthalten. Solche Kügelchen sind kommerziell von einer Vielzahl an Quellen erhältlich, einschließlich Molecular Probes, Sigma oder Polysciences.
  • Die Begriffe „Spaltstelle" oder „Proteasestelle" beziehen sich auf die durch die Protease gespaltene Bindung (z.B. eine spaltbare Bindung) und typischerweise die drei Aminosäuren, welche die Bindung auf beiden Seiten umgeben. Die Buchstaben "P1", "P2", "P3" etc. beziehen sich auf die Aminosäurepositionen, 1 Aminosäure, 2 Aminosäuren und 3 Aminosäuren N-terminal zu der zu spaltenden Bindung. Die Buchstaben "P'1", "P'2", "P'3". beziehen sich auf die Aminosäurepositionen 1 Aminosäure, 2 Aminosäuren und 3 Aminosäuren C-terminal zu der zu spaltenden Bindung, wie unten gezeigt.
    zu spaltende Bindung P3 P2 P1 --- P'1 P'2 P'3
  • Der Begriff „manipuliertes Erkennungsmotiv" bezieht sich auf ein Erkennungsmotiv, dessen natürlich vorkommende Sequenz durch mindestens eine Aminosäuresubstitution manipuliert wurde.
  • Der Begriff „manipulierte Proteasestelle" bezieht sich auf eine Proteasestelle, deren natürlich vorkommende Sequenz durch mindestens eine Aminosäuresubstitution manipuliert wurde.
  • Der Begriff „fluoreszierende Gruppe" bezieht sich auf eine Gruppe, die elektromagnetische Energie absorbieren kann und in der Lage ist, zumindest teilweise einen gewissen Anteil dieser Energie als elektromagnetische Strahlung über einen gewissen Zeitraum abzugeben. Geeignete fluoreszierende Gruppen schließen folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Coumarine und verwandte Farbstoffe, Xanthen-Farbstoffe wie Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanin-Farbstoffe, Bimane, Akridine, Isoindole, Dansyl-Farbstoffe, Aminophthalsäurehydrazide wie Luminol und Isoluminolderivate, Aminophthalimide, Aminonaphthalimide, Aminobenzofurane, Aminochinoline, Dicyanohydrochinone, fluoreszierende Halbleiter-Nanochristalle, fluoreszierende Proteine und fluoreszierendes Europium und Terbium-Komplexe und verwandte Verbindungen.
  • Der Begriff „fluoreszierende Eigenschaft" bezieht sich auf eine beliebige der folgenden: der molare Extinktionskoeffizienten bei einer geeigneten Anregungswellenlänge, die fluoreszierende Quanteneffizienz, die Form des Anregungs- oder Emissionsspektrums, das Maximum der Anregungswellenlänge, oder die Emissionsgröße bei einer beliebigen Wellenlänge während, oder zu einem oder mehreren Zeitpunkten nach, der Anregung der fluoreszierenden Gruppe, das Verhältnis der Anregungsamplituden bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen, das Verhältnis der Emissionsamplitüden bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen, die Lebensdauer des angeregten Zustands, die fluoreszierende Anisotropie oder eine beliebige andere messbare Eigenschaft einer fluoreszierenden Gruppe und dergleichen. Vorzugsweise bezieht sich fluoreszierende Eigenschaft auf Fluoreszenzemission oder das Verhältnis der Fluoreszenzemission bei zwei oder mehr als zwei Wellenlängen.
  • Der Begriff „homolog" bezieht sich auf zwei Sequenzen oder Teile derselben, die bei optimaler Anordnung unter Verwendung des ALIGN-Programms zu mehr als oder zu genau 75 % identisch sind. Homologie oder Sequenzidentität bezieht sich auf das Folgende. Zwei Aminosäuresequenzen sind homolog, wenn es eine partielle oder vollständige Identität zwischen ihren Sequenzen gibt. Zum Beispiel bedeutet 85 % Homologie, dass 85 % der Aminosäuren identisch sind, wenn die zwei Sequenzen für maximale Übereinstimmung angeordnet sind. Lücken (in einer der beiden Sequenzen, die auf Übereinstimmung überprüft werden) sind bei maximierender Abgleichung erlaubt; Lücken in der Länge von 5 oder weniger sind bevorzugt, wobei 2 oder weniger noch bevorzugter sind. Alternativ und vorzugsweise sind zwei Proteinsequenzen (oder Polypeptidsequenzen, die von diesen stammen mit einer Länge von mindestens 30 Aminsäuren) homolog, in der hierin verwendeten Bedeutung des Begriffs, wenn sie mehr als 5 Treffer (in Einheiten der Standardabweichung) bei dem Abgleich haben, unter Verwendung des ALIGN Programms mit der Mutationsdatenmatrix und einer Gap Penalty von 6 oder mehr. Siehe Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, Band 5, National Biomedical Research Foundation, S. 101–110, und Anhang 2 zu diesem Band, S. 1–10.
  • Der Begriff „moduliert" bezieht sich entweder auf die teilweise oder vollständige Steigerung oder Hemmung (z.B. Abschwächung der Effizienzrate) einer Aktivität oder eines Prozesses.
  • Der Begriff „Modulator" bezieht sich auf eine chemische Verbindung (natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend) wie ein biologisches Makromolekül (z.B. Nukleinsäure, Protein, nicht-Peptid oder organisches Molekül) oder einen aus biologischen Materialien wie Zellen oder Geweben von Bakterien, Pflanzen, Pilzen oder Tieren (vor allem Säugetieren, einschließlich Menschen) hergestellten Extrakt. Modulatoren werden gemäß ihrer potentiellen Aktivität als Inhibitoren oder Aktivatoren (direkt oder indirekt) eines biologischen Prozesses oder biologischer Prozesse eingeteilt (z.B. Agonist, partieller Antagonist, partieller Agonist, inverser Agonist, Antagonist, antineoplastische Wirkstoffe, zytotoxische Wirkstoffe, Inhibitoren der neoplastischen Transformation oder Zellproliferation, Wirkstoffe, welche die Zellproliferation fördern und dergleichen) durch Einschließen in Screening-Assays wie hierin beschrieben. Die Aktivität eines Modulators kann bekannt, unbekannt oder teilweise bekannt sein.
  • Der Begriff „nicht natürlich vorkommend" bezieht sich auf die Tatsache, dass ein Objekt nicht in der Natur gefunden werden kann. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder eine Polynukleotidsequenz, die in einem von einer natürlichen Quelle isolierten und nicht im Labor absichtlich modifizierten Organismus (einschließlich Viren) vorhanden ist, natürlich vorkommend, während eine Sequenz, die absichtlich vom Menschen modifiziert wurde, nicht natürlich vorkommend ist.
  • Der Begriff „optische Eigenschaft" bezieht sich auf eine physikalische Eigenschaft von Licht, einschließlich den folgenden: der molare Extinktionskoeffizient bei einer geeigneten Anregungswellenlänge, die fluoreszierende oder lumineszierende Quanteneffizienz, die Form des Anregungs- oder Emissionsspektrums, das Maximum der Anregungswellenlänge, das Verhältnis der Anregungsamplituden bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen, das Verhältnis der Emissionsamplituden bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen, die Lebensdauer des angeregten Zustands, die fluoreszierende Anisotropie oder eine beliebige andere messbare optische Eigenschaft einer Verbindung oder ein beliebiges Produkt oder eine beliebige Emission, die von dieser Verbindung stammt, entweder spontan oder als Antwort auf elektrische oder chemische Stimulierung oder Reaktion.
  • Der Begriff „Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer in dem die Monomere Aminosäuren sind und miteinander durch Amidbindungen verbunden sind, wobei auf das Polymer alternativ als Peptid Bezug genommen wird. Zusätzlich sollen auch nicht natürlich Aminsäuren, zum Beispiel Beta-Alanin, Phenylglycin und Homoarginin eingeschlossen sein. Herkömmlich vorgefundene Aminosäuren, die nicht Gen-kodiert sind, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für eine allgemeine Besprechung siehe Spatola, A.F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, B. Weinstein, Hrsg., Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983). Bei allen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminosäuren kann es sich entweder um das D- oder das L-Isomer handeln. Die L-Isomere sind bevorzugt. Chemisch modifizierte oder substituierte Aminosäuren einschließlich phosphorylierter, sulfatierter, methylierter oder prenylierter Reste können auch verwendet werden, um Polypeptide für spezifische Anwendungen herzustellen.
  • Der Begriff „posttranslationale Modifikation" bezieht sich auf die enzymatische oder nicht-enzymatische Modifikation eines Aminosäurerestes (vorzugsweise enzymatisch). Solche kovalenten Modifikationen schließen Phosphorylierung ein. Eine bevorzugte posttranslationale Modifikation schließt Phosphorylierung ein.
  • Der Begriff posttranslational schließt nichtkovalente Modifikationen einschließlich Protein-Protein-Interaktionen und das Binden von allosterischen oder anderen Modulatoren oder zweiten Botenstoffen wie Calcium oder cAMP oder Inositolphosphate an das Erkennungsmotiv ein.
  • Der Begriff „Sondengruppe" bezieht sich auf eine chemische Gruppe, die als Marker oder Indikator oder Kontraststoff für Absorptionsspektroskopie, Lumineszenzspektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie oder magnetische Detektion verwendet wird.
  • Der Begriff „Quencher" bezieht sich auf ein Molekül oder einen Teil einer Verbindung, das/der in der Lage ist, die Emission von einer Sondengruppe zu reduzieren. Eine solche Reduktion schließt die Reduktion des Lichts nach demjenigen Zeitraum, in dem ein Photon normalerweise von einer fluoreszierenden Gruppe abgegeben wird, ein. Quenching kann durch einen beliebigen einer Vielzahl von Mechanismen stattfinden, einschließlich Fluorescence resonance energy transfer, photoinduzierter Elektronentransfer, paramagnetische Steigerung von Intersystem Crossing. Dexter-Transfer (Austausch-Wechselwirkungen) und Anregungskopplung, wie die Bildung von dunklen Komplexverbindungen. Bevorzugte Quencher schließen jene ein, die durch Fluorescence resonance energy transfer wirken.
  • Der Begriff „Erkennungsmotiv" bezieht sich auf die gesamte oder einen Teil einer Polypeptidsequenz, die von einer Proteinphosphorylierungsaktivität erkannt wird, um ein Polypeptid in die Lage zu versetzen, durch diese Protein phosphorylierungsaktivität modifiziert zu werden. Typischerweise beträgt die Affinität eines Proteins, z.B. eines Enzyms, für das Erkennungsmotiv ungefähr 1 mM (apparente Kd), bevorzugt wird eine größere Affinität von ungefähr 10 μM oder weniger, noch bevorzugter 1 μM oder am bevorzugten hat es eine apparente Kd von ungefähr 0,1 μM. Der Begriff soll nicht auf die optimalen oder bevorzugten Erkennungsmotive beschränkt sein, sondern umfasst alle Sequenzen, die einem Peptid Substraterkennung spezifisch ermöglichen können. Vorzugsweise handelt sich bei dem Erkennungsmotiv um ein phosphoryliertes Erkennungsmotiv (z.B. schließt es eine Phosphatgruppe ein). Typischerweise umfasst das Erkennungsmotiv zumindest teilweise eine Proteasestelle. Die Proteasestelle kann an jeder beliebigen Stelle innerhalb des Erkennungsmotivs angeordnet sein.
  • Der Begriff „Testchemikalie" bezieht sich auf eine Chemikalie, die durch ein oder mehr als ein Screeningverfahren der Erfindung als ein möglicher Modulator getestet wird. Bei einer Testchemikalie kann es sich um jede beliebige Chemikalie handeln, wie eine anorganische Chemikalie, eine organische Chemikalie, ein Protein, ein Peptid, ein Kohlenhydrat, ein Lipid oder eine Kombination derselben. Üblicherweise werden zahlreiche zuvor bestimmte Konzentrationen von Testchemikalien für das Screening verwendet, wie 0,01 Mikromolar, 1 Mikromolar und 10 Mikromolar. Kontroll-Scans auf Testchemikalien schließen die Messung eines Signals in der Abwesenheit der Testverbindung oder den Vergleich mit einer Verbindung, von der bekannt ist, dass sie das Ziel moduliert, ein.
  • EINFÜHRUNG
  • Die vorliegende Erfindung erkennt erstmals an, dass optische Sonden so ausgestaltet sein können, dass sie einen Bereich an Proteinphosphorylierungsaktivitäten messen können. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, die in Verfahren verwendet werden können, insbesondere in Verfahren für Hochdursatz-Screening und für miniaturisierte Screeningsysteme zur Entdeckung von Medikamenten und der Erstellung von Profilen derselben. Theoretische Sonden verleihen Assays, die typischerweise eine große dynamische Reichweite aufweisen, erhöhte Empfindlichkeit und ermöglichen ratiometrisches Auslesen für die Detektion von Proteinphosphorylierungsaktivitäten.
  • Als eine nicht einschränkende Einführung für die Reichweite der Erfindung schließt die Erfindung mehrere allgemeine und nützliche Aspekte ein, einschließlich:
    • 1) eine Polypeptidgruppe, die ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Proteasestelle, die an eine Sondengruppe gekoppelt ist, enthält. Typischerweise ändert die Anwesenheit einer Modifikation an dem Erkennungsmotiv die Proteaseaktivität an der Proteasestelle, was zu einer Modulation der Spaltungsgeschwindigkeit der Protease führt. Die Spaltung wird durch eine messbare Veränderung bei mindestens einer optischen Eigenschaft der optischen Sonde nach Spaltung an der Proteasestelle bestimmt. In unterschiedlichen Ausführungsformen kann die Erfindung des Weiteren eine zweite optische Sonde, wie einen fluoreszierenden Quencher oder eine zweite fluoreszierende Gruppe oder eine lumineszierende Gruppe umfassen. Typischerweise ist die zweite optische Sonde so an das Polypeptid gekoppelt, dass Erkennungsmotiv und Proteasestelle sich zwischen ihnen befinden.
    • 2) Verfahren zur Verwendung der optischen Sonden (1), um zu bestimmen ob eine Probe eine Proteinphosphorylierungsaktivität wie Proteinphosphorylierung enthält.
    • 3) Verfahren für die Verwendung der optischen Sonden (1), um zu bestimmen, ob eine Testchemikalie die Aktivität einer Proteinphosphorylierungsaktivität moduliert.
    • 4) Bibliotheken an optischen Sonden, von denen jede eine einzigartige Sequenz zur Verwendung beim Auswählen einer optimalen Sequenzspezifität einer Proteinphosphorylierungsaktivität aufweist.
    • 5) Systeme für spektrometrische Messungen unter Verwendung der oben genannten optischen Sonden (1) und Verfahren.
    • 6) Mikrofluidische spektroskopische Systeme für die Verwendung der optischen Sonden (1) das mindestens eine Flüssigkeit enthaltende Struktur mit mindestens einem elektroosmotischen oder elektrophoretischen System zur Kontrolle von Flüssigkeitsbewegungen innerhalb dieser Struktur aufweist.
  • Diese Aspekte der Erfindung und andere hierin beschriebene Aspekte, können durch das Verwenden der hierin beschriebenen gegenständlichen Verfahren und Zusammensetzungen realisiert werden. Zur Beschreibung des gesamten Schutzumfangs der Erfindung muss des Weiteren beachtet werden, dass zahlreiche Aspekte der Erfindung kombiniert werden können, um wünschenswerte Ausführungsformen der Erfindung darzustellen. Solche Kombinationen führen zu besonders nützlichen und robusten Ausführungsformen der Erfindung.
  • Ausgestaltung von Peptidsequenzen zur Verwendung in den optischen Sonden der vorliegenden Erfindung
  • Im Allgemeinen umfassen Peptidsequenzen für das Messen einer Proteinphosphorylierungsaktivität ein Erkennungsmotiv für Proteinphosphorylierung, das einen Rest enthält, der, wenn er modifiziert wird, die Spaltungsrate des Substrats durch eine Protease im Vergleich zu der nicht modifizierten Form moduliert. Typischerweise enthalten solche Peptide eine einzige zu spaltende Bindung (Bindung, die innerhalb des Substrats gespalten wird) für eine spezifische Protease und weisen angemessene Löslichkeit in wässriger Lösung auf (z.B. 0,1 mg/ml oder höher). Die Ausgestaltung und Größe von Peptidsequenzen für spezifische optische Sonden und die Wahl einer bestimmten Protease ist abhängig von der Anwendung für die die optische Sonde eingesetzt werden soll. So ist zum Beispiel im Falle von Anwendung vom Typ des Resonance energy transfer das Peptid, das die fluoreszierenden oder lumineszierenden Gruppen trennt, typischerweise in der Größenordnung von einer Länge von 5 bis 50 Aminosäuren, vorzugsweise einer Länge von 10 bis 25 Aminosäuren oder bevorzugter einer Länge von 10 bis 15 Aminosäuren vorhanden. Für Anwendungen, die auf Polarisierungen beruhen, kann das Peptid deutlich größer sein, bis zu und einschließlich ganzer Proteindomänen, zum Beispiel einer Länge von 50 bis 100 Aminosäuren. Kleinere Peptide in der Größenordnung von 5 bis 50 Aminosäuren können ebenfalls verwendet werden. Typischerweise kann sich die Proteasestelle in jeder beliebigen Position, entweder vollständig oder teilweise innerhalb des Erkennungsmotivs befinden. Das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle können sich in jeder beliebigen Position innerhalb des Peptids mit Bezug auf die optische Sondengruppe befinden. Der folgende Teil beschreibt die Ausgestaltung von geeigneten Peptidsubstraten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Darauffolgende Abschnitte beschreiben die Auswahl und das Koppeln von geeigneten fluoreszierenden Gruppen zur Verwendung in der Erfindung.
  • Eine Ausgestaltung von Peptiden für das Messen von Proteinphosphorylierung
  • Im Allgemeinen wirken Proteinkinasen auf Proteine über das Hinzufügen von Phosphatgruppen (Phosphorylierung), primär auf die Aminosäuren Tyrosin, Serin oder Threonin durch eine freie Hydroxyl-Gruppe. Die Proteinkinasen, die diese Reaktionen enzymatisch katalysieren können in eine Anzahl an verschiedenen Familien klassifiziert werden, basierend auf gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Typischerweise haben Kinasen innerhalb einer Familie eine ähnliche Gesamttopologie, ähnliche Regulationsweisen und ähnliche Substratspezifitäten (siehe Tabelle 1 und können mit der Erfindung ebenso wie mit den in Zukunft entwickelten Erkennungsmotiven verwendet werden). Zum Beispiel bevorzugen Bestandteile der AGC(Proteinkinase A, G oder C)-Familien der Kinasen typischerweise Phosphorylierungs-Erkennungsmotive mit basischen Aminosäuren (R oder K), jene in der CMGC-Gruppe bevorzugen typischerweise Motive, die Prolin enthalten, etc. In Tabelle 1 stehen leere Zellen in der Spalte "Substratpräferenz" dafür, dass keine vollständige Information für jedes Mitglied einer bestimmten Klasse verfügbar war, oder dafür, dass die Familie zu klein war, um eine deutliche Substratpräferenz anzuzeigen oder dafür, dass noch keine deutlich definierte Substratpräferenz existiert.
  • Innerhalb von Unterfamilien haben bestimmte Bestandteile spezifische Vorlieben für Aminosäuren in spezifischen Positionen innerhalb des Substrats. Diese Präferenzen wurden für eine Anzahl an Kinasen wie hierin beschrieben ausführlich charakterisiert. Zusätzliche Verfahren für das Identifizieren der Substratspezifitäten und Binden der Erkennungsmotive neuer Kinasen sind im Stand der Technik bekannt und können mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Verfahren ermöglichen es, die Substratspezifität von praktisch jeder beliebigen jetzt bekannten oder in der Zukunft entdeckten Kinase schnell zu identifizieren, siehe zum Beispiel US Patente Nr. 5,532,167 von Cantley et al., erteilt am 2. Juli 1996, und PCT Anmeldung WO 98/54577 von Lai et al., eingereicht am 28. Mai 1998.
    TABELLE 1
    HAUPTGRUPPEN UNTERGRUPPEN BESCHREIBUNG SUBSTRATPRÄFEREN Z
    AGC Gruppe
    Gruppe 1 Familie der durch zyklische Nukleotide regulierten Proteinkinasen auf Arg/Lys gerichtet
    Gruppe 2 Familie der durch Diacylglycerol aktivierten/phospholipidabhängigen auf Arg/Lys gerichtet
    Proteinkinasen
    Gruppe 3 verwandt mit Proteinkinase A und Proteinkinase C auf Arg/Lys gerichtet
    Gruppe 4 Kinasen, die an G-Protein gekoppelte Rezeptoren phosphorylieren auf negative Ladung gerichtet
    Gruppe 5 Sprosshefe AGC-verwandte Protein kinasen nicht verfügbar
    Gruppe 6 Kinasen, welche die Familie von ribosomalem Protein S6 phosphorylieren auf Arg/Lys gerichtet
    Gruppe 7 Familie der Knospungs-Hefe DBF2/20
    Gruppe 8 Familie der Bedecktsamer PVPK1 Proteinkinase-Homologa
    Gruppe 9 Andere AGC-verwandte Kinasefamilien Verschiedene
    CAMK-GRUPPE
    CaMK Gruppe 1 Durch Ca2+/CaM und nahe Verwandte regulierte Kinasen auf Arg/Lys gerichtet
    CaMK Gruppe 2 CaMK Gruppe II auf Arg/Lys gerichtet
    CaMK Andere Andere CaMK verwandte Kinasefamilien Verschiedene
    CMGC-Gruppe
    CMGC Gruppe 1 Familie der Cyclin abhängigen Kinasen (CDKs) und nahe Verwandte auf Ser/Pro gerichtet
    CMGC Gruppe 2 Familie der ERK (MAP) Kinasen auf Ser/Pro gerichtet
    CMGC Gruppe 3 Familie der Glycogen-Synthase Kinase 3 auf Ser/Pro gerichtet
    CMGC Gruppe 4 Familie der Caseinkinase II auf negative Ladung gerichtet
    CMGC Gruppe 5 Clk-Familie
    CMGC Gruppe 6 CMGC-Guppe andere Verschiedene
    PTK-GRUPPE 1
    Nichtmembrandurchspannende Proteintyrosinkinasen
    PTK Gruppe 1 Src-Familie auf IY gerichtet
    PTK Gruppe 2 Tec-/Atk-Familie
    PTK Gruppe 3 Csk-Familie auf IYM gerichtet
    PTK Gruppe 4 Fes-(Fps-)Familie auf IYE gerichtet
    PTK Gruppe 5 Abl-Familie auf IYA gerichtet
    PTK Gruppe 6 Syk-/ZAP70-Familie auf YE gerichtet
    PTK Gruppe 7 Tyk2-/Jak 1-Familie
    PTK Gruppe 8 Ack-Familie
    PTK Gruppe 9 Familie der fokalen Adhesionskinase (FAK)
    PTK-Gruppe 2
    membrandurchspannende Proteintyrosinkinasen
    PTK Gruppe 10 Familie des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) auf EEEYF gerichtet
    PTK Gruppe 11 Eph-/Elk-/Eck-Rezeptor
    PTK Gruppe 12 Axl-Familie
    PTK Gruppe 13 Tie-/Tek-Familie
    PTK Gruppe 14 PDGF-Familie auf EEEYV gerichtet
    PTK Gruppe 15 FGF-Familie auf EXYXF gerichtet
    PTK Gruppe 16 Insulinrezeptor-Familie auf YMMM gerichtet
    PTK Gruppe 17 LTK-/ALK-Familie
    PTK Gruppe 18 Ros-/Sevenless-Familie
    PTK Gruppe 19 Trk-/Ror-Familie
    PTK Gruppe 20 DDR-/TKT-Familie
    PTK Gruppe 21 Familie der Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren
    PTK Gruppe 22 Nematode Kin 15/16-Familie
    PTK Gruppe 23 andere membrandurchspannende Kinasen Verschiedene
    OPK-Gruppe
    Andere Proteinkinasen (die nicht zu größeren Gruppen gehören)
    OPK Gruppe 1 Polo Familie
    OPK Gruppe 2 MEK-/STE7-Familie
    OPK Gruppe 3 PAK-/STE20-Familie
    OPK Gruppe 4 MEKK-/STE1-Familie
    OPK Gruppe 5 NimA-Familie
    OPK Gruppe 6 Weel-/mik1-Familie
    OPK Gruppe 7 Familie von an Transkriptionskontrolle beteiligten Kinasen
    OPK Gruppe 8 Raf-Familie
    OPK Gruppe 9 Familie des Activin/TGFb-Rezeptor
    OPK Gruppe 10 mutmaßliche Bedecktsamer-Rezeptorkinasen und nahe Verwandte
    OPK Gruppe 11 Familie der PSK-/PTK Leucin-Zipper-Domäne von „gemischter Abstammung"
    OPK Gruppe 12 Familie der Caseinkinase 1
    OPK Gruppe 13 Familie der prokaryotischen Proteinkinase PKN
    OPK Gruppe 14 Andere Familien von Proteinkinasen (jeweils ohne nahe Verwandte) Verschiedene
  • Eukaryotische Proteinphosphatasen sind strukturell und funktionell unterschiedliche Enzyme, die durch drei unterschiedliche Genfamilien vertreten sind. Zwei von diesen dephosphorylieren Phosphoserin- und Phosphothreoninreste, wohingegen die Proteintyrosinphosphatasen (PTPs) Phosphotyrosin-Aminosäuren dephosphorylieren. Eine Unterfamilie der PTPs, die Phosphatasen mit dualer Spezifität, dephosphoryliert alle drei Phosphor-Aminosäuren. Innerhalb jeder Familie sind die katalytischen Domänen stark erhalten, wobei die funktionale Diversität durch regulatorische Domänen und Untereinheiten verliehen wird.
  • Die Protein-Serin- oder -Threonin-Phosphatasen vom Typ 1 und 2A sind für 95 % der Phosphatase-Aktivität in Zellextrakten verantwortlich (Brautigan and Shriner, Methods. Enzymol. 159: 339–346 (1988)). Diese Enzyme haben breite Substratspezifitäten und können in vivo durch Targeting von den Enzymen zu einzelnen subzellulären Stellen reguliert werden.
  • Die Gesamtanzahl an Proteintyrosinphosphatasen, die in dem Säugetiergenom kodiert sind, wurde auf zwischen 500 und ungefähr 2000 geschätzt. Diese Schätzungen sind auf Grund der großen Anzahl an Einträgen in Sequenz-Datenbänken, bei denen es sich um Splicing-Formen oder Duplikate derselben PTP-Sequenz handelt, ungenau.
  • i) Tyrosinphosphorylierung
  • Optische Sonden zur Detektion der Tyrosinkinase-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch Einbau des gewünschten Phosphorylierungsmotivs in ein Peptid hergestellt und durch Gewährleistung, dass der einzige aromatische Rest (Tyr, Trp oder Phe) in dem Substrat das zu phosphorylierende Tyrosin ist. In manchen Fällen kann es auch vorzuziehen sein, die negativ geladenen Aminosäuren in den Positionen P'1, P'2 oder P'3 zu entfernen oder deren Anzahl zu reduzieren. Ist dies der Fall, so moduliert die Phosphorylierung des Tyrosin-Restes durch die von Tyrosin gesteuerte Proteinkinase-Aktivität die Geschwindigkeit der Hydrolyse der optischen Sonde durch Chymotrypsin im Vergleich zu der nicht-phosphorylierten optischen Sonde. Die anwesenden Erfinder haben erkannt, dass das Entfernen von negativ geladenen Resten in der optischen Sonde C-terminal zu der zu spaltenden Bindung die Effizienz der Spaltung der nicht-phosphorylierten optischen Sonde verbessert, wodurch teilweise die Nützlichkeit der optischen Sonde für das Messen von Kinase- oder Phosphatase-Aktivitäten signifikant erhöht wird. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um spezifische optische Sonden für praktisch alle bekannten Tyrosinkinase-Aktivitäten durch Routine-Optimierung der Reaktionsbedingungen, wie hierin beschrieben, zu erzeugen. Spezifische veranschaulichende Beispiele für verschiedene Tyrosinkinase-Klassen sind in Tabelle 2 gezeigt, unten zur Verwendung mit Chymotrypsin.
    TABELLE 2
    Kinase Optimales Erkennungsmotiv für die Kinase für die optische Sonde spezifisches Motiv
    c-FGR MEEIYGIFF ( 2 ) MEEIYGILS SEQ. ID. NO: 1
    Lyn DEEIYEELE ( 2 ) DEEIYESLE SEQ. ID. NO: 2
    Src-1 GEEEIYGEFEK ( 1 ) GEEEIYGEIEK SEQ. ID. NO: 3
    C-Abl AXVIYAAPF ( 1 ) AEAIYAAPL SEQ. ID. NO: 4
    CSK XEPIYMFFF ( 2 ) EPIYMLSL SEQ. ID. NO: 5
    Insulinrezeptor XEEEYMMMF ( 1 ) EEEYMMMM SEQ. ID. NO: 6
    PDGF-Rezeptor EEEEYVFIX (1) EEEEYVVIX SEQ. ID. NO: 7
    EGF-Rezeptor EEEEYFELV ( 1 ) EEEEYVLLV SEQ. ID. NO: 8
    FGF-Rezeptor AEEEYFFLF ( 1 ) AEEEYFVLM SEQ. ID. NO: 9
  • In Tabelle 2 zeigen Reste in Fettschrift jene Reste an, von denen angenommen wird, dass sie bei der Erkennung von Kinase eine signifikante Rolle spielen und Reste in Kursivschrift stehen für jene Reste, die substituiert werden können, um die effektive Modulation der proteolytischen Empfindlichkeit der optischen Sonde gegenüber Chymotrypsin nach Phosphorylierung zu ermöglichen. Das Tyrosin, das phosphoryliert wird, ist unterstrichen und die angegebenen Referenzziffern beziehen sich auf (1) Songyang, et al., Current Biology 4: 973–983, 1994, und (2) Ruzzene, et al., Eur. J. Biochem. 246: 433–439.
  • ii) Serin-/Threoninphosphorylierung
  • Für die Entwicklung von optischen Sonden für das Messen von Serin- oder Threonin-Kinase-Aktivitäten sind Peptide so ausgestattet, dass sie eine einzelne aromatische Aminosäure (Tyr, Trp oder Phe) die sich typischerweise innerhalb von ungefähr drei Aminosäuren eines durch eine geeignete serin- oder threoninspezifische Kinase phosphorylierten Serin- oder Threonin-Restes befindet. In manchen Fällen kann es auch vorzuziehen sein (in Abhängigkeit von der gewählten Protease), die negativ geladenen Aminosäuren (z.B. Reste von Asp oder Glu) in den Positionen P'1, P'2 oder P'3 zu entfernen oder deren Anzahl zu reduzieren, um zu gewährleisten, dass die Wirkung der Phosphorylierung des Serin- oder Threonin-Restes zu einer umfangreichen Modulation bei der proteolytischen Empfindlichkeit der optischen Sonden nach Phosphorylierung führt. Beispiele für solche Sequenzen sind unten in Tabelle 3 für die Verwendung mit Chymotrypsin gegeben.
    Tabelle 3
    Kinase Optimales Motiv Optische Sonde mit p-Ser in P'1 Optische Probe mit p-Ser in P'2
    Proteinkinase A RRRRSIIFI (1) RRRFSIIII SEQ. ID. NO: 10 RRFRSIIII SEQ. ID. NO: 11
    Proteinkinase C RRRKIFSFRRK(5) RRRKFSLRRKA SEQ. ID. NO: 12
    CaMK I LRRRLSDSNL (6) LRRRFSASNL SEQ. ID. NO: 13
    CaMK II KRQQSFDLF ( 2 ) KRQFSIDLK SEQ. ID. NO: 14 KRFQSIDLK SEQ. ID. NO: 15
    Caseinkinase I FDTGSIIIFF (2) GDQDTYSLLDK SEQ. ID. NO: 16 GDQDYLSLDK SEQ. ID. NO: 17
    Caseinkinase II EDEFSEDEE ( 2 ) EDEFSEDEE SEQ. ID. NO: 18 EDFESEDEE SEQ. ID. NO: 19
    CycA/cdk2 HHHRSPRKR (1) HHHFSPRKR SEQ. ID. NO: 20 HHFRSPRKR SEQ. ID. NO: 21
    CycB/cdc2 HHHKSPRRR (1) HHHFSPRRR SEQ. ID. NO: 22 IDIFKSPRRR SEQ. ID. NO: 23
    ERK RVDEPDSPGEK (4) RVDEPFSPGEK SEQ. ID. NO: 24
    Glycogen-Synthase PRPASVPP ( 6 ) PRPFSVPP SEQ. ID. NO: 25
    SLK I RRFGSLRRF ( 1 ) RRRFSLRRI SEQ. ID. NO: 26 RRFGSLRRI SEQ. ID. NO: 27
    SRPK 2 RRRHSRRRR (3) RRRFSRRRR SEQ. ID. NO: 28 RRFHSRRRR SEQ. ID. NO: 29
  • In Tabelle 3 zeigen Reste in Fettschrift jene Reste an, von denen angenommen wird, dass sie bei der Erkennung von Kinase eine signifikante Rolle spielen und Reste in Kursivschrift stehen für jene Reste, die substituiert werden können, um die effektive Modulation der proteolytischen Empfindlichkeit der optischen Sonde gegenüber Chymotrypsin nach Phosphorylierung zu ermöglichen. Das Serin, das phosphoryliert wird, ist unterstrichen und die angegebenen Referenzziffern beziehen sich auf (1) Songyang, et al., Current Biology 4: 973–983, (1994), (2) Songyang, et al., Mol. Cell Biol. 16: 6486–6493, (1996), (3) Wang, et al., J. Cell Biol. 140: 737–750, (1998), und (4)
    • Gonzalez et al., J. Biol. Chem., 266: 22159–22163, (1991), (5) Nishikawa et al., J. Biol. Chem. 272: 952–960 (1997), (6) Kemp und Pearson Meth. Enzymology 200: 121–155 (1991).
  • Wahl der Protease
  • Im Allgemeinen haben Proteasen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung typischerweise die folgenden Eigenschaften: Sie sind im allgemeinen in einem Zustand von hoher Reinheit erhältlich, sind im Wesentlichen stabile und erkennen ein Substrat-Erkennungsmotiv, das mindestens eine Position umfasst, in der die Anwesenheit oder Abwesenheit eines posttranslational modifizierten Restes die Aktivität der Protease gegenüber dem Substrat moduliert.
  • Bevorzugte Substrate besitzen gut definierte Proteasestellen und weisen eine signifikante Modulation, z.B. mindestens 2-fache oder bevorzugter mindestens 5-fache Modulation, der Aktivität gegenüber einem phosphorylierten Rest im Vergleich zu einem nicht modifizierten Rest auf.
  • Eine Wahl der Protease für das Messen von Proteinphosphorylierung
  • Proteasen, die zur Messung der Phosphorylierung des Peptids verwendet werden schließen jene ein, die ein Substrat-Erkennungsmotiv erkennen, das mindestens eine Position umfasst, in der die Anwesenheit oder Abwesenheit eines posttranslational modifizierten Restes die Aktivität der Protease gegenüber dem Substrat moduliert.
  • Beispiele dafür sind die in Tabelle 6 gegebenen oder andere derartige Proteasen, die jetzt oder in Zukunft entwickelt werden.
    Tabelle 6
    Name C-Nummer Typ gespaltene Peptidbindung Primäre Spezifität
    Caspase 3 Cystein DXXD-P'1 P1 = Asp, P'1 = neutral bevorzugt
    Cathepsin G C 3.4.21.20 Serin P1 - P'1 P1 = aromatisch bevorzugt, W, Y, F
    Chymotrypsin C 3.4.21.1 Serin P1 - P'1 P1 = aromatisch bevorzugt, W, Y, F
    Elastase C 3.4.21.36 Serin P1 - P'1 P1 = ungeladen, nicht aromatisch, z.B. A, V, L, I, G, S, T P'1 = nicht spezifisch
    Endoproteinase Asp-N Unbekannt P1 - Asp P'1 = Asp oder P'1 = Cysteinsäure P1 = nicht spezifisch
    Endoproteinase Glu-N C 3.4.21.9 Serin Glu - P'1 P1 = Glu oder Asp P'1 = nicht spezifisch
    Streptomyces griseus GluSGP C 3.4.21.82 Serin Glu - P'1 P1 = Glu oder Asp P'1 = nicht spezifisch
    Staphylococcus aureus V8 C 3.4.21.19 Serin Glu-P'1 P1 = Glu oder Asp P'1 = nicht spezifisch
  • Die Flexibilität bei der Wahl von phosphorylierter Aminosäure (Tyrosin, Serin oder Threonin) kombiniert mit der Flexibilität bei der Wahl der Protease ermöglicht praktisch, dass jede beliebige Proteinkinase unter Verwendung der vorliegenden Erfindung gemessen werden kann. Des Weiteren ist zu beachten, dass die oben genannten Beispiele für Peptide gelten, die verwendet werden könnten, um optische Sonden wie hierin beschrieben zu entwickeln. Viele andere alternative Substrate für eine spezifische Modifikation der Proteinphosphorylierung sind auf Grund der dem Ansatz innewohnenden Flexibilität ebenfalls möglich.
  • Eine in Betracht gezogene Version des Verfahrens besteht darin, induzierbare, kontrollierende Nukleotidsequenzen zu verwenden, um einen plötzlichen Anstieg bei der Expression der Protease innerhalb einer Zelle für die Entwicklung eines zellbasierten Assays zu bewirken. Eine geeignete optische Eigenschaft würde typischerweise bei einem oder mehr als einem Zeitintervall nach dem Auftreten der gesteigerten Expression der Protease gemessen.
  • Wahl der Sondengruppen
  • Die Wahl der Sondengruppe wird von einer Anzahl an Faktoren bestimmt, einschließlich des Typs der durchgeführten Messungen, der Verfügbarkeit von spezifischer Geräteausstattung und der Frage, wie einfach es ist, die Sondengruppe an das Peptid zu koppeln. Zusätzlich sind auch weitere Faktoren, die für eine bestimmte Anwendung spezifisch sind, relevant und schließen die Wirkung von Labeling auf die Löslichkeit des Peptids, Kinetik der optischen Sonde mit Bezug auf die Proteinphosphorylierungsaktivität oder Protease und die benötigte Detektionssensibilität des Assays ein. Glücklicherweise sind zahlreiche Sondengruppen kommerziell erhältlich oder können leicht hergestellt werden, so dass die Verfügbarkeit von Sondengruppen, die die Anforderungen einer bestimmten Situation erfüllen, nicht beschränkend ist.
  • Bevorzugte Fluorophore für fluoreszierende Sonden weisen typischerweise gute Quantenausbeute, Lebensdauer und Extinktionskoeffizienten auf, sind resistent gegenüber Stoßlöschung und Bleichen und sollten vorzugsweise leicht an den Liganden konjugieren. Besonders wünschenswert sind Fluorophore deren Absorptionsvermögen und Emission im roten und beinahe infraroten Bereich liegt, die in Studien mit Tierversuchen auf Grund reduzierter Streuung der Hintetrgrundfluoreszenz und größerer Übertragung durch Gewebe nützlich sind. Beispiele für solche Gruppen schließen Cyanine, Oxazine, Thiazine, Porphyrine, Phthalocyanine, fluoreszierende Infrarot ausstrahlende, polynukleare, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Violanthrone, Fluoreszenz-Proteine, Near IR Squarain-Farbstoffe ein. (Wie zum Beispiel in Dyes and Pigments, 17 19–27 (1991), US Patent Nr. 5,631,169 von Lakowicz et al., erteilt am 20. Mai 1997, gezeigt; und organometallische Komplexe wie die Ruthenium- und Lanthanid-Komplexe aus den US Patenten Nr. 4,745,076 und 4,670,572 ). Die Lanthanid-Komplexe haben den Vorteil, dass sie nicht durch Sauerstoff gelöscht werden und die lange Lebensdauer ermöglicht die einfache Unterdrückung der Autofluoreszenz von biologischen Proben. Spezifische Materialien schließen Fluoresceinisothiocyanat (besonders Fluorescein-5-isothiocyanat), Dichlortriazinyl-Aminofluorescein, Tetramethylrhodamin-5 (und -6)-isothiocyanat, mit 1,3-bis-(2-dialkylamino-5-thienyl) substituierte Squaraine und die Succinimidylester von: 5 (und 6)-Carboxyfluoroscein; 5 (und 6)-Carboxytetramethylrhodamine; und 7-Amino-4-methylcoumarin-3-Essigsäure. Fluoreszierende Nanokristalle von Halbleitern sind mit einem Bereich an Emissionsspektra verfügbar, sind hoch fluoreszierend und sind ebenfalls bevorzugt (siehe Bruchez et al., Science 281: 2013–2016).
  • Bevorzugte lumineszierende Sonden schließen chemilumineszierende, elektrolumineszierende und biolumineszente Verbindung ein. Bevorzugte biolumineszente Verbindungen schließen biolumineszente Proteine wie Luciferasen von Leuchtkäfern, Bakterien oder Schnellkäfern, Aequorine und andere Photoproteine, wie zum Beispiel in den US Patenten 5,221,623 , erteilt am 22. Juni 1989 an Thompson et al. und 5,683,888 , erteilt am 4. November 1997 an Campbell; 5,674,713 , erteilt am 7. September 1997 an DeLuca et al.; 5,650,289 erteilt am 22. Juli 1997 an Wood und US Patent 5,843,746 erteilt am 1. Dezember 1998 an Tatsumi et al. Bevorzugte elektrolumineszierende Sonden schließen Ruthenium-Komplexe, wie zum Beispiel in US Patent 5,597,910 , erteilt am 28. Januar 1997 an Gudibande, beschrieben. Bevorzugte chemilumineszierende Substrate schließen jene ein, die auf 1,2-Dioxetanen basieren, wie zum Beispiel in den US Patenten 4,372,745 erteilt am 8. Februar 1983 an Mandle et al.; 5,656,207 erteilt am 12. August 1997 an Woodhead et al. und 5,800,999 erteilt am 1. September 1998 an Bronstein et al, beschrieben.
  • Bevorzugte Sonden zur Verwendung als NMR-Kontrastmittel schließen Chelate von paramagnetischen oder diamagnetischen Metallionen, die mit lipophilen Komplexen einen Komplex bilden, wie in US Patent 5,628,982 , erteilt am 13. Mai 1997 an Lauffer et al. und US Patent 5,242,681 , erteilt am 7. September 1993 an Elgavish et al. beschrieben und Fluorin-18 und -19 enthaltende Verbindungen, J. Nucl. Med. 39 1884–91 (1998), ein.
  • In manchen Anwendungen kann es erwünscht sein, dass die oben genannten Verbindungen derivatisiert werden, um sie hydrophober zu machen und ihnen eine bessere Permeationsfähigkeit durch Zellemembranen zu verleihen. Die derivatisierenden Gruppen sollten einer Hydrolyse im Inneren von Zellen unterzogen werden, um die Verbindungen zu regenerieren und sie so innerhalb der Zellen "einzufangen". Zu diesem Zwecke ist es bevorzugt, dass jedes beliebe phenolische Hydroxyl oder freies Amin in den Farbstoffstrukturen mit C1-C4 Acylgruppen (z.B. Formyl, Acetyl, n-Butyl) acyliert oder in verschiedene Ester und Carbonate, wie in Bundgaard, H., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers (1985), Kapitel 1, Seite 3 ff. beschrieben, umgewandelt wird. Weitere Modifikation der fluoreszierenden Gruppen kann gegebenenfalls auch durchgeführt werden, wie in US Patent Nr. 5,741,657 , erteilt am 21. 4. 1998 an Tsien et al. beschrieben.
  • Die Sonde kann an das Polypeptid durch einen Linker gebunden sein, der einen Spacer zwischen der Sonde und dem Peptid vorsieht und damit sterische Interferenzen der Sonde auf die Interaktion zwischen dem Erkennungsmotiv und der Proteinphosphorylierungsaktivität verhindert. Bevorzugte Spacer sind im Wesentlichen unter zellulären Bedingungen stabil und können auf einfache Weise an das Peptid und die Sonde gekoppelt werden. Bevorzugte Beispiele schließen flexible aliphatische Linker wie y-Amino-n-Buttersäure (GABA), Diaminopentan und Aminohexanoyl ebenso wie starre aromatische Linker ein. Solche Linker sind im Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel im von Molecular Probes veröffentlichten „Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" von Richard Haugland beschrieben.
  • Zusätzliche nichtkovalente Verfahren zur Bindung können ebenfalls verwendet werden, um die Peptidgruppe zu markieren. Zum Beispiel kann das Peptid so ausgestaltet sein, dass es eine spezifische Bindestelle für eine fluoreszierende Gruppe aufweist, wie in den anhängigen US Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/955,050 , eingereicht am 21. Oktober 1997 mit dem Titel „Methods of using synthetic molecules and target sequences"; 08/955,859 , eingereicht am 21. Oktober 1997, mit dem Titel „Synthetic molecules that specifically react with target sequences" und 08/955,206 , eingereicht am 21. Oktober 1997, mit dem Titel „Target sequences for synthetic molecules", beschrieben. Das Markieren kann dann durch Inkubation des Peptids mit dem fluoreszierenden Bindungspartner, der in der Lage ist, die Membran zu durchdringen, erzielt werden, was die Vorteile aufweist, dass die Expression von Peptiden innerhalb von intakten, lebenden Zellen ermöglicht wird und dass das darauffolgende Markieren dieser Peptide in situ, um optische Sonden innerhalb von intakten, lebenden Zellen zu bilden, möglich ist.
  • Fluoreszierende Proteine
  • Für manche Anwendungen auf Zellbasis schließen bevorzugte fluoreszierende Gruppen endogene fluoreszierende Proteine, funktional manipulierte fluoreszierende Proteine und deren Homologe ein. Da der gesamte Fluorophor und das gesamte Peptid innerhalb von intakten, lebenden Zellen ohne Hinzufügen von anderen Co-Faktoren oder Fluorophoren exprimiert werden kann, verleihen solche optischen Sonden die Fähigkeit, Proteinphosphorylierungsaktivitäten innerhalb von definierten Zellpopulationen, Geweben oder einem gesamten transgenen Organismus zu überwachen. Dazu dient zum Beispiel die Verwendung von induzierbaren Kontroll-Nukleotidsequenzen, um einen plötzlichen Anstieg bei der Expression der optischen Sonde und geeigneter Protease zu erreichen. Endogene fluoreszierende Proteine wurden isoliert und aus einer Anzahl an Meereslebewesen kloniert, einschließlich der Weichkorallen Renilla reniformis, R. kollikeri und R. mullerei und aus den Seefedern Ptilosarcus, stylatula und Acanthoptilum, ebenso wie aus der Qualle aus dem Pazifischen Ozean Aequorea victoria (Szent-Gyorgyi et al. (SPIE Konferenz 1999), D.C. Prasher et al., Gene, 111: 229–233 (1992)). Diese Proteine sind in der Lage, ein hoch fluoreszierendes, intrinsisches Chromophor durch die Zyklisierung und Oxidation von inneren Aminosäuren innerhalb des Proteins zu bilden, die spektral von schwach fluoreszierenden Aminosäuren wie Tryptophan und Tyrosin gelöst werden können.
  • Zusätzliche fluoreszierende Proteine wurden ebenfalls in anderen Organismen beobachtet, obwohl sie in den meisten Fällen das Hinzufügen von exogenen Faktoren benötigen, um eine Fluoreszenzentwicklung möglich zu machen. Das Klonieren und die Expression von gelb fluoreszierendem Protein aus dem Stamm Vibrio Fischeri Y-1 wurde zum Beispiel von T.O. Baldwin et al., Biochemistry (1990) 29: 5509–15, beschrieben. Dieses Protein benötigt Flavine als fluoreszierende Kofaktoren. Die Klonierung von Peridinin-Chlorophyll-a bindendem Protein aus dem Dinoflagellaten Symbiodinium sp. wurde von B.J. Morris et al., Plant MolecularBiology, (1994) 24: 673:77 beschrieben. Ein nützlicher Aspekt dieses Proteins besteht darin, dass es rot fluoresziert. Die Klonierung von Phycobili-Proteinen aus maritimen Cyanobakterien wie Synechococcus, z.B. Phycoerythrin und Phycocyanin wird in S.M. Wilbankset al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 1226–35 beschrieben. Diese Proteine benötigen Phycobiline als fluoreszierende Kofaktoren, für deren Einbau in die Proteine wiederum Hilfsenzyme erforderlich sind. Die Proteine fluoreszieren bei gelben bis roten Wellenlängen.
  • Eine Vielzahl an Mutanten des GFP aus Aequorea Victoria wurde gebildet, die im Vergleich zu dem nativen GFP unterschiedliche spektrale Eigenschaften, verbesserte Leuchtkraft und gesteigerte Expression und Faltung in Säugetierzellen aufweisen, Tabelle 7 (Green Fluorescent Proteins, Kapitel 2, Seiten 19 bis 47, Hrsg. Sullivan und Kay, Academic Press, US Patente Nr. 5,625,048 von Tsien et al., erteilt am 29. April 1997; 5,777,079 von Tsien et al., erteilt am 7. Juli 1998; und US Patent Nr. 5,804,387 von Cormack et al., erteilt am 8. September 1998). In vielen Fällen haben diese funktional manipulierten fluoreszierenden Proteine bessere spektrale Eigenschaften als Wildtyp GFP aus Aequorea und sind für die Verwendung in den optischen Sonden der Erfindung bevorzugt.
    Tabelle 7
    Mutationen allgemeine Bezeichnung Quantum Ertrag (Φ) & Molare Extinktion (ε) Max. Anregung und Emission Relative Fluoreszenz bei 37° C Empfindlichkeit gegenüber niedrigem pH% max. F bei pH 6
    S65 Typ
    S65T, S72A, N149K, M153T, I167T Emerald Φ = 0,68 ε = 57.500 487 509 100 91
    F64L, S65T, V163A Φ = 0,58 ε = 42.000 488 511 54 43
    F64L, S65T (EGFP) EGFP Φ = 0,60 ε = 55.900 488 507 20 57
    S65T Φ = 0,64 ε = 52.000 489 511 12 56
    Y66H Typ
    F64L, Y66H, Y145F, V163A P4-3E Φ = 0,27 ε = 22.000 384 448 100 N.D.
    F64L, Y66H, Y145F Φ = 0,26 ε = 26.300 383 447 82 57
    Y66H, Y145F P4-3 Φ = 0,3 ε = 22.300 382 446 51 64
    Y66H BFP Φ = 0,24 ε = 21.000 384 448 15 59
    Y66W Typ
    S65A, Y66W, S72A N146I, M153T, V163A W1C Φ = 0,39 ε = 21.200 435 495 100 82
    F64L, S65T, Y66W, N146I, M153T, V163A W1B Φ = 0,4 ε = 32.500 434 452 476 (505) 80 71
    Y66W, N146I, M153T, V163A hW7 Φ = 0,42 ε = 23.900 434 452 476 (505) 61 88
    Y66W 436 485 N.D. N.D.
    T203Y Typ
    S65G, S72A, K79R, T203Y Topaz Φ = 0,60 ε = 94.500 514 527 100 14
    S65G, V68L, S72A T203Y 10C Φ = 0,61 ε = 83.400 514 527 58 21
    S65G, V68L, Q69K S72A, T203Y h10C+ Φ = 0,71 ε = 62.000 516 529 50 54
    S65G, S72A, T203H Φ = 0,78 ε = 48.500 508 518 12 30
    S65G, S72A, T203F Φ = 0,70 ε = 65.500 512 522 6 28
    T2031 Typ
    T203I, S72A, Y145F Sapphire Φ = 0,64 ε = 29.000 395 511 100 90
    T203I T202F H9 Φ = 0,6 ε = 20.000 395 511 13 80
  • Zellbasierte Assays
  • Die rekombinante Herstellung von optischen Sonden im Inneren von lebenden Zellen schließt Exprimieren von Nukleinsäuren mit Sequenzen, die für das fluoreszierende Protein und Substratpeptid als ein Fusionsprotein kodieren, ein. in einer unten beschriebenen Ausführungsform umfasst die optische Sonde ein erstes fluoreszierendes Protein, ein Peptid, das ein Proteinphosphorylierungs-Erkennungsmotiv und eine Proteasestelle und ein zweites fluoreszierendes Protein, die als eine einzige Polypeptidkette miteinander fusioniert sind. Nukleinsäuren, die für fluoreszierende Proteine kodieren, können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren erhalten werden. So kann zum Beispiel eine Nukleinsäure, die für das Protein kodiert, durch Polymerase-Kettenreaktion von cDNA aus einem geeigneten Organismus, der Primer auf Basis der DNA-Sequenz des Fluoreszenzproteins verwendet, isoliert werden. PCR-Verfahren werden zum Beispiel in US Patent Nr. 4,683,195 ; Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; und Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).
  • Geeignete, die optischen Sonden der Erfindung exprimierende Klone können dann identifiziert, isoliert und durch Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting, FACS) charakterisiert werden, wodurch typischerweise die Analyse von ein paar Tausend Zellen pro Sekunde ermöglicht wird.
  • Die Konstruktion von Expressionsvektoren und die Expression von Genen in transfizierte Zellen schließt die Verwendung von molekularen Klonierungstechniken, die im Stand der Technik ebenfalls hinreichend bekannt sind, ein. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) und Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., (Current Protocols, ein Joint Venture zwischen Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., (neueste Beilage). Nukleinsäuren, die für die Transfektion von Zellen mit Sequenzen, die für die Expression des Polypeptids von Interesse klonieren, verwendet werden, sind im Allgemeinen in Form eines Expressionsvektor, einschließlich Sequenzen zur Expressionskontrolle, operativ mit einer für die Expression des die optische Probe enthaltenden Polypeptids kodierenden Nukleotidsequenz verbunden.
  • Messverfahren
  • Verfahren die mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, schließen die Folgenden ein: Fluoreszenzspektroskopie, Lumineszenzspektroskopie, Absorptionsspektroskopie und magnetische Detektion.
  • Fluoreszenzverfahren, die mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, schließen kontinuierliche oder zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, Fluoreszenz-Polarisierungs-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie auf Basis von Resonanzenergie ein. Verfahren für das Durchführen solcher Assays an fluoreszierenden Materialien sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und werden z.B. in Lakowicz, J.R., Topics in Fluorescence Spectroscopy, Bänder 1 bis 3, New York: Plenum Press (1991); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Celisin Culture, Part B, Methods in Cell Biology, Bd. 30, Ed. Taylor, D.L. & Wang, Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), S. 219–243; Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), S. 296–361 beschrieben. Die Auswahl und Verwendung von spezifischen Fluorophoren oder Quenchern für bestimmte Anwendungen ist im Stand der Technik bekannt, siehe z.B. Berlman, I.B. Energy transfer parameters of aromatic compounds, Academic Press, New York and London (1973), das Tabellen mit spektralen Überlappungsintegralen für die Auswahl von Resonanzenergie-Transferpartnern enthält. Zusätzliche Informationsquellen schließen den Molecular Probes Catalog, 1999; und Tsien et al., 1990 Handbook of Biological Confocal Microscopy S. 169–178, ein,
  • ASSAYS, DIE OPTISCHE SONDEN VERWENDEN
  • Verfahren um zu bestimmen, ob eine Probe eine Aktivität aufweist, schließen typischerweise das Kontaktieren der Probe mit einer optischen Sonde, Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, welche die Proteinphosphorylierung des Substrats ermöglichen und anschließendes Hinzufügen einer Protease ein. Schließlich wird der Grad der Proteinphosphorylierungsaktivität in der Probe durch das Bestimmen von mindestens einer optischen Eigenschaft der optischen Sonde oder einem Produkt derselben detektiert. In manchen Fällen können die optische Sonde und die Protease gleichzeitig zu einer Probe hinzugefügt werden. Alternativ würde das Verfahren im Falle, dass die Probe Zellen enthält, typischerweise die Stimulierung der Zellen einschließen und anschließend entweder das Lysieren der Zellen in Anwesenheit des Substrats oder im Falle, dass das Substrat innerhalb der Zellen exprimiert wird, Lysieren der Zellen in Anwesenheit einer Protease zur Messung von Substratmodifikation beinhalten. Das zur Bestimmung des Grades der Proteinphosphorylierungsaktivität verwendete Verfahren hängt von dem verwendeten Assay-Format ab.
  • Gemäß einem Aspekt kann das Verfahren auf dem Unterschied bei der Fluoreszenzanisotropie der optischen Sonde vor und nach der Spaltung mit einer Protease basieren. In diesem Fall umfasst die optische Sonde typischerweise eine Polypeptidgruppe, die ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Proteasestelle, die an eine Sondengruppe gekoppelt ist, enthält (1). Die Modifikation des Polypeptids durch die Proteinphosphorylierungsaktivität führt zu einer Modulation der Geschwindigkeit mit der die Protease das Polypeptid spaltet, was durch eine messbare Veränderung bei der Fluoreszenz-Polarisierung der optischen Sonde nach Spaltung bestimmt wird.
  • Polarisierungsmessungen basieren auf der relativen Rotationsbewegung des Fluorophors verglichen mit der Lebensdauer dieses Fluorophors im angeregten Zustand. Bei globulären Molekülen in verdünnten Lösungen kann das Verhältnis zwischen Polarisierung (p) und dem Grad der Rotationsbewegung einfach abgeleitet werden (siehe Weber, Polarization of the fluorescence of solutions, in Fluorescence and Phosphorescence Analysis, Don Hercules (ed.), Interscience Publishers New York. Kapitel 8, Seiten 217–240 (1966)). Rotationsbewegungen können mit der Rotations-Diffusionskonstante des Moleküls in Verbindung stehen und damit auch mit dem molekularen Volumen. In der Praxis gibt es einen engen Zusammenhang zwischen der molekularen Größe und der relativen Polarisierung von ausgestrahltem Licht von einem Fluorophor. Als eine Folge kann eine signifikante Änderung bei der Fluoreszenz-Polarisierung stattfinden, wenn auf die optischen Sonden der vorliegenden Erfindung durch eine Protease eingewirkt wird. Messungen auf der Basis von Polarisierungen können relativ einfach eingestellt und für einen großen Bereich an Konzentrationen, Temperaturen und ionischer Stärken erhalten werden.
  • In einer Ausführungsform dieses Verfahren können die Messungen der Fluoreszenzanisotropie durch Verbinden eines Endes des Peptids mit einer festen Matrix oder einem Kügelchen verbessert werden. In beiden Fällen führt die Spaltung der optischen Sonde zu einem größeren Abfall bei der Fluoreszenz-Polarisierung auf Grund der erhöhten Rotationsflexibilität der optischen Sonde, sobald diese von der soliden Matrix oder dem Kügelchen getrennt wurde.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt nützt die vorliegende Erfindung den Transfer von Resonanzenergie, und zwar entweder zwischen zwei fluoreszierenden Gruppen (FRET) oder einer biolumineszenten Gruppe und einer fluoreszierenden Gruppe (Bioluminescent resonance energy transfer, BRET) oder einer fluoreszierenden Gruppe und einem Quencher (Resonanzenergie-Transfer, RET) um eine Fluoreszenzdetektion zu ermöglichen.
  • Bei FRET-Anwendungen umfasst die optische Sonde typischerweise eine erste fluoreszierende Gruppe und eine zweite fluoreszierende Gruppe, die so an das Polypeptid gekoppelt ist, dass das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle sich zwischen ihnen befinden (1). In diesem Fall führt die Spaltung des Polypeptids durch eine Protease zu einer Änderung bei dem Energietransfer zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und der zweiten fluoreszierenden Gruppe, was verwendet werden kann, um Proteinphosphorylierungsaktivität zu bestimmen. In diesem Fall werden die fluoreszierenden Gruppen typischerweise so ausgewählt, dass das Anregungsspektrum einer der Gruppen (die fluoreszierende Gruppe, die als Akzeptor dient) mit dem Emissionsspektrum der fluoreszierenden Gruppe, die als Donor dient, überlappt. Die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe wird durch Licht von angemessener Intensität innerhalb des Anregungsspektrums der als Donor dienenden fluoreszierenden Gruppe und unter Bedingungen, unter denen die direkte Anregung des Akzeptor-Fluororphors minimiert ist, angeregt. Die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe transferiert dann die absorbierte Energie durch nicht radiative Mittel an den Akzeptor, der im Folgenden einen Teil der absorbierten Energie als Fluoreszenzemission bei einer charakteristischen Wellenlänge wieder abgibt. FRET kann sich als eine Reduzierung der Intensität des fluoreszierenden Signals von dem Donor, Reduzierung in der Lebensdauer seines angeregten Zustands und einer Erhöhung bei der Fluoreszenzemission von der fluoreszierenden Gruppe des Akzeptors zeigen. Wenn das Peptidsubstrat, das die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe und die als Akzeptor dienende fluoreszierende Gruppe verbindet, gespalten wird, trennen sich die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe und die als Akzeptor dienende fluoreszierende Gruppe physikalisch und FRET wird reduziert oder findet nicht mehr statt. Unter diesen Umständen steigt die Fluoreszenzemission des Donors und die Fluoreszenzemission des Akzeptors sinkt.
  • Die Effizienz von FRET hängt von der Trennungsdistanz und der Orientierung der als Donor dienenden Fluoreszenzgruppe und der als Akzeptor dienend Fluoreszenzgruppe, der Fluoreszenz-Quantenausbeute der als Donor dienenden Gruppe und der Energieüberlappung mit der als Akzeptor dienenden Gruppe ab. Foster hat das Verhältnis folgendermaßen abgeleitet: E = (Fo – F)/Fo = R0 6/(R6 + R0 6)worin E für die Effizienz von FRET steht, F und Fo die Fluoreszenzintensität des Donors jeweils in Anwesenheit und Abwesenheit des Akzeptors beschreiben und R für die Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor steht. R0, der Abstand bei dem die Effizienz des Energietransfers bei 50 % des Maximums liegt, ist (in Å) durch R0 = 9.79 × 103(K2QJn–4)1/6 angegeben, worin K2 ein Orientierungsfaktor mit einem Durchschnittswert ist, der annähernd 0,67 für frei mobile Donoren und Akzeptoren beträgt; Q für die Quantenausbeute des ungelöschten Donors steht, n der Brechungsindex des intervenierenden Mediums ist und J für das Überlappungsintegral, das den Grad der spektralen Überlappung quantitativ ausdrückt, steht, J = oo 0 F 4d/oo 0 F dworin das molare Absorptionsvermögen des Akzeptors in M–1cm–1 ist und F für die Donorfluoreszenz bei Wellenlänge gemessen in cm steht. Forster, T. (1948) Ann.Physik 2: 55–75. Der charakteristische Abstand R0, bei dem FRET eine Effizienz von 50 % aufweist, hängt von der Quantenausbeute des Donors, dem Extinktionskoeffizienten des Akzeptors, der Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Donors und dem Anregungsspektrum des Akzeptors und dem Orientierungsfaktor zwischen den beiden Fluorophoren ab.
  • Vorzugsweise werden Änderungen bei dem FRET-Grad als eine Funktion der Änderung in dem Verhältnis der Menge an Fluoreszenz von den als Donor und Akzeptor dienenden Gruppen bestimmt, wobei dieser Prozess "rationing" genannt wird. Durch Berechnen des Verhältnisses ist der Assay unempfindlich gegenüber Schwankungen bei der Substratkonzentration, wobei Bleichen durch starke Lichteinstrahlung und Anregungsintensität den Assay stabiler machen. Dies ist bei automatisierten Screening-Anwendungen, bei denen die Qualität der produzierten Daten für die nachfolgende Analyse und Interpretation von Bedeutung ist, besonders wichtig.
  • Eine in Betracht gezogene Variation des oben genannten Assays besteht darin, die optische Sonde entweder in lebende eukaryotische oder prokaryotische Zellen einzuführen oder zu exprimieren, um so die Messung von intrazellulären, posttranslationalen Aktivitäten zu ermöglichen.
  • Gemäß einem Aspekt schließt das Verfahren eine optische Sonde ein, die ein erstes fluoreszierendes Protein, ein Peptid, das ein Proteinphosphorylierungs-Erkennungsmotiv und eine Proteasestelle enthält, und ein zweites Fluoreszenzprotein, die als eine einzige Polypeptidkette miteinander fusioniert sind, umfasst. In diesem Fall würden das erste Fluoreszenzprotein und das zweite Fluoreszenzprotein ausgewählt um zu ermöglichen, das FRET wie oben beschrieben stattfindet. Wobei ein bevorzugtes Paar an funktional manipulierten für Fluoreszenzprotein zum Beispiel Topaz (S65G, S72A, K79R, T203Y) und W1B (F64L, S65T, Y66W, N146I, M153T, V163A) ist (Tabelle 7).
  • Gemäß einem anderen Aspekt schließt das Verfahren eine optische Sonde ein, die ein Peptid, das eine oder mehr als eine Bindungsstelle für eine fluoreszierende Gruppe, ein Erkennungsmotiv für posttranslationale Modifikation und eine Proteasestelle umfasst. Zum Beispiel kann die Bindungsstelle eine Sequenz umfassen, die eine fluoreszierende Gruppe erkennt, wie in den anhängigen US Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/955,050 , eingereicht am 21. Oktober 1997 mit dem Titel „Methods of using synthetic molecules and target sequences"; 08/955,859 , eingereicht am 21. Oktober 1997, mit dem Titel „Synthetic molecules that specifically react with target sequences" und 08/955,206 , eingereicht am 21. Oktober 1997, mit dem Titel „Target sequences for synthetic molecules", beschrieben. In diesem Fall kann die Expression des Peptids, das das posttranslationale Erkennungsmotiv, die Proteasestelle und die Bindungsstelle umfasst, unter Verwendung von genetischen Mitteln wie oben beschrieben erzielt werden. Das Hinzufügen eine fluoreszierenden Gruppe zur Verbesserung der Permeationsfähigkeit durch Membranen, wobei diese Gruppe in der Lage ist, an die Bindungsstelle zu binden, würde die in situ Bildung einer optischen Sonde ermöglichen.
  • In beiden Fällen soll eine in Betracht gezogene Version des Verfahrens induzierbare Kontroll-Nukleotidsequenzen verwenden, um einen plötzlichen Anstieg entweder bei der Expression der optischen Sonde oder der posttranslationalen Aktivität, die untersucht werden, zu bewirken, z.B. durch Induktion der Expression des Konstrukts. Eine geeignete Protease könnte in der Zelle exprimiert oder induziert oder in die Zelle eingeführt werden, und zwar unter Verwendung einer membrane translocating sequence wie in US Patent Nr. 5,807,746 , erteilt am 15. September 1998 an Lin et al. beschrieben. Die Effizienz von FRET wird typischerweise bei einem oder mehr als einem Zeitintervall nach dem Auftreten der gesteigerten Expression der Protease überprüft.
  • Gemäß einem anderen Aspekt würde das Verfahren die Einführung einer optischen Sonde der vorliegenden Erfindung in die Zelle durch die Verwendung einer membrane translocating sequence wie hierin beschrieben, einschließen.
  • Bei BRET-Anwendungen umfasst die optische Sonde typischerweise eine lumineszierende Gruppe und eine fluoreszierende Gruppe, die so an das Polypeptid gekoppelt ist, dass das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle sich zwischen ihnen befinden (1). In diesem Fall führt die Spaltung des Polypeptids durch eine Protease zu einer Änderung bei dem Energietransfer zwischen der lumineszierenden Gruppe und der fluoreszierenden Gruppe, was verwendet werden kann, um Aktivitäten vom posttranslationalen Typ zu bestimmen. In diesem Fall werden die lumineszierenden und die fluoreszierenden Gruppen typischerweise so ausgewählt, dass das Emissionsspektrum der lumineszierenden Gruppe mit dem Anregungsspektrum der fluoreszierenden Gruppe überlappt. Da die lumineszierende Gruppe Licht durch eine chemilumineszierende, elektrolumineszierende oder biolumineszente Reaktion zur Verfügung stellt, besteht kein Bedarf für direkte Lichtanregung, um den angeregten Zustand in der lumineszierenden Gruppe hervorzurufen. Stattdessen müssen der lumineszierenden Gruppe geeignete Substrate oder geeignete Spannung bereit gestellt werden, um die Schaffung eines angeregten Zustands innerhalb der lumineszierenden Gruppe zu ermöglichen. Im Falle von biolumineszenten Proteinen wird auf solche Substrate im Allgemeinen als Luciferine Bezug genommen (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5,650,289 , erteilt am 22. Juli 1997 an Wood). Findet BRET statt, wird die Energie von dem angeregten Zustand der lumineszierenden Gruppe durch nicht radiative Mittel auf die fluoreszierende Gruppe übertragen und nicht in Form von Licht von der lumineszierenden Gruppe ausgesandt. Da die lumineszierenden und fluoreszierenden Gruppen bei charakteristischen Wellenlängen Licht aussenden, kann das Emissionsverhältnis der beiden eine ratiometrische Ablesung ergeben, wie für die Anwendungen auf Basis von FRET beschrieben. BRET kann sich als eine Reduzierung der Intensität des fluoreszierenden Signals von der lumineszierenden Gruppe, Reduzierung in der Lebensdauer ihres angeregten Zustands und einer Erhöhung bei der Fluoreszenzemission von der fluoreszierenden Gruppe zeigen. Wenn das Peptidsubstrat, das die lumineszierende Gruppe und die fluoreszierende Gruppe verbindet, gespalten wird, trennen sich die lumineszierende Gruppe und die fluoreszierende Gruppe physikalisch und BRET wird reduziert oder eingestellt. Unter diesen Umständen steigt die Lichtemission von der lumineszierenden Gruppe und die Fluoreszenzemission von der fluoreszierenden Gruppe sinkt. Die Effizienz von BRET hängt von denselben Trennungs- und Orientierungsfaktoren wie oben für FRET beschrieben ab.
  • Bei RET-Anwendungen umfasst die optische Sonde typischerweise eine erste fluoreszierende Gruppe und eine Quenchergruppe, die so an das Polypeptid gekoppelt ist, dass das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle sich zwischen ihnen befinden (1). In diesem Fall führt die Spaltung des Polypeptids durch eine Protease zu einer Änderung bei dem Energietransfer zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und der Quenchergruppe, was verwendet werden kann, um posttranslationale Aktivität zu bestimmen. in diesem Fall werden die fluoreszierende Gruppe und die Quenchergruppe typischerweise so ausgewählt, dass das Absorptionsspektrum eines der Quencher (die als Akzeptor dienende Gruppe) mit dem Emissionsspektrum der fluoreszierenden Gruppe, die als Donor dient, überlappt. Die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe wird durch Licht von geeigneter Intensität innerhalb des Anregungsspektrums der als Donor dienenden fluoreszierenden Gruppe angeregt. Anschließend transferiert die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe die absorbierte Energie durch nicht radiative Mittel an den Quencher, der in diesem Fall keine absorbierte Energie als Licht wieder abgibt. RET kann sich als Reduktion in der Intensität der fluoreszierenden Signale von dem Donor oder als Reduktion bei der Lebensdauer des angeregten Zustands manifestieren. Wenn das Peptidsubstrat, das die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe und die Quenchergruppe verbindet, gespalten wird, trennen sich die als Donor dienende fluoreszierende Gruppe und Quenchergruppe physikalisch und RET wird reduziert oder eingestellt. Unter diesen Umständen steigt die Fluoreszenzemission von der fluoreszierenden Gruppe an.
  • Die Assays zur Modifikation der Proteinphosphorylierung der vorliegenden Erfindung können bei Screening-Assays von Medikamenten verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche eine Proteinphosphorylierungsaktivität verändern. In einer Ausführungsform wird der Assay in vitro an einer Probe ausgeführt (z.B. in einer Probe, die von einer Zelle oder einem Zelllysat oder gereinigtem Enzym isoliert wurde). Eine Probe, die eine bekannte Menge von Aktivität enthält, wird mit einer optischen Sonde der Erfindung und mit einer Testchemikalie gemischt. Die Menge der Aktivität in der Probe wird dann nach Hinzufügen einer Protease wie hierin beschrieben bestimmt, zum Beispiel durch Bestimmen von mindestens einer optischen Eigenschaft der Sonde. Dann wird die optische Eigenschaft der Probe in Anwesenheit der Testchemikalie mit der optischen Eigenschaft der Probe in Abwesenheit der Testverbindung verglichen. Ein Unterschied zeigt an, dass die Testverbindung Auswirkungen auf die Aktivität hat.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Fähigkeit einer Testchemikalie, eine Proteinphosphorylierungsaktivität zu beeinflussen, in einem zellbasierten Assay bestimmt werden. In diesen Assays werden Zellen, die mit einem für eine optische Sonde der Erfindung kodierenden Expressionsvektor, wie oben beschrieben, transfiziert werden, unterschiedlichen Mengen der Testchemikalie ausgesetzt und die Wirkung auf FRET oder Fluoreszenzpolarisierung in jeder Zelle kann nach Induktion oder Einführung einer geeigneten Protease bestimmt werden. Typischerweise wird der Unterschied bei FRET oder Polarisierung von behandelten Zellen mit jenem von unbehandelten Kontrollen verglichen, so wie dies bei jedem beliebigen Verfahren der vorliegenden Erfindung der Fall ist.
  • Zusätzlich können Bibliotheken von optischen Sonden durch Herstellen von eine unterschiedliche Population von Aminosäuresequenzen enthaltenden Peptiden geschaffen werden. Solche Bibliotheken sind nützlich für die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Proteinphosphorylierungsaktivitäten, die unbekannte oder schlecht definierte Substratspezifitäten aufweisen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „Bibliothek" auf eine Sammlung, die mindestens 5 verschiedene Bestandteile umfasst, vorzugsweise mindestens 100 verschiedene Bestandteile und noch bevorzugter mindestens 200 verschiedene Bestandteile umfasst. Die Aminosäuresequenzen für das Peptid befinden sich typischerweise im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren in der Länge und können vollkommen zufällig sein oder aber sie tendieren zu einer bestimmten Sequenz auf Grund eines bestimmten strukturellen Motivs, zum Beispiel auf Grund eines bekannten Substrats für eine bestimmte Proteinphosphorylierungsaktivität. In manchen Fällen ist die Bibliothek genetisch erstellt und die einzelnen Bestandteile werden in bakterielle Zellen oder Zellen von Säugetieren exprimiert. Geeignete, die optischen Sonden der Erfindung exprimierende Klone können dann identifiziert, isoliert und durch Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting, FACS) charakterisiert werden, was üblicherweise die Analyse von ein paar Tausend Zellen pro Sekunde ermöglicht. Alternativ können die Peptide chemisch synthetisierte und individuelle an eine feste Matrix gebundene Bestandteile und innerhalb einer zweidimensionalen Anordnung angeordnet sein.
  • Typischerweise enthält die Bibliothek unterschiedliche Peptide, wobei nur einige wenige Aminosäurepositionen variieren, z.B. von einer bis zehn, wobei aber die Wahrscheinlichkeit von Substitutionen sehr hoch ist. Typischerweise hat jeder Bestandteil der Bibliothek von optischen Sonden eine einzige, definierte Proteasestelle und ein variables Proteinphosphorylierungs-Erkennungsmotiv, sodass zufällige Sequenzen mit den Ausgestaltungsvoraussetzungen für die bestimmte Proteinphosphorylierungsaktivität (wie oben beschrieben) übereinstimmen. In einer Ausführungsform schließt die Anordnung systematisch substituierte Aminosäuren ein, die an ein Substrat wie in US Patent Nr. 5,770,456 , erteilt am 23. Juni, 1998 an Holmes, beschrieben, gebunden sind.
  • Screenen der Bibliothek zur Identifizierung von optimalen Substraten kann durch Inkubation der Anordnung mit einer die Proteinphosphorylierungsaktivität enthaltende Probe, Hinzufügen einer geeigneten Protease und anschließendes Detektieren von mindestens einer optischen Eigenschaft von jedem Bestandteil der Bibliothek. Jene Bibliotheksbestandteile, die effizienter durch die Proteinphosphorylierungsaktivität modifiziert werden, können dann durch den Grad identifiziert werden, bei dem die optische Eigenschaft jedes Bibliotheksbestandteils nach Kontakt mit der Proteinphosphorylierungsaktivität modifiziert wird.
  • Alternativ können Bibliotheken von bekannten Erkennungsmotiven erstellt werden, um ein Aktivitätsprofil von Proteinphosphorylierungsaktivitäten in einer Probe zu erstellen. In diesem Fall wird Screenen der Bibliothek zur Charakterisierung der relativen Proteinphosphorylierungsaktivitäten durch Inkubation der Anordnung mit einer die Proteinphosphorylierungsaktivitäten enthaltenden Probe, Hinzufügen einer geeigneten Protease und anschließendem Detektieren von mindestens einer optischen Eigenschaft von jedem Bestandteil der Bibliothek verwendet. Jene Bibliotheksbestandteile, die nach Kontakt mit der Probe effizienter modifiziert werden, können dann durch den Grad identifiziert werden, zu dem die optische Eigenschaft jedes Bibliotheksbestandteils nach Kontakt mit der Probe modifiziert wird, um die Proteinphosphorylierungsaktivität innerhalb der Probe zu bestimmen.
  • EIN SYSTEM FÜR SPEKTROSKOPISCHE MESSUNG
  • Die optischen Sonden der vorliegenden Erfindung können mit zahlreichen Systemen für spektrometrische Messungen verwendet werden. In einer Ausführungsform umfasst das System das Folgende: ein Reagenz für einen Assay und eine Vorrichtung, die mindestens eine Platte oder einen Behälter, vorzugsweise eine Multiwell-Plattform und eine zweite Plattform, um die Platte oder den Behälter für die Detektion eines Signals aus der Probe zu halten. Das System kann des Weiteren einen Detektor, wie einen für das Detektieren eines Signals aus einer Probe oder einer Platte auf/in einem Behälter geeigneten Detektor, da solche Detektoren im Stand der Technik bekannt sind oder später entwickelt werden. Das System kann multiple Platten oder Behälter oder Multiwell-Plattformen umfassen. In diesem Zusammenhang schließt ein Reagens für einen Assay jedes beliebige Reagens ein, das benutzt werden kann um biochemische oder biologische Testverfahren in vitro oder in vivo durchzuführen, wie zum Beispiel Puffer, Kofaktoren, Proteine wie Enzyme oder Proteasen, Kohlenwasserstoffe, Lipide, Nukleinsäuren, aktive Fragmente derselben, organische Lösungsmittel wie DMSO, Chemikalien, Analyte, Therapeutika, Zusammensetzungen, Zellen, Antikörper, Liganden und dergleichen.
  • In diesem Zusammenhang handelt es sich bei einem aktiven Fragment um einen Teil eines Reagens, das im Wesentlichen die Aktivität des Elterreagens aufweist. Die Wahl an optischen Sonden hängt von der Art des durchzuführenden Assays ab. Assays auf FRET Basis umfassen zum Beispiel typischerweise eine optische Sonde mit zwei Fluorophoren. Assays auf der Basis von fluoreszierender Polarisierung werden typischerweise mit optischen Sonden, die eine fluoreszierende Gruppe umfassen, ausgeführt (1).
  • Die optischen Sonden der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung mit Systemen und Verfahren, die automatisierte und integrierbare Arbeitsstationen zur Identifizierung von Modulatoren und Chemikalien mit nützlichen Aktivitäten verwenden, geeignet. Solche Systeme sind im Stand der Technik im Allgemeinen beschrieben (siehe US Patente Nr. 4,000,976 an Kramer et al. (erteilt am 4. Januar 1977), 5,104,621 an Pfost et al. (erteilt am 14. April 1992), 5,125,748 an Bjornson et al. (erteilt am 30. Juni 1992), 5,139,744 an Kowalski (erteilt am 18. August 1992), 5,206,568 Bjornson et al. (erteilt am 27. April 1993), 5,350,564 an Mazza et al. (27. September 1994), 5,589,351 an Harootunian (erteilt am 31. Dezember 1996), und PCT Anmeldungen WO 93/20612 an Baxter Deutschland GMBH (veröffentlicht am 14. Oktober 1993), WO 96/05488 an McNeil et al. (veröffentlicht am 22. Februar 1996), WO 93/13423 an Agong et al. (veröffentlicht am 8. Juli 1993) und PCT/US98/09526 an Stylli et al., eingereicht am 14. Mai 1998).
  • Typischerweise schließt ein solches System folgendes ein: A) ein Modul zur Lagerung und zum Wiederauffinden, das Lagerorte für das Lagern einer Vielzahl an Chemikalien in Lösung in adressierbaren Wells, einen chemischen Well-Wiederauffinder umfasst und programmierbare Auswahl und Wiederfinden der adressierbaren Wells und Lagerkapazität für mindestens 100.000 adressierbare Wells aufweist, B) ein Modul zur Probenverteilung, das einen Flüssigkeitsanwender umfasst, um Lösungen von ausgewählten chemischen Wells anzusaugen oder zu dispensieren, wobei das Modul zur chemischen Verteilung eine programmierbare Auswahl und Ansaugung von den ausgewählten adressierbaren chemischen Wells aufweist und programmierbare Verteilung in gewählte adressierbare Proben-Wells (einschließlich Verteilung in Anordnungen von adressierbaren Wells mit unterschiedlicher Dichte von adressierbaren Wells pro Quadratzentimeter) oder an Stellen, vorzugsweise zuvor ausgewählten Stellen, auf der Platte, C) einen Probentransporter, um die ausgewählten adressierbaren chemischen Wells zu dem Proben-Verteilungs-Modul zu befördern, wobei der Transporter optional den Transports zu den ausgewählten adressierbaren chemischen Wells oder Stellen auf einer Platte programmierbar steuern kann (einschließlich adaptives Routing und paralleles Verarbeiten), D) ein Reaktionsmodul, das entweder einen Reagent Dispenser zum Verteilen von Reagens in die ausgewählten adressierbaren Proben-Wells oder Stellen auf einer Platte oder einen fluoreszierenden Detektor für die Detektion von chemischen Reaktionen in den ausgewählten adressierbaren Proben-Wells oder Stellen auf einer Platte und ein Modul zur Datenverarbeitung und -Integration aufweist.
  • Das Modul für Lagerung und Wiederauffinden, das Modul für die Verteilung von Proben und das Reaktionsmodul werden von dem Modul für Datenverarbeitung und -integration integriert und programmierbar gesteuert. Das Modul für Lagerung und Wiederauffinden, das Modul für die Verteilung von Proben, das Modul für den Transport von Proben, das Reaktionsmodul und das Modul für Datenverarbeitung und -integration werden operabel verbunden um die schnelle Verarbeitung der adressierbaren Proben-Wells oder Stellen auf einer Platte zu erleichtern. Typischerweise können Vorrichtungen der Erfindung mindestens 100.000 adressierbare Wells oder Stellen auf einer Platte in einem Zeitraum von 24 Stunden verarbeiten. Diese Art von System ist in der PCT-Anmeldung WO/98/52047 von Stylli et al. mit dem Titel „Systems and method for rapidly identifying useful chemicals in liquid samples" beschrieben. "
  • Wenn erwünscht wird jedes einzelne Modul integriert und programmierbar gesteuert, um die schnelle Verarbeitung von flüssigen Proben zu vereinfachen, ebenso wie die operable Verbindung dazu dient, die schnelle Verarbeitung von flüssigen Proben zu vereinfachen. In einer Ausführungsform, sieht die Erfindung ein Reaktionsmodul vor, bei dem es sich um einen Fluoreszenzdetektor zur Überwachung von Fluoreszenz handelt. Der Fluoreszenzdetektor ist in andere Arbeitsstationen mit dem Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul integriert und operabel mit dem Probentransporter verbunden. Vorzugsweise entspricht der Fluoreszenzdetektor dem hierin beschriebenen Typ und kann für Epifluoreszenz verwendet werden. Andere Fluoreszenzdetektor, die mit dem Modul für Datenverarbeitung und -integration kompatibel sind und der Probentransporter, falls operable Verbindung mit dem Probentransporter gewünscht ist, können wie im Stand der Technik bekannt oder wie in Zukunft entwickelt verwendet werden. Für manche Ausführungsformen der Erfindung, vor allem für Platten mit 96, 192, 384 und 864 Wells pro Platte, sind Detektoren für die Integration in das System erhältlich. Solche Detektoren werden in US Patent 5,589,351 (Harootunian), US Patent 5,355,215 (Schroeder), US Patentanmeldung (Seriennummer anhängig) mit dem Titel „Detektor and Screening Device for Ion Channels", eingereicht am 17.7.1998, und PCT Patentanmeldung WO 93/13423 (Akong) beschrieben. Alternativ kann eine gesamte Platte unter Verwendung eines Imagers, wie zum Beispiel einem Molecular Dynamics Fluor-Imager 595 (Sunnyvale, CA), „gelesen" werden. Multiwell-Plattformen mit mehr als 864 Wells, einschließlich solche mit 3.456 Wells können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe zum Beispiel PCT Anmeldung PCT/US98/11061 , eingereicht am 2.6.1998. Diese Platten mit höherer Dichte machen miniaturisierte Assay-Volumen nötig, welche wiederum die Verwendung von hoch empfindlichen Assays, in denen keine Waschvorgänge durchgeführt werden müssen, erfordern. Die vorliegende Erfindung sieht solche Assays wie hierin beschrieben vor.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das System ein Verarbeitungssystem von Flüssigkeiten mit Mikrovolumen, das elektrokinetische Kräfte einsetzt, um die Bewegung von Flüssigkeiten durch Kanäle des Systems zu steuern, wie zum Beispiel in US Patent Nr. 5,800,690 erteilt am 1. September 1998 an Chow et al., Europäische Patentanmeldung EP 0 810 438 A2 eingereicht am 5. Mai 1997 von Pelc et al. und PCT Anmeldung WO 98/00231 eingereicht am 24. Juni 1997 von Parce et al. beschrieben. Diese Systeme verwenden Analysesysteme auf der Basis von „Chips", um massiv parallele miniaturisierte Analyse zur Verfügung zu stellen. Solche Systeme sind in jenen Fällen, die miniaturisierte Analyse erforderlich machen, bevorzugte Systeme für spektroskopische Messungen.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das System eine zweidimensionale Anordnung von optischen Sonden, die auf einem Substrate verteilt sind, umfassen, wie zum Beispiel in den US Patenten Nr. 4,216,245 erteilt am 5. August 1980 an Johnson, 5,721,435 erteilt am 24. Februar 1998 an Troll und 5,601,980 erteilt am 11. Februar 1997 an Gordon et al., beschrieben. Ein solches System stellt die Fähigkeit zur Verfügung, schnell eine große Anzahl an optischen Sonden und/oder eine große Anzahl an Proben in einem einfachen, miniaturisierten Hochdurchsatzverfahren zu untersuchen.
  • EIN VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG EINER CHEMIKALIE, EINES MODULATORS ODER EINES THERAPEUTIKUMS
  • Die optischen Sonden der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um ein Therapeutikum auf nützliche therapeutische Aktivität oder toxikologische Aktivität hin zu testen. Ein Therapeutikum wird durch Kontaktieren einer Testchemikalie, von der angenommen wird, dass sie eine modulierende Aktivität eines biologischen Prozesses oder Target mit einem biologischen Prozess oder Target auf einer Platte oder in einem Behälter, wie zumindest ein Well einer Multiwell-Plattform, aufweist, die auch eine optische Sonde umfasst. Die Testchemikalie kann Teil einer Bibliothek von Testchemikalien sein, die auf Aktivität, wie biologische Aktivität, hin untersucht wird. Die Bibliothek kann einzelne Bestandteile haben, die einzeln oder in Kombination getestet werden oder die Bibliothek kann aus einer Kombination von einzelnen Bestandteilen bestehen. Solche Bibliotheken können mindestens zwei Bestandteile, bevorzugt mehr als ungefähr 100 Bestandteile oder mehr als ungefähr 1000 Bestandteile, noch bevorzugter mehr als ungefähr 10.000 Bestandteile und am Bevorzugtesten mehr als ungefähr 100.000 oder 1.000.000 Bestandteile aufweisen. Nach geeigneter Inkubation der Probe mit der optischen Sonde wird eine Protease hinzugefügt und mindestens eine optische Eigenschaft (wie FRET oder Polarisierung) der Probe wird bestimmt und mit einer nicht behandelten Kontrolle verglichen. Ein möglicher Modulator wurde identifiziert, wenn die Probe, welche die Testchemikalie aufweist, erhöhten oder reduzierten FRET oder erhöhte oder reduzierte Polarisierung im Vergleich zu jener der Kontrolle oder des Hintergrund-Niveaus zeigt.
  • Der mögliche Modulator kann weiter charakterisiert und seine Struktur, Stärke, Toxikologie und Pharmakologie unter Verwendung hinreichend bekannter Verfahren untersucht werden. Die Struktur eines möglichen durch die Erfindung identifizierten Modulators kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, wie Massenspektroskopie bestimmt oder bestätigt werden. Im Falle von mutmaßlichen Modulatoren, die für längere Zeiträume gelagert wurden, können Struktur, Aktivität und Stärke des mutmaßlichen Modulators bestätigt werden.
  • In Abhängigkeit von dem für die Identifizierung eines möglichen Modulators verwendeten Systems, wird der mögliche Modulator mutmaßlich pharmakologische Aktivität aufweisen. Wird zum Beispiel gefunden, dass der mögliche Modulator eine beteiligte Proteintyrosinphosphatase hemmt, zum Beispiel bei in vitro T-Zellen-Proliferation, so hat der mögliche Modulator vermutlich pharmakologische Eigenschaften als ein Immunosuppressor oder Entzündungshemmer (siehe Suthanthiran et al., Am. J. Kidney Disease, 28: 159–172 (1996)). Solche Verknüpfungen sind im Stand der Technik in Zusammenhang mit mehreren Krankheitszuständen bekannt, und es wird erwartet, dass im Verlauf der Zeit immer mehr entdeckt werden. Geeignete bestätigende in vitro und in vivo Modelle für pharmakologische Aktivität, ebenso wie Toxikologie können basierend auf solchen Verknüpfungen ausgewählt werden. Die verwendeten optischen Sonden und Verfahren, die hierin beschrieben werden, ermöglichen die schnelle pharmakologische Untersuchung zur Bestimmung von Selektivität und Spezifität und Toxizität. Dies Daten können anschließen verwendet werden, um neue Kandidaten mit verbesserten Charakteristika zu entwickeln.
  • BIOVERFÜGBARKEIT UND TOXIKOLOGIE VON MÖGLICHEN MODULATOREN
  • Nach ihrer Identifizierung können mögliche Modulatoren mit Bezug auf Bioverfügbarkeit und toxikologische Wirkungen unter Verwendung von bekannten Verfahren (siehe Lu, Basic Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment, Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985); US Patente Nr. 5,196,313 an Culbreth (erteilt am 23. März 1993) und US Patent Nr. 5,567,952 an Benet (erteilt am 22. Oktober 1996)). Zum Beispiel kann die Toxikologie eines möglichen Modulators festgestellt werden, indem die in vitro Toxizität gegenüber einer Zelllinie, wie zum Beispiel einer Zelllinie von Säugetieren, d.h. Menschen bestimmt wird. Mögliche Modulatoren können zum Beispiel mit Gewebeextrakten, wie Leberpräparaten, wie mikrosomalen Präparaten behandelt werden, um gestiegene oder gesunkene toxikologische Eigenschaften der Chemikalie nach Verstoffwechslung durch einen ganzen Organismus zu bestimmen. Die Ergebnisse aus solchen Arten von Studien sind oft voraussagen was die toxikologischen Eigenschaften von Chemikalien in Tieren, wie Säugetieren, einschließlich Menschen betrifft.
  • Die toxikologische Aktivität kann unter Verwendung von Reportergenen, die während toxikologischer Aktivität oder durch Zelllyse (siehe WO 98/13343 , veröffentlicht am 2.4.1998) aktiviert werden. Bevorzugte Reportergene produzieren ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Translationsprodukt (wie zum Beispiel ein Grünes Fluoreszenzprotein (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5,625,048 an Tsien et al., erteilt am 29.4.1998; US Patent Nr. 5,777,079 an Tsien et al., erteilt am 7.7.1998; WO 96/23810 an Tsien, veröffentlicht am 8.8.1996; WO 97/28261 , veröffentlicht am 8.7.1997; PCT/US97/12410 , eingereicht am 16.7.1997; PCT/US97/14595 , eingereicht am 15.8.1997)) oder ein Translationsprodukt, das ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Produkt (wie zum Beispiel Beta-Lactamase (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5,741,657 an Tsien, erteilt am 21.4.1998 und WO 96/30540 , veröffentlicht am 3.10.1996)), produzieren kann, wie ein Produkt aus enzymatischem Abbau. In der vorliegenden Erfindung kann Zelllyse als eine Reduktion bei einem Fluoreszenzsignal von mindestens einem Photon-erzeugenden Wirkstoff innerhalb einer Zelle in der Anwesenheit von mindestens einem Photon-reduzierendem Wirkstoff detektiert werden. Solche toxikologischen Bestimmungen können unter Verwendung von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen durchgeführt werden, optional unter Erstellung eines toxikologischen Profils wie in PCT/US94/00583 , eingereicht am 21.1.1994 ( WO 94/17208 ), dem Deutschen Patent Nr. 69406772.508 , erteilt am 25.11.1997; EPC 0680517 , erteilt am 12.11.1994; US Patent Nr. 5,589,337 , erteilt am 31.12.1996; EPO 651825 , erteilt am 14.1.1998; und US Patent Nr. 5,585,232 , erteilt am 17.12.1996) beschrieben.
  • Alternativ, oder zusätzlich zu diesen in vitro Studien können die Bioverfügbarkeit und toxikologischen Eigenschaften eines möglichen Modulators im Tiermodel, wie mit Mäusen, Ratten, Hasen oder Affen unter Verwendung von etablierten Methoden bestimmt werden (siehe Lu, wie oben (1985); und Creasey, Drug Disposition in Humans, The Basis of Clinical Pharmacology, Oxford UniversityPress, Oxford (1979), Osweiler, Toxicology, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1995), Yang, Toxicology of Chemical Mixtures; Case Studies, Mechanisms, and Novel Approaches, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1994), Burrell et al., Toxicology of the Immune System; A Human Approach, Van Nostrand Reinhld, Co. (1997), Niesink et al., Toxicology; Principles and Applications, CRC Press, Boca Raton, FL (1996)). In Abhängigkeit von Toxizität, Zielorgan, Gewebe, Lokus und vermutetem Mechanismus des möglichen Modulators, hätte der Fachmann keine Probleme die geeigneten Dosen, LD50-Werte, Verabreichungswege und Dosierungsschemata, die geeignet wären, um die toxikologischen Eigenschaften des möglichen Modulators festzustellen, zu bestimmen. Zusätzlich zu den Tiermodellen können klinische Versuche, die sich nach etablierten Verfahren, wie jenen, die von den Food and Drug Administration der USA (USFDA) oder ähnlichen Organisationen von anderen Regierungen ausgegeben werden, richten, durchgeführt werden. Diese Toxizitätsstudien liefern die Grundlage für das in vivo Bestimmen des therapeutischen Nutzens eines möglichen Modulators.
  • WIRKSAMKEIT VON MÖGLICHEN MODULATOREN
  • Die Wirksamkeit eines möglichen Modulators kann unter Verwendung mehrerer im Stand der Technik anerkannter Verfahren, wie in vitro Verfahren, Tiermodelle oder klinischer Versuche am Menschen festgestellt werden (siehe Creasey, wie oben (1979)). Anerkannte in vitro Modelle gibt es für mehrere Krankheiten oder Zustände. Zum Beispiel ist die Fähigkeit einer Chemikalie, die Lebensdauer von mit HIV infizierten Zellen in vitro zu verlängern, als ein akzeptables Model zur Identifizierung von Chemikalien, von denen erwartet wird, dass sie bei der Behandlung von HIV-Infektionen oder AIDS wirksam sind, anerkannt (siehe Daluge et al., Antimicro. Agents Chemother, 41: 1082–1093 (1995)). Des Weiteren wurde die Fähigkeit von Ciclosporin A (CsA) zur Verhinderung der Proliferation von T-Zellen in vitro als ein akzeptables Model für die Identifizierung von Chemikalien, von denen erwartet wird, dass sie sich als Immunosuppressoren wirksam zeigen, etabliert (siehe Suthanthiran et al., wie oben, (1996)). Ein akzeptables in vitro oder Tiermodel ist für annähernd jede Klasse an Therapeutikum, Krankheit oder Zustand verfügbar. Solche Modelle bestehen zum Beispiel für gastrointestinale Erkrankungen, Krebs, in der Kardiologie, in der Neurobiologie und in der Immunbiologie. Zusätzlich können diese in vitro Verfahren Gewebeextrakte, wie Leberpräparate, wie mikrosomale Präparate verwenden, um eine verlässliche Indikation der Wirkung des Metabolismus auf den möglichen Modulator zu geben. Auf die gleiche Weise können Tiermodelle verwendet werden, um die Wirksamkeit von Chemikalien für die Behandlung von zahlreichen Erkrankungen oder Krankheitszuständen festzustellen. So dient zum Beispiel das Knie von Hasen als akzeptiertes Model für das Testen von Chemikalien auf die Wirksamkeit bei der Behandlung von Arthritis (siehe Shaw and Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br) 55: 197–205 (1973)). Hydrokortison, dass für die Verwendung bei Menschen in der Behandlung von Arthritis zugelassen ist, ist in diesem Model wirksam, was den Wert dieses Modells bestätigt (siehe McDonough, Phys. Ther. 62: 835–39 (1982)). Bei der Auswahl eines geeigneten Modells für die Bestimmung der Wirksamkeit eines möglichen Modulators kann der Fachmann sich vom Stand der Technik leiten lassen, um ohne Probleme ein geeignetes Model, die geeignete Dosis und den geeigneten Verabreichungsweg, das geeignete Dosierungsschema und den geeigneten Endpunkt auszuwählen.
  • Außer den Tiermodellen können auch klinische Versuchsreihen an Menschen verwendet werden, um die Wirksamkeit eines möglichen Modulators in Menschen zu bestimmen. Die USFDA, oder ähnliche Regierungsbehörden, haben Verfahren für derartige Studien festgelegt (siehe www.fda.gov).
  • SELEKTIVITÄT VON MÖGLICHEN MODULATOREN
  • Die oben beschriebenen in vitro und in vivo Verfahren legen auch die Selektivität eines möglichen Modulators fest. Es ist anerkannt, dass Chemikalien in der Lage sind, einen großen Bereich an biologischen Prozessen zu modulieren oder dass sie selektiv sein können. Zur Bestimmung der Spezifität des möglichen Modulators können Enzym-Panels oder Zell-Panels auf Basis der vorliegenden Verwindung verwendet werden. Die Selektivität ist zum Beispiel im Bereich der Chemotherapie offensichtlich, wobei die Selektivität einer Chemikalie, was ihre Toxizität gegenüber Krebszellen aber nicht gegenüber nicht-Krebszellen angeht, offensichtlich erwünscht ist. Selektive Modulatoren werden bevorzugt, da sie weniger Nebeneffekte im klinischen Versuch aufweisen. Die Selektivität eines möglichen Modulators kann in vitro durch Testen der Toxizität und der Wirkung eines möglichen Modulators auf eine Vielzahl von Zelllinien, die eine Vielzahl an Signalpfaden und Empfindlichkeiten aufweisen, festgestellt werden. Die aus diesen in vitro Studien der Toxizität erhaltenen Daten können auf in vivo Tiermodelstudien, einschließlich klinischer Versuche am Menschen, angewandt werden, um Toxizität, Wirksamkeit und Selektivität der im Stand der Technik anerkannten Verfahren zur Überprüfung des möglichen Modulators zu bestimmen.
  • So können zum Beispiel Anordnungen von Sonden mit Kinase oder Phosphatase verwendet werden, um schnell ein Profil der Selektivität einer Testchemikalie mit Bezug auf deren Fähigkeit, verwandte Kinasen oder Phosphatasen zu hemmen, zu erstellen. Solche Anordnungen können sich innerhalb einer Mikrotiterplatte befinden oder als Printed Arrays vorliegen, wie zum Beispiel in den US Patenten Nr. 4,216,245 erteilt am 5. August 1980 an Johnson, 5,721,435 erteilt am 24. Februar 1998 an Troll, und 5,601,980 erteilt am 11. Februar 1997 an Gordon et al. offenbart. Ein solches System verleiht die Fähigkeit, schnell eine große Anzahl an Kinasen oder Phosphatasen in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Testchemikalie zu untersuchen, um ein Profil der Selektivität eines möglichen Modulators in einem einfachen, miniaturisierten Hochdurchsatzverfahren zu erstellen.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung.
  • Beispiel 1. Messung von Tyrosinkinase-Aktivität unter Verwendung von optischen Sonden
  • Peptider wurden durch traditionelle Festphasensynthese, siehe Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149–2154 (1963); Fields, G. B., et al., Principles and practice of solid-phase peptide synthesis, Seiten 77–183 in Synthetic Peptides: A Users Guide, Grant, G.R., ed., W. H. Freeman and Co. New York, (1992), in Verbindung mit der "tea-bag" Methode (Teebeutel-Methode) unter Verwendung von Chemie auf Basis von Boc/Benzyl hergestellt. Siehe Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 513–5135 (1985). Peptide wurden auf Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz) unter Verwendung von traditioneller Chemie auf Boc/Benzyl-Basis assembliert. Eine kleine Änderung am Protokoll (im Fall des Abl-spezifischen Substrats (AEAIYAAPL, SEQ. I.D. No. 4) bestand in der Verwendung einer basenempfindlichen Schutzgruppe (Fmoc) für die Seitenkette des C-terminalen Lysinrestes. Beutel aus Polypropylen-Netzmaterial wurden mit MBHA-Harz gefüllt. Die Beutel („Teebeutel") wurden in einer NalgeneTM Flasche mit Dichlormethan (DCM) in ausreichender Menge, um die Beutel zu bedecken, platziert und für einen Zeitraum von 5 Min geschüttelt, um das Anschwellen des Harzes zu ermöglichen. Die DCM-Lösung wurde dann entsorgt und die eigentliche Synthese wurde durchgeführt. (Alle folgenden Schritte beinhalteten das Hinzufügen von ausreichend Lösungsmittel um alle Beutel zu bedecken und lebhaftes Schütteln um einen angemessenen Lösungsmitteltransfer zu ermöglichen.
  • Die Beutel wurden 3 Mal gewaschen, und zwar zunächst für 2 Minuten mit 5 %igem Diisopropylethylamin (DIEA) in DCM (Neutralisierungsschritt) und dann zweimal mit 100 % DCM (jeweils für eine Minute), um die überschüssige Base zu entfernen. Nach der Neutralisierung wurden die Beutel sortiert und in einer NalgeneTM Flasche, die eine Lösung der Aminsäure von Interesse in DCM enthielt, platziert und eine gleiche Menge von Diisopropylcarbodiimid (DIC) in DCM wurde hinzugefügt, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren. Ein 5-facher Überschuss an Aminosäure und DIC wurde für alle Kopplungen verwendet. Die Flasche wurde für einen Zeitraum von einer Stunde geschüttelt, um sicher zu stellen, dass die Reaktion vollständig war. Die Reaktionsmischung wurde entsorgt und die Pakete wurden zwei Mal 1 Minute lang in DMF gewaschen, um überschüssige Aminosäuren und Nebenprodukte wie Diisopropylharnstoff zu entfernen. Die zwei letzten Waschvorgänge mit DCM wurden ausgeführt, um überschüssiges DMF zu entfernen. Das N-α-t-Boc wurde durch Acidolyse über einen Zeitraum von 30 Minuten unter Verwendung einer 55 %igen TFA-Lösung in DCM entfernt, wodurch das TFA-Salz der α-Aminogruppe zurückblieb. Die Beutel wurden im Anschluss mit DCM (1 × 1 Minute), Isopropanol (2 × 1 Minute) und DCM (1 × 1 Minute) gewaschen. Die Synthese wurde durch Wiederholen desselben Vorgangs während der Substitution für die entsprechende Aminosäure beim Kupplungsschritt abgeschlossen.
  • Nach dem Entfernen des N-α-t-Boc aus der γ-Amino-n-Buttersäure (GABA) wurden die Beutel 3 Mal für jeweils 2 Minuten mit 5 %igem DIEA in DCM und anschließen mit DCM (3 × 2 Minuten) gewaschen. Die Beutel wurden sortiert, in einer eine Lösung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in DCM/DMF (80/20) enthaltenden NalgeneTM Flasche platziert und 2 Minuten lang geschüttelt (2-facher Überschuss). Anschließend wurde reines DIEA zu der FITC-Lösung hinzugefügt. Die Flasche wurde für einen Zeitraum von 3 Stunden geschüttelt, um die Vollständigkeit der Reaktion zu gewährleisten. Die Reaktionsmischung wurde entsorgt und die Beutel wurden in DCM (4 × 2 Minuten) und DMF (1 × 2 Minuten) gewaschen.
  • Die Fmoc-Gruppe an der Seitenkette des C-terminalen Lysinrestes wurde unter Verwendung einer Lösung von 20 % Piperidin in DMF für einen Zeitraum von 25 Minuten entfernt. Die Beutel wurden im Anschluss mit DMF (2 × 2 Minuten), DCM (1 × 2 Minuten) und DMF (1 × 2 Minuten) gewaschen. Die Beutel wurden dann in einer eine Lösung von 7-Hydroxycoumarin-3-Carbonsäure (1,5-facher Überschuss) in DMF enthaltenden NalgeneTM Flasche platziert und 2 Minuten lang geschüttelt. Eine Lösung von PyBop/HOBt in DMF wurde zu der Flasche hinzugefügt und die Mischung wurde 2 Minuten lang geschüttelt. Anschließend wurde reines DIEA hinzugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden lang geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde entsorgt, die Pakete wurden mit DMF (3 × 2 Minuten) und DCM (3 × 2 Minuten) gewaschen und in einen Trockenschrank platziert und unter Vakuum in Vorbereitung der Spaltung getrocknet.
  • Alle Peptide waren Seitenketten-entschützt und bei 0° C mit flüssigem HF in Anwesenheit von Anisol als Carbokationen-Fänger gespalten. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang fortgesetzt. Flüssiger HF wurde dann entfernt, unter Verwendung eines starken N2-Stroms über einen Zeitraum von 90 Minuten, gefolgt von der Verwendung eines Ansaug-Vakuums für 60 Minuten, während die Temperatur auf 0° C gehalten wurde. Die Reaktionsgefäße wurden von dem Apparat entfernt und das restliche Anisol wurde mit zwei Ethylether-Waschungen entfernt. Die Peptide wurden mittels zweier Waschschritte mit 30 ml 10 %igem AcOH entfernt. Für jedes Peptid wurde die Extraktionslösungen gepoolt und lyophilisiert. Die noch nicht gereinigten Peptide wurden gewogen und in Erwartung ihrer Reinigung unter Stickstoff gelagert.
  • Automatisierte Peptid-Synthese
  • Alternativ wurden fluoreszierende Peptidsubstrate unter Verwendung eines automatisierten Peptidsynthesizers (ABI 432A, Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Einsatz von Fmoc/t-Boc-Chemie hergestellt. Siehe Fields, G. B., et al., Principles and practice of solid-phase Peptide synthesis, Seiten 77–183 in Synthetic Peptides: A Users Guide, Grant, G.R., ed., W. H. Freeman and Co. New York, (1992). Kurz zusammengefasst kann gesagt werden, dass, nachdem die Synthese des erwünschten Peptids (das eine nicht geschützte, N-terminale GABA und ein Fmoc-geschützes, C-terminales Lysin enthielt) abgeschlossen war, die Synthesesäule aus dem ABI432A-Synthesizer entfernt wurde. Die Säule, die das an das Harz gebundene Peptid enthielt, wurde per Hand mit DMF gespült, um das Harz anschwellen zu lassen. Eine zwei ml Lösung von 100 μM FITC (5-facher Überschuss) in 10 %igem DIEA/DMF wurde dann langsam über einen Zeitraum von 2 Stunden durch die Synthesesäule mittels einer Spritzenpumpe injiziert. Die Synthesesäule wurde mit (5 × 10 ml) DMF und THF (3 × 5 ml) gewaschen und schließlich mit einem Strahl trockenen Stickstoffs getrocknet. Das getrocknete Harz wurde in 1 ml Trifluoressigsäure (TFA), die 50 μl Ethandithiol und 50 μl Thioanisol enthielt, suspendiert und diese Mischung wurde unter Stickstoff 4 Stunden lang gerührt. Das Peptid wurde durch Hinzufügen von 20 ml Ether aus der TFA-Lösung ausgefällt. Der Feststoff wurde weiter mit Ether gewaschen (3 × 20 ml), um die Thiol-Fänger zu entfernen. Das ausgefällte Peptid (immer noch mit dem gespaltenen Harz gemischt) wurde unter Vakuum getrocknet. Schließlich wurde das C-terminale Lysin des Peptids (im Fall des Abl-spezifischen Peptids AEAIYAAPL, SEQ. ID. NO: 4) mit dem N-Hydroxysuccimidylester von 7-Hydroxycoumarin-3-carbonsäure (NHS-Coumarinester) markiert. Dies wurde durch Inkubation eines 5-fachen Überschusses des NHS-Coumarinesters mit dem Peptid über Nacht bei Raumtemperatur in einer Lösung von 10 % iges DIEA enthaltendem DMF erreicht. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde das Peptid wie unten beschrieben gereinigt.
  • Ein fluoreszierendes Fluroescein-/Rhodamin-Substrat wurde unter Verwendung eines zu der oben beschriebenen Methode identischen Verfahren, mit Ausnahme der Tatsache, dass ein aminreaktives Rhodaminfluorophor (Lissaminrhodamin B Sulfonylchlorid) zur Markierung des C-terminalen Lysins verwendet wurde, hergestellt. Frühere Versuche zur Synthese von Peptiden mit einem C-terminalen Lysin markiert mit Rhodamin, während die Peptide noch an das Harz gebunden waren, waren nicht erfolgreich. Das oben beschriebene Verfahren (markieren mit Rhodamin nach Spaltung von dem Harz) unterbindet die problematische Tendenz von Rhodamin-Markierungen, sich irreversibel an die Harze zu binden. Die Reaktion von aminreaktiven Rhodaminderivaten während die Peptide noch an das Harz gebunden sind, hindert sie anscheinend an der Reaktion mit dem C-terminalen Lysin.
  • Die Rohpeptide wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf einer C18-Säule unter Verwendung etablierter Verfahren gereinigt. Die Lösungsmittel der mobilen Phase waren 0,1 % ige TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 %ige TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B). Die Teile, die das gereinigte Material enthielten wurden gepoolt und lyophilisiert und die gereinigten Peptide wurden mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC und durch Massenspektralanalyse charakterisiert. Die Peptidkonzentrationen wurden durch Absorptionsspektroskopie unter Verwendung von Extinktionskoeffizienten von Coumarin und Fluorescein von jeweils 35.000 und 75.000 M–1 cm–1 bestimmt. Die Peptide waren bei 4° C für mindestens einen Monat stabil und bei –20° unbegrenzt stabil.
  • Herstellung von phosphorylierten optischen Sonden
  • Zur Herstellung einer Probe von phosphorylierter optischer Sonde wurden die Peptide mit überschüssiger Tyrosinkinase-Aktivität für einen ausreichend langen Zeiten inkubiert, um die vollständige Phosphorylierung des Peptids zu gewährleisten. Typisch für v-Abl Kinasereaktionen bestand der Puffer aus: 0,1 × Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS), 5 mM MgCl2, 200 μM ATP und mehr als 10 % des gesamten Reaktionsvolumen des Enzyms Tyrosinkinase. Die Reaktionsvolumen betrugen typsicherweise 20 μl, allerdings wurden auch Reaktionen mit 10 μl und 100 μl durchgeführt. Üblicherweise wurde die rekombinante v-Abl-Kinase von Calbiochem erworben. Die Kinasereaktionen wurden durch Hinzufügen von 20 mM EDTA, pH 8 gelöscht. Der Phosphorylierungsgrad des Peptids wurde im Zeitablauf durch Entnahme von Proben aus der Reaktionsmischung und Analyse derselben durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht.
  • Alternativ könnten phosphorylierte optische Sonden direkt während der Peptidsynthese unter einfacher Verwendung des O-Benzyl-geschützten Phosphatderivats der erwünschten Hydroxyl enthaltenden Aminosäure hergestellt werden. N-α-Fmoc-O-Benzyl-L-phosphotyrosin ist zum Beispiel im Handel erhältlich und mit Standard Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese kompatibel. Siehe White, P. et al. in "Innovations & Perspectives in Solid Phase Synthesis and Combinatorial Libraries, 4th International Symposium", R. Epton (Ed.), Mayflower Scientific Ltd. Birmingham, (1966), S. 557. Somit können phosphorylierte optische Sonden einfach unter Verwendung von Protokollen, die den oben für die automatisierte Peptidsynthese beschriebenen ähnlich sind, unter Verwendung von Fmoc-Chemie hergestellt und wie weiter unten beschrieben gereinigt werden.
  • Zum Beispiel unter Verwendung eines Dionex HPLC-Geräts und einer C18 Umkehrphasen-Säule durch ein Elutionsgradientenprofil aus entweder 5 bis 80 Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure (~ pH 3) oder 5 bis 80 % Acetonitril/0,1 % Triethylamin (pH 7,5) über 25 Minuten. Alternativ wurde der Grad der Phosphorylierung durch Massenspektroskopie bestimmt. Wurden beide Verfahren verwendet, so war der Grad der Peptidphosphorylierung nach Inkubation mit der Kinase typischerweise größer als 95 %. Peptide zur Negativkontrolle wurden unter zu den Bedingungen für die phosphorylierten Peptide identischen Bedingungen inkubiert, allerdings in Abwesenheit von ATP.
  • Änderungen in der Fluoreszenz nach Spaltung
  • Für die anfängliche Überprüfung der Spaltung der optischen Sonden wurden Messungen der Fluoreszenzemission in einer Kuvette unter Verwendung eines Steady-State Fluorimeter (SPEX) durchgeführt. Im Falle von mit Fluorescein/Coumarin markierten Peptiden wurden Emissionsspektra zwischen 420 und 600 nm durch Anregung bei 405 nm erhalten (maximalle Absorption von Coumarin und geringe direkte Anregung von Fluorescein). Typischerweise betrug die Konzentration der optischen Sonden 100 nM, und das gesamte Reaktionsvolumen belief sich auf 700 μl.
  • 2 zeigt, dass Spaltung der nicht-phosphorylierten optischen Sonden durch Chymotrypsin zu einem starken Anstieg in der Fluoreszenzemission bei ungefähr 460 nm führt, ebenso wie zu geringerer Reduktion der Emission bei 530 nm, die durch den Verlust an Fluorescence resonance energy transfer (FRET) zwischen dem Donor (Coumarin) und dem Akzeptor (Fluorescein) verursacht wird. Zum Vergleich: die phosphorylierte optische Sonde wird nicht durch Chymotrypsin abgebaut und weist beinahe keine Veränderung bei Emissionscharakteristika bei beiden Wellenlängen nach Inkubation mit der Protease auf. Die erhebliche, 30-fache Differenz bei den Emissionsverhältnissen von phosphoryliertem (nicht gespaltenem) Substrat und nicht phosphoryliertem (gespaltenem) Substrat liefert die Basis für einen Aspekt der vorliegenden Erfindung. Des Weiteren ist zu beachten, dass es auf Grund der Tatsache, dass die Emissionsspektra unabhängig bei zwei bestimmten Wellenlängen variieren, möglich ist, ein Emissionsverhältnis zu berechnen, das mehrere signifikante Vorteile im Vergleich zu Messungen einzelner Wellenlängen aufweist. Diese schließen größere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bei Screeninganwendungen ein, da das Verhältnis größtenteils unabhängig (innerhalb eines bestimmten Rahmens) gegenüber der absoluten Lichtintensität und der Konzentration an optischen Sonden ist.
  • Um zu bestätigen, dass das Emissionsverhältnis direkt mit dem Grad der Phosphorylierung der optischen Sonde zusammenhängt, werden Mischungen von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden in definierten Mengen hergestellt und mit 0,1 × PBS auf 100 μl verdünnt und dann zu einer 96-Well Multiwellplatte hinzugefügt. Die Emissionsverhältnisse (460/530) wurden mit einem Cytofluor Plattenlesegerät (Perspective Biosystems), unter Verwendung eines 395 nm Anregungsfilter [Halbwertsbreite (FWHM) von 25 nm], eines 460 nm Emissionsfilter (FWHM = 40 nm) und eines 530 nm Emissionsfilters (FWHM = 50 nm) erzielt. Messungen wurden vor und 1 Minute nach dem Hinzufügen von 0,04 nMol bovinem Alpha-Chymotrypsin (Calbiochem, 230832, 1,018 USP Einheiten/mg) durchgeführt und die 460/530-Emissionsverhältnisse berechnet. Die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse belegen ein direktes Verhältnis zwischen dem Grad der Phosphorylierung der optischen Sonde und des 460/530-Emissionsverhältnisses.
    Tabelle 8
    % phosphoryliertes Peptid Best Fit tatsächliche Daten 460/530-Emissionsverhältnis
    0 0,904 0,904
    10 2,118 2,086
    20 3,331 3,256
    30 4,545 4,193
    40 5,758 5,440
    50 6,972 6,498
    60 8,186 7,919
    70 9,399 9,332
    80 10,613 10,598
    90 11,826 11,865
    100 13,040 13,044
  • Optimierung der Proteasekonzentration
  • Zur Bestimmung der relativen proteolytischen Empfindlichkeit der phosphorylierten und nicht-phosphorylierten optischen Sonde (AEAIYAAPL, SEQ. ID. NO: 4) wurden Proben von beiden mit verschiedenen Konzentrationen an Chymotrypsin in 0,1 × PBS inkubiert. Fluoreszenzmessungen wurden auf einem 96-Well Plattenlesegerät wie zuvor beschrieben durchgeführt. In 3, stehen die nicht ausgefüllten Symbole für die Kontrolle, nämlich die nicht-phosphorylierte optische Sonde. In diesem Fall ist die Spaltung der optischen Sonde wie durch das 460/530-Emissionsverhältnis angezeigt, bereits bei 10 nM Chymotrypsin signifikant und ereicht in Anwesenheit von 100 nM Protease unter diesen Bedingungen einen Maximalwert von ungefähr 12. Zum Vergleich: die phosphorylierte optische Sonde (ausgefüllte Symbole) beginnt erst eine vergleichbare Veränderung bei dem Emissionsverhältnis zu zeigen, wenn sie einer 1000-fach höheren Proteasekonzentration (10 μM) ausgesetzt wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass maximale Differenzen bei dem Emissionsverhältnis zwischen phosphorylierter und nicht-phosphorylierter optischer Sonde auftreten können, in diesem Fall bei Proteasekonzentrationen zwischen 0,1 bis 1 μM Chymotrypsin. Unter diesen Bedingungen wurde praktisch die gesamte, nicht-phosphorylierte, optische Sonde gespalten, wohingegen praktisch die gesamte phosphorylierte optische Sonde noch intakt ist. Optimale Bedingungen zur Inkubation mit Protease für andere spezifische optische Sonden können unter Verwendung von ähnlichen Verfahren und Protokollen bestimmt werden.
  • Beispiel 2. Bewertung von optischen Sonden für das Screenen von Inhibitoren von Proteintyrosinkinase
  • Um die Erfindung in einem Hochdurchsatz-Screeningformat zu bewerten, wurden Assays auf Basis von optischen Sonden in einem 96-Well Plattenlesegerät durchgeführt. Die Ergebnisse belegten, dass mit der vorliegenden Erfindung leicht reproduzierbare und äußerst exakte Ergebnisse erzielt werden konnten. Wie in Tabelle 9 gezeigt, reduziert die Berechnung von Emissionsverhältnissen signifikant die Standardabweichung und VK-Werte im Vergleich zu Intensitätsmessungen bei entweder 460 oder 530 nm. Die Reduzierung von Fehlern ist eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung und Analyse von Screeningsystemen, und vor allem bei automatisierten Hochdurchsatz- und Ultrahochdurchsatz-Screeningsystemen.
    Tabelle 9
    Emission 460 nm Emission 530 nm Verhältnis
    Mittelwert 1290 1922 0,67
    Standardabweichung 3,7 4,8 0,01
    VK 2,9 % 2,5 % 1,5 %
  • Die Analyse der Kinetik der Phosphorylierung der optischen Sonde ergab Werte für die apparente Km für das Substrat von 40 μM und einen apparenten Km-Wert für ATP von 8 μM. Der Durchsatz der optischen Sonde durch v-Abl betrug 9,5 s–1, was mit veröffentlichten Werten für gereinigte Tyrosinkinasen und optimale Peptidsubstrate übereinstimmt. Zum Beispiel Seethalaand Menzel., Anal Biochem. 253: 210–218 (1997); Songyang et al., Nature 373: 536–539.
  • Vergleich mit anderen Screeningverfahren
  • Um zu bestimmen, wie der Kinase-Assay auf Basis von optischen Sonden im Vergleich mit anderen Screeningverfahren wie der direkten Messung von 32P-Einbau in ein Peptid abschnitt, wurde ein direkter Vergleich zwischen den beiden Verfahren gezogen. Proben von fluoreszierendem Substrat (2 μM) wurden mit v-Abl Kinase wie oben beschrieben entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von γ-markiertem 32P-ATP (0,5 μM oder 10 μCi pro 20 μl Reaktionsvolumen) phosphoryliert. Im Fall der 32P-Einbau-Versuche wurde die radioaktive Einbau durch das Binden der optischen Sonde an P81-Filter wie zuvor beschrieben, bestimmt (z.B. Seethala and Menzel, Anal. Biochem., 253: 210-218, 1997). Es wurde gezeigt, dass Abl-Peptid, das an P81-Filter bindet, in der Lage war, einen konstanten Teil an phosphoryliertem Peptid einzufangen. Der radioaktive Einbau in die optische Sonde wurde unter Verwendung eines Top Count Flüssigszintillationszähler (Packard) überwacht. Die Inkubation der optischen Sonde mit Chymotrypsin (100 nM) und die Messung von Fluoreszenzemissionsverhältnissen waren wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Ergebnisse von einem typischen Versuch werden in Tabelle 10 dargestellt und zeigen dass beide Verfahren zur Messung der Tyrosinkinase-Aktivität ähnliche Ergebnisse ergaben und verlässlich das Niveau der Substratphosphorylierung anzeigen.
    Tabelle 10
    Enzymkonzentration (ng/Assay) % Phosphorylierung wie durch Fluoreszenz bestimmt % Phosphorylierung wie durch 32P-Einbau bestimmt
    0 0,0 0,0
    0,5 3,1 4,6
    1,5 9,0 12,3
    4,0 36,8 42,1
    10,0 69,2 65,6
    22,0 96,0 95,5
    44,0 100,0 100,0
  • Charakterisierung eines Inhibitors von Proteintyrosinkinase in einem Screening-Assay
  • Um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung effektiv Inhibitoren von Tyrosinkinase-Aktivität identifizieren kann, wurde eine direkter Vergleich bei der Wirkung eines Inhibitors der Tyrosinphosphorylierung auf Änderungen bei der Fluoreszenz nach der der Inkubation mit Chymotrypsin oder nach dem 32P-Einbau (4) gezogen. Die Ergebnisse zeigten beinahe identische Dosierungsabhängigkeiten und Hemmungskurven für den Inhibitor bei der Verwendung der beiden Verfahren zur Messung von Tyrosinkinase-Aktivität. Diese Versuche zeigen deshalb, dass die vorliegende Erfindung ein empfindliches und praktisches System für die Messung der Phosphorylierung vorsieht und dass die mit dem Assay-System erzielten Ergebnisse direkt mit jenen, die durch Messung von 32P-Einbau erzielt werden, vergleichbar sind.
  • Beispiel 3. Messung von anderen Tyrosinkinase-Aktivitäten unter Verwendung von optischen Sonden
  • Messung der Aktivität von Src-Kinase
  • Zur Messung der Aktivität von Src-Kinase wurden zwei optische Sonden, Src-1 (GEEEIYGEIEK, SEQ. ID. NO: 3) und Src-2 (GEEEIYGVIEK) entwickelt. Im Fall des Src-1 Kinasesubstrats und wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde eine zweite aromatische Aminosäure in der optischen Sonde mit Isoleucin ersetzt. Bei dem zweiten Substrat, Src-2, wurde die negativ geladene Aminosäure (Glu = E) in der Position P'2 mit Bezug auf die Proteasestelle mit Valin ersetzt (Val = V), um eine effizientere Spaltung der nicht-phosphorylierten optischen Sonde durch Chymotrypsin zu ermöglichen. Die Reaktionsbedingungen für Src-Kinase (Upstate Biotechnology) entsprachen jenen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, mit Ausnahme der Tatsache, dass 25 mM Glycerinphosphat und 1 mM DTT ebenfalls hinzugefügt wurden. Die Inkubation der optischen Sonde mit Chymotrypsin (100 nM) und die Messung von Fluoreszenzemissionsverhältnissen waren wie in Beispiel 1 beschrieben. Die apparenten Km-Werte für die beiden Substrate (bestimmt durch Fluoreszenzmessungen nach Proteaseinkubation) mit Bezug auf die Src-Kinase betrugen jeweils 11 μM und 19 μM. Andere optische Sonden, die wie hierin beschrieben ausgestaltet sind, können hergestellt werden, um spezifische optische Sonden für einen Bereich an Tyrosinkinase-Aktivitäten vorzusehen, die anschließend unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren optimiert werden können.
  • Vergleichendes Beispiel 4. Messung von Tyrosinphosphatase-Aktivitäten unter Verwendung von optischen Sonden
  • Um zu zeigen, das die vorliegende Erfindung auch zur Bestimmung von Aktivitäten von Proteintyrosinphosphatase verwendet werden könnte, wurden Versuche unter Verwendung von phosphorylierten optischen Sonden, die mit Proteintyrosinphosphatasen inkubiert wurden, durchgeführt. Optische Sonden wurden zunächst vollständig wie oben beschrieben phosphoryliert und Proben von phosphorylierter optischer Sonde zu einer abschließenden Konzentration von 500 nM wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Proteintyrosinphosphatase B (PTP-B) Agarose (Upstate Biotechnology) für 20 Minuten bei 30° C in 0,1 × PBS inkubiert. Zu dem erforderlichen Zeitintervall wurde PTP-B-Agarose durch kurzes Zentrifugieren vor dem Transfer in 96-Well Cytofluorplatten für Fluoreszenzmessungen und nach Hinzufügen von Chymotrypsin (100 nM) wie in Beispiel 1 beschrieben entfernt.
  • Ergebnisse von einem typischen Versuch werden in Tabelle 11 gezeigt. In diesem Versuch wurden die relativen Raten der Dephosphorylierung der optischen Sonden des phosphorylierten Src-2-spezifischen Substrats (SEQ. ID. NO: 29) und eines Abl-spezifischen (SEQ. I.D. No. 4) Substrats durch die Proteintyrosinphosphatase PTP-B verglichen.
    Tabelle 11
    Log Konzentration von Proteintyrosinphosphatase [PTB-B] Fluoreszenzemissions-Verhältnis von Src-2 Peptid nach Behandlung mit Protease Fluoreszenzemissions-Verhältnis von abl-Peptid (SEQ. ID. No: 4) nach Behandlung mit Protease
    –7,7 17,7 n.d.
    –8,7 17,6 17,7
    –9.7 15,8 17,8
    –10,7 5,40 16,6
    –11,7 1,99 8,60
    –12,7 1,75 5,70
    –13,7 1,62 5,30
    –14,7 1,60 5,30
  • Im Fall der Tyrosinphosphatase PTP-B, wird das Src-2-Substrat einfacher dephosphoryliert als das Abl-Substrat. Die Analyse der Enzymkinetik durch eine Michealis-Menten-Grafik zeigt, dass der apparente Km-Wert für die Src-2 optische Sonde 1,3 μM und der kcat-Wert 79 s beträgt. Der Kcat/Km-Wert für dieses Substrat beträgt beinahe 108 M–1 sec–1, was auf eine äußerst effiziente Erkennung der Phosphotyrosin enthaltenden optischen Sonde hindeutet. Diese Versuche zeigen deshalb, dass die vorliegende Erfindung ein empfindliches und praktisches System für die Messung von Proteintyrosinphosphatase-Aktivität vorsieht und dass die mit dem Assay-System erzielten Ergebnisse direkt mit jenen, die durch Messung der Dephosphorylierung erzielt werden, vergleichbar sind. Die vergleichsweise breite Substratspezifität von Phospho-Tyrosinphosphatasen (siehe zum Beispiel Barford et al. (1995) Nature Struct. Biol. 2: 1043–1053) legt nahe, dass der Ansatz für das Messen eines weiten Bereichs an Proteintyrosinkinase-Aktivitäten nützlich ist.
  • Vergleichendes Beispiel 5. Bewertung von optischen Sonden für das Screenen von Inhibitoren von Proteintyrosinkinase
  • Um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um Inhibitoren von Proteintyrosinphosphatase zu identifizieren und charakterisieren, wurden Versuche in Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Orthovanadat, einem hinreichend charakterisierten, kompetitiven Inhibitor von Tyrosin-spezifischen Phosphatase-Aktivitäten durchgeführt. Orthovanadat hemmte die Tyrosin phosphatase-Aktivität kompetitiv mit einem apparenten IC50 von 420 nM (5) unter Verwendung der optischen Sonden der Erfindung. Dieser Wert stimmt mit Werten aus der Literatur zur Orthovanadathemmung von PTP-B, erhalten durch Messen von 32P-Marierungen, überein. Dieses Ergebnis zeigt, dass die vorliegende Erfindung für die Entwicklung von empfindlichen und selektiven Screening-Assays für die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinphosphorylierungsaktivitäten verwendet werden kann.
  • Beispiel 6. Messung von Serin-/Threoninphosphorylierung unter Verwendung von optischen Sonden
  • Messung der Aktivität von Proteinkinase A
  • Um zu zeigen, dass optische Sonden zur Messung von Serin- oder Threoninkinasen entwickelt wurden, wurden Peptide gestaltet, die wirkungsvoll von Proteinkinase A erkannt und phosphoryliert werden konnten. In diesem Fall wurde das Substrat mit einer einzigen aromatischen Aminosäure (F) ausgestaltet, die sich direkt N-terminal zu der Phosphorylierungsstelle für Proteinkinase A, die in SEQ. ID. NO: 12, unten, unterstrichen ist, befand (die Position P'1 mit Bezug zu der Protease-Spaltstelle von Chymotrypsin). Dies führt zur Modulation der Geschwindigkeit der Spaltung der optischen Sonde durch Chymotrypsin nach Phosphorylierung.
  • Das Peptid (RRRKFSLRRKA, SEQ. ID. NO: 12) wurde mit Fluoresceinisothiocyanat am N-Terminus und 7-Hydroxycoumarin-3-carboxamid am C-Terminus wie oben beschrieben markiert. Um die relative proteolytische Aktivität der phosphorylierten und nicht-phosphorylierten optischen Sonden zu bestimmen, wurden Proben von beiden entnommen. Zu diesem Zweck wurden 10 μM des Substrats in einem Gesamtvolumen von 10 μl vollständig durch Inkubation mit überschüssiger Proteinkinase A für eine Stunde bei 30° C in einem aus 50 mM TRIS-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und 200 μM ATP bestehenden Puffer phosphoryliert. Negativkontrolle- Kinasereaktionen ohne ATP wurden verwendet um nicht-phosphorylierte Kontrollproben herzustellen. In beiden Fällen wurden die Proben 10-fach mit 50 mM HEPES, ph 7,5, 10 mM CaCl2 und 0,01 % Brij-35 enthaltendem Puffer verdünnt und mit 0,8 nM Chymotrypsin inkubiert. Die Fluoreszenzemissionsverhältnisse wurden für eine Stunde überwacht und sind in Tabelle 12 gezeigt.
    Tabelle 12
    Zeit der Spaltung (Minuten) Nichtphosphorylierte optischeSonde Phosphorylierte optische Sonde -fache Differenz in Verhältnissen
    0 0,34 0,01 0,33 0,01 1,0
    10 3,15 0,06 0,54 0,01 5,8
    20 6,71 0,29 0,78 0,01 8,6
    30 9,86 0,43 1,02 0,02 9,7
    40 12,00 0,4 1,27 0,03 9,5
    50 13,34 0,40 1,53 0,03 8,7
    60 14,02 0,27 1,78 0,03 7,9
  • Die maximale Differenz bei dem 460/530-Verhältnis war nach 30 Minuten Behandlung mit Chymotrypsin ungefähr 9,7-fach. Diese Änderung des Verhältnis stellt somit eine stabile und empfindliche Messung von Proteinphosphorylierung, die durch ihr hohes Signal-zu-Geräusch-Verhältnis gut für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen geeignet ist.
  • Beispiel 7. Bewertung von optischen Sonden für das Screenen von Inhibitoren von Serin-/Threoninkinase
  • Um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden konnte, um Inhibitoren von Serin-/Threoninkinase zu identifizieren, wurden Versuche mit einer Anzahl an zuvor charakterisierten Inhibitoren von Serin-/Threoninkinase-Aktivität durchgeführt. Im Fall der kompetitiven ATP-Inhibitoren Staurosporin und H-89-Inhibitor bei einer abschließenden Konzentration von 10 μM wurde mit Proteinkinase A vorinkubiert und das fluoreszierende Substrat (SEQ. ID. NO: 28) in 50 mM TRIS-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und die Reaktionen wurden durch Hinzufügen von ATP (10 μM) initiiert. Für den Substrat-kompetitiven Inhibitor PKI, wurde der Inhibitor (2,8 μM) mit Enzym vorinkubiert, und zwar vor dem Hinzufügen von optischer Sonde und ATP (100 μM) in dem oben beschriebenen Puffer. Nach einstündiger Inkubation bei 30° C wurde Chymotrypsin zu einer abschließenden Konzentration von 0,8 nM hinzugefügt und anschließend wurde das 460/530-Verhältnis nach einer Stunde wie oben beschrieben (Beispiel 6) bestimmt. Das Ergebnis führte zu beinahe vollständiger Hemmung der Aktivität von Proteinkinase A bei den getesteten Inhibitorkonzentrationen (Tabelle 13A und 13B).
    Tabelle 13A
    Negativkontrolle (Keine Aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis Positivkontrolle (Aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis Kinase + Inhibitor Staurosporin (10 μM) 460/530-Emissionsverhältnis Kinase + Inhibitor H-89 (10 μM) 460/530-Emissionsverhältnis
    14,02 0,27 1,78 0,03 13,92 0,07 13,29 0,14
    Tabelle 13B
    Negativkontrolle (Keine Aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis Positivkontrolle (Aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis Kinase + Inhibitor PKI (2,8 μM) 460/530-Emissionsverhältnis
    11,67 0,48 2,11 0,19 11,71 0,15
  • Bewertung der Verwendung von optischen Sonden für Hochdurchsatz-Screening
  • Um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung reproduzierbar Inhibitoren in einem Screening-Assay vom Hochdurchsatz-Typ detektieren konnte, wurde ein Screen in einer 96-Well-Platte durchgeführt. Der Versuch wurde mit zufällig beimpften Wells, die einen bekannten Inhibitor von Proteinkinase A, Staurosporin, enthielten unter Bedingungen durchgeführt, unter denen annähernd 20 % des Substrats in phosphoryliertes Produkt umgewandelt wurden. Die 96-Well-Platte wurde mit geeigneten no-ATP und no-Inhibitor Kontrollen ausgestattet. Fünfzehn Wells wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und erhielten 5 μl von 360 nM Staurosporin (in 3 %igem DMSO). Die abschließende Konzentration an Staurosporin in den fünf beimpften Wells lag bei 60 nM, was dem empirisch bestimmten IC80 entsprach. Alle anderen Wells (einschließlich der No-Inhibitor-Wells) erhielten 5 μl von 3 %igem DMSO. Alle Wells (außer Blindproben) erhielten dann 10 μl Kinase-Reaktionsmischung, die die optische Sonde (abschließende Konzentration in der Kinasereaktion 3,3 μM), Puffer und Proteinkinase A einschloss. Nach 5-minütiger Vorinkubation wurden die Kinasereaktionen durch Hinzufügen von 15 μl von 20 μM ATP ausgelöst und 15 Minuten bei 30° C inkubiert. Die abschließenden Kinasereaktionen waren wie folgt: 3,3 μM fluoreszierendes Substrat (SEQ. ID. NO: 28), 60 nM Staurosporin, 0,004 Einheiten Proteinkinase A, 10 μM ATP, 10 mM MgCl2. Die Kinasereaktionen wurden durch Hinzufügen von 30 μl eines 50 mM HEPES, pH 7,4, 0,01 % Brij-35 und 20 mM EDTA enthaltenden Puffers beendet. Die anfänglichen 460/530-Verhältnisse wurden erreicht und anschließend wurde die Chymotrypsinreaktion durch Hinzufügen von 40 μl eines 50 mM HEPES, pH 7,4, 0,01 % Brij-35 und 2 nM Chymotrypsin (50 ng/ml) enthaltenden Puffers ausgelöst. Die abschließende Konzentration von Chymotrypsin in der Reaktion lag bei 0,8 nM (20 ng/ml). Die 460/530-Emissionsverhältnisse wurden nach 30 Minuten erreicht. Bei diesem Assay-Format wurden alle mit Staurosporin beimpften Wells korrekt als positive Treffer für Kinaseinhibition (6; schwarze Punkte) zugeordnet.
  • Des Weiteren wurde in diesen Wells die Kinase-Aktivität um ungefähr 80 % im Vergleich zu den no-ATP-Kontrollen (negativ) gehemmt. Der Assay war einfach reproduzierbar und wies einen geringen Variationskoeffizienten auf (Tabelle 14).
    Tabelle 14
    Proben Variantionskoeffizient
    Kein ATP (n = 7) 1,6 %
    Kontroll-Kinase (n = 7) 2,6 %
    Kinase + Inhibitor (n = 15) 1,8 %
    Kinase, kein Inhibitor (n = 65) 2,6 %
    Variationskoeffizient (in %) = 100 × (Standardabweichung/Mittelwert) N = Anzahl an Wells
  • Beispiel 8. Messung von anderen Serin-/Threoninkinase-Aktivitäten
  • Messung der Aktivität von Caseinkinase 1
  • Um die Aktivität von Caseinkinase 1 zu messen, wurde eine optische Sonde wie oben beschrieben gestaltet. In diesem Fall war das Kinasesubstrat so ausgestaltet, dass der Phosphorylierungspunkt sich in der Position P'2 (unterstrichen in SEQ. ID. NO: 17, unten) mit Bezug auf die von Chymotrypsin gespaltene, spaltbare Bindung befand, welche die Schaffung eines für Caseinkinase 1 geeigneten Erkennungsmotiv ermöglicht. Ein Substratpeptid (GDQDYLSLDK, SEQ. ID. NO: 17) wurde mit Fluoresceinisothiocyanat am N-Terminus und 7-Hydroxycoumarin-3-carboxamid am C-Terminus wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und markiert.
  • Proben von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten optischen Sonden wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und getestet. In diesem Fall wurde die vollständige Phosphorylierung der optischen Sonde (1 μM) nach Inkubation bei Raumtemperatur für 15 bis 30 Minuten in Anwesenheit von 500 Einheiten Caseinkinase 1 (New England BioLabs) in 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT und 200 μM ATP erreicht.
  • Zur Bestimmung der relativen proteolytischen Empfindlichkeit der phosphorylierten und nicht-phosphorylierten optischen Sonden wurden Proben von beiden mit verschiedenen Konzentrationen an Chymotrypsin inkubiert und die Spaltung durch Messung des 460/530-Emissionsverhältnisses wie in Beispiel 1 beschrieben überwacht. Die in Tabelle 15 gezeigten Ergebnisse belegen, dass die nicht-phosphorylierte optische Sonde deutlich stärker für proteolytische Spaltung bei niedrigen Konzentrationen von Chymotrypsin empfänglich ist, als die phosphorylierte optische Sonde.
    Tabelle 15
    Konzentration von Chymotrypsin (μM) Negativkontrolle (keine aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis Positivkontrolle (nur aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis -fache Differenz in Verhältnissen
    0,04 3,0 1,2 2,5
    0,1 6,6 1,4 4,7
    0,2 10,9 1,7 6,4
    0,3 12,3 1,9 6,5
    0,4 14,3 2,3 6,2
    1,0 15,4 3,8 4,1
    2,0 15,6 6,0 2,6
  • In diesem Versuch trat die maximale Differenz bei den 460/530-Emissionsverhältnissen von nicht-phosphoryliertem Substrat gegenüber phosphoryliertem Substrat bei einer Chymotrypsinkonzentration von ungefähr 0,3 μM Chymotrypsin auf. Bei dieser Konzentration war die Differenz in den Emissionsverhältnissen von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Fluoreszenzproben größer als 6-fach, was zeigte, dass die vorliegende Erfindung hochempfindliche Verfahren für das Messen dieser Klasse and Serin-/Threoninkinase-Aktivitäten in einem Screeningformat vorsieht.
  • Messung der Aktivität von ERK-Kinase
  • Um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung auch zur Detektion der Aktivität einer auf Prolin gerichteten Serin-/Threoninkinase verwendet werden konnte, wurde eine optische Sonde (VAPFSPGGRAK) als Substrat für extrazelluläre Signal-geregelte Kinase (ERK), die das Serin in phosphorylierter Form (unterstrichen in SEQ. ID. NO: 27 dargestellt) in der Position P'1 mit Bezug auf die Chymotrypsin-Spaltstelle (F) enthielt, ausgestaltet. Dieses Substrat (100 μM) wurde durch Inkubation bei 30° C für 3 Stunden in einem 100 μl Reaktionsvolumen, die 500 ng ERK (Biomol) und 500 μM ATP in einem Puffer bestehend aus 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, und 0,01 % Brij-35, phosphoryliert. Um die proteolytische Empfindlichkeit von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Proben zu testen, wurden 2 μl der Negativkontroll-Reaktion (keine Kinase) oder der Kinasereaktion in einem 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM CaCl2 und 0,01 % Brij-35 enthaltenden Puffer auf 100 μl verdünnt und mit Chymotrypsin bei einer Konzentration von 4 nM inkubiert. Die Spaltungsreaktionen wurden auf dem Cytofluor 1 h lang überwacht. Die Ergebnisse belegen, dass die phosphorylierte optische Sonde gegenüber Chymotrypsin weniger empfindlich war, als das nicht-phosphorylierte Peptid (Tabelle 16). Die maximale Differenz bei dem 460/530-Verhältnis war ungefähr 15,2-fach und trat nach 30 Minuten Spaltung auf. Diese Daten belegen, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um die Aktivität einer auf Prolin gerichteten Kinase zu überwachen.
    Tabelle 16
    Spaltungszeit (Min) Negativkontrolle (keine aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis Positivkontrolle (nur aktive Kinase) 460/530-Emissionsverhältnis -fache Differenz in Verhältnissen
    0 0,28 0,33 0,85
    10 4,17 0,44 9,45
    20 7,56 0,56 13,55
    30 10,03 0,66 15,16
    40 11,71 0,78 14,99
    50 12,73 0,89 14,34
    60 13,40 1,00 13,36
  • Messung der Aktivität von Proteinkinase C
  • Um die Aktivität von Proteinkinase C unter Verwendung der optischen Sonden der vorliegenden Erfindung zu messen, wurde ein Peptid (RRRKFSLRRKA, SEQ. ID. NO: 12) ausgestaltet, bei dem die Phosphorylierung durch eine Proteinkinase C an der Position P'1 in SEQ. ID. NO: 12 mit Bezug auf die von Chymotrypsin gespaltene zu spaltende Bindung stattfand. Das ermöglichte, dass ein optimales Erkennungsmotiv für Proteinkinase C innerhalb der Sequenz der optischen Sonde platziert und eine Phosphorylierungsstelle, welche die proteolytische Empfindlichkeit des Substrat gegenüber Chymotrypsin modulierte, geschaffen werden konnte. Die Analyse von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Proben der optischen Sonde zeigte, dass Phosphorylierung durch Proteinkinase C die proteolytische Empfänglichkeit des Substrats deutlich modulierte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um optische Sonden, die in der Lage sind, die Aktivität von Proteinkinase C zu messen, zu entwickeln.
  • Vergleichendes Beispiel 9. Messung von Aktivitäten von Serin-/Threoninphosphatase
  • Aktivität von Proteinphosphatase I
  • Um zu bestimmen, ob die optischen Sonden zur Detektion von Serin-/Threoninphosphatsase-Aktivitäten verwendet werden konnten, wurden Proben der für Caseinkinase 1 spezifischen, phosphorylierten optischen Sonden präpariert und mit verschiedenen Serin-/Threoninproteinphosphatasen behandelt. Zu diesem Zweck wurde die optische Sonde der Caseinkinase 1 (GDQDYLSLDK, SEQ. ID. NO: 17) (100 μM) vollständig mit CKI (2000 Einheiten) in einem 100 μl Reaktionsvolumen enthaltend 200 μM ATP für 5 Stunden bei 30° C phosphoryliert. Eine Negativkontrolle-Kinasereaktion wurde durchgeführt, die kein ATP zur Herstellung von nicht-phosphorylierten optischen Kontroll-Sonden enthielt. Die Resistenz der phosphorylierten optischen Sonden gegenüber Chymotrypsinspaltung (Daten nicht dargestellt) bestätigte die vollständige Phosphorylierung der mit CKI behandelten optischen Sonde. Phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Proben der optischen Sonde (2 μM) wurden in einem 50 μl Volumen mit oder ohne 1 Einheit der Serin-/Threoninphosphatase Proteinphosphatase 1 (PP1) für 2 Stunden bei 30° C in einem Puffer bestehend aus 50 mM Tris-Cl, pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01 % Brij-35 und 1 mM MnCl2 inkubiert. Die Reaktionen wurden auf 100 μl mit 50 mM HEPES, pH 7,5 verdünnt, mit Chymotrypsin (0,2 μM) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die Fluoreszenzwerte wurden auf dem Cytofluor wie oben beschrieben gemessen. Vor dem Hinzufügen von Chymotrypsin wiesen alle Reaktionen ähnliche 460/530-Verhältnisse von ungefähr 1,2 auf.
    Tabelle 17
    nicht-phosphorylierte Kontrolle phosphorylierte Kontrolle phosphorylierte Kontrolle + Phosphatase (PP 1)
    460/530-Emissionsverhältnis nach Chymotrypsin 9,8 2,0 10,0
  • Nach dem Hinzufügen von Chymotrypsin (Tabelle 17) lag das 460/530-Verhältnis der nicht-phosphorylierten optischen Sonde bei 9,8, wohingegen das 460/530-Verhältnis der phosphorylierten optischen Sonde 2,0 betrug. Allerdings lag das 460/530-Verhältnis als die phosphorylierte optische Sonde zunächst mit PP1 und dann mit Chymotrypsin behandelt wurde bei 10,0, was darauf hindeutet, dass PP1 annähernd die gesamte optische Sonde dephosphorylierte.
  • Aktivität von Proteinphosphatase 2A
  • Die optischen Sonden wurden auch dahingehend bewertet, ob eine Verwendung derselben zur Messung der Aktivität von Proteinphosphatase 2A (PP 2A) möglich war. Phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Proben der optischen CKI-Sonden wurden präpariert und mit 0,3 Einheiten von PP 2A wie oben beschrieben inkubiert, mit der Ausnahme, dass MnCl2 nicht beinhaltet war. Nach Verdünnung und Hinzufügen von Chymotrypsin wie oben beschreiben, wurden Fluoreszenzwerte unter Verwendung eines 96-Well Plattenlesegeräts (Cytofluor) gemessen. Nach einer 1,5-ständigen Inkubation mit Chymotrypsin lag das 460/530-Emissionsverhältnis der phosphorylierten optischen Sonde bei 1,8 ± 0,2 (Tabelle 18).
    Tabelle 18
    nicht-phosphorylierte Kontrolle phosphorylierte Kontrolle phosphorylierte Kontrolle + Phosphatase (PP 2A)
    460/530-Emissionsverhältnis nach Chymotrypsin 11,0 ± 0,1 1,8 ± 0,2 8,8 ± 0,1
  • Als die phosphorylierte optische Sonde jedoch zunächst mit PP 2A und anschließend mit Chymotrypsin inkubiert wurde, lag das 460/530-Verhältnis bei 8,8 ± 0,1. Dieser Wert beträgt ungefähr 80 % des Wertes, der bei der Behandlung der nicht-phosphorylierten optischen Sonde mit Chymotrypsin erhalten wurde (11,0 ± 0,1). Somit wurde ein Großteil der phosphorylierten optischen Sonde unter den verwendeten Bedingungen dephosphoryliert. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die vorliegende Erfindung auch als ein Assay für die Aktivität der Serin-/Threoninphosphatase PP 2A verwendet werden kann.
  • Vergleichendes Beispiel 10. Bewertung von optischen Sonden für das Screenen auf Inhibitoren von Serin- oder Threoninphosphatase
  • Identifizierung von Inhibitoren von Proteinphosphatase 1
  • Um zu bestimmen, ob der Proteinphosphatase-Assay mit optischer Sonde Inhibitoren von PP1 detektieren konnte, wurde der Phosphatase-Assay in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 μM Microcystin-LR, einem starken Inhibitor von PP1, durchgeführt. Die Phosphatase-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Tatsache, dass die Phosphatase mit Microcystin-LR für einen Zeitraum von 10 Minuten vorinkubieren konnte, bevor phosphorylierte oder nicht-phosphorylierte optische Sonden hinzugefügt wurden. PP1-Reaktionsansätze wurden bei 30° C 1 Stunde lang vorinkubiert und dann in 50 mM HEPES, pH 7,5 auf 100 μl verdünnt, woraufhin Chymotrypsin zu 0,2 μM hinzugefügt wurde. Fluoreszenzwerte wurden auf dem Cytofluor nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wie oben beschrieben gemessen. Nach der Behandlung der phosphorylierten optischen Sonde mit PP1 und anschließend mit Chymotrypsin lag das 460/530-Verhältnis bei 13,2 ± 0,2. Dieser Wert war mit jenem der nicht-phosphorylierten optischen Sonde (13,2 ± 0,1) identisch, was darauf hindeutet, das PP1 die mit CKI behandelte optische Sonde in diesem Versuch vollständig dephosphorylierte (Tabelle 19). In Anwesenheit von 1 μM Microcystin-LR war die PP1-Aktivität jedoch fast vollständig gehemmt, wie das 460/530-Verhältnis von 2,8 ± 0,1 belegt. Kontrollproben, in denen die nicht-phosphorylierte optische Sonde mit Microcystin-LR behandelt wurde, ergaben ein abschließendes 460/530-Verhältnis von 13,3 ± 0,2, wodurch gezeigt wird, dass Microcystin-LR die Chymotrypsinspaltung nicht hemmte. Somit konnte die vorliegende Erfindung verwendet werden, um Inhibitoren von PP1-Aktivität zu detektieren.
    Tabelle 19
    nicht-phosphorylierte optische Sonde + PP1 phosphorylierte optische Sonde + PP nicht-phosphorylierte optische Sonde + PP1 + Microcystin-LR phosphorylier te optische Sonde + PP1 + Microcystin-LR
    Nach Chymotrypsin 13,2 ± 0,1 13,2 ± 0,2 13,3 ± 0,2 2,8 ± 0,1
  • Identifizierung von Inhibitoren von Proteinphosphatase 2A
  • Um zu bestimmen, ob der Proteinphosphatase-Assay mit optischer Sonde Inhibitoren von PP 2A detektieren konnte, wurde der Phosphatase-Assay in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100 nM Microcystin-LR durchgeführt. PP 2A-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt und wurden bei 30° C für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden mit 50 mM HEPES, pH 7,5 auf 100 μl verdünnt, woraufhin Chymotrypsin zu 0,2 μM hinzugefügt wurde. Fluoreszenzwerte wurden auf dem Cytofluor nach 1,5-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Wie oben beschrieben ergab die Behandlung der phosphorylierten optischen Sonde mit PP 2A und anschließend mit Chymotrypsin ein abschließendes 460/530-Verhältnis von 8,8 ± 0,1. In Anwesenheit von 100 nM Microcystin-LR war die PP 2A-Aktivität jedoch vollständig gehemmt, wie das 460/530-Verhältnis von 1,9 ± 0,1 belegt (Tabelle 20). Kontrollproben, in denen die nicht-phosphorylierte optische Sonde mit Microcystin-LR und Chymotrypsin behandelt wurde, ergaben ein abschließendes 460/530-Verhältnis von 11,1 ± 0,2, wodurch gezeigt wurde, dass Microcystin-LR die Chymotrypsinspaltung nicht hemmte. Somit steht fest, dass der Phosphatase-Assay auf Basis von optischen Sonden in der Lage ist, Inhibitoren der PP 2A-Aktivität zu detektieren.
    Tabelle 20
    nicht-phosphorylierte optische Sonde + PP 2A phosphorylierte optische Sonde + PP 2A nicht-phosphorylierte optische Sonde + PP 2A + Microcystin-LR phosphorylierte optische Sonde + PP 2A + Microcystin-LR
    Vor Chymotrypsin 1,4 ± 0,0 1,3 ± 0,0 1,4 ± 0,1 1,4 ± 0,1
    Nach Chymotrypsin 11,1 ± 0,1 8,8 ± 0,1 11,1 ± 0,2 1,9 ± 0,1
  • Beispiel 11. Verwendung von anderen Proteasen zur Messung von Kinase-Aktivität
  • Messung der Aktivität von ERK-Kinase
  • Um zu bestimmen, wie Phosphorylierung auf Serin in der optischen Sonden (SEQ. ID. NO: 24) die Geschwindigkeit der Spaltung von Caspase beeinflusste, wurden Proben von phosphorylierten optischen Sonden und Kontrollproben (nicht-phosphorylierte optische Sonden) mit der Protease Caspase-3 behandelt. Phosphorylierte Proben der optischen Sonden (70 pmol) wurden durch Inkubation zwischen 8 Stunden und Inkubation über Nacht mit ERK2-Kinase (Biomol) hergestellt. Die Reaktionen wurden typischerweise in 10 μl unter Verwendung von 200–500 μM ATP und 50–200 ng ERK2 in einem Puffer bestehend aus 50 mM HEPES; pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA und 1 mM DTT bei 30° C durchgeführt. Negativkontrolle-Kinasereaktionen wurden zur Herstellung von optischen Kontroll-Sonden (nicht-phosphoryliert) wie oben durchgeführt, mit Ausnahme der Tatsache, dass kein ATP verwendet wurde. Zur Überwachung der Spaltung der optischen Sonden durch Caspase-3 wurden 10 μl Volumen von phosphorylierten Proben und (nicht-phosphorylierten) Kontrollproben der optischen Sonde in einzelnen Wells einer 96-Well Multiwellplatte platziert. Spaltungsreaktionen mit Caspase-3 wurden in diesen Proben nach Verdünnung auf 100 μl in einem Puffer bestehend aus 100 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 20 % Glycerin, 0,01 % Brij-35 und 50–100 ng Caspase-3 (Upstate Biotechnology) durchgeführt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Emissionen wurden während der Caspase-3 Inkubation in 5-Minuten Intervallen unter Verwendung eines Cytofluor Plattenlesegeräts wie in Beispiel 1 beschrieben ausgelesen.
  • Wie in 7 gezeigt, ändert sich das 460/530-Emissionsverhältnis, das wie oben beschrieben (Beispiel 1) erhöhte Spaltung der optischen Sonde anzeigt, schneller im Fall der optischen (nicht-phosphorylierten) Kontrollsonde, als dies bei dem phosphorylierten Substrat der Fall ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorylierung der optischen Sonde durch eine auf Serin oder Threonin gerichtete Proteinkinase zu einer Modulation der Spaltungsgeschwindigkeit dieses Substrats durch Caspase-3 führt. Die maximale Differenz bei dem Verhältnis der Fluoreszenzemission ergab sich in diesem Fall 30 Minuten nach Kontakt mit Caspase-3 und führte zu einer mehr als 3-fachen Differenz bei dem Emissionsverhältnis von phosphorylierten zu nicht-phosphorylierten optischen Sonden.
  • Messung von Inhibitoren von Serin- oder Threoninkinase
  • Um zu bestätigen, dass das Assay-Verfahren für die Detektion von Inhibitoren der Aktivität von ERK-Kinase verwendet werden konnte, wurde die Wirkung von Roscovitin (ein bekannter Inhibitor von ERK-Kinase) unter Verwendung der vorliegenden Erfindung untersucht. Zu diesem Zweck wurde ERK-Kinase (50 ng) mit den angegebenen Mengen von Roscovitin (Calbiochem) in Anwesenheit von 100 μM ATP vorinkubiert. Nach 10 Minuten wurden optische Sonden (zu einer abschließenden Konzentration von 0,7 μM) hinzugefügt, und die Inkubationen für weitere 2 h bei 30° C fortgesetzt. Nach der Inkubation wurden die Reaktionsmischungen auf 100 μl verdünnt und Fluoreszenzmessungen wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
  • Die in 8 gezeigten Ergebnisse belegen, dass der Assay die Anwesenheit des Kinase-Inhibitors detektieren konnte. Der berechnete IC50 für Roscovitin unter Verwendung des Assays auf Basis von optischen Sonden betrug 45 μM. Somit zeigen diese Experimente, dass die vorliegende Erfindung ein empfindliches und praktisches System für die Messung von ERK Serin-/Threoninkinase-Inhibitoraktivität zur Verfügung stellt.
  • Die vorliegende Erfindung sieht neuartige optische Sonden und Verfahren für deren Verwendung vor. Während spezifische Beispiele angegeben wurden, ist die obige Beschreibung veranschaulichend und nicht einschränkend. Dem Fachmann werden nach Lektüre dieser Beschreibung viele Variationen der Erfindung ersichtlich sein.
  • Der Schutzumfang der Erfindung ist mit Bezug auf die beigefügten Patentansprüche einschließlich des vollen Schutzumfangs ihrer Äquivalente definiert.
  • Auflistung der SEQUENCE I.D. NO:
    • SEQ. ID. NO: 1 MEEIYGILS
    • SEQ. ID. NO: 2 DEEIYESLE
    • SEQ. ID. NO: 3 GEEEIYGEIEK
    • SEQ. ID. NO: 4 AEAIYAAPL
    • SEQ. ID. NO: 5 EPIYMLSL
    • SEQ. ID. NO: 6 EEEYMMMM
    • SEQ. ID. NO: 7 EEEEYVVI
    • SEQ. ID. NO: 8 EEEEYVLLV
    • SEQ. ID. NO: 9 AEEEYFVLM
    • SEQ. ID. NO: 10 RRRFSIIII
    • SEQ. ID. NO: 11 RRFRSIIII
    • SEQ. ID. NO: 12 RRRKFSLRRKA
    • SEQ. ID. NO: 13 LRRRFSASNL
    • SEQ. ID. NO: 14 KRQFSIDLK
    • SEQ. ID. NO: 15 KRFQSIDLK
    • SEQ. ID. NO: 16 GDQDTYSLLDK
    • SEQ. ID. NO: 17 GDQDYLSLDK
    • SEQ. ID. NO: 18 EDEFSEDEE
    • SEQ. ID. NO: 19 EDFESEDEE
    • SEQ. ID. NO: 20 HHHFSPRKR
    • SEQ. ID. NO: 21 HHFRSPRKR
    • SEQ. ID. NO: 22 HHHFSPRRR
    • SEQ. ID. NO: 23 HHFKSPRRR
    • SEQ. ID. NO: 24 RVDEPFSPGEK
    • SEQ. ID. NO: 25 PRPFSVPP
    • SEQ. ID. NO: 26 RRRFSLRRI
    • SEQ. ID. NO: 27 RRFGSLRRI
    • SEQ. ID. NO: 28 RRRFSRRRR
    • SEQ. ID. NO: 29 RRFHSRRRR

Claims (35)

  1. Eine modifizierte optische Sonde zum Messen von Proteinphosphorylierungsaktivität, die folgendes umfasst: ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid, das eine erste fluoreszierende Gruppe umfasst, wobei dieses Polypeptid ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierung innerhalb des Polypeptids und eine Spaltstelle für Protease innerhalb dieses nicht natürlich vorkommenden Polypeptids umfasst; und wobei die Proteinphosphorylierung dieses Erkennungmotivs die Spaltgeschwindigkeit des nicht natürlich vorkommenden Polypeptids durch eine Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease reguliert und die erste fluoreszierende Gruppe die Detektion des nicht natürlich vorkommenden Polypeptids oder eines Polypeptidfragments davon ermöglicht.
  2. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei dieses Polypeptid des Weiteren eine zweite, an dieses Polypeptid gebundene, fluoreszierende Gruppe umfasst, wobei sich das Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und dieser zweiten fluoreszierenden Gruppe befinden.
  3. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei dieses Polypeptid des Weiteren eine an dieses Polypeptid gebundene lumineszierende Gruppe umfasst, wobei sich das Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und dieser lumineszierenden Gruppe befinden.
  4. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei dieses Polypeptid des Weiteren eine an dieses Polypeptid gebundene Quenchergruppe umfasst, wobei sich das Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und dieser Quenchergruppe befinden.
  5. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Erkennungsmotiv um ein modifiziertes Erkennungsmotiv handelt.
  6. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Spaltstelle für Protease um eine modifizierte Spaltstelle für Protease handelt.
  7. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei dieses Polypeptid in der Länge nicht mehr als 15 Aminosäuren aufweist.
  8. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 1, wobei dieses Polypeptid in der Länge nicht mehr als 50 Aminosäuren aufweist.
  9. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 5, wobei dieses Polypeptid des Weiteren eine Quenchergruppe umfasst, wobei sich das modifizierte Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und dieser Quenchergruppe befinden.
  10. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 5, wobei dieses Polypeptid des Weiteren eine zweite, an dieses Polypeptid gebundene, fluoreszierende Gruppe umfasst, wobei sich das modifizierte Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids zwischen der ersten fluoreszierenden Gruppe und dieser zweiten fluoreszierenden Gruppe befinden.
  11. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 10, wobei die erste fluoreszierende Gruppe ein erstes fluoreszierendes Protein umfasst.
  12. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei der Phosphorylierung um Phosphorylierung durch Tyrosinkinaseaktivität handelt.
  13. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei der Phosphorylierung um Phosphorylierung durch Protein-Serin- oder Threoninkinaseaktivität handelt.
  14. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 10, wobei die Phosphorylierung an der Aminosäureposition, die 1 Aminosäure N-terminal zu der leicht spaltbaren Bindung (P1 Position) mit Bezug auf diese Protease liegt, stattfindet.
  15. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 10, wobei die Phosphorylierung an der Aminosäureposition, die 2 Aminosäuren N-terminal zu der leicht spaltbaren Bindung (P2-Position) mit Bezug auf diese Protease liegt, stattfindet.
  16. Die modifizierte optische Sonde gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei dem fluoreszierenden Protein um ein grün fluoreszierendes Protein aus Aequorea handelt.
  17. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe eine Phosphorylierungsaktivität aufweist, das folgendes umfasst: a) Kontaktieren einer Probe mit einer modifizierten optischen Sonde, wobei diese modifizierte optische Sonde folgendes umfasst: ein Polypeptid umfassend eine erste Gruppe der Sonde, wobei das Polypeptid ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierung innerhalb dieses Polypetids und eine Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids umfasst; und wobei Proteinphosphorylierung dieses Erkennungmotivs die Geschwindigkeit der Spaltung des Polypeptids durch eine Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease reguliert; b) Kontaktieren der Probe und der modifizierten optischen Sonde mit einer Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease; und c) Detektieren mindestens einer optischen Eigenschaft der modifizierten optischen Sonde oder eines Produkts derselben.
  18. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Polypeptid in der Länge nicht mehr als 15 Aminosäuren aufweist.
  19. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Polypeptid in der Länge nicht mehr als 50 Aminosäuren aufweist.
  20. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die optische Eigenschaft eine fluoreszierende Eigenschaft umfasst.
  21. Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei es sich bei der fluoreszierenden Eigenschaft um Fluoreszenzanisotropie handelt.
  22. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das Polypeptid an eine feste Matrix gebunden ist.
  23. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, das des Weiteren einen an dieses Polypeptid gebundenen Quencher umfasst, wobei sich das Erkennungsmotiv und die Proteasestelle zwischen der ersten Gruppe der Sonde und diesem Quencher befinden.
  24. Das Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei der optischen Eigenschaft um Fluoreszenzemission handelt.
  25. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Polypeptid an ein Kügelchen gebunden ist.
  26. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, das des Weiteren eine zweite, an dieses Polypeptid gebundene Gruppe der Sonde umfasst, wobei das Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease sich zwischen der ersten Gruppe der Sonde und dieser zweiten Gruppe der Sonde befinden.
  27. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei es sich bei der optischen Eigenschaft um Fluorescence resonance energy transfer handelt.
  28. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei es sich bei der Protease um eine der folgenden handelt: Caspase 3, Cathepsin G, Chymotrypsin, Elastase, Endoproteinase Asp-N oder Endoproteinase Glu-N.
  29. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei es sich bei der Proteinphosphorylierungsaktivität um Proteintyrosinkinaseaktivität handelt.
  30. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei es sich bei der Proteinphosphorylierungsaktivität um Protein-Serin- oder Threoninkinaseaktivität handelt.
  31. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Testchemikalie die Aktivität einer Proteinphosphorylierungsaktivität reguliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Kontaktieren einer Probe enthaltend ein Enzym, das Proteinphosphorylierungsaktivität aufweist, mit einer Testzusammensetzung und einer modifizierten optischen Sonde, wobei diese modifizierte optische Sonde folgendes umfasst: eine erste, an ein Polypeptid gebundene Gruppe der Sonde, wobei das Polypeptid ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids umfasst; und wobei Proteinphosphorylierung des Erkennungmotivs innerhalb dieses Polypeptids durch diese Proteinphosphorylierungsaktivität die Geschwindigkeit der Spaltung dieses Polypeptids durch eine Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease reguliert, b) Kontaktieren dieser Probe enthaltend das Enzym mit einer Testzusammensetzung und einer modifizierten optischen Sonde mit einer Protease; und c) Bestimmen mindestens einer optischen Eigenschaft dieser modifizierten optischen Sonde.
  32. Ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenzspezifität einer Proteinphosphorylierungsaktivität, das folgendes umfasst: a) Kontaktieren einer Probe enthaltend die Proteinphosphorylierungsaktivität mit einer Bibliothek von modifizierten optischen Sonden, wobei jede dieser modifizierten optischen Sonden folgendes umfasst: eine erste Gruppe der Sonde und einen fluoreszierenden Quencher, gebunden an ein Polypeptid, wobei das Polypeptid ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids umfasst; und wobei Proteinphosphorylierung des Erkennungmotivs innerhalb des Polypeptids durch diese Proteinphosphorylierungsaktivität die Geschwindigkeit der Spaltung dieses Polypeptids durch eine Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease reguliert; und wobei sich das Erkennungsmotiv und die Spaltstelle für Protease zwischen der ersten Gruppe der Sonde und dem fluoreszierenden Quencher befinden, b) Kontaktieren dieser Probe enthaltend die Proteinphosphorylierungsaktivität und der modifizierten optischen Sonde mit einer Protease; und c) Bestimmen einer optischen Eigenschaft dieser Bibliothek der modifizierten optischen Sonden.
  33. Ein System für spektroskopische Messungen, das folgendes umfasst: mindestens ein Reagens für einen Assay, wobei das Reagens für die posttranslationsartige Aktivität erforderlich ist, und eine Vorrichtung, wobei diese Vorrichtung einen Behälter und eine Plattform umfasst, wobei der Behälter folgendes umfasst: a) eine optische Sonde umfassend: eine erste, an ein Polypeptid gebundene Gruppe der Sonde, wobei das Polypeptid ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids umfasst; und wobei Proteinphosphorylierung des Erkennungmotivs innerhalb dieses Polypeptids durch diese Proteinphosphorylierungsaktivität die Geschwindigkeit der Spaltung dieses Polypeptids durch eine Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease reguliert b) eine Probe c) eine Protease mit Spezifität für die Spaltstelle für Protease.
  34. Das System gemäß Anspruch 33, wobei es sich bei dem Behälter um einen Well in einer Multiwellplatte handelt.
  35. Ein System für mikrofluidische, spektroskopische Messungen, das folgendes umfasst: 1) eine Vorrichtung, wobei diese Vorrichtung eine flüssigkeitsgefüllte Struktur mit mindestens einem elektro-osmotischen oder elektrophoretischen System zur Steuerung der Flüssigkeitsbewegung innerhalb der Vorrichtung umfasst; 2) eine optische Sonde, umfassend: eine erste, an ein Polypeptid gebundene Gruppe der Sonde, wobei das Polypeptid ein Erkennungsmotiv für eine Proteinphosphorylierungsaktivität und eine Spaltstelle für Protease innerhalb dieses Polypeptids umfasst; und wobei Proteinphosphorylierung des Erkennungmotivs innerhalb dieses Polypeptids durch diese Proteinphosphorylierungsaktivität die Geschwindigkeit der Spaltung dieses Polypeptids durch eine Protease mit Spezifität für diese Spaltstelle für Protease reguliert. 3) mindestens eine Probe, und 4) eine Protease mit Spezifität für die Spaltstelle für Protease.
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