DE60034566T2

DE60034566T2 - Peptidakzeptor ligationsverfahren

Info

Publication number: DE60034566T2
Application number: DE60034566T
Authority: DE
Inventors: Markus West Newton KURZ; Peter Weston LOHSE; Richard Concord WAGNER
Original assignee: Adnexus Therapeutics Inc
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1999-07-27
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: CA2693274A1; EP1196637A4; DK1870417T3; US7078197B2; CA2377468C; NO20020348D0; CY1113185T1; AU6111200A; EP1196637B1; JP5512463B2; HK1112007A1; KR20020033743A; AU781783B2; DE60034566D1; WO2001007657A1; NO20020348L; US20060246549A1; EP1196637A1; US20020182687A1; ES2284508T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein Ligationsverfahren, insbesondere zum Anfügen von Peptidakzeptoren an Nukleinsäuren.
Es gibt gegenwärtig Verfahren für die Herstellung von RNA-Protein-Fusionen. Eine RNA-Protein-Fusion wird durch Anbringen eines Peptidakzeptors an das 3'-Ende eines RNA-Moleküls, gefolgt von in vitro- oder in situ-Translation der RNA erzeugt. Das Produkt ist ein Peptid, das an das 3'-Ende der dafür kodierenden RNA angebracht ist. Die Erzeugung von diesen RNA-Protein-Fusionen erleichtert die Isolierung von Proteinen mit erwünschten Eigenschaften aus großen Pools von teilweise oder vollständig zufälligen Aminosäuresequenzen und löst das Problem einer Aufdeckung und Amplifikation von Proteinsequenzinformation durch kovalentes Anbringen der RNA-kodierenden Sequenz an ihr entsprechendes Proteinmolekül.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül. Diese Verfahren erleichtern die Herstellung von RNA-Protein-Fusionen, die beispielsweise für die Isolierung von Proteinen oder Nukleinsäuren mit erwünschten Eigenschaften aus großen Pools an teilweise oder vollständig zufälligen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen verwendbar sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren können durch eine Vielzahl von Strategien für ein Anfügen eines Peptidakzeptors an ein Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden. Diese verschiedenen Ansätze unterscheiden sich voneinander in den Bindungstypen, die durch das Anbringen des Peptidakzeptors an die Nukleinsäure ausgebildet werden, und hinsichtlich der für das Anbringen verwendeten Reagenzien. Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül, umfassend ein Bereitstellen eines RNA-Moleküls, ein Bereitstellen eines Peptidakzeptors, der kovalent an ein Nukleinsäure-Linkermolekül gebunden ist, und ein Hybridisieren des RNA-Moleküls an das Nukleinsäure-Linkermolekül unter Bedingungen, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Peptidakzeptor und dem RNA-Molekül erlauben, wobei die 3'-Sequenz des RNA-Moleküls eine Haarnadelstruktur ausbildet oder die 5'-Sequenz des Linkermoleküls eine Haarnadelstruktur ausbildet.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Peptidakzeptor an das RNA-Molekül unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gebunden.
Das RNA-Molekül kann eine Translationsinitiationssequenz und ein Startcodon umfassen, die operativ mit einer Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz gekoppelt sind. Des Weiteren ist ein bevorzugter Peptidakzeptor Puromycin, ein Nukleosid-Analogon, das sich an den C-Terminus einer wachsenden Peptidkette anfügt und eine Translation terminiert. In einer Ausführungsform umfasst der Peptidakzeptor Puromycin, das an einen Linker wie einen Nukleotid-Linker gebunden ist. Dieser Linker erleichtert die Ausrichtung des Peptidakzeptors mit dem RNA-Molekül für ein Anbringen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Linkerregion des Peptidakzeptors nicht-nukleotidische Gruppen wie PEG. Andere Möglichkeiten für Akzeptoren umfassen tRNA-ähnliche Strukturen am 3'-Ende der RNA, sowie andere Verbindungen, die in einer zu Puromycin ähnlichen Weise fungieren. Solche Verbindungen umfassen in nicht begrenzender Weise eine jegliche Verbindung, die eine Aminosäure aufweist, die an Adenin oder eine Adenin-ähnliche Verbindung gekoppelt ist, wie die Aminosäure-Nukleotide Phenylalanyl-Adenosin (A-Phe), Tyrosyl-Adenosin (A-Tyr) und Alanyl-Adenosin (A-Ala), sowie Amid-gekoppelte Strukturen wie Phenylalanyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin, Alanyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin und Tyrosyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin. In einer jeglichen dieser Verbindungen können eine jegliche der natürlich auftretenden L-Aminosäuren oder deren Analoga verwendet werden. Des Weiteren kann erfindungsgemäß ein kombiniertes tRNA-ähnliche 3'-Struktur-Puromycin-Konjugat verwendet werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist eine DNA-Sequenz zwischen dem Ende der Message und dem Peptidakzeptor eingeschlossen. Diese Sequenz soll dazu dienen, dass das Ribosom am Ende des offenen Leserasters eine Pause einlegt, was dem Peptidakzeptor (beispielsweise Puromycin) zusätzliche Zeit gibt, die entstehende Peptidkette aufzunehmen, bevor die Peptidyl-tRNA-Bindung hydrolysiert wird. Während einer in vitro-Translation kann das Ribosom ebenfalls an der Stelle einer chemischen Ligation, insbesondere an einer Psoralen-Quervernetzungsstelle oder an einer PNA-Klammer eine Pause einlegen.
In einer weiteren erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsform werden vorwiegend nicht-nukleotidische Linkergruppen anstelle der an den Peptidakzeptor angebrachten Nukleotid-Linker verwendet. Diese Ausführungsform erleichtert die Ligation eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül. Beispielsweise kann der Linker Triethylenglykol-Spacer enthalten. Der Linker kann auch 2'-OMe-RNA-Phosphoramidite enthalten. In manchen Fällen, in denen eine Hybridisierung eine Voraussetzung für eine chemische oder enzymatische Ligation ist, muss ein ausreichender Teil des Linkers benachbart zu der Ligationsstelle aus Nukleinsäuren bestehen.
Ferner kann die RNA oder der Linker, die/der erfindungsgemäß verwendet wird, eine Sequenz (wie eine Poly(A)-Sequenz) für eine Verwendung bei einer Aufreinigung, z.B. einer Affinitätsaufreinigung, des RNA-Moleküls oder eines RNA-Protein-Fusionsmoleküls, das aus einer solchen RNA oder einem solchen Linker gebildet wird, enthalten.
Das an einen Peptidakzeptor angebrachte RNA-Molekül kann in vitro oder in situ translatiert werden, um ein RNA-Protein-Fusionsmolekül zu erzeugen. Das RNA-Protein-Fusionsmolekül wird sodann bei Hochsalzbedingungen und/oder bei niedriger Temperatur (wie über Nacht bei –20°C) wie durch Szostak et al. (09/247,190) beschrieben inkubiert. Das RNA-Protein-Fusionsmolekül kann auch beispielsweise durch Standard-Poly(A)-Aufreinigungsverfahren aufgereinigt werden.
Ein „Protein" betrifft hier jegliche zwei oder mehr natürlich auftretende oder modifizierte Aminosäuren, die durch eine oder mehrere Peptidbindungen miteinander verbunden sind. „Protein" und „Peptid" werden austauschbar verwendet.
Eine „RNA" betrifft eine Sequenz von zwei oder mehr kovalent miteinander verbundenen, natürlich auftretenden oder modifizierten Ribonukleotiden. Ein Beispiel einer modifizierten RNA, das von diesem Begriff umfasst ist, ist Phosphorothioat-RNA.
Eine „Translationsinitiationssequenz" betrifft eine jegliche Sequenz, die eine funktionelle Ribosomeneintrittsstelle bereitstellen kann. In bakteriellen Systemen wird diese Region manchmal als Shine-Dalgarno-Sequenz bezeichnet.
Ein „Startcodon" betrifft drei Basen, die den Start einer Protein-kodierenden Sequenz signalisieren. Ein „Stoppcodon" betrifft drei Basen, die das Ende einer Protein-kodierenden Sequenz signalisieren. Im Allgemeinen sind Startcodons AUG (oder ATG) und Stoppcodons sind UAA (oder TAA), UAG (oder TAG) oder UGA (oder TGA). Jedoch kann ein jegliches anderes Basentriplet, das als Start- oder Stoppcodon verwendet werden kann, eingesetzt werden.
„Kovalent gebunden" betrifft ein Zusammenfügen, entweder direkt durch eine kovalente Bindung oder indirekt durch eine andere kovalent gebundene Sequenz (beispielsweise DNA, die einer Pausierungsstelle entspricht).
„Nicht-kovalent gebunden" betrifft ein Zusammenfügen durch Mittel, die von einer kovalenten Bindung verschieden sind.
„Haarnadelstruktur" betrifft eine doppelsträngige Region, die durch einen einzelnen Nukleinsäurestrang gebildet wird. Vorzugsweise sind solche Haarnadelstrukturen mindestens 8 Basenpaare lang und mehr bevorzugt 8 bis 15 Basenpaare lang.
„Chemisches Ligieren" betrifft das Zusammenfügen von zwei Molekülen ohne die Verwendung eines Enzyms. Chemische Ligation kann zu nicht-kovalenten sowie kovalenten Bindungen führen.
„Peptidakzeptor" betrifft ein jegliches Molekül, das an den C-Terminus einer wachsenden Proteinkette durch die katalytische Aktivität der ribosomalen Peptidyltransferase-Funktion angefügt werden kann. Typischerweise enthalten solche Moleküle (i) eine Nukleotidgruppe oder eine Nukleotid-ähnliche Gruppe wie Adenosin oder ein Adenosin-Analogon (eine Di-Methylierung an der N-6-Aminoposition ist verträglich), (ii) eine Aminosäuregruppe oder Aminosäure-ähnliche Gruppe wie eine jegliche der 20 D- oder L-Aminosäuren oder ein jegliches Aminosäure-Analogon davon, einschließlich O-Methyltyrosin oder ein jegliches der von Ellman et al. (Meth. Enzymol. 202: 301, 1991) beschriebenen Analoga, und (iii) eine Bindung zwischen den beiden (beispielsweise eine Ester-, Amid- oder Ketonbindung an der 3'-Position oder weniger bevorzugt der 2'-Position). Vorzugsweise bringt diese Bindung die Winkelstruktur des Rings nicht signifikant aus der natürlichen Ribonukleotid-Konformation. Peptidakzeptoren können auch ein Nukleophil aufweisen, das in nicht begrenzender Weise eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Sulfhydrylgruppe sein kann. Des Weiteren können Peptidakzeptoren aus Nukleotid-Mimetika, Aminosäu re-Mimetika oder Mimetika der kombinierten Nukleotid-Aminosäure-Struktur aufgebaut sein.
Ein „Linker" oder „Linkermolekül" betrifft eine Sequenz, die Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide oder Analoga davon enthält.
„Funktionalisieren" betrifft die Modifizierung in einer Weise, die zu der Anfügung einer funktionellen Gruppe oder eines funktionellen Rests führt. Beispielsweise kann ein RNA-Molekül durch
-Oxidation oder Aminierung funktionalisiert werden oder ein Peptidakzeptor kann durch Anbringen einer Amin-, Hydrazin-, (Thio)hydrazid- oder (Thio)semicarbazongruppe funktionalisiert werden.
Eine „externe Matrize" betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem Ligationsreaktionsgemisch gegeben wird, jedoch nicht Teil des Endprodukts der Ligationsreaktion ist.
„Hochsalzbedingungen" betrifft eine Konzentration eines monovalenten Kations von mindestens 200 mM und vorzugsweise mindestens 500 mM oder sogar 1 M und/oder eine Konzentration eines divalenten Kations oder eines Kations mit einer höheren Valenz von mindestens 25 mM, vorzugsweise mindestens 50 mM und am meisten bevorzugt mindestens 100 mM.
„Affinitätsaufreinigungssequenz" betrifft eine Nukleotidsequenz, die bei der Aufreinigung einer Nukleinsäure oder eines Nukleinsäure-Protein-Fusionsmoleküls verwendet wird. Beispielsweise kann eine Affinitätsaufreinigungssequenz eine Poly(A)-Sequenz wie A_8-20 sein, die für eine Aufreinigung von Nukleinsäure- oder Fusionsmolekülen an Oligo-dT-Cellulose verwendet werden kann. Eine Affinitätsaufreinigungssequenz kann auch eine Polypeptidsequenz sein, die für eine Aufreinigung eines Nukleinsäure-Protein-Fusionsmoleküls verwendet wird. Weitere beispielhafte Aufreinigungstechniken sind in Szostak et al. U.S.S.N. 09/247,190 beschrieben.
Die Erfindung stellt eine Reihe von Vorteilen bereit. Beispielsweise erleichtern die hier beschriebenen Verfahren die wirksame Ligation von Peptidakzeptoren an RNA-Moleküle, wobei in manchen Aspekten kein Bedarf für eine externe Matrize besteht, um die RNA und den Peptidakzeptor zusammenzubringen. Die Erfindung verringert auch die Kosten, die mit der Herstellung einer RNA-Protein-Fusion in Verbindung stehen.
Andere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen deutlich werden.
Detaillierte Beschreibung
Die Zeichnungen werden zuerst kurz beschrieben werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Schritten, die bei der Ligation eines Peptidakzeptor-Linkers an eine RNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei einer Haarnadelmatrize beteiligt sind. Entweder bildet die RNA-3'-Sequenz oder der Peptidakzeptor-Linker eine Haarnadelstruktur und der Peptidakzeptor-Linker hybridisiert mit der RNA, wodurch die RNA und der Peptidakzeptor nahe zusammengebracht werden.
2 ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Schritten, die bei der Ligation eines Peptidakzeptor-Linkers an eine RNA unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase beteiligt sind.
3A ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Schritten, die bei der 3'-Modifikation einer RNA durch Hydrazid- und Semicarbazonbildung beteiligt sind.
3B ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Schritten, die bei der 3'-Modifikation einer RNA durch reduktive Aminierung beteiligt sind.
4A–4D sind eine Reihe von Diagrammen, die beispielhafte Strategien für die chemische Ligierung eines funktionalisierten Puromycin-Linkers an eine funktionalisierte RNA zeigen. Eine Strategie ist Matrizen-unabhängig (4A). Andere Strategien umfassen die Verwendung externer Oligo-Matrizen, um die RNA und den Puromycin-Linker auszurichten. Bei den Strategien, die externe Oligo-Matrizen einbeziehen, kann die Oligo-Matrize an sowohl die RNA als auch den Puromycin-Linker hybridisieren (4B), oder an den Puromycin-Linker angefügt sein und mit der RNA hybridisieren (4D). Des Weiteren kann die funktionelle Gruppe am 5'-Ende (4B und 4C) oder im Inneren (4D) des Puromycin-Linkers liegen.
5 ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Schritten, die bei der Synthese eines vollständig geschützten Carbohydrazidphosphoramidits für eine Verwendung in einem modifizierten Pyromycin-Linker beteiligt sind.
6 ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Schritten, die bei der Ligation eines Peptidakzeptor-Linkers an eine RNA durch Anbringen einer funktionellen Gruppe an das 3'-Ende der RNA, gefolgt von einer chemischen Ligation, beteiligt sind. Die funktionelle Gruppe kann sodann mit einem in geeigneter Weise modifizierten Linkermolekül umgesetzt werden, um die RNA und den Puromycin-Linker über eine Thiol- (A), Maleimid- (B) oder Amingruppe (C) kovalent miteinander zu verbinden.
7A–7C sind eine Reihe von schematischen Darstellungen von beispielhaften Schritten, die bei der Ligation eines Peptidakzeptors an eine RNA unter Verwendung von Fotokreuzvernetzung beteiligt sind. In diesem allgemeinen Verfahren quervernetzt eine an den Puromycin-Linker angebrachte Psoralengruppe den Puromycin-Linker bei Exposition gegenüber UV-Strahlung mit der RNA. Die Psoralengruppe kann am 5'-Ende (7A), im Inneren (7B) oder am 3'-Ende (7C) des Puromycin-Linkers liegen.
7D ist eine schematische Darstellung von mRNAs, die für eine Bildung von Fotoquervernetzungen verwendet werden.
7E ist eine schematische Darstellung eines Duplex, das zwischen der konstanten 3'-Sequenz der mRNA (konstante Region der mRNAs von 7D) und dem Fotolinker gebildet wurde, wobei die mögliche Psoraleninterkalationsstelle gezeigt ist. Ebenfalls gezeigt ist die Struktur von Psoralen, das über eine C6-Alkylkette an die 5'-Phosphatgruppe des Linkers angebracht wurde. Die Variablen x und y bestimmen die Anzahl an dA-Nukleotiden bzw. Triethylenglykol-Einheiten (TEG) in dem Linker. Das Autoradiogramm auf der linken Seite zeigt die gelelektrophoretische Analyse der Fotoquervernetzungsreaktion zwischen mRNA 1 und Linker B.
7F ist eine Darstellung eines Gels, das eine in vitro-Translation und Fusionsbildung zeigt. Eine Proteinsynthese von mRNA-Matrize 2 und -Matrize 3 ist in den Spuren 1 bzw. 3 gezeigt. Eine Translation von mRNA-Matrizen, die mit Linker B fotoquervernetzt waren, erzeugte mRNA-Protein-Fusionen (Spuren 2 und 4). Matrize 3 trägt ein Stoppcodon, das der Linkerquervernetzungsstelle folgt. Spur 5 zeigt das Fusionsprodukt nach Aufreinigung auf Oligo-dT-Cellulose. Eine schematische Darstellung einer Fusionsbildung unter Verwendung eines mRNA-Moleküls mit einem Stoppcodon ist über dem Bild des Gels gezeigt.
7G ist eine Darstellung eines Gels, das die Abhängigkeit der Ausbeute eines mRNA-Protein-Fusionsmoleküls von der Linkerzusammensetzung und Salzkonzentration zeigt.
7H ist eine schematische Darstellung der Schritte, die bei der Ligierung von mRNA an fotospaltbare hybridisierte Linker auf Biotinbasis und deren darauf folgende Fusionsbildung beteiligt sind.
8A ist eine schematische Darstellung der Anbringung eines Puromycin-Linkers an eine RNA durch (PNA)₂-RNA-Triplexbildung. Der Puromycin-Linker ist an zwei PNA-Moleküle angebracht, die an RNA binden, wodurch eine Triplehelix durch starke nicht-kovalente Bindungen gebildet wird.
8B ist eine schematische Darstellung von Schritten, die bei der Synthese von PNA-Linker-Konjugaten beteiligt sind. Der Linker ist an einen Festträger angebracht und derart modifiziert, dass er sich an die PNA anfügt. Die PNA wird sodann an den gewünschten Linker gekoppelt und das PNA-Linkermolekül wird entschützt und von dem Festträger abgetrennt.
Hier sind verschiedene Verfahren zum Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül beschrieben. Die RNA kann durch einen jeglichen Standardansatz erzeugt werden, einschließlich normaler zellulärer Synthese, rekombinanter Techniken und chemischer Synthese, und sie umfasst in nicht begrenzender Weise zelluläre RNA, mRNA-Bibliotheken und zufällige synthetische RNA-Bibliotheken. Der Peptidakzeptor (beispielsweise Puromycin) wird typischerweise an einen DNA- oder RNA-Linker gebunden. Solche Peptidakzeptormoleküle können durch ein jegliches Standardverfahren, beispielsweise gemäß Roberts und Szostak (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297, 1997), Szostak et al. ( WO 98/31700 ) und Szostak et al., U.S.S.N. 09/247,190 erzeugt werden. Techniken zur Durchführung eines jeglichen erfindungsgemäßen Verfahrens werden nun detailliert unter Zuhilfenahme spezieller Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht begrenzend zu verstehen.
Beispiel 1: Enzymatische Ligationsverfahren, die T4-DNA-Ligase auf eine Haarnadelmatrize einbeziehen
In einem spezifischen erfindungsgemäßen Ansatz wird T4-DNA-Ligase verwendet, um einen Peptidakzeptor an ein RNA-Molekül unter Verwendung einer Haarnadelenthaltenden Matrize anzubringen wie beispielsweise in 1 gezeigt. Die Ligationsreaktion erfolgt in einer selbst-Matrizen-bildenden Weise und verwendet kein Splint-Oligo. Entweder die 3'-Sequenz der RNA oder das 5'-Ende der Linkerregion des Peptidakzeptors bildet eine Haarnadelstruktur. Eine nahe Positionierung des 5'-Endes der Linkerregion des Peptidakzeptors und des 3'-Endes der RNA zusammen mit einer Haarnadelstruktur erleichtert eine enzymatische Ligation mit T4-DNA-Ligase wie beispielsweise in Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben. Das Verhältnis der Recktanten beträgt etwa 1:1, obwohl ein leichter Überschuss (1:1,2) von einem der Recktanten annehmbar ist. Optimale Ligationsbedingungen können leicht von Reaktion zu Reaktion unterschiedlich sein und können experimentell unter Verwendung bekannter Techniken bestimmt werden.
Beispiel 2: Enzymatische Ligationsverfahren, die terminale Transferase einbeziehen
Ein weiteres enzymatisches Verfahren für das Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül umfasst die Modifizierung des 3'-Endes der RNA, gefolgt von einer Ligation unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase wie beispielsweise in 2 gezeigt. Die TdT-Reaktion erfolgt wie allgemein in Sambrook, Fritsch & Maniatis (supra) beschrieben. Dieses Enzym verlängert das 3'-Ende von Nukleinsäuren mit Desoxy- (oder Didesoxy-) Nukleotidtriphosphaten. Diese (d/dd)NTPs können an ihren Rasenresten chemisch modifiziert sein, um die gewünschten Linkerstrukturen zu tragen (wie beispielsweise in Meyer, Methods in Molecular Biology, Agrawal, Hrsg., Band 26, Totowa: Humana Press, 1994, Seiten 73–91; Kumar et al., Anal. Biochem. 169:376, 1988; Riley et al., DNA 5:333, 1986; und Schmitz et al., Anal. Biochem. 192:222, 1991 beschrieben). Wie in 2 gezeigt, muss das Linkermolekül mit einem (d/dd)NTP beginnen. Der Rest der Linkerzusammensetzung kann jedoch unterschiedlich sein. Ein spezielles Merkmal dieses terminale Transferase-Ligationsverfahrens ist, dass die DNA-Linkerregion des Peptidakzeptors nur eine (d/dd)NTP-Einheit kurz sein kann.

Beispiel 3: Chemische Ligationsverfahren, die eine Funktionalisierung des 3'-Endes einer RNA durch
-Oxidation, gefolgt von chemischer Ligation einbeziehen

Ein Peptidakzeptor kann auch an ein RNA-Molekül durch Funktionalisieren des 3'-Endes der RNA mittels
-Oxidation, gefolgt von chemischer Ligation des Peptidakzeptors an die RNA angebracht werden wie in 3A gezeigt. Die
-Oxidation erfolgt wie nachstehend beschrieben und gemäß den Verfahren von Agrawal (Methods in Molecular Biology, Agrawal, Hrsg., Band 26, Totowa: Humana Press, 1994, Seiten 93–120), Proudnikov und Mirzabekov (Nucleic Acids Res. 24:4535, 1996), Gosh et al. (Anal. Biochem. 178:43, 1989), Bauman et al. (J. Histochem. Cytochem. 29:227, 1981), und Wu et al. (Nucleic Acids Res. 24:3472, 1996). Da der
-Oxidationsschritt strikt ein 1,2-Diol für eine Reaktion erfordert, wird nur das terminale Nukleotid modifiziert, wodurch innere Reste des RNA-Moleküls unbeeinflusst bleiben. Der sich ergebende Dialdehyd kann einer weiteren Reaktion mit verschiedenen Nukleophilen wie Aminen, Hydrazinen, Carbo(thio)hydraziden oder (Thio)semicarbaziden unterzogen werden, was Strukturen ergibt, die zu einer Schiffschen Base ähnlich sind. Diese Reaktionen erfolgen wie beispielsweise in Agrawal (supra), Proudnikov und Mirzabekov (supra), Gosh et al. (supra), Bauman et al. (supra), und Wu et al. (supra) beschrieben. Während die (Thio)hydrazide und (Thio)semicarbazone, die nach Reaktion mit Carbo(thio)hydraziden bzw. (Thio)semicarbaziden erhalten werden, ziemlich stabil sind, erfordern die anfänglichen Addukte, die Amine oder Hydrazine enthalten, gewöhnlich einen darauf folgenden Reduktionsschritt, wie eine reduktive Aminierung, wie in 3B gezeigt und in Agrawal (supra), Proudnikov und Mirzabekov (supra), Gosh et al. (supra), Bauman et al. (supra) und Wu et al. (supra) beschrieben, um die neu gebildeten Bindungen gegenüber einer Hydrolyse zu stabilisieren.
Die vorstehend beschriebenen Kopplungsreaktionen können unter Verwendung einer Reihe unterschiedlicher Strategien wie in den 4A–4D gezeigt erfolgen. Beispielsweise kann die Ligation in einer Weise erfolgen, die von einer externen Matrize unabhängig ist, wie in 4A gezeigt. Die Strategie erfordert einen großen Überschuss an modifiziertem Peptidakzeptor (z.B. einen 100- bis 1000-fachen Überschuss), um eine erfolgreiche Ligation an das RNA-Molekül zu erreichen. Um die Wirksamkeit der RNA-Ligation zu erhöhen, können externe Matrizen-Oligos für eine Substratausrichtung verwendet werden, wie in 4B gezeigt. Vorzugsweise sind solche Oligos, die hinsichtlich der Sequenz zu den RNA- und Peptidakzeptor-Linkersequenzen komplementär sind, mindestens etwa zehn Nukleotide lang. Typischer weise wird dieses Oligo mindestens etwa zehn Nukleotide umfassen, die zu dem RNA-Molekül komplementär sind, und etwa zehn Nukleotide, die zu dem Peptidakzeptor-Linker komplementär sind.
Alternativ können die reaktiven Stellen durch direkte Hybridisierung von Linker- und RNA-Domänen nahe zueinander gebracht werden, wie in den 4C–4D gezeigt. In diesem Fall beträgt die Länge der hybridisierenden Sequenz mindestens 10 bis 15 Nukleotide.
Eine Reihe unterschiedlicher Konstrukte für das Anbringen von Peptidakzeptoren an RNA durch Quervernetzungsbildung kann verwendet werden. Beispielsweise umfasst ein Typus eines beispielhaften Konstrukts einen Peptidakzeptor, der an einen Linker angebracht ist, der eine Modifizierung an seinem 5'-Ende trägt, wie in den 4A–4C gezeigt. Ein alternatives Konstrukt kann eine innere funktionelle Gruppe umfassen, die durch eine Hybridisierungsdomäne an einer Seite und an einen Puromycin-Linker-Anteil an der anderen Seite flankiert wird (4D).
Die Synthese dieser modifizierten Linker umfasst Standard-automatische DNA-Synthese unter Verwendung käuflich verfügbarer Phosphoramidite (Glen Research, Sterling, VA) für ein Zusammenfügen des Hauptkörpers von Nukleotiden oder Abstandsgruppen. Das 3'-Puromycin kann durch die Verwendung von Puromycin-CPG (Glen Research, Sterling, VA) als einen Festträger für eine Synthese eingebracht werden. Das Anbringen der reaktiven funktionellen Gruppen kann unter Verwendung käuflich verfügbarer Reagenzien wie Aminoterminus-Modifikatoren (Glen Research, Sterling, VA) oder Uni-Link-Aminomodifikatoren (Clontech, Palo Alto, CA) erreicht werden. Andere funktionelle Gruppen können unter Verwendung geeigneter Phosphoramidite eingebaut werden. Ein beispielhaftes Verfahren für eine Erzeugung eines Carbohydrazidphosphoramidits ist in 5 beschrieben. Ein Carbohydrazidphosphoramidit wurde durch eine Vereinigung eines Lactons mit Hydrazin und Methanol und Aussetzen der Recktanten gegenüber Reflux für zwei Stunden, um eine Carbohydrazidgruppe zu erzeugen, hergestellt. Die Ausbeute für diesen Schritt der Synthese betrug 97%. Das sich ergebende Produkt wurde sodann mit dem Salz einer Dimethoxytritylgruppe und Pyridin/Toluol bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden umgesetzt, um eine geschützte Carbohydrazidgruppe zu erzeugen. Die Produktausbeute für diesen Schritt betrug 88%. Dieses Produkt wurde weiter mit einer Phosphoramiditgruppe in Gegenwart von Tetrahydrofuran und Diisopropyl amin bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgesetzt, was ein Reaktionsprodukt eines vollständig geschützten Carbohydrazidphosphoramidits ergab (72%).
Des Weiteren kann die Reaktivität des Peptidakzeptors gegenüber der
-oxidierten RNA weiter durch Einbau von mehrfachen Kopien an reaktiven Gruppen verstärkt werden.
Eine beispielhafte Ligationsreaktion wurde wie folgt durchgeführt. 1 nmol RNA, bestehend aus einem Transkript, das für ein Flag-Epitop und einen Strep-Tag kodiert, der Sequenz: 5' G GGA CAA UUA CUA UUU ACA AUU ACA AUG GAC UAC AAG GAC GAU GAC GAU AAG GGC GGC UGG UCC CAC CCC CAG UUC GAG AAG GCA UCC GCU (SEQ ID NO: 1), wurde mit 20 μl 500 mM NaOAc (pH 5,2), 10 μl 5 mM NaIO₄ vereinigt und auf ein Endvolumen von 100 μl mit Wasser gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden 10 μl 10 mM Na₂SO₃ hinzugegeben und das Reaktionsgemisch erneut 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 40 μl 1 M Phosphatpuffer (pH 8,0), 1,5 nmol des Peptidakzeptor-Linkers Uni-A1/8 mit der Sequenz: 5' X CGC GGA TGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu (SEQ ID NO: 2) (worin X ein Uni-Link-Aminomodifikator [Clontech] ist und Pu Puromycin-CPG [Glen Research] ist) und 20 μl NaCNBH₃ wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Gemisch wurde sodann 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, ausgefällt, auf einem 6% TBE-Harnstoff-Gel aufgereinigt und einer Zerkleinerung und Durchtränkung über Nacht unterzogen, um das RNA-Protein-Fusionsmolekül zu erhalten. Diese Reaktion ergab 230 pmol Produkt.
Beispiel 4: Chemische Ligationsverfahren, die ein Anbringen von funktionellen Gruppen an das 3'-Ende eines RNA-Moleküls, gefolgt von chemischer Ligation, einbeziehen
Ein Peptidakzeptor kann auch an ein RNA-Molekül durch Anbringen einer funktionellen Gruppe an das 3'-Ende der RNA, gefolgt von chemischer Ligation angebracht werden, wie in 6 gezeigt. In einer Abänderung des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden reduktive Aminierung und verwandte Reaktionen verwendet, um funktionelle Gruppen an den 3'-Terminus einer RNA anzubringen. Diese neu eingebrachten Gruppen setzen sich sodann weiter mit geeigneterweise modifizierten Linkern auf dem Peptidakzeptor um, was zu der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der RNA und dem Peptidakzeptor führt. Beispielhafte reaktive Gruppen umfassen Thiole (für eine Disulfid-Bildung oder Reaktionen mit thiolphilen Reagenzien wie Pyridyldisulfiden; 6, Reaktion A) oder Maleimide (6, Reaktion B).
Andere mögliche reaktive Gruppen für die Funktionalisierung des 3'-Endes einer RNA, gefolgt von einem Anbringen eines Peptidakzeptors sind Amine. Zum Beispiel können N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) auf 5'-Amino-modifizierten Linkern des Peptidakzeptors durch Umsetzen mit Disuccinimidylglutarat (DSG) oder verwandten Reagenzien wie in Cox et al. (J. Immunol. 145:1719, 1990) und unter http://www.piercenet.com/Products/linksearch.cfm (Pierce, Rockford, IL; 6, Reaktion C) beschrieben erzeugt werden. Dieser modifizierte Linker kann sodann mit der Amino-funktionellen Gruppe der modifizierten RNA umgesetzt werden.
Dieser Typus einer Ligationsreaktion kann in einer externe Matrize-unabhängigen oder -abhängigen Weise wie vorstehend beschrieben unter Verwendung der gleichen allgemeinen Verfahren durchgeführt werden.
Beispiel 5: Chemische Ligationsverfahren, die fotochemische Verfahren einbeziehen
Ein Peptidakzeptor kann auch an ein RNA-Molekül unter Verwendung fotochemischer Verfahren wie in den 7A–7H gezeigt angebracht werden. Peptidakzeptor-Linkermoleküle, die Psoralengruppen tragen, ermöglichen das Einbringen von Quervernetzungen in komplementäre RNA-Stränge bei Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht. Diese Technik kann allgemein wie in Pieles und Englisch (Nucleic Acids Res. 17:285, 1989) und Godard et al. (Nucleic Acids Res. 22:4789, 1994) beschrieben durchgeführt werden. Ein Anbringen der Psoralengruppe an den 5'-Terminus der Linkerregion des Peptidakzeptors kann unter Verwendung käuflich verfügbarer Psoralenamidite, 2'-OMe-RNA-Phosphoramidite, Psoralen-C6-Phosphoramidite und Triethylenglykol (TEG)-Phosphoramidite (Glen Research, Sterling, VA) in einem Standard-DNA-Synthesegerät erfolgen.
In einer Ausführungsform wurde dieses Verfahren wie folgt durchgeführt. 1 nmol RNA, bestehend aus einem RNA-Transkript, das für ein Flag-Epitop und einen Strep-Tag kodiert, und einer fotochemischen Zielstelle, der Sequenz: 5' G GGA CAA UUA CUA UUU ACA AUU ACA AUG GAC UAC AAG GAC GAU GAC GAU AAG GGC GGC UGG UCC CAC CCC CAG UUC GAG AAG AAC GGC UAU A (SEQ ID NO: 3), 1,2 nmol Fotolinker 30/10, bestehend aus der Sequenz: 5' Pso TAG CCG TTC T AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu (SEQ ID NO: 4) (worin Pso ein Psoralen-C2-Amidit [Glen Research] ist und Pu Puromycin-CPG [Glen Research] ist), das gemäß Standardprotokollen des Herstellers synthetisiert wurde, oder 30/15, bestehend aus der Sequenz: 5' Pso TAG CCG TTC TTC TCG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu (SEQ ID NO: 5) (worin Pso ein Psoralen-C2-Amidit ist und Pu Puromycin-CPG ist), 10 × Puffer (250 mM Tris, pH 7,0; 1 M NaCl) und Wasser (um das Endvolumen auf 360 μl zu bringen) wurden vereinigt und 2 Minuten auf 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann 15 Minuten bei 0°C mit einer Wellenlange von mehr als 310 nm unter Verwendung einer 450 W Tauchlampe (Mitteldruck; ACE-Glas, Katalog-Nr. 7825-34), ausgestattet mit einem Pyrex-Absorptionsrohr (ACE-Glas, Katalog-Nr. 7835-44) in einem Quartz-Tauchrohr (ACE-Glas, Katalog-Nr. 7854-25), bestrahlt, wobei sich die Probe in einem Mikrozentrifugationsröhrchen befand, das an das Tauchrohr befestigt war und in Eiswasser gekühlt wurde. Die Probe wurde sodann mit 40 μl 3 M NaOAc und 1000 μl Ethanol ausgefällt und in 75 μl Wasser resuspendiert. Sodann wurden 75 μl 2 × Ladepuffer (Novex) zu der Probe hinzugegeben und die Probe wurde auf einem vorgegossenen 6% TBE-Harnstoff-Gel (Novex) aufgereinigt. Das Produkt wurde durch ein Verfahren einer Zerkleinerung und Durchtränkung (0,3 M NaOAc, über Nacht bei Raumtemperatur), gefolgt von Ausfällen mit Ethanol wiedergewonnen. Dieses Fotoquervernetzungsverfahren ergab 272 pmol RNA-Protein-Fusionsprodukt bei Verwendung von Fotolinker 10/30 und 227 pmol bei Verwendung von Fotolinker 15/30.
Im Fall dieses Fotoquervernetzungsverfahrens einer chemischen Ligation wurden verschiedene Parameter der Reaktion bewertet. Zuerst wurde die Salzabhängigkeit der Fotoquervernetzungsbildung getestet. Ein Satz an Quervernetzungsexperimenten mit Puffern, die 100 bis 1000 mM NaCl enthielten, wurde durchgeführt. Kein Unterschied hinsichtlich der Ligationswirksamkeiten wurde unter den verschiedenen Reaktionen festgestellt. Des Weiteren ergab eine Veränderung der RNA-Zielsequenz zu: 5'... GAC UAC AAG GAC GAG GCA UCC GCU CUU UCA CUA UA (SEQ ID NO: 6) (wobei die unterstrichene Sequenz ein Ziel für den Psoralen-Linker darstellt) signifikant verringerte Produktausbeuten (15 bis 20% verringert), was zeigt, dass die RNA-Zielsequenz wichtig war. Sodann wurde bestimmt, dass die Produktausbeute durch den wiederholten Austausch von Psoralen-Linkern, die während des Reaktionsverlaufs inaktiviert worden waren, erhöht werden konnte. Dieses Experiment wurde wie folgt durchgeführt. Die RNA, Linker und 10 × Puffer wurden vereinigt und auf 80°C 2 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt und wie vorstehend beschrieben bestrahlt. Sodann wurden zusätzlich 1 nmol Linker und 1 μl Puffer hinzugegeben. Der Linker hybridisierte mit der RNA und wurde sodann bestrahlt. Dieser Vorgang wurde durch Zugabe von 2 nmol Linker und 2 μl Puffer und Bestrahlung wiederholt. Dieses Verfahren ermöglichte eine Erhöhung der Produktausbeute von 20% auf mehr als 40% im Fall bestimmter Sequenzen.
Die Leistung der Ligationsprodukte, die durch fotochemische Quervernetzungsverfahren erzeugt worden war, wurde auch bewertet. In Experimenten mit Linkern verschiedener Längen (Psoralen zusammen mit 15 Basenpaaren an Ziel-Hybridisierungsdomäne zusammen mit dA_nCCPu [worin n = 7, 12, 17 oder 22]) wurde Folgendes festgestellt. Lange Linker ergaben die höchste Ausbeute an RNA-Protein-Fusion unter Hochsalzbedingungen (500 mM KCl zusammen mit 50 mM MgCl₂). In Puffern mit verringerter Salzkonzentration (250 mM KCl zusammen mit 10 mM MgCl₂ oder 250 mM KCl) führten die kurzen Linker zu höheren Ausbeuten als die längeren Linker, jedoch waren die Gesamtausbeuten im Allgemeinen geringer. Im Allgemeinen scheinen Ausbeuten zu denjenigen vergleichbar zu sein, die mit enzymatisch ligierten RNA-Matrizen erhalten wurden.
In anderen beispielhaften Verfahren wurden verschiedene mRNAs und Puromycin-Linker synthetisiert, so dass der Peptidakzeptor am 3'-Ende des Linkers lag. Die Linker wurden mit den Ziel-mRNAs hybridisiert und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bei einer Bildung von mRNA-Protein-Fusionsmolekülen durch in vitro-Translationstechniken bewertet. Die Wirkung der Linkerlänge und -zusammensetzung auf die Ausbeute an Fusionsmolekül wurde auch bestimmt.
7D zeigt den Aufbau der für die Quervernetzungsreaktionen verwendeten mRNAs. Ein jedes der RNA-Moleküle enthielt einen Teil der 5'-UTR des Tabakmosaikvirus (TMV) mit einem guten Initiationscodonkontext (Gallie et al., Nucleic Acids Res., 16:883–93, 1988; und Kozak, Microbiol. Rev., 47:1–45, 1983) und ein Translationsinitiationscodon (AUG). Alle mRNAs trugen auch eine 3'-terminale 10 Nukleotide lange Linker-Hybridisierungssequenz, 5'-GCAUCCGCUAUU, die für die Aminosäuresequenz ASA kodiert und mit der Dinukleotidsequenz 5'-UA für eine Psoralenfotoquervernetzung (konst.) endet, wie beschrieben von Sinden und Hagerman (Biochemistry, 23:6299–6303, 198) und Gamper et al. (Photochem. Photobiol., 40:29–34, 1984). Des Weiteren enthielt eine mRNA (mRNA 1) ein Flag-Epitop, DYKDDDDK (Hopp et al., Biotechnology, 6:1205–1210, 1988), gefolgt von einer Strep-Tag II-Se quenz, WSHPQFEK (Schmidt et al., J. Mol. Biol., 255:753–66, 1996). Andere mRNA-Moleküle (mRNAs 2, 3 und 4) enthielten eine 4-4-20 scFv-Anti-Fluorescein-Einzelkettenantikörpermatrize, wie beschrieben von Bedzyk et al. (J. Biol. Chem., 265:18615–20, 1990) und Mallender et al. (J. Biol. Chem., 271:5338–46, 1996). Des Weiteren enthielten die mRNAs 3 und 4 ein stromabwärts gelegenes Stoppcodon (UAA), um eine Freisetzung der mRNA aus dem Ribosom nach Translation von restlicher nicht-quervernetzter Matrize zu induzieren (vgl. infra). Ein Poly-A-Schwanz wurde auch an mRNA 4 für eine Aufreinigung durch Oligo-dT angebracht.
Die in diesen Untersuchungen verwendeten mRNAs (7D) wurden durch T7-RNA-Polymerase-run off-Transkription (Megashortscript Transkriptionskit, Ambion, TX) von PCR-DNA-Matrizen gemäß den Verfahren von Milligan et al. (Nucleic Acids Res., 15:8783–8798, 1987) hergestellt. Nach einer Transkription wurden alle RNAs durch Elektrophorese auf 6% TBE-Harnstoff-Polyacrylamidgelen (Novex, CA) aufgereinigt. Die Produktbanden wurden durch UV-Beschattung sichtbar gemacht, ausgeschnitten, zerkleinert und über Nacht in 0,3 M NaOAc durchtränkt. Nach Ausfällung mit Ethanol wurden die RNAs resuspendiert und in H₂O aufbewahrt. Radiomarkierte RNA wurde gemäß dem gleichen Verfahren durch Einbau von [α-³²P]-UTP (Amersham, IL) in den Transkriptionspuffer synthetisiert.
Die Puromycin-Linker, die in diesen Untersuchungen verwendet wurden (7E), wurden unter Verwendung eines Expedite-Synthesegerätes Modell 8909 (PerSeptive Biosystems, MA) unter Verwendung herkömmlicher Festphasen-Phosphoramiditchemie hergestellt. Puromycin-CPG, DNA-Phosphoramidite, 2'-OMe-RNA-Phosphoramidite, Psoralen-C6-Phosphoramidit und Triethylenglykol (TEG)-Phosphoramidite (Spacer 9) wurden gemäß den empfohlenen Protokollen eingesetzt (Glen Research). Eine Psoralengruppe wurde über eine C6-Alkylkette an das 5'-Phosphat des Linkers angebracht. Flexible Triethylenglykolphosphat (TEG)-Spacer und Polynukleotid-Sequenzen unterschiedlicher Längen wurden verwendet, um 5'-dCdC-Puromycin an das 3'-Ende anzubringen (vgl. die Tabelle in 7E). Die Linker-Hybridisierungssequenz wurde anhand von 2'-OMe-RNA-Phosphoramiditen hergestellt, um die Paarungsstabilität der Stammstruktur zu verstärken (Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131–6148, 1987 und Majlessi et al., Nucleic Acids Res., 26:2224–2229, 1998). Nach Entschützen in konzentriertem Ammoniumhydroxid für 8 Stunden bei 55°C wurden die Linker durch reverse Phase-HPLC auf einer C18-Spheri-5-Säule (Perkin Elmer, CA) mit 50 mM Triethylammoniumacetat in 5% v/v Acetonitril als Puffer A und 50 mM Triethylammoniumacetat in 70% v/v Acetonitril als Puffer B und mit ei ner Flussrate von 1,5 ml/Minute aufgereinigt. Ein linearer Gradient von 15–60% Puffer B über 45 Minuten wurde für eine Elution verwendet. Nach einem Trocknen wurden die Linker resuspendiert und in H₂O aufbewahrt.
Die Linker (5 μM) wurden an die Ziel-mRNAs (2,5 μM) in 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7, und 100 mM NaCl durch Erhitzen auf 85°C für 30 Sekunden, gefolgt von einem Abkühlen auf 4°C über einen Zeitraum von 5 Minuten hybridisiert. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur in Borsilikatglasgefäßen (Kimble/Kontes, NJ) unter Verwendung einer Mehrwellen-Hand-UV-Lampe, Modell UVGL-25 (UVP, CA), auf eine große Wellenlänge (Wellenlange λ > 300 nm) eingestellt, bestrahlt. Das Produktgemisch der Fotoquervernetzungsreaktion zwischen radiomarkierter mRNA 1 und Linker B wurde auf einem denaturierenden 6% TBE-Harnstoff-Gel (Novex) untersucht und auf einem Phosphorimagersystem (Molecular Dynamics, CA) sichtbar gemacht (7E). Diese Fotoquervernetzungsproduktgemische enthielten im Allgemeinen < 20% nicht-umgesetzte und > 80% fotoquervernetzte mRNA und wurden direkt für eine in vitro-Translation und darauf folgende Bildung von mRNA-Protein-Fusion ohne weitere Aufreinigung verwendet. Im Fall der längeren mRNA-Substrate 2, 3 und 4 (> 800 Nukleotide) war der relative Größenunterschied zwischen mRNA und quervernetzter mRNA zu gering, um in einem Gel aufgelöst zu werden. In diesen Fällen wurden die unbehandelten Fotoquervernetzungsreaktionsgemische direkt zu dem Lysat für eine Fusionsbildung ohne weitere Aufreinigung gegeben.
Eine Translation und Fusionsbildung der mRNA-Fusionsmoleküle wurde zuerst unter Verwendung von mRNA 2 in den nachstehenden Experimenten getestet. In vitro-Translationsreaktionen erfolgten unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozytenlysaten (Ambion) für 30 Minuten bei 30°C. Die Reaktionen enthielten 100 pmol fotoquervernetzte mRNA (vgl. oben), 10 mM Creatinphosphat, 150 mM KOAc, 0,5 mM MgCl₂, 0,1 mM einer jeden Aminosäure mit der Ausnahme von Methionin, 150 μCi [³⁵S]-Methionin (Amersham) und 67% v/v Lysat in einem Gesamtvolumen von 300 μl. Bildung von mRNA-Protein-Fusion wurde durch die Zugabe von KCl und MgCl₂ auf Endkonzentrationen von 590 mM bzw. 50 mM in einem Volumen von 500 μl gemäß den Verfahren von Roberts & Szostak und Szostak et al. (supra) verstärkt. Eine Inkubation wurde für weitere 60 Minuten bei 20°C fortgesetzt. Variierende Konzentrationen an KCl und MgCl₂ wurden auch getestet, um die Salzabhängigkeit von der Fusionsbildung zu untersuchen.
Die in vitro-Translationsprodukte wurden durch Verdünnen des Lysats in 10 ml Bindepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,25% v/v Triton X-100) und durch Zugabe zu dem Gemisch von 10 mg Oligo-dT-Cellulose Typ 7 (Pharmacia, NJ) isoliert. Die Proben wurden 60 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Festträger wurde sodann mit 5 ml eiskaltem Bindepuffer gewaschen, gefolgt von einer Elution mit 100 μl-Mengen an deionisiertem H₂O. Die Menge an isolierter mRNA-Protein-Fusion wurde durch Szintillationszählen des eingebauten [³⁵S]-Methionins bestimmt. Das Produkt wurde mittels Elektrophorese auf 4–12% NuPage-Gelen unter Verwendung von MES-Laufpuffer (Novex) untersucht.
Die Gele wurden nach ausgedehntem Waschen, um überschüssiges [³⁵S]-Methionin zu entfernen, getrocknet und Banden wurden auf einem Phosphorimagersystem (Molecular Dynamics) sichtbar gemacht.
Eine Gelanalyse zeigte zwei Banden, die der Peptidyl-tRNA und dem freien Peptid entsprachen (7F, Spur 1). Wenn eine Translation mit fotoquervernetzter mRNA 2 erfolgte, erschien eine dritte und langsamer wandernde Bande, was eine erfolgreiche Bildung von mRNA-Protein-Fusion anzeigte (7F, Spur 2). Erhöhte Ausbeuten an freiem Protein und Fusion (etwa 20% mehr) wurden mit mRNA 3 erhalten, die hinsichtlich der kodierenden Sequenz zu mRNA 2 identisch war, jedoch ein Stoppcodon stromabwärts der Fotoquervernetzungsstelle trug (7F, Spuren 3 und 4). Relative Bandenintensitäten zeigten, dass 30% der Gesamtmenge an synthetisiertem Protein in mRNA-Protein-Fusion umgewandelt worden waren (7F, Spur 4).
Ein mRNA-scFv-Fusionsmolekül, hergestellt aus mRNA 4 von 7E, wurde durch Binden der A₁₈-Linkerregionen an Oligo-dT-Cellulose, gefolgt von Waschen mit Bindepuffer gemäß den Verfahren von Roberts und Szostak und Szostak et al. (supra) aufgereinigt (7E, Spur 5). Das Fusionsprodukt konnte mit einer 1,3%igen Ausbeute basierend auf der Menge an fotoquervernetzter Einsatz-mRNA isoliert werden. Physikalische Eigenschaften (Gelmobilität, Bindung an Oligo-dT-Cellulose, selektive Peptidbindung an Affinitätsreagenzien) der Fusionen, die anhand von fotoquervernetzter mRNA hergestellt worden waren, waren zu denjenigen des Fusionsprodukts identisch, das mit enzymatisch ligierten mRNA-Matrizen erhalten worden war.
Um die Zusammensetzung des Peptidanteils der Fusionsmoleküle zu bestätigen, wurden Fusionen, die mit der mRNA-Matrize 1 in Quervernetzung an Linker B von 7E, kodierend für das Flag- und Strep-Tag II-Epitop, hergestellt worden waren, bezüglich einer Proteinbindung getestet. Eine Lösung von 10 μl ³⁵S-markierter mRNA-Peptid-Fusion (hergestellt anhand von mRNA 1 mit Linker B) wurde zu 20 μl Anti-Flag M2-Affinitätsgel (Sigma, MO) in 300 μl Puffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP 40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄ und 1 mM NaF gegeben. Ein zweites Präzipitationsexperiment wurde durch Zugabe des gleichen Fusionsprodukts zu 20 μl StrepTactin-Sepharose (Genosys, TX) in 300 μl Puffer mit 100 mM Tris-HCl, pH 7,1, 1 mM EDTA und 0,5 mg/ml Hefe-tRNA durchgeführt. Beide Präzipitationsgemische wurden parallel unter identischen Bedingungen behandelt: Die Gemische wurden eine Stunde bei 4°C zentrifugiert und sodann auf eine Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,45 μm; Millipore, MA) übertragen. Der Puffer wurde durch Zentrifugation entfernt und der Rückstand in 5 × 300 μl eiskaltem Puffer gewaschen. Der Rückstand wurde durch Szintillationszählen analysiert und Fusionsbindung wurde auf 54% und 62% für die Anti-Flag-M2-Matrix bzw. die StrepTactin-Matrix bestimmt. Eine Kontrollreaktion mit Protein-A-Agarose (Sigma) zeigte keine nachweisbare Bindung an die Matrix.
Um die Wirkung der Linkerlänge und -zusammensetzung auf Fusionsbildung in Gegenwart verschiedener Salzkonzentrationen zu testen, wurde mRNA 3 an die Linker A-F von 7E fotoquervernetzt und jede Matrize wurde sodann bezüglich Fusionsbildung getestet (7G). Nach Inkubation für 30 Minuten bei 30°C wurden die Proben in kleinere Mengen aufgeteilt, zu denen unterschiedliche Mengen an KCl und MgCl₂ gegeben wurden. Die Proben wurden weitere 60 Minuten bei 20°C inkubiert und sodann das Fusionsprodukt durch Gelelektrophorese analysiert. Die höchsten Ausbeuten an mRNA-Protein-Fusion wurden mit den langen Linkern A und B (40 bzw. 35 Nukleotide) unter Hochsalzbedingungen erhalten. Eine geringere Salzkonzentration führte zu einem signifikanten Abfall hinsichtlich der Fusionsbildung mit den Linkern A und B. Auf der anderen Seite waren die Fusionsausbeuten im Fall der kürzeren Linker C bis F weniger Salz-abhängig. Des Weiteren nahm die Ausbeute des Fusionsmoleküls im Allgemeinen mit der Anzahl an flexiblen TEG-Spacern zu. Eine Analyse der unbehandelten mRNA-Protein-Fusionsmolekül-Lysate zeigte, dass bis zu 45% des Gesamtproteins als mRNA-Protein-Fusion vorlag. Da der Linker F nicht die Oligo-dA-Sequenz aufwies, die für eine Oligo-dT-Aufreinigung erforderlich war, wurde mRNA 4 mit einer A₁₈-Sequenz an ihrem 3'-Ende hergestellt, was eine Aufreinigung der Fusion auf Oligo-dT-Cellulose ermöglichte.
Alternativ zu den vorstehend beschriebenen Techniken, die ein Anbinden von Psoralen au das 5'-Ende des Linkers einbeziehen, kann die Psoralengruppe auch an einer inneren Position der Linkerregion des Peptidakzeptors eingebaut werden, wie in 7B gezeigt und in Pieles et al. (Nucleic Acids Res. 17:8967, 1989) beschrieben, oder durch Einbau eines verzweigten Phosphoramidits (Clontech, Palo Alto, CA) innerhalb der Linkersequenz, gefolgt von einer Zugabe eines Psoralenphosphoramidits (Glen Research, Sterling, VA) eingebracht werden. Beispielsweise kann die Psoralengruppe mit der RNA über einen verzweigten Linker wie in U.S.S.N. 09/453,190 beschrieben quervernetzt werden.
In einer Ausführungsform wurde ein Linker der Sequenz 5' cgt agg cga gaa agt gat X AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu (worin Pu Puromycin-CPG [Glen Research] ist, C und A Standard-3'-Amidite [Glen Research] sind, a, t, c und g 5'-Phosphoramidite [Glen Research] sind und X ein asymmetrisches Verzweigungsamidit [Clontech] ist) gemäß Standard-Herstellerprotokollen, gefolgt von selektiver Entschützung des X am Verzweigungspunkt (gemäß den Anweisungen von Clontech) und darauf folgender Kopplung eines Psoralen-C6-Amidits (Glen Research) synthetisiert. Dieser Linker wurde sodann mit einer RNA mit der Zielsequenz 5'... GCA UCC GCU CUU UCA CUA UA unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Fotoquervernetzungstechniken fotoquervernetzt. Dieses RNA-Linker-Konstrukt wurde sodann erfolgreich für die Synthese von RNA-Protein-Fusionen verwendet.
In einer noch weiteren Ausführungsform kann ein Linker mit einem an das 3'-Ende der Zielhybridisierungsdomäne angebrachten Psoralen auch konstruiert werden (7C). Bei diesem Verfahren wird das 5'-Ende des Psoralen-haltigen Linkers durch einen weiteren Linker, der nach Umkehr der Strangorientierung mit einem 3'-Puromycin endet, verlängert. Eine darauf folgende Spaltung der RNA-Zieldomäne mit RNase H ist optional und wird die Flexibilität des Linker-Konstrukts erhöhen. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz das Anbringen des Linkers an inneren Positionen viel längerer RNA-Moleküle und die nicht translatierte Region stromabwärts der Linkerstelle wird sodann vor einer Translation und RNA-Protein-Fusionsbildung abgetrennt.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens wurde ein Linker mit der Sequenz 5' Pso atg cga gaa agt gat aaa aaa aaa aaa CC Pu (worin Pu Puromycin-CPG [Glen Re search] ist, C ein Standard-3'-Amidit [Glen Research] ist, a, t, c und g 5'-Phosphoramidite [Glen Research] sind und Pso ein Psoralen-C6-Phosphoramidit [Glen Research] ist) gemäß Standard-Herstellerprotokollen hergestellt. Der Linker wurde sodann mit einer RNA mit der Zielsequenz 5'... GUA UAC GCU CUU UCA CUA unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Fotoquervernetzungstechniken fotoquervernetzt. Dieses RNA-Linker-Konstrukt (mit und ohne vorherige Behandlung mit RNase H) wurde sodann erfolgreich für die Synthese von RNA-Protein-Fusionen verwendet.
Ein Vorteil der fotochemischen Verfahren für ein Anbringen eines Peptidakzeptors an eine RNA ist, dass diese Verfahren keine chemische Modifikation der RNA vor einer Ligation erfordern. Dies macht das Verfahren sehr robust und selektiv und ermöglicht die Verwendung einer RNA aus einer unbehandelten T7-Transkriptionsreaktion als Substrat für die chemische Ligation.
Beispiel 6: Fotospaltbares Biotin-basierende RNA-Aufreinigung und Ligation
Falls erwünscht kann ein Affinitäts-basierter RNA-Aufreinigungsschritt mit einem fotochemischen Ligationsverfahren wie vorstehend beschriebenkombiniert werden (7H). Ein geeignetes Linkermolekül wird an seinem Puromycinterminus mit einer fotospaltbaren Biotingruppe (z.B. EZ-Link^TM NHS-PC-LC-Biotin, Pierce, Rockford, IL) modifiziert. Die Ziel-RNA (erhalten beispielsweise aus einer unbehandelten Transkriptionsreaktion) wird sodann an eine definierte Menge an Linker hybridisiert und das sich ergebende Duplex auf einem Festträger wie Streptavidinharz (oder einem verwandten Harz) abgefangen. Die überschüssige RNA sowie die Komponenten der Transkriptionsreaktion werden sodann durch ausgedehntes Waschen entfernt. Eine Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht führt gleichzeitig zu Fotoquervernetzungsbildung und Produktfreisetzung aus dem Harz. Die ligierte RNA kann sodann direkt in eine Translations- und Fusionsbildungsreaktion ohne weitere Aufreinigung eingebracht werden.
Dieses Verfahren ist gegenüber vorherigen RNA-Aufreinigungsschemata vorteilhaft. Beispielsweise muss nach Transkription nur bestimmt werden, dass die Menge an RNA über der Menge an verwendetem Linker liegt. Wenn sie dem beschriebenen Verfahren unterzogen wird, wird die Menge automatisch auf eine Menge verringert, die nicht höher als die Menge an verwendetem Linker ist. Dies wiederum erlaubt, zu dem nächsten Schritt ohne eine weitere Quantifizierung der RNA (oder ligierten RNA) durch beispielsweise Aufzeichnungen von A₂₆₀-UV-Messungen überzugehen und die RNA-Mengen müssen nicht anderweitig eingestellt werden. Das Herstellungsverfahren für das Nukleinsäure-Protein-Fusionsmolekül ist daher geeigneter für eine Automatisierung.
In einer beispielhaften Ausführungsform kann dieses Protokoll einer Biotin-basierenden RNA-Aufreinigung und Ligation wie folgt durchgeführt werden. Bei diesem auf fotospaltbarem Biotin basierenden RNA-Aufreinigungs- und Ligationsverfahren wird der Linker zuerst biotinyliert. Der Linker C6-Psoralen-2-OMe[U AGC GGA UGC] dA₁₈ TEG₂ dCdC-Puromycin wird durch Vereinigen von 100 μl an 100 μM Linker (10 nmol insgesamt), 50 μl an 1 μmol EZ-Link^TM PC-LC-Biotin in DMSO, 20 μl 10 × PBS, pH 7,4, und 30 μl H₂O biotinyliert. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und führt zu einer quantitativen Ausbeute. Das Gemisch wird sodann zweimal mit Ethanol ausgefällt, wobei eine erwartete Ausbeute bei > 90% des PC-biotinylierten Linkers liegt, und in 200 μl H₂O resuspendiert.
RNA wird sodann unter Verwendung von beispielsweise dem T7-Megashortscript-Kit (Ambion) transkribiert. Eine Transkription erfolgt unter Verwendung von 10 pmol einer DNA-Matrize mit der Sequenz GCA UCC GCU AUU UAA A_n am 3'-Terminus für eine 250 μl-Reaktion. Diese Transkriptionsreaktion sollte etwa 2 bis 5 nmol an RNA-Rohprodukt ergeben. Keine Aufreinigung (Phenolextraktion, NAP-5-Säule oder RNeasy-Säule) ist erforderlich, bevor zu dem nächsten Schritt übergegangen wird.
In dem nächsten Schritt dieser Aufreinigungs- und Ligationstechnik wird der biotinylierte Linker (10 μl an 50 pmol/μl biotinyliertem Linker; 500 pmol insgesamt) mit 62,5 bis 250 μl des Transkriptionsgemisches (mit einer geschätzten Minimalmenge von 500 pmol RNA) unter Verwendung beispielsweise einer PCR-Vorrichtung (Erhitzen für 30 Sekunden auf 80°C, sodann Abkühlen auf 4°C bei 0,3°C/Sekunde) zusammen mit 15 μl 5 M NaCl (auf eine Endkonzentration von 0,25 M bei einer 300 μl-Reaktion) und H₂O für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 300 μl hybridisiert. Die RNA des Reaktionsgemisches wird sodann an 100 μl Neutravidinpartikel (Pierce, Rockford, IL) durch vorsichtiges Schütteln des Reaktionsgemisches bei 4°C für 30 Minuten immobilisiert. Die Partikel werden sodann gewaschen und in 300 μl H₂O resuspendiert.
Die Partikel werden sodann abzentrifugiert und 3-mal mit 100 μl Puffer (25 mM Tris, pH 7,0, und 0,25 M NaCl) gewaschen. Sodann werden die Partikel mit UV 15 Minuten bei Raumtemperatur bestrahlt (unter Verwendung einer UV-Handlampe UVGL-25; ein Mikrozentrifugationsröhrchen mit den Partikeln wird direkt auf die Lampe gestellt), um chemisch den Linker mit der RNA zu ligieren und das ligierte Molekül von den Partikeln foto-freizusetzen. Es wird erwartet, dass 250 pmol ligierte RNA foto-freigesetzt werden. 75 μl H₂O werden zu den Röhrchen gegeben, die Röhrchen werden 30 Sekunden vortexiert und die Partikel abzentrifugiert. Der Überstand mit 75 μl mit dem RNA/Linker-Ligationsprodukt wird für eine Translation und Bildung von Nukleinsäure-Protein-Fusionsmolekülen verwendet.
Die Nukleinsäure-Protein-Fusionsmoleküle werden durch Vereinigen der 75 μl an Überstand aus dem vorherigen Schritt, Vereinigen mit 225 μl der Pufferbestandteile und Lysat aus dem Kaninchen-Retikulozytenlysat-Kit (Ambion) und Inkubation des Gemisches für 30 Minuten bei 30°C gebildet. KCl und MgCl₂ werden sodann bei einer Endkonzentration von 500 mM bzw. 50 mM zugegeben und die Reaktion wird weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Nukleinsäure-Protein-Fusionsmoleküle zu erzeugen.
Beispiel 7: Anbringen von Peptidakzeptor an eine RNA über starke nicht-kovalente Bindungen (Vergleichsbeispiel)
Als eine Alternative zu einer Bildung von kovalenten Bindungen für das Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül sind auch Verfahren möglich, die lediglich auf der Bildung eines starken Komplexes beruhen. Ein Verfahren bezieht die Verwendung von Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) für eine Erkennung und Bindung von RNA wie in 8A gezeigt ein. PNAs sind DNA-Mimetika, die ein Rückgrat umfassen, das aus achiralen und ungeladenen N-(2-Aminoethyl)glycineinheiten besteht (Knudsen und Nielsen, Nucleic Acids Res. 24:494, 1996). Es wurde gezeigt, dass PNAs mit Sequenzspezifität und hoher Affinität an komplementäre einzelsträngige DNA und RNA hybridisieren. Insbesondere können Triplehelix-bildende Konstrukte, die zwei PNA-Moleküle umfassen, die an RNA binden, wodurch eine Klammer gebildet wird, wirksame Mittel für eine starke Bindung von RNA bereitstellen, da solche Konstrukte gegenüber thermischer Denaturierung und Bedingungen, die für in vitro-Translation verwendet werden, extrem widerstandsfähig sein können (8A) (Hanvey et al., Science, 258:1481, 1992).
Die Verwendung von Pseudoisocytosinbasen verstärkt weiter die Stabilität bei neutralem und basischem pH-Wert (Egholm et al., Nucleic Acids Res. 23:217, 1995). Es wurde gezeigt, dass solche PNA-Klammern mit mRNA unter in vitro-Translationsbedingungen assoziiert bleiben und nicht durch das Ribosom verdrängt werden können (Knudsen und Nielsen, Nucleic Acids Res. 24:494, 1996). Diese Eigenschaft maximiert die Stabilität der entsprechenden RNA-Protein-Fusionskonstrukte.
Die Herstellung von Nukleinsäure-Linker-PNA-Konstrukten kann durch Festphasensynthese ausgehend von Puromycin-CPG erfolgen, wie in 8B gezeigt und in Uhlmann et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:2633, 1996) beschrieben. Nach Zusammenfügen des gewünschten Nukleinsäureanteils (oder PEG-Spacers, falls erwünscht) unter Verwendung von Standard-automatischer Synthese wird die Festphasensynthese durch Anbringen der PNA-Domäne mit den geeigneten Reagenzien fortgesetzt (beispielsweise wie beschrieben in Uhlman et al. (supra)). Alternativ kann die PNA als getrennte Einheit vorsynthetisiert werden (PE Biosystems, Foster City, CA), gefolgt von einer chemischen Kopplung an den gewünschten Linkeranteil.
In einem spezifischen Beispiel kann ein Puromycin-DNA-Linker mit einer 5'-terminalen Aminogruppe modifiziert werden, die weiter in einen chemisch aktivierten Ester (beispielsweise einen NHS-Ester durch Reaktion mit Disuccinimidylglutarat oder verwandten Reagenzien; diese Technik ist beispielsweise in Cox et al. (J. Immunol. 145:1719, 1990) und unter http://www.piercenet.com/Products/linksearch.cfm, Pierce, Rockford, IL beschrieben) umgewandelt werden kann. Eine darauf folgende Umsetzung mit der PNA-Einheit (mit einem ungeschützten Aminoterminus oder einem carboxyterminalen Lysin) verbindet die Domänen kovalent. Dieser Vorgang kann in einer homogenen Lösung mit dem endgültigen DNA-Linker-Produkt oder mit den DNA-tragenden Schutzgruppen und gekoppelt an das Festharz erfolgen.
Beispiel 8: Optimierung von Linkerlänge und -zusammensetzung
Im Fall aller vorstehend beschriebenen Strategien ist es bevorzugt, das Linker-Konstrukt zu optimieren. Faktoren, die zu berücksichtigen sind, sind beispielsweise der mögliche Einbau von Matrizen-/Ziel-Erkennungselementen und die sterische Zugänglichkeit von gebundenen funktionellen Gruppen. Insbesondere, wenn eine Matrizen- oder Zielerkennung durch Nukleinsäurehybridisierung beteiligt ist, werden Faktoren einschließlich der Zielsequenz und der chemischen Natur des Linkers vorzugsweise optimiert. Beispielsweise ist bekannt, dass die RNA-Hybridisierungsstär ke und dementsprechend die Ligationswirksamkeit durch die Verwendung von 2-OMe-RNA oder Propin-modifizierten Nukleobasen anstelle von DNA erhöht werden (wie beschrieben beispielsweise in Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15:6131, 1987; Kibler-Herzog et al., Nucleic Acids Res. 19:2979, 1991 und Wagner et al., Science 260:1510, 1993).
Die Linker können auch bezüglich ihrer Wirksamkeit in der RNA-Protein-Fusionsreaktion optimiert werden. Dies wird sowohl im Allgemeinen ein Abändern der Länge des Linkers umfassen, kann jedoch auch die Verwendung unterschiedlicher Aufbaublöcke für ein Zusammenfügen von RNA und Protein beteiligen. In einem spezifischen Beispiel können die Desoxynukleotide des Linkers durch PEG-Spacer oder 2-OMe-RNA-Einheiten (beides von Glen Research, Sterling, VA) ersetzt werden.

Claims

Verfahren zum Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül, umfassend: (a) Bereitstellen eines RNA-Moleküls, (b) Bereitstellen eines Peptidakzeptors, der kovalent an ein Nukleinsäure-Linkermolekül gebunden ist, und (c) Hybridisieren des RNA-Moleküls an das Nukleinsäure-Linkermolekül unter Bedingungen, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Peptidakzeptor und dem RNA-Molekül erlauben, wobei die 3'-Sequenz des RNA-Moleküls eine Haarnadelstruktur ausbildet oder die 5'-Sequenz des Linkermoleküls eine Haarnadelstruktur ausbildet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ausbildung der kovalenten Bindung durch T4-DNA-Ligase katalysiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Peptidakzeptor kovalent an ein nicht-nukleotidisches Linkermolekül gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der Linker Triethylenglycol-Spacer umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei der Linker 2'-OMe-RNA-Phosphoramidite umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die RNA oder der Linker eine Affinitätsaufreinigungssequenz enthält und das Verfahren ferner ein Aufreinigen der RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Affinitätsaufreinigungssequenz eine Poly(A)-Sequenz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.