DE60034347T2

DE60034347T2 - Vorrichtung und verfahren für hochdichte elektrophorese

Info

Publication number: DE60034347T2
Application number: DE60034347T
Authority: DE
Inventors: Timothy M. Moss Beach WOUDENBERG; Reid B. Burlingame KOWALLIS
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2020-07-15
Also published as: DE60034347D1; WO2001006228A3; US6660147B1; EP1813683A1; US20040178074A1; EP1204861B1; WO2001006228A2; CA2378091A1; ATE359502T1; EP1204861A4; US20090317824A1; AU6490300A; JP2003504637A; JP3990910B2; US20110124002A1; US7491305B2; AU773950B2; EP1204861A2; US20070128652A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die elektrophoretische Analyse von zu untersuchenden Analyten. Insbesondere betrifft die Erfindung kleinskalige Vorrichtungen zum Durchführen von elektrophoretischen Trennungen und/oder Analysen von Analysen sowie chemische und biochemische Verfahren, die derartige Vorrichtungen einsetzen.
REFERENZEN

Bergot et al., PCT-Veröffentlichungsnr. WO 91/07507.
Eckstein, F., Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach, Kapitel 8 und 9, IRL Press, Oxford, GB (1991).
Fodor, S.P.A., et al., U.S.-Patentnr. 5,445,934 (1995).
Fung et al, U.S.-Patentnr. 4,757,141.
Grossman, P.D., und J.C. Colburn (Hrsg.), Capillary Electrophoresis: Theory and Practice, Academic Press, Inc., London, UK (1992).
Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1992).
Hobbs, Jr., et al., U.S.-Patentnr. 5,151,507.
Huang, X.C., et al., Anal. Chem. 64: 967 (1992).
Jackson, P., PCT-Veröffentlichungsnr. WO 91/05256.
Keller und Manak, DNA Probes, 2. Ausgabe, Stockton Press, New York (1993).
Kheterpal et al., Electrophoresis 17: 1852–1859 (1996).
Landegren et al., U.S.-Patentnr. 4,988,617.
Lee et al., EP 805190 A2 (1997).
Livak et al., PCT-Anmeldenr. PCT/US98/09657.
Madou, M., Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, LLC, Boca Raton, FL (1997).
Mathies, R. A., et al., U.S.-Patentnr. 5,091,652 (1992).
Matthews et al, Anal. Biochem. 169: 1–25 (1988).
Menchen, S., et al., PCT-Veröffentlichungsnr. WO 94/05688 (1994).
Menchen, S., et al., U.S.-Patentnr. 5,188,934 (1993).
Pastinen, T., et al., Genome Res. 7: 606–614 (1997).
Rosenblum et al., Nucl. Acids Res. 25: 4500–4504 (1997).
Sze, S. M., Hrsg., VLSI Technology, 2. Ausgabe, McGraw-Hill Publishing, New York, NY (1988).
Whiteley et al., U.S.-Patentnr. 4,883,750.

HINTERGRUND
Die strukturelle Analyse von Polynukleotiden und anderen Biomolekülen wird in der modernen Molekularbiologie immer wichtiger. Seit der Entwicklung der Polynukleotidamplifizierungstechnologie, wie beispielsweise PCR, und Projekten, die darauf gerichtet sind, das menschliche Genom zu sequenzieren, gibt es ein großes Interesse in diesem Gebiet. Insbesondere die Erfordernis, eine große Anzahl von Proben so schnell wie möglich zu verarbeiten, hat dazu geführt, dass ein Bedarf nach analytischen Systemen mit einer verbesserten Auflösung, Durchsatzrate und Automatisierung besteht.
Es wäre wünschenswert, eine Vorrichtung zu haben, die eine effiziente, großskalige Analyse von vielen Proben in einem Bereich zu ermöglichen, der so klein wie möglich ist, um Kosten und das Ausmaß der Probenhandhabung zu reduzieren. Zur gleichen Zeit sollte die Vorrichtung eine reproduzierbare, hochempfindliche Detektion von zu untersuchenden Analyten liefern. Vorzugsweise sollte die Vorrichtung kompatibel mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Probentypen sein und dazu geeignet sein, mit unterschiedlichen Probensätzen wieder verwendet zu werden.
EP 0 138 763 A2 beschreibt eine Vorrichtung zum Formen von Gelen in Filme bzw. Folien für Dünnschichtelektrophorese. Die Vorrichtung umfasst ein Reservoir, das direkt mit der Öffnung von Formpresswerkzeugen kommuniziert, und zwar mittels einer biegsamen Kapillarleitung, deren äußeres Ende bündig mit der Öffnung abschließt oder sehr wenig in diese eindringt.
ZUSAMMENFASSUNG
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung für die elektrophoretische Trennung von Analyten bereit. In einer bevorzugten Ausführungs form umfasst die Vorrichtung ein planares bzw. ebenes Substrat, das (1) einen zentralen Reservoirbereich definiert, (2) eine Vielzahl von elektrophoretischen Kanälen in fluider Kommunikation mit dem zentralen Reservoirbereich, die im Wesentlichen radial von dem zentralen Reservoirbereich nach außen gerichtet sind und co-planar miteinander sind, wobei jeder Kanal (i) ein proximales Ende aufweist, das mit dem Reservoirbereich verbunden ist, und (ii) ein distales Ende. An dem distalen Ende von jedem Kanal definiert das Substrat ferner wenigstens eine Kammer, die in fluider Kommunikation mit dem distalen Ende des Kanals verbunden ist. Beispielsweise kann jeder Kanal mit einer Probenkammer, einer Proben-aufnehmenden Kammer bzw. Probenaufnahmekammer und einer Laufpufferkammer (running puffer chamber) verbunden sein. Alternativ kann jeder Kanal mit zwei distalen Kammern verbunden sein. Jede Kammer der einen oder mehreren Kammern ist mit dem distalen Ende eines Kanals über einen Durchgangsweg verbunden, der von jeder Kammer in eine Richtung führt, die anfänglich von dem zentralen Reservoirbereich weggerichtet ist, wobei eine Zentrifugation des Substrats um eine zentrale Achse, die senkrecht zu den Kanälen verläuft, wirksam ist, um Flüssigkeit von dem zentralen Reservoirbereich in die Kanäle und Kammern zu verteilen, so dass jedwede Luftblasen in den Kammern, Kanälen und Durchgangswegen in Richtung der Rotationsachse gezwungen werden, wenn eine derartige Flüssigkeit in dem zentralen Reservoirbereich vorhanden ist.
Die Vorrichtung umfasst vorzugsweise Elektroden zum Anlegen eines Spannungspotentials bzw. einer Spannungsdifferenz zwischen den Kammern und dem zentralen Reservoir. Die Vorrichtung kann außerdem einen Detektor zum Detektieren ausgewählter Komponenten umfassen, die in den Kanälen vorhanden sein können. In einer Ausführungsform sind der Detektor und das Substrat derart angeordnet, dass der Detektor und/oder das Substrat relativ zueinander rotiert werden können, um eine Rotationsdetektion zu ermöglichen. Gemäß einem Ansatz kann der Detektor beispielsweise um eine zentrale Achse innerhalb des zentralen Reservoirbereichs rotiert werden, um Signalemission von jedem der Kanäle bei einem ausgewählten Abstand von der Achse oder entlang einer ausgewählten Länge von jedem Kanal zu detektieren. In einer alternativen Ausführungsform kann das Substrat um eine zentrale Achse rotiert werden, so dass die Kanäle sequenziell den Detektor passieren, um eine oder mehrere Komponenten zu detektieren, die in den Kanälen vorhanden sein könnten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Detektor ausgestaltet, ein Fluoreszenzsignal oder ein Chemilumineszenzsignal zu detektieren.
In einer Ausführungsform kann die Vorrichtung ein ringförmiges Septum (annular septum) umfassen, das die Kammern abdeckt und diese teilweise definieren kann und das den Nadelzugriff auf die Kammern für die Zuführung von Flüssigkeiten in die Kammern ermöglicht.
In einer weiteren Ausführungsform können eine oder mehrere der Kanäle ein Elektrophoresemedium enthalten, wie beispielsweise ein kovalent quervernetztes Medium, ein nicht kovalent quervernetztes Medium oder ein fließbares Medium.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Aufbereiten einer Vielzahl von Elektrophoresewegen bereit, die im Wesentlichen blasenfrei sind. Das Verfahren kann das Bereitstellen einer Vorrichtung, wie diese vorstehend beschrieben worden ist, umfassen, so dass der Reservoirbereich eine Flüssigkeit enthält oder in fluider Kommunikation mit einer Flüssigkeitsquelle steht, sowie das Zentrifugieren des Substrats um eine zentrale Achse, die senkrecht zu den Kanälen verläuft, so dass die Flüssigkeit von dem zentralen Reservoirbereich in die Kanäle und Kammern verteilt wird, so dass jedwede Luftblasen in den Kammern, Kanälen und/oder Durchgangswegen in Richtung der Rotationsachse gezwungen werden, was eine Vielzahl von blasenfreien elektrophoretischen Wegen zwischen dem Reservoir und den Kammern liefert.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Verfahren das Bereitstellen einer Vorrichtung, wie diese vorstehend beschrieben worden ist, umfassen, so dass der Reservoirbereich und optional die Kanäle, die Durchgangswege und/oder die Kammern eine Flüssigkeit enthalten, sowie das Zentrifugieren des Substrats um eine zentrale Achse, die senkrecht zu den Kanälen verläuft, so dass die Flüssigkeit von dem zentralen Reservoirbereich in die Kanäle und Kammern verteilt wird, so dass jedwede Luftblasen in den Kammern, Kanälen und/oder Durchgangswegen in Richtung der Rotationsachse gezwungen werden, was eine Vielzahl von blasenfreien elektrophoretischen Wegen zwischen dem Reservoir und den Kammern liefert.
Die vorstehend beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren können außerdem für die Probenanalyse verwendet werden. Gemäß einem Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Analysieren einer Vielzahl von Proben. Das Verfahren umfasst vorzugsweise das Bereitstellen einer Vorrichtung, wie diese vorstehend beschrieben worden ist, so dass der zentrale Reservoirbereich, die Kanäle und die Kammern ein flüssiges Medium enthalten, das für die Elektrophorese derartiger Proben geeignet ist. Proben werden in einer oder mehreren der Probenkammern bereitgestellt und ein elektrisches Feld wird unter Bedingungen angelegt, die wirksam sind, um eine Migration von Probe bzw. Proben durch wenigstens einen Kanal in Richtung des zentralen Reservoirbereichs zu bewirken. Der Kanal bzw. die Kanäle können vor, während und/oder nach der Elektrophorese abgefragt bzw. beobachtet werden, um eine oder mehrere Probenkomponenten in dem Kanal bzw. in den Kanälen zu detektieren.
Die Erfindung kann auf die Trennung und/oder Analyse einer Vielzahl von Proben angewendet werden, insbesondere Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide, kleine Moleküle und dergleichen. Ferner können zu detektierende Probenkomponenten mit detektierbaren Markern markiert werden, wie beispielsweise fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Markern, um die Detektion zu erleichtern. Die Erfindung ist außerdem nützlich in Kombination mit einer großen Vielzahl von Probenaufbereitungsverfahren, wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion, Oligonukleotidligationsassays, Restriktionsfragmentanalyse, Polymersequenzierung, Screeningassays und dergleichen.
Diese und weitere Merkmale und Aspekte der Erfindung ergeben sich eingehender anhand der nachstehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Übersicht eines Substrats gemäß der Erfindung in Querschnittsansicht.
2 zeigt eine vergrößerte Ansicht des zentralen Reservoirs des Substrats von 1.
3 zeigt eine vergrößerte Ansicht des distalen Endes eines Kanals, der über Durchgangswege mit einer Probenkammer, einer Proben-aufnehmenden Kammer und einer Laufpufferkammer verbunden ist.
Die 4A–4C zeigen beispielhafte Ausgestaltungen zum Bereitstellen von Elektroden in den Kammern und dem zentralen Reservoir, um elektrische Spannungen und Ströme zu regeln.
Die 5, 6 und 7 zeigen eine perspektivische Ansicht in Explosionsdarstellung, eine Querschnittsansicht bzw. eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Substratanordnung.
8 zeigt eine Zentrifugenvorrichtung zum Einbringen von Flüssigkeit in ein Kanalarray gemäß der Erfindung mit Flüssigkeiten und zum Entfernen von Luftblasen.
9 zeigt einen Rotationsdetektor zum Detektieren und/oder Überwachen von Probenkomponenten in den Kanälen.
Die 10A–10C zeigen eine Ausführungsform, bei der elektrische Spannungen über eine Kontaktkarte an das Substrat angelegt werden.
Die 11A–11B zeigen eine Ausführungsform, bei der elektrischen Spannungen über Bürstenkontakte an das Substrat angelegt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen, Apparaturen und Verfahren, die dazu geeignet sind, rasch und bequem eine Vielzahl von Proben unter Verwendung der Elektrophorese zu analysieren. Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung radiale Kanalarrays bereit, die elektrophoretische Durchgangswege aufweisen, die, wenn diese mit einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt sind, im Wesentlichen blasenfrei sind. Die Erfindung liefert somit eine verbesserte Verlässlichkeit bei Elektrophoreseanwendungen mit hohen Durchsatzraten.
Die hierin verwendeten Begriffe „Kanal" und „Mikrokanal" sind austauschbar.
I. Vorrichtung
In den 1–7 sind zahlreiche Merkmale eines radialen Kanalarrays gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dargestellt. Wie sich dies 1 entnehmen lässt, definiert das Substrat 20 eine Vielzahl von Mikrokanälen 22, die von einem zentralen Reservoirbereich 24 ausgehen. Jeder Mikrokanal umfasst ein proximales Ende 22a und ein distales Ende 22b. Die Kanäle definieren Linien, die sich an einen zentralen Punkt oder an einer zentralen Achse 24a schneiden (2), und zwar in der Mitte des Arrays. Der zentrale Reservoirbereich 24 stellt einen Haltebereich bzw. eine Haltefläche für einen Elektrophorese-Puffer bereit, der sich in fluider Kommunikation mit den proximalen Enden befindet. Das zentrale Reservoir kann außerdem dazu verwendet werden, um ein Elektrophoresemedium oder ein Waschfluid in die Kanäle einzubringen.
In der in 3 dargestellten Ausführungsform endet jeder Mikrokanal 22 an seinem distalen Ende mit drei Kammern 26a, 26b und 26c, die über Verbindungsdurchgangswege 28a, 28b und 28c mit dem distalen Ende verbunden sind. Jede Kammer ist mit dem dazugehörigen Mikrokanal über einen Durchgangsweg verbunden bzw. verknüpft, der mit einem radial entfernten Bereich der Kammer verbunden ist. Mit anderen Worten: jeder Durchgangsweg führt von jeder Kammer in eine Richtung, die anfänglich weg von dem zentralen Reservoirbereich gerichtet ist, um ein zentrifugales Entfernen von Blasen aus den Durchgangswegen der Elektrophorese zu erleichtern. Die Durchgangswege von jeder der Kammern 26a, 26b und 26c sind vorzugsweise verbunden bzw. verknüpft, um ein T-Injektionsverbindungsstück 30 auszubilden, wobei die Durchgangswege 28a und 28c jeweils einen rechten Winkel hinsichtlich des distalen Mikrokanalendes 22b an dem Verbindungsstück 30 ausbilden. Diese Kammern können für zahlreiche Zwecke verwendet werden, wie beispielsweise als eine Probenkammer, eine Laufpufferkammer oder eine Proben-aufnehmende Kammer bzw. Probenaufnahmekammer, wie dies nachstehend detaillierter beschrieben wird. Wenn beispielsweise die Kammern 26a und 26c als eine Probenkammer und eine Proben-aufnehmende Kammer bzw. Probeaufnahmekammer verwendet werden, dann kann ein elektrisches Feld zwischen diesen zwei Kammern dazu verwendet werden, um ein ausgewähltes Probenvolumen in das Verbindungsstück 30 für eine anschließende Elektrophorese in Richtung des zentralen Reservoirbereichs zu ziehen. Die Kammern können ebenso mit unabhängig regelbaren Elektroden bereitgestellt sein, um elektrische Spannungen und Ströme in der Vorrichtung für unterschiedliche Arbeitsabläufe zu regeln, wie beispielsweise die Elektroden 32a, 32b und 32c, die in den 4A und 4B dargestellt sind, sowie die zentrale Elektrode 32d, die in 4C dargestellt ist.
Vorzugsweise sind die drei Kammern 26a, 26b und 26c, die zu jedem distalen Ende 22b dazu gehören, an unterschiedlichen Radialabständen von der Mitte des Substrats angeordnet, um eine erhöhte Packungsdichte der Mikrokanäle und Kammern zu ermöglichen. In 3 lässt es sich somit erkennen, dass sich die Kammer 26s am nächsten bei der Substratmitte befindet, gefolgt von der Kammer 26c und so dann der Kammer 26b, obgleich andere Anordnungen ebenso verwendet werden können.
Die 4A und 4B zeigen eine teilweise Querschnittsansicht bzw. eine teilweise Draufsicht eines Substrats 20, das Kammern 26a, 26b und 26c umfasst, sowie elektrisch leitende Leitungen (Elektroden) 32a, 32b und 32c, die entlang der Oberfläche des Substrats verlaufen und die sich, wie dargestellt, in jede Kammer erstrecken können. Außerdem dargestellt sind optionale konzentrische Ringkontakte 34a, 34b und 34c, die an der anderen Seite des Substrats angeordnet sind und elektrisch mit den Leitungen 32a, 32b und 32c über Verbindungen 33a, 33b und 33c verbunden sein können, wie dies dargestellt ist. Die konzentrischen Ringkontakte können vorgesehen sein, um elektrophoretische Trennungen in den Kanälen parallel durchzuführen. Die Kammern können mit einer ringförmigen Abdeckung oder einem ringförmigen Septum 50 abgedeckt sein, wie dies nachstehend unter Bezugnahme auf die 5 bis 7 detaillierter beschrieben wird.
4C zeigt eine teilweise Querschnittsansicht des zentralen Bereichs des Substrats, einschließlich der Abdecklage 40, des zentralen Reservoirbereichs 24 und einer mit Gewinden versehenen Befestigungsvorrichtung 38, mittels der das Substrat mit einer Motorwelle 39 verbunden werden kann, um das Substrat um die zentrale Achse 24a zu rotieren. Die Motorwelle ist vorzugsweise elektrisch geerdet, um das Äquivalent einer vierten Elektrode 32b bereitzustellen, die in Kombination mit den Elektroden 32a, 32b und 32c verwendet werden kann, die eine gerichtete Bewegung von geladenen Spezien zwischen Kammern oder in die Kanäle hinein und durch diese hindurch ermöglichen. Jede Elektrode kann mit einer unabhängig regelbaren Spannungsquelle verbunden sein, um die Bewegung von Materialien in den Kammern und Kanälen zu geeigneten Zeitpunkten zu steuern.
Obgleich die 4A bis 4C bestimmte Elektrodenausgestaltungen zeigen, wird man erkennen, dass eine Vielzahl anderer Ausgestaltungen ebenso verwendet werden kann. Beispielsweise können die Elektroden von oberhalb der Kammern bereitgestellt werden, z.B. als Teil einer Abdecklage, die über dem Substrat befestigt ist, in dem die Kanäle, Durchgangswege, Kammern und das zentrale Reservoir definiert sind. Gleichermaßen kann die Elektrode in dem zentralen Reservoir oberhalb des zentralen Reservoirs angeordnet sein, und zwar statt durch den Boden, wie dies mit der Bezugsziffer 32d in 4C dargestellt ist.
Die 5–7 zeigen eine beispielhafte Substratanordnung 100, die ein Substrat 20, eine Kanalabdeckung 40 und eine ringförmige Kammerabdeckung 50 umfasst. Die Kanalabdeckung 40 kann dazu verwendet werden, um das Kanalarray abzudecken, und zwar bevor das Array mit flüssigen Medien gefüllt wird. Die Abdeckung 40 kann zusätzlich einen Einlass 52 für das Einbringen von Flüssigkeit in das zentrale Reservoir des Arrays für das Verteilen in die Kanäle umfassen. Die ringförmige Kammerabdeckung 50 ist bereitgestellt, um die Kammern abzudecken, während oder nachdem diese mit Flüssigkeit gefüllt werden bzw. worden sind.
Die zahlreichen Merkmale des Kanalarrays können jedwede Dimensionen und Ausgestaltungen aufweisen, die mit den Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung kompatibel sind. Kleinere Dimensionen werden im Allgemeinen bevorzugt, um die Dichte von Mikrokanälen zu maximieren, um einen hohen Probendurchsatz zu erleichtern. Beispielsweise können die Mikrokanäle eine Vielzahl von Querschnittsausgestaltungen aufweisen, wie beispielsweise quadratisch, rechteckig, halbkreisförmig, kreisförmig, konkav oder V-förmig, und zwar mit einem großen Bereich von Breiten und Tiefen. Insbesondere kann das Substrat diskrete Kapillarröhren als Mikrokanäle umfassen, die auf einer planaren Oberfläche des Substrats angeordnet sind. Vorzugsweise weisen die Kanäle rechteckige, quadratische oder konkave Querschnitte mit Tiefen und Breiten auf, die üblicherweise zwischen 250 μm bis 1 μm, noch typischer zwischen 100 μm bis 1 μm und vorzugsweise 50 μm oder weniger betragen. Dies betrifft ebenso die Querschnitte der Durchgangswege, die die Kammern mit den distalen Enden der Kammern verbinden.
Die Längen der Kanäle sind so gewählt, um einen gewünschten Grad an Trennung der Probenkomponenten zu ermöglichen, wobei kleinere Längen auf Kosten einer verminderten Trennung kürzere Elektrophoresezeiten liefern und größere Längen auf Kosten längerer Elektrophoresezeiten längere Trennwege und eine bessere Trennung liefern. Beispielsweise sind Kanäle mit einer Länge zwischen 1 cm und 50 cm für zahlreiche Trennungen geeignet, obgleich größere und kleinere Längen ebenso verwendet werden können.
Die Kammern an den distalen Enden der Mikrokanäle können jedwede Ausgestaltung aufweisen, wie beispielsweise kreisförmig, oval, quadratisch und dergleichen, wobei diese jedoch typischerweise kreisförmig sind. Die Größen- und Ausgestaltungen der Kammern, die mit jedem Mikrokanal verbunden sind, können gleich oder unterschiedlich sein. Beispielsweise sollte die Probenkammer groß genug sein, um ein ausreichendes Probenvolumen aufzunehmen, typischerweise 10 μl oder weniger. Im Allgemeinen ist es weiter bevorzugt, dass alle Kammern groß genug sind, um eine hinreichende Menge Puffer zu enthalten, um eine Pufferverminderung während der Elektrophorese zu vermeiden.
Die Elektroden zum Erzeugen elektrischer Ströme können aus irgendeinem geeigneten leitfähigen Material hergestellt werden und sind typischerweise aus einem oder mehreren Metallen oder aus einer oder mehreren Legierungen hergestellt. Beispielhafte Elektrodenmaterialien umfassen Kupfer, Silber, Platin, Palladium, Kohlenstoff, Nichrom und Gold. Die Elektrodenmaterialien können durch bekannte Verfahren ausgebildet werden, und zwar vorzugsweise durch Dampfablagerung, Siebdruck oder andere Musterverfahren. Die Elektrodenmaterialien können mit geeigneten Beschichtungsmaterialien beschichtet werden, um elektrochemische Reaktionen mit Proben und Reagenzien zu unterbinden. Beispielsweise können Elektroden mit einer Permeationsschicht beschichtet werden, die einen Cutoff bei einem niedrigen Molekulargewicht aufweist und den Durchgang von kleinen Ionen ermöglicht, jedoch nicht den von Reagenz- oder Analytenmolekülen, wie dies beispielsweise in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 95/12808 und WO 96/01836 beschrieben wird.
Die Durchgangswege, die von den Kammern zu den Kanälen führen, weisen vorzugsweise eine auf ein Mindestmaß beschränkte Länge auf, um eine rasche Elektrophorese zu erleichtern. Größere Längen als die Minimallängen können jedoch dazu nützlich sein, eine Leckage von Flüssigkeit aus den Kammern in die Kanäle zu vermeiden.
Das Substrat, das das Kanalarray definiert, weist vorzugsweise ein gleichmäßiges Gewicht um dessen zentrale Achse auf, um eine stabile Zentrifugation zu ermöglichen. Typischerweise wird das Substrat in der Form einer Scheibe mit einem im Wesentlichen kreisförmigen Umfang bereitgestellt.
Das Substrat kann aus irgendeinem Material oder aus irgendeiner Kombination von Materialien ausgebildet werden, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind. Materialien, die verwendet werden können, umfassen zahlreiche Kunststoffpolymere- und -Copolymere, wie beispielsweise Polypropylene, Polystyrole, Polyimide und Polycarbonate. Anorganische Materialien, wie beispielsweise Glas und Silizium, sind ebenso nützlich. Silizium ist vorteilhaft hinsichtlich seiner Kompatibilität mit Mik roherstellungstechniken und seiner großen thermischen Leitfähigkeit, was ein rasches Heizen und Kühlen der Vorrichtung erleichtert, falls dies notwendig ist.
Das Kanalarray kann durch irgendein geeignetes bekanntes Verfahren ausgebildet werden. Für Kunststoffmaterialien ist im Allgemeinen das Spritzgießen dazu geeignet, Kanäle und so weiter auszubilden, die eine gewünschte Ausgestaltung aufweisen. Für Silizium können herkömmliche Ätztechniken aus der Halbleiterindustrie verwendet werden, wie dies beispielsweise in Madou (1997) und Sze (1988) beschrieben wird. Ätztechniken können bevorzugt werden für Kanalarrays mit sehr kleinen Abmessungen.
Das Substrat enthält typischerweise zwei oder mehr laminierte Lagen bzw. Schichten. Beispielsweise kann das Kanalarray durch Ätzen oder Spritzgießen in der Oberfläche eines Substrats ausgebildet werden, wonach das Kanalarray abgedichtet wird, indem eine Materiallage darüber angeordnet wird, die zumindest die Kanäle, Durchgangswege, Kammern und optional das zentrale Reservoir abdeckt, um ein Verdampfen von Flüssigkeiten aus dem Array zu vermeiden (siehe 5–7).
Im Allgemeinen können die Substratlagen abdichtend auf eine Vielzahl von Art und Weisen verbunden bzw. verklebt (bonding) werden. Herkömmlicherweise wird eine geeignete Verbindungssubstanz bzw. Bonding-Substanz, wie beispielsweise ein Klebstoff oder ein Harz des Epoxytyps, auf eine oder beide gegenüberliegende Oberflächen aufgebracht, die miteinander verbunden werden sollen. Die Bonding-Substanz kann vollständig auf eine der beiden Oberflächen aufgebracht werden, so dass die Bonding-Substanz (nach dem Aushärten) in Berührung mit den Kammern und/oder den Kanälen kommt. In diesem Fall wird die Bonding-Substanz derart ausgewählt, dass diese mit der Probe und jedweden Detektionsreagenzien kompatibel ist, die in dem Assay verwendet werden. Alternativ kann die Bonding-Substanz um das Kanalarray aufgebracht werden, so dass der Kontakt mit der Probe minimal sein wird oder vollständig vermieden wird. Die Bonding-Substanz kann ebenso als Teil eines Tapes oder einer Membran, das bzw. die auf der Rückseite ein Klebemittel aufweisen, bereitgestellt werden, das sodann in Berührung bzw. Kontakt mit der gegenüberliegenden Oberfläche gebracht wird. Gemäß einem noch weiteren Ansatz wird die abdichtende Verbindung unter Verwendung einer Klebemitteldichtungsringlage erreicht, die zwischen die zwei Substratlagen angeordnet wird. Bei jedem dieser Ansätze kann die Verbindung bzw. das Bonding durch irgendein geeignetes Verfahren erreicht werden, einschließlich beispielsweise Druckabdichten, Ultraschallschweißen und Wärmeaushärtung.
Die Substrate und Vorrichtungen gemäß der Erfindung können ausgestaltet sein, um ein rasches Heizen und Abkühlen der Kammern und Kanäle zu ermöglichen, um die Probenaufbereitung (beispielsweise für die PCR) und/oder die Probentrennung zu erleichtern. In einer Ausführungsform wird die Vorrichtung unter Verwendung einer externen Temperaturregeleinrichtung geheizt oder gekühlt. Die Temperaturregeleinrichtung ist ausgestaltet, eine oder mehrere Oberflächen der Vorrichtung zu heizen bzw. zu kühlen, oder kann ausgestaltet sein, die Detektionskammern selbst selektiv zu heizen. Um das Heizen oder Kühlen gemäß dieser Ausführungsform zu erleichtern, ist das Substratmaterial vorzugsweise aus einem Material ausgebildet, das eine hohe Wärmeleitfähigkeit aufweist, wie beispielsweise Kupfer, Aluminium oder Silizium. Alternativ kann eine Substratlage in Berührung mit den Kammern und/oder Kanälen aus einem Material ausgebildet sein, das eine moderate oder geringe Wärmeleitfähigkeit aufweist, so dass die Temperatur von allen oder ausgewählten Kammern und/oder Kanälen bequemerweise geregelt werden kann, indem die wärmeleitende Lage beheizt oder gekühlt wird, und zwar unabhängig von der Wärmeleitfähigkeit von anderen Lagen in dem Substrat. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Außenlage über einer der Oberflächen des Substrats bereitgestellt, und zwar als ein Kupfertape, das auf einer Rückseite ein Klebemittel aufweist.
In einer alternativen Ausführungsform sind Mittel zum Modulieren der Temperatur der Detektionskammern in dem Substrat der Vorrichtung selbst bereitgestellt. Beispielsweise kann das Substrat resistive Leiterbahnen bzw. Spuren enthalten, die Bereiche berühren, die an die Probenkammern angrenzen, wobei ein Durchtritt eines elektrischen Stroms durch die Leiterbahnen wirksam ist, die Kammern zu heizen oder zu kühlen. Dieser Ansatz ist insbesondere für Substrate geeignet, die auf Silizium basieren, und kann eine bessere Temperaturregelung liefern.
Für eine optische Detektion ist das Material, das das Kanalarray definiert, vorzugsweise optisch durchsichtig oder umfasst wenigstens durchsichtige Bereiche oder Fenster, die ein Betrachten eines Teils jedes Kanals oder des gesamten Kanals ermöglichen, und optional das Betrachten der Kammern, Durchgangswege und/oder anderer Elemente des Kanalarrays ermöglichen. Zu diesem Zweck können auf Silica basierende Gläser, Quarz, Polycarbonat oder eine optisch durchsichtige Kunst stofflage verwendet werden. Die Auswahl des bestimmten transparenten bzw. durchsichtigen Materials wird zum Teil von den optischen Eigenschaften des Materials und den spektroskopischen Eigenschaften des zu detektierenden Signals abhängen. Bei einem auf Fluoreszenz basierenden Assay beispielsweise sollte das Material eine geringe Fluoreszenzemission bei der Wellenlänge bzw. den Wellenlängen aufweisen, die gemessen wird bzw. werden. Das Fenstermaterial sollte außerdem eine minimale Lichtabsorption bei den zu untersuchenden Signalwellenlängen aufweisen.
Andere Lagen oder Materialien können außerdem umfasst werden. Beispielsweise kann die Probenkammer mit einem Material ausgekleidet sein, das eine hohe Wärmeleitfähigkeit aufweist, wie beispielsweise Silizium oder ein wärmeleitendes Metall, um ein rasches Heizen und Kühlen der Probe zu ermöglichen. Siliziumoberflächen, die die Probe berühren, sind vorzugsweise mit einer Oxidationsschicht oder einer anderen geeigneten Beschichtung beschichtet, um die Oberfläche reaktionsträger zu machen. Gleichermaßen kann dort, wo ein wärmeleitendes Metall in dem Substrat verwendet wird, das Metall mit einem inerten Material, wie beispielsweise einem Kunststoffpolymer, beschichtet werden, um eine Korrosion des Metalls zu vermeiden und um die Metalloberfläche von einem Kontakt mit der Probe zu trennen.
Für die Elektrophorese von Proben wird das Kanalarray vorzugsweise mit einem Elektrophoresemedium über den Zentralreservoirbereich gefüllt. Zu diesem Zweck können der zentrale Reservoirbereich und die Kanäle unter Verwendung einer Abdeckung umschlossen werden, die mit einem Einlass ausgestattet ist, um Flüssigkeit in das Array zu transportieren, und die distalen Kammern können mit einer ringförmigen Abdeckung abgedeckt sein, wie beispielsweise der Abdeckung 50 in 5.
In einer Ausführungsform ist die ringförmige Abdeckung porös hinsichtlich Luft, jedoch verhältnismäßig undurchlässig hinsichtlich wässriger Flüssigkeiten. Wie sich dies 5 entnehmen lässt, fließt somit eine Flüssigkeit, die durch den Einlass 42 eingebracht wird, beispielsweise mittels Druck oder einer Zentrifugalkraft, durch die radialen Kanäle und in die distalen Kammern, so dass die verdrängte Luft durch die kreisförmige Abdeckung entweicht. Sobald die Kammern gefüllt sind, stellt die poröse Abdeckung einen Gegendruck bereit, der hinreichend ist, um die Flüssigkeit daran zu hindern, aus den Kammern zu lecken. Die poröse ringförmige Abdeckung kann sodann mit einem ringförmigen Septum ersetzt werden, um die Kammern ab zudichten, wobei jedoch das Einbringen von Fluiden in die Kanäle durch eine Kanüle oder Nadel ermöglicht wird. Gemäß einem alternativen Ansatz wird eine ringförmige Abdeckung, die porös sein kann oder nicht, in unmittelbarer, jedoch nicht abdichtender, Berührung mit dem äußeren Radialbereich des Substrats während des Füllens angeordnet, so dass überschüssige Flüssigkeit durch eine schmale Lücke zwischen der ringförmigen Oberfläche und der äußeren Substratoberfläche entweicht. Nachdem das Füllen abgeschlossen worden ist, kann der ringförmige Ring fest gegen die gegenüberliegende Substratoberfläche gedrückt werden, um die Kammern abzudichten, so dass überschüssige Flüssigkeit zwischen dem ringförmigen Ring und den Substratoberflächen herausgedrückt wird. Das Füllen kann ferner dadurch befördert werden, dass die Substratanordnung in einer Vakuumatmosphäre angeordnet wird, um dabei behilflich zu sein, den Widerstand durch irgendwelche Luft zu verhindern, die in den Kanälen und Kammern vorhanden ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung kann das Füllen der Kanäle mit Flüssigkeit erleichtert werden, indem das Array um die zentrale Achse senkrecht zu der Ebene des Arrays gedreht wird, um Fluid in Richtung des Randes des Arrays durch die Zentrifugalkraft zu treiben. Überdies werden jedwede Blasen in den Kammern in Richtung der Mitte des Arrays weg von den Durchgangswegen getrieben, die die Kammern mit den Kanälen verbinden. In dieser Hinsicht zeigt 8 eine Substratanordnung 100, die in einer Zentrifugierungsvorrichtung 200 angeordnet ist, um die Vorrichtung, wie soeben beschrieben, zu zentrifugieren. Die Substratanordnung 100 wird mit einer Geschwindigkeit und über einen Zeitraum gedreht, die bzw. der ausreicht, um im Wesentlichen alle Blasen aus den Kanälen und Durchgangswegen zu entfernen, um ununterbrochene elektrische und flüssige Durchgangswege zwischen dem zentralen Reservoir und den Kammerelektroden bereitzustellen.
Das Elektrophoresemedium in den Kanälen kann jedwedes Medium sein, das von dem Benutzer für die Zwecke dieser Erfindung als geeignet erachtet wird. Üblicherweise wird es sich bei diesem Medium um ein wässriges Medium handeln, obgleich nicht wässrige Medien ebenso vorstellbar sind. Überdies kann das Medium Mittel enthalten, die die Migrationsraten von Probenkomponenten verringern oder anderweitig verändern. Beispiele für derartige Mittel umfassen wasserlösliche Polymere, wie beispielsweise Agarose, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellullose, Polyethylenglykol, Galaktomannan, Polyvinylalkohol, Polyacrylyloaminomethoxye thanol, Polyethylenimin, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinyloxazolidon, und außerdem Fluor-enthaltende Polymere (siehe beispielsweise Ramakrishna et al., US-Patentschrift Nr. 5,552,028 und 5,567,292; Grossman, US-Patentschrift Nr. 5, 374,527; Menchen et al., US-Patentschrift Nr. 5,468,365; und Grossman et al. (1992)). Die vorstehend erwähnten Materialien können dazu verwendet werden, um verwickelte bzw. verschränkte Matrizen auszubilden, wenn die Konzentrationen hinreichend hoch sind, obgleich verdünntere (nicht verwickelte) Konzentrationen ebenso verwendet werden können. Kovalent quervernetzte bzw. querverbundene Medien, wie beispielsweise Polyacrylamid, das mit Bisacrylamid quervernetzt ist, können ebenso verwendet werden, wobei in diesem Fall das Beladen üblicherweise durchgeführt wird, bevor das Medium quervernetzt wird, z.B. durch eine UV-Bestrahlung oder durch Hinzufügung eines Initiatorreagenz, wie beispielsweise Tetramethylendiamin plus Ammoniumpersulfat.
Falls dies erwünscht ist, können die Innenoberflächen von allen Kanälen oder von einem Teil der Kanäle des Kanalarrays mit jedwedem geeignetem Beschichtungsmaterial beschichtet sein, um die Probenabsorption zu vermindern. Da die Elektrophorese üblicherweise in einem wässrigen Trennmedium durchgeführt wird, kann die Adsorption von Probe üblicherweise dadurch reduziert werden, dass die Innenoberflächen der Trennkavität mit einer hydrophilen Beschichtung beschichtet werden, die potentiell adsorbierende Oberflächenbereiche maskiert bzw. verdeckt. Beispielhafte Reagenzien zum Beschichten adsorbierender Oberflächen umfassen Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyether, Celluloseacetat, Polyalkylenoxide, Poly(vinylpyrrolidon) und andere Materialien, wie diese bekannt sind. Vorzugsweise werden derartige Beschichtungen kovalent an die Innenoberflächen angebracht, obgleich absorbierende nicht kovalente Beschichtungen ebenso geeignet sein können.
Beschichtungsreagenzien zum Vermindern der Probenabsorption können außerdem dazu verwendet werden, um die Größe des elektroosmotischen Flusses (electroosmotic flow; EOF) zu steuern. Beispielsweise kann der EOF entlang Glassilikatoberflächen im Wesentlichen reduziert werden, indem diese mit einem neutralen Reagenz beschichtet werden, das einen bedeutenden Prozentsatz an Oberflächensilanolgruppen maskiert. Das Ausmaß des EOF kann außerdem dadurch kontrolliert werden, indem Beschichtungsreagenzien verwendet werden, die positiv oder negativ geladene Gruppen aufweisen. Positive geladene Beschichtungen können dazu verwendet werden, um negative Oberflächenladungen auszugleichen, um eine Gesamt oberflächenladung von 0 zu liefern, so dass EOF = 0. Beschichtungen mit höheren Dichten positiver Ladung können dazu verwendet werden, um die Richtung des EOFs für geladene Oberflächenmaterialien umzukehren. Dies kann nützlich zum Verlangsamen der Gesamtmigrationsraten von positiv geladenen Probenspezies sein. Im Gegensatz dazu können negativ geladene Beschichtungen dazu verwendet werden, um die Menge der negativen Ladungen auf den Oberflächen zu steigern, um die Gesamtmigrationsraten der negativ geladenen Spezien zu verlangsamen. Repräsentative positiv geladene Beschichtungen umfassen Polyethylenimin, quaternisiertes Polyethylenimin und Chitosan. Repräsentative negativ geladene Beschichtungen umfassen Carboxylat- und Sulfonat-enthaltende Materialien, wie beispielsweise Poly(methylglutamat) und 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonatpolymere. Man wird erkennen, dass geladene Beschichtungen außerdem wirksam Probenadsorption vermindern können, insbesondere bei Proben, die dieselbe Probenpolarität wie die Beschichtung aufweisen (beispielsweise Wiktorowicz, US-Patentschriften Nr. 5,015,350 und 5,181,999).
Die Wahl von Additiven in dem Trennmedium, wenn diese vorhanden sind, wird zum Teil von der Probe und der Art der Innenoberflächen sowie von anderen Faktoren abhängen. Bei einigen Anwendungen kann es wünschenswert sein, sowohl eine kovalente Oberflächenbeschichtung als auch lösliche Puffermittel zu verwenden, um die Probenadsorption und EOF zu steuern.
Proben können von jedweder Quelle stammen, die gelöst oder in einer Flüssigkeit extrahiert werden kann, die mit den Verwendungen der vorliegenden Erfindung kompatibel ist, und die potentiell ein oder mehrere interessante Analyten enthalten kann. Beispielsweise kann es sich bei der Probe um ein biologisches Fluid, wie beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Tränenfluid, Samen, Speichel, Rückenmarksfluid oder ein purifiziertes oder modifiziertes Derivat davon handeln. Proben können außerdem von Pflanzen, Tiergeweben, zellulären Lysaten, Zellkulturen, Mikrobenproben und Bodenproben gewonnen werden. Die Probe kann gereinigt sein oder vorbehandelt sein, falls dies notwendig ist, und zwar vor dem Testen, um Substanzen zu entfernen, die andernfalls die Analytendetektion stören könnten. Typischerweise wird es sich bei dem Probenfluid um eine wässrige Lösung handeln, insbesondere für polare Analyten, wie beispielsweise Polypeptide, Polynukleotide und Salze. Die Lösung kann Oberflächenmittel oder Detergenzien enthalten, um die Analytenlöslichkeit zu verbessern. Für nicht polare und hydrophobe Analyten können organische Lösungsmittel geeigneter sein.
Für jeden Kanal wird Probe vorzugsweise in eine distale Kammer geladen, die hierin als eine Probenkammer bezeichnet wird, und zwar durch Injektion durch eine Kammerwand, z.B. über ein Septummaterial, wie dies vorstehend beschrieben worden ist. Bereits vorhandener Luft und/oder Flüssigkeit in der Kammer wird es vorzugsweise ermöglicht, aus der Kammer über eine zweite Nadel einer Kanüle zu entweichen, die durch die Kammerwand geführt ist, so dass die Kammer vorzugsweise gleichmäßig mit der Probe gefüllt wird. Eine oder mehrere der anderen distalen Kammern von jedem Kanal können ebenso mit einem ausgewählten flüssigen Medium unter Verwendung derselben Füll- bzw. Ladetechnik gefüllt werden. Das Probenladen kann unter Verwendung einer robotisch gesteuerten Probenabgabevorrichtung automatisiert werden, falls dies erwünscht ist.
Nachdem das Beladen bzw. Füllen mit Probe abgeschlossen ist, kann das Substrat, wie vorstehend unter Bezugnahme auf 7 beschrieben, zentrifugiert werden, um jedwede Luftblasen in Richtung der Mitte des Kanalarrays zu treiben sowie aus den unterschiedlichen Wegen für die Elektrophorese heraus.
Im beladenen Zustand wird ein Probenaliquot vorzugsweise von der Probenkammer zu dem distalen Ende des Kanals übertragen, indem ein elektrisches Feld zwischen der Proben-enthaltenden Kammer und einer ausgewählten „Senkenkammer" (Abfallkammer) angelegt wird. Wie sich dies 3 entnehmen lässt, kann beispielsweise die Probe in Kammer 26a elektrokinetisch in das Verbindungsstück 30 übertragen werden, indem ein elektrisches Feld zwischen den Kammern 26a und 26c angelegt wird. Die Probenmenge (Probenstopfen), die in den Durchgangsweg des Kanals 22 überführt wird, ist proportional zu den Querschnitten der Durchgangswege 28a und 28c an dem Verbindungsstück 30 (das die anfängliche Bandbreite des Aliquots definiert) und durch den Querschnitt des Kanals 22 an dem Verbindungsstück 30. Nachdem das erste elektrische Feld abgestellt worden ist, wird ein elektrisches Feld zwischen der Kammer 26b und dem zentralen Reservoir 24 angelegt, um somit den Probenstopfen in den Kanal 22 zu ziehen und die Trennung von Probenkomponenten auf der Grundlage unterschiedlicher elektrophoretischer Mobilitäten einzuleiten. Jedwede andere geeignete Probeladesequenz kann ebenso verwendet werden.
Elektrophoretische Vorgänge können in den Kanälen gleichzeitig (parallel), individuell (sequenziell) oder als eine Kombination von diesen durchgeführt werden. Wie sich dies den vorstehend beschriebenen 4A–4C entnehmen lässt, kann die Elektrophorese sequenziell durchgeführt werden, indem geeignete Spannungen an Elektroden 32a, 32b, 32c und 32d angelegt werden (ohne dass Ringe 34a–34c und Verbindungsstücke 33a–33c erforderlich sind). Herkömmlicherweise kann dies erreicht werden, indem eine elektrische Kontaktkarte an die Ober- oder Unterseite des Substrats angebracht wird, so dass die Kontaktkarte individuelle elektrische Kontakte aufweist, die mit den Substratelektroden ausgerichtet sind, wie dies in den 10A–10C dargestellt ist.
Die 10A–10C zeigen eine Querschnittsseitenansicht und eine Draufsicht einer beispielhaften Kontaktkarte 400, die dazu verwendet werden kann, um unterschiedliche elektrische Spannungen an die distalen Kammern eines Mikrokanals anzulegen. Die Kontaktkarte 400 umfasst obere und untere Vorsprünge 402a und 402b, die eine Kavität zwischen diesen definieren, um schmiegsam eine elektrische Leitung auf dem Substrat zu ergreifen, wie beispielsweise die elektrischen Leitungen 32a, 32b und 32c (4B und 10C). Die oberen und unteren Vorsprünge der Karte bestehen vorzugsweise aus einem biegsamen Material, so dass die Kontaktkarte ohne Weiteres auf dem Substrat 20 eingeklemmt werden kann und von diesem entfernt werden kann. Die Kontaktkarte 400 umfasst außerdem elektrische Leitungen 404a, 404b und 404c, die freiliegende Enden 406a, 406b bzw. 406c aufweisen, um elektrische Leitungen 32a, 32b und 32c zu berühren, wie dies in der Querschnittsseitenansicht von 10C dargestellt ist.
Gleichzeitige elektrophoretische Vorgänge können bequemerweise durchgeführt werden, indem geeignete Spannungen an einen oder mehrere leitfähige Ringe angelegt werden, die elektrisch mit den Elektroden in den distalen Kammern verbunden sind, wie beispielsweise die Ringe 34a, 34b und 34c, die in den 4A und 4B dargestellt sind. Bei dieser Ausführungsform werden die Spannungspotentiale bzw. Spannungsdifferenzen vorzugsweise über leitfähige Bürsten bereitgestellt, die in Kontakt mit den konzentrischen Ringen verbleiben können, während das Substrat um dessen Achse für eine Analytendetektion rotiert wird, falls dies erwünscht ist. Wie sich dies den 11A und 11B beispielsweise entnehmen lässt, wird ein Substrat 20 mit konzentrischen Ringkontakten, wie beispielsweise den in 4A dargestellten Kontakten 34A, 34B und 34C, von entsprechenden Bürstenkontakten 502a, 502b und 502c berührt, die von einem oder mehreren Haltern gehalten werden, wie beispielsweise den Haltern 504a, 504b und 504c.
Die gleichzeitige Elektrophorese weist den Vorteil einer schnelleren Probenanalyse auf. Die sequenzielle Elektrophorese andererseits ermöglicht eine genauere Regelung bzw. Kontrolle der Elektrophoresebedingungen in jedem Kanal.
Zu untersuchende Probenkomponenten können in den Kanälen mittels einer Vielzahl von Techniken detektiert werden, wie beispielsweise Fluoreszenzdetektion, Chemilumineszenzdetektion, UV-sichtbare Adsorption, Radioisotopendetektion, elektrochemische Detektion sowie Biosensoren. Bei optischen Detektionsverfahren (z.B. Fluoreszenz, Absorptionsvermögen oder Chemilumineszenz) sollte die Substratanordnung wenigstens eine Detektionszone in der Nähe des proximalen Endes von jedem Kanal enthalten.
Typischerweise wird die optische Detektion von oberhalb oder unterhalb der Ebene der Substratanordnung durchgeführt. Im Allgemeinen werden zu detektierende optische Signale die Absorption oder die Emission von Licht mit einer Wellenlänge zwischen ungefähr 180 nm (Ultraviolett) und ungefähr 50 μm (fernes Infrarot) enthalten. Bevorzugt liegt die Wellenlänge zwischen ungefähr 200 nm (Ultraviolett) und ungefähr 800 nm (nahes Infrarot). Für die Fluoreszenzdetektion weist vorzugsweise jedwedes undurchsichtige Substratmaterial in der Detektionszone ein geringes Reflektionsvermögen auf, so dass die Reflektion des einfallenden Lichts zurück zum Detektor auf ein Mindestmaß beschränkt wird. Ein hohes Reflektionsvermögen wird jedoch wünschenswert sein für Detektionen, die auf Lichtabsorption basieren. Bei der Chemilumineszenzdetektion, bei der Licht einer bestimmten Wellenlänge üblicherweise erzeugt wird, ohne dass die Probe mit einer externen Lichtquelle bestrahlt wird, sind die Absorptions- und Reflektionseigenschaften der Substratanordnung weniger wichtig, falls wenigstens ein optisch transparentes Fenster pro Kanal zum Detektieren des Signals vorhanden ist. Vorzugsweise ist die gesamte Substratanordnung transparent, um eine Visualisierung des gesamten Kanalarrays zu ermöglichen.
Wenn das Material, das die Oberseite und die Seiten der Kanäle definiert, optisch klar ist und die Detektion Fluoreszenzmessungen umfasst, dann können die Kanäle mit Anregungslicht durch die Seiten der Kanäle (parallel zu der Ebene der Substratanordnung) oder typischerweise diagonal von oben (z.B. in einem Winkel von 45°) bestrahlt werden, und emittiertes Licht wird von oberhalb der Substratanordnung üblicherweise in einer Richtung gesammelt, die senkrecht zu der Ebene des Kanalarrays verläuft.
9 zeigt ein beispielhaftes Detektionssystem 300, das eine Rotationsplatte 302, eine Substratanordnung 100 und einen Detektorarm 304 umfasst. Der Detektorarm 304 trägt eine Detektorstange 306 mit einem unteren Ende, das über einer ausgewählten Detektionszone auf dem Kanalarray der Anordnung 100 positioniert ist. Im Betrieb wird die Detektorstange 306 über einer Detektionszone eines Kanals für eine Zeitdauer (oder Zeitdauern) positioniert, die ausreichend ist bzw. sind, um ein Signal von dem Kanal zu sammeln, um das Vorhandensein von einer oder mehreren Probenkomponenten in dem Kanal zu identifizieren und/oder zu quantifizieren.
Gemäß einem Ansatz verbleibt die Detektorstange über der Detektionszone des Kanals während der elektrophoretischen Trennung der Probe, um ein Elektropherogramm von Komponenten kontinuierlich oder bei diskreten Zeitpunkten aufzuzeichnen, während diese entlang der Detektorstange wandern. Nachdem die erwünschte Information gesammelt worden ist, wird die Anordnung 100 rotiert, so dass der Detektor über der Detektionszone in dem nächsten Kanal positioniert wird, und ein weiteres Elektropherogramm wird aufgezeichnet. Somit wird die Elektrophorese sequenziell von Kanal zu Kanal durchgeführt, bis die erwünschten Elektropherogramme erhalten worden sind.
Gemäß einem weiteren Ansatz werden Signale periodisch in jedem Kanal während einer simultanen Elektrophorese in zwei oder mehr Kanälen gemessen, indem die Anordnung zu ausgewählten Zeitintervallen rotiert wird, um Elektropherogramme gleichzeitig als eine Reihe von Zeitpunkten zu sammeln. Vorzugsweise ist die Frequenz der Datenerfassung von jedem Kanal hinreichend, um die Erfassung von wenigstens zwei Punkten und vorzugsweise mehr pro Komponentenpeak sicherzustellen, um die Genauigkeit und die Empfindlichkeit der Detektion zu verbessern.
Die zu messenden Probenkomponenten oder Analyten können markiert sein, um eine empfindliche und genaue Detektion zu erleichtern. Marker können direkte Marker sein, die selbst detektiert werden können, oder indirekte Marker, die in Kombination mit anderen Mitteln detektierbar sind. Beispielhafte direkte Marker umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fluorophore, Chromophore (z.B. ³⁰P, ³⁵S, ³H), Spinmarker, Chemilumineszenzmarker (beispielsweise Dioxetan-erzeugende Reste), Radioisotope und dergleichen. Beispielhafte indirekte Marker umfassen Enzyme, die ein Signal-erzeugendes Ereignis katalysieren, sowie Liganden, wie beispielsweise ein Antigen oder Biotin, die spezifische Bindungen mit hoher Affinität zu einem detek tierbaren Antiliganden eingehen können, wie beispielsweise ein markierter Antikörper oder Avidin. Zahlreiche Referenzen zum Markieren von zu untersuchenden Molekülen wie beispielsweise DNA, Proteine, Polysaccharide und dergleichen, sind bekannt. Beispielhafte Referenzen umfassen Matthews et al. (1988), Haugland (1992), Keller und Manak (1993), Eckstein (1991), Fung et al., Hobbs et al., Lee et al., Menchen et al., Bergot et al., Rosenblum et al. (1997), und Jackson (WO 91/05256).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Probenkomponenten oder Targetanalyten mittels Fluoreszenzdetektion gemessen. Um eine solche Detektion durchzuführen, kann die Detektionszone jedes Kanals durch eine geeignete Lichtquelle beleuchtet werden, z.B. eine Hochleistungsquecksilberdampflampe, einen Laser oder dergleichen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Beleuchtungseinrichtung um einen Laser mit einem Beleuchtungsstrahl bei einer Wellenlänge zwischen 488 und 550 nm. Weiter bevorzugt, insbesondere für Farbstoff-markierte Polynukleotide, wird die Beleuchtung unter Verwendung von Laserlicht durchgeführt, das durch einen Argonionenlaser erzeugt wird, und zwar insbesondere die Emissionslinien bei Wellenlängen von 488 und 514 nm eines Argonionenlasers oder die Emissionslinie bei 532 nm eines Neodymium Festkörper YAG-Lasers. Zahlreiche Argonionenlaser werden kommerziell vertrieben, die Laserlicht simultan bei diesen Linien erzeugen, z.B. Cyonics Ltd. (Sunnyvale, Kalifornien) Modell 2001 oder dergleichen. Die Fluoreszenz wird sodann durch einen lichtempfindlichen Detektor detektiert, z.B. eine Fotomultiplierröhre, eine CCD oder dergleichen. Vorzugsweise weist der Fluoreszenzdetektor eine konfokale Anordnung auf, wie diese in Huang et al., 1992, Kheterpal et al., (1996) und in anderen Referenzen (siehe ebenso Fodor, 1995, und Mathies et al. 1992) beschrieben wird.
Die Probenkomponentensignale können ebenso von einem oder mehreren der Kanäle simultan unter Verwendung eines flächenhaften Detektors gesammelt werden, wie beispielsweise ein ladungsgekoppelter Detektor (charge-coupled detector; CCD), (z.B. Modell TE/CCD512SF, Princeton Instruments, Trenton, NJ) mit geeigneter Optik (Ploem, 1993), wie dies in Yershov et al. (1996) beschrieben wird, oder kann mittels TV-Monitoren abgebildet werden (Khrapko, 1991). Bei radioaktiven Signalen (z.B. ³²P) kann eine Phosphorabbildungsvorrichtung verwendet werden (Johnston et al., 1990; Drmanac et al., 1992; 1993). Andere kommerzielle Hersteller von Abbildungsinstrumenten umfassen General Scanning Inc. (Watertown, Massachusetts, www.genscan.com), Genix Technologies (Waterloo, Ontario, Kanada; www.confocal.com) und Applied Precision Inc.
Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung kann für eine große Vielzahl von Anwendungen angewendet werden. Die Erfindung kann für medizinische oder tiermedizinische Zwecke eingesetzt werden, wie beispielsweise das Detektieren von Pathogenen, das Diagnostizieren oder Überwachen von Krankheiten, das genetische Screenen, das Bestimmen von Antikörper. oder Antigen-Titer, das Detektieren und das Überwachen von Gesundheitsänderungen und das Überwachen einer Medikamententherapie. Die Erfindung ist außerdem nützlich bei einer großen Vielzahl von forensischen, industriellen Anwendungen sowie Umweltanwendungen, einschließlich dem Screenen von Molekülen für ausgewählte Aktivitäten.
Beispielsweise kann die Erfindung dazu verwendet werden, um zahlreiche Nukleotid- und Polynukleotidanalyten zu analysieren, die durch eine Vielzahl von Techniken erzeugt werden, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion, Oligonukleotidligationsassay (z.B. Whiteley et al. und Landegren et al.), Minisequencing (Pastinen et al., 1997), Mikrosatelliten/variable Anzahl von Tandemwiederholungsanalysen (variable number of tandem repeat analyses; VNTR; z.B. Livak et al.), Restriktionsfragmentlängenpolymorphismusanalyse (restriction fragment length polymorphism; RFLP) und Sanger-Sequenzieren (z.B. Lee et al., EP 805190 A2 , Seiten 38–39).
Die Erfindung ist außerdem nützlich für das Analysieren anderer Typen von Probenkomponenten, wie beispielsweise Polypeptide, Aminosäuren, Polysaccharide, Monosaccharide, Metaboliten, Medikamente, usw. Die Erfindung ist außerdem nützlich für das Screenen mit hoher Durchsatzrate, wobei eine große Anzahl von unterschiedlichen Molekülen hinsichtlich einer ausgewählten Aktivität getestet werden, wie beispielsweise das Eingehen einer Verbindung eines Liganden mit einem Rezeptor, die Aktivierung oder Unterdrückung eines Enzyms und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine vorteilhafte Art und Weise bereit, um rasch Analyten in einer Vielzahl von Proben zu analysieren. Die Erfindung ist hochgradig flexibel hinsichtlich ihrer Anwendungen, da sie an die Analyse einer großen Vielzahl von Analyten und Probenmaterialien angepasst werden kann. Ferner erlaubt die Erfindung bei Arrayausgestaltungen, bei denen distale Kammern mit den Kanälen über Durchgangswege verbunden sind, die weg von der Mitte des Arrays führen, die Entfernung von Blasen aus den elektrophoretischen Wegen mittels Zentrifugation vor der Probentrennung und Probenanalyse, um somit die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der Analysen zu erhöhen. Überdies sind nur sehr kleine Probenvolumina notwendig, da die Abmessungen der Kanalarrays gemäß der Erfindung sehr klein sein können.
Obgleich die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen und Beispiele beschrieben worden ist, wird man erkennen, dass zahlreiche Modifizierungen und Veränderungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie dieser in den anhängenden Ansprüchen definiert ist.

Claims

Vorrichtung für die elektrophoretische Trennung von Analyten, wobei die Vorrichtung umfasst: ein Substrat (20), umfassend a) einen zentralen Reservoirbereich (24), b) eine Vielzahl von elektrophoretischen Kanälen (22) in fluider Kommunikation mit dem zentralen Reservoirbereich, wobei die elektrophoretischen Kanäle (22) im Wesentlichen radial von dem zentralen Reservoirbereich nach außen gerichtet sind und co-planar miteinander sind, wobei jeder Kanal (i) ein proximales Ende (22a) aufweist, das mit dem Reservoirbereich verbunden ist, und (ii) ein distales Ende (22b), sowie c) für jeden Kanal eine oder mehrere Kammern (26a, 26b, 26c), dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder die mehreren Kammern jeweils über einen Durchgangsweg (28a, 28b, 28c) in fluider Kommunikation mit dem distalen Ende dieses Kanals verbunden sind, wobei jeder Durchgangsweg von jeder Kammer in eine Richtung führt, die anfänglich von dem zentralen Reservoirbereich weg gerichtet ist, wobei eine Zentrifugation des Substrats um eine zentrale Achse (24a), die senkrecht zu der Ebene der Kanäle verläuft, wirksam ist, um Flüssigkeit von dem zentralen Reservoirbereich in die Kanäle und Kammern zu verteilen, so dass jedwede Luftblasen in den Kammern, Kanälen und Durchgangswegen in Richtung der Rotationsachse gezwungen werden, wenn eine derartige Flüssigkeit in dem zentralen Reservoirbereich vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das distale Ende (22b) von jedem Kanal (22) über Durchgangswege (28a, 28b, 28c) mit zwei Kammern (26a, 26b, 26c) verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das distale Ende (22b) von jedem Kanal (22) durch Durchgangswege (28a, 28b, 28c) mit einer Probenkammer, einer Probenaufnahmekammer und einer Laufpufferkammer verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung ferner Elektroden (32a, 32b, 32c, 32d) aufweist, um ein Spannungspotential zwischen den Kammern (26a, 26b, 26c) und dem zentralen Reservoir (24) anzulegen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung ferner einen Detektor zum Detektieren ausgewählter Komponenten umfasst, die in einem oder mehreren der Kanäle (22) vorhanden sein können.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Detektor um einen Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Detektor handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei der Detektor um eine zentrale Achse (24a) innerhalb des zentralen Reservoirbereichs (24) rotiert werden kann, um Signalemission von jedem der Kanäle (22) bei einem ausgewählten Abstand von der Achse zu detektieren.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Vorrichtung ferner einen Mechanismus zum Rotieren des Substrats (20) um eine zentrale Achse (24a) umfasst, so dass die Kanäle (22) der Reihe nach den Detektor passieren, um eine oder mehrere Komponenten zu detektieren, die in den Kanälen (22) vorhanden sein können.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Kammern (26a, 26b, 26c) zum Teil durch ein ringförmiges Septum (50) definiert sind, das die Kammern abdeckt und einen Nadelzugang zu den Kammern ermöglicht, um Flüssigkeit den Kammern zuzuführen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer der Kanäle (22) ein Elektrophoresemedium enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei das Elektrophoresemedium ein fließbares Medium ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei das Elektrophoresemedium ein kovalent querverbundenes Medium ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat (20) wenigstens 20 der Kanäle (22) definiert.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Kanäle (22) Querschnittsdurchmesser zwischen 1 und 100 μm aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Kanäle (22) Querschnittsdurchmesser zwischen 2 und 50 μm aufweisen.
Verfahren zum Aufbereiten einer Vielzahl von Elektrophoresewegen, die im Wesentlichen blasenfrei sind, umfassend: Bereitstellen einer Vorrichtung nach Anspruch 1, so dass der Reservoirbereich (24) entweder eine Flüssigkeit enthält oder in fluider Kommunikation mit einer Flüssigkeitsquelle steht, Zentrifugieren des Substrats (20) um eine zentrale Achse (24a), die senkrecht zu den Kanälen (22) verläuft, so dass die Flüssigkeit von dem zentralen Reservoirbereich in die Kanäle und Kammern (26a, 26b, 26c) verteilt wird, so dass jedwede Luftblasen in den Kammern, Kanälen und/oder Durchgangswegen in Richtung der Rotationsachse gezwungen werden, was eine Vielzahl von blasenfreien elektrophoretischen Wegen zwischen dem Reservoir und den Kammern liefert.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Kanäle (22), die Durchgangswege (28a, 28b, 28c) und/oder die Kammern (26a, 26b, 26c) eine Flüssigkeit enthalten.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17 zum Analysieren einer Vielzahl von Proben, wobei das Verfahren ferner umfasst: Anlegen eines elektrischen Feldes unter Bedingungen, die wirksam sind, eine Migration von Probe durch wenigstens einen der Kanäle (22) in Richtung des zentralen Reservoirbereichs (24) zu bewirken, und Abfragen wenigstens eines der Kanäle, um eine oder mehrere Probenkomponenten in dem Kanal bzw. den Kanälen zu detektieren.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die zu detektierenden Komponenten Nukleinsäuren sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die zu detektierenden Nukleinsäuren fluoreszent markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Proben mittels einer Polymerasekettenreaktionsamplifizierung von einer oder mehreren ausgewählten Targetsequenzen aufbereitet werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Proben durch die Ligase von wenigstens zwei Oligonukleotiden aufbereitet werden, wenn die Oligonukleotide an benachbarte Bereiche eines Targetpolynukleotids gebunden sind, die komplementär zu den wenigstens zwei Oligonukleotiden sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die zu detektierenden Komponenten Polypeptide sind.