DE60029363T2

DE60029363T2 - Fluoreszenzverfahren zum Messen von Enzymaktivität unter Verwendung von Polyionen

Info

Publication number: DE60029363T2
Application number: DE60029363T
Authority: DE
Inventors: Theo T. San Jose Nikiforov
Original assignee: Caliper Life Sciences Inc
Current assignee: Caliper Life Sciences Inc
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: EP1183536B1; CA2373747A1; DE60014365D1; ATE332978T1; EP1183536A1; IL146375A0; AU762155B2; DE60014365T2; JP4472879B2; JP2003502620A; NZ515384A; CN1355884A; MXPA01011831A; DE60029363D1; ATE278190T1; AU5134300A; CN1130564C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Praktisch die gesamte chemische, biologische und biochemische Forschung hängt von der Fähigkeit des Wissenschafters ab, die Richtung seiner Forschungsarbeit festzulegen, indem er Reaktionsgemische auf das Vorhandensein oder Fehlen einer bestimmten chemischen Spezies testet. In einem einfachen Fall wird die Geschwindigkeit oder Effizienz einer Reaktion getestet, indem die Geschwindigkeit der Bildung des ReaktionsProdukts oder der Verbrauch eines Reaktionssubstrats gemessen wird. Auf ähnliche Art und Weise werden Wechselwirkungsreaktionen, z.B. Bindungs- oder Dissoziationsreaktionen, im Allgemeinen mittels Messung der Menge an gebundenem oder freiem Material im resultierenden Reaktionsgemisch untersucht.
Bei bestimmten Reaktionen ist die Spezies von Interesse oder ein geeigneter Ersatzstoff leicht detektierbar und von den übrigen Reagenzien einfach zu unterscheiden. Es muss also nur nach diesen Spezies gesucht werden, um sie entdecken zu können. Dies wird oft bewerkstelligt, indem ein Reaktionsprodukt mittels eines/-r ein optisches Signal abgebenden Elements oder Gruppierung, das/die nur auf dem Produkt oder Substrat vorhanden oder aktiv ist. Durch die Messung der Stärke des optischen Signals kann direkt die Menge des Produkts oder des verbliebenen Substrats bestimmt werden.
Leider besitzen viele besonders interessante Reaktionen nicht über den Vorteil eines leicht verfügbaren Ersatzreagens, das nur dann ein Signal erzeugt, wenn es der Reaktion von Interesse ausgesetzt ist. Zum Beispiel werden bei vielen für die biologische Forschung interessanten Reaktionen die Reagenzien nicht jenen Modifikationen unterzogen, die substanzielle Veränderungen der optischen Eigenschaften zur Folge haben. Einige Wissenschafter haben versucht, Substrate herzustellen, die Veränderungen der optischen Eigenschaften hervorrufen können. Zum Beispiel führen typische, zwischen zwei Molekülen stattfindende Bindungsreaktionen zu einem gebundenen Komplex dieser Moleküle. Sogar wenn ein Element des Bindungspaars markiert wird, bewirkt die Bildung des Komplexes jedoch im Allgemeinen keinen optisch detektierbaren Unterschied zwischen dem Komplex und dem markierten Mole kül. Folglich basieren die meisten Bindungstests auf der Immobilisierung eines Elements oder Moleküls des Bindungspaars. Das markierte Molekül wird dann mit dem immobilisierten Molekül in Kontakt gebracht, und der Immobilisierungsträger wird gewaschen. Nach dem Waschen wird der Träger auf das Vorhandensein eines markierten Moleküls, das die Bindung der markierten Komponente an die nichtmarkierte, immobilisierte Komponente anzeigt, untersucht. Oft werden groß angelegte Tests verschiedener Bindungspaare vorbereitet, um den Durchsatz des Testformats zu erhöhen. Siehe z.B. US-A-5.143.854 an Pirrung et al.
Alternativ dazu haben Forscher für Nucleinsäure-Hybridisierungstests komplementäre Markierungssysteme entwickelt, welche die Umgebung von gebundenen Elementen nützen, um, entweder im gebundenen oder ungebundenen Zustand, Fluoreszenzsignale zu erzeugen. Siehe z.B. US-A-5.668.648, 5.707.804, 5.728.528, 5.853.992 und 5.869.255 an Mathies et al. für eine Beschreibung von FRET-Farbstoffen und Tyagi et al., Nature Biotech 14, 303–8 (1996), und Tyagi et al., Nature Biotech 16, 49–53 (1998), für eine Beschreibung von molekularen Leuchtfeuern.
Wie oben erwähnt sind Bindungsreaktionen nur eine Testkategorie, die im Allgemeinen keine optisch detektierbaren Signale erzeugt. In ähnlicher Weise gibt es eine Reihe von Tests, deren Reagenzien und/oder Produkte sogar trotz Einführung optisch detektierbarer Elemente nicht leicht voneinander zu unterscheiden sind. Beispielsweise verfügen Kinasetests, die Phosphatgruppen in phosphorylierte Substrate einführen, im Allgemeinen über keine Ersatzsubstrate, die bei Vollendung der Phosphorylierungsreaktion ein detektierbares Signal erzeugen. Stattdessen basieren diese Reaktionen typischerweise auf einer Veränderung der Struktur des Produkts, dessen Strukturänderung genutzt wird, um die Reaktanten vom Produkt zu trennen. Das abgetrennte Produkt wird dann detektiert. Hierbei ist wohl offensichtlich, dass Tests, die zusätzliche Trennschritte erfordern, extrem zeitraubend und aufgrund der Verluste in den verschiedenen Test-Schritten weniger effizient sein können. S. Ramakristian et al., Analytical Biochemistry 255, 257–262. (1998) offenbaren einen Fluoreszenzpolarisationstest zur Messung der Kinaseaktivität, bei dem hochspezifische Antikörper auf phosphorylierte Substrate gerichtet werden.
Es wäre generell wünschenswert, die zuvor beschriebenen Tests durchführen zu können, ohne dazu feste Träger, zusätzliche Trennschritte oder dergleichen zu benötigen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese wie auch eine Reihe anderer wichtiger Anforderungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein in den Ansprüchen dargelegtes Verfahren zur Durchführung einer breiten Vielzahl von Tests bereit. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung der Enzymaktivität bereit, das Folgendes umfasst:
das Kontaktieren eines fluoreszenzmarkierten Substrats mit einem Enzym, um ein Gemisch herzustellen, das ein fluoreszenzmarkiertes Produkt umfasst, worin das Produkt und das Substrat unterschiedliche Bindungsaffinitäten für ein Polyion aufweisen, das mehrwertige Metallkationen aufweist, die basierend auf einem Ladungsunterschied zwischen dem Produkt und dem Substrat damit assoziiert sind;
das Kontaktieren des Gemischs mit dem Polyion, worin sich das Polyion vorzugsweise mit einem von Produkt und Substrat bindet; und
das Bestimmen einer Konzentration des Produkts, das durch die Aktivität des Enzyms produziert wird, durch Messen der Bindung des Polyions an das Produkt unter Verwendung von Fluoreszenzintensitätsdetektion und/oder Fluoreszenzpolarisationsdetektion.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines allgemeinen Testverfahrens, das gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt wird.
2 ist eine schematische Darstellung eines Bindungstests, z.B. eines Nucleinsäure-Hybridisierungstests, der gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
3 ist eine schematische Darstellung eines Enzymtests, z.B. ein Kinasetest, der gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt wird.
4 ist eine schematische Darstellung eines Phosphatasetests, der gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt wird.
5 ist eine allgemeine schematische Darstellung eines Gesamtsystems, das zur Durchführung der Testverfahren der vorliegenden Erfindung angewandt wird.
6 ist eine schematische Darstellung einer mehrschichtigen Mikrofluidikvorrichtung, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls als Reaktions-/Test-Behälter Anwendung findet.
7 ist eine schematische Darstellung einer Mikrofluidikvorrichtung mit einer äußeren Probennahmepipette als Reaktions-/Test-Behälter in den Verfahren der vorliegenden Erfindung.
8 ist eine schematische Darstellung eines Beispiels für ein System zur optischen Detektion, das in Verfahren der vorliegenden Erfindung Anwendung findet.
9 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens unter Verwendung eines Softwareprogramms oder Computers, das mittels eines Testsystems unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
10 zeigt ein exemplarisches Computersystem und den Computeraufbau für die Anwendung von Verfahren der vorliegenden Erfindung.
11 veranschaulicht die Vernetzung einer Mikrofluidikvorrichtung mit anderen Elementen eines Systems zur Kontrolle von Materialbewegung, zur Detektion von Testergebnissen in der Mikrofluidikvorrichtung und zur Analyse dieser Ergebnisse.
Die 12A–E sind grafische Darstellungen der Fluoreszenzpolarisation verschiedener fluoreszierender phosphorylierter Verbindungen in Gegenwart von zunehmenden Mengen eines Polykations.
13 ist eine grafische Darstellung der Fluoreszenzpolarisation eines Gemischs aus einem fluoreszenzierenden, phosphorylierbaren Substrat und einem phosphorylierten Produkt, worin die relativen Konzentrationen von Substrat und Produkt in Gegenwart eines Polykations variieren.
14 ist eine grafische Darstellung ähnlich jener aus 13, wobei jedoch ein anderes phosphorylierbares Substrat und ein anderes phosphoryliertes Produkt verwendet wurden.
15 ist eine grafische Darstellung der Korrelation zwischen der mittels Kapillarelektrophoresetrennung/Detektion (vertikale Achse) und mittels Fluoreszenzpolarisationsdetektion (horizontale Achse) detektierten Aktivität von Proteinkinase B (PKB).
16 ist eine grafische Darstellung der Fluoreszenzpolarisation über der Reaktionszeit von PKA-Tests (Proteinkinase-A-Tests), die in Gegenwart mehrerer verschiedener ATP-Konzentrationen im Reaktionsgemisch durchgeführt wurden.
17 ist eine grafische Darstellung der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit über der ATP-Konzentration, die aus den in 16 angeführten Daten abgeleitet wurde.
18 ist ein Lineweaver-Burke-Plot, der aus den Test-Daten der 16 und 17 abgeleitet wurde.
19 ist eine grafische Darstellung der Phosphatase-Aktivität von Kontroll- und Enzymtestgemischen über der Zeit.
20 ist eine grafische Darstellung der Stärke der Fluoreszenzpolarisation über der Zeit für jeden von drei Proteasetestdurchgängen (negative Kontrolle und zwei verschiedene Enzymkonzentrationen).
21 ist ein Balkendiagramm der Stärke der Fluoreszenzpolarisation einer fluoreszierenden PNA-Sonde, die eingesetzt wird, um sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart variierender Konzentrationen an Polykation eine nichtkomplementäre und komplementäre Target-DNA-Sequenz abzufragen.
22 ist eine grafische Darstellung der Fluoreszenzpolarisation eines Gemischs aus einer Target-Nucleinsäuresequenz und einer perfekt komplementären PNA-Sonde (obere Linie, Rauten) und eines Gemischs aus einer Target-Sequenz, die mit Ausnahme einer einzigen Basen-Fehlpaarung mit einer fluoreszierenden PNA-Sonde komplementär ist (untere Linie, Quadrate).
Die 23A, B und C sind grafische Darstellungen der Schmelzkurven von DNA/PNA-Hybriden, deren Target-Sequenzen und Sonden drei verschiedene Konfigurationen aufweisen. Es werden Target-Sequenzen, die eine exakte Paarung darstellen, sowie zwei verschiedene Fehlpaarungen für das Target (23A, B bzw. C) und für drei verschiedene Sondenlängen (9-mer, 11-mer und 13-mer) gezeigt, die in jeder der grafischen Darstellungen durch drei Linien dargestellt sind.
24 ist eine grafische Darstellung der SNP-Detektion unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, d.h. von Fluoreszenzpolarisationsdetektion, und unter Vergleich dieses Detektionsverfahrens mit einfachen Fluoreszenzintensitätsmessungen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Einführung
Die vorliegende Erfindung stellt allgemein Testverfahren bereit, die in einer Reihe von verschiedenen Kontexten sehr nützlich sind, wo andere typische Testformate nicht anwendbar sind. Mit den vorliegenden Verfahren kann in Gegenwart des Reaktionssubstrats ein Reaktionsprodukt detektiert werden, obwohl das Produkt anhand einer Eigenschaft detektiert wird, die es mit dem Reaktionssubstrat gemein hat, z.B. eine Fluoreszenzmarkergruppe.
Allgemein wird mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung zwischen Reaktionsprodukt und einem Reaktionssubstrat dadurch unterschieden, dass ein Ladungsunterschied zwischen dem Reaktionsprodukt und dem Reaktionssubstrat als Folge der Reaktion festgestellt wird. Die Ladung einer dieser beiden Reaktionskomponenten, sei diese auf dem Substrat oder auf dem Produkt, dient dazu, diese Komponente an eine relativ große polyionische Verbindung zu binden. Die bevorzugte Bindung der großen polyionischen Verbindung entweder an das Substrat oder das Produkt führt zu einer erheblichen Differenz des Ausmaßes an Polarisation der Fluoreszenzemissionen dieser Komponente, wenn diese mit polarisiertem Licht angeregt wird. Da sich die große Verbindung als Folge der Ladungsverfügbarkeit oder -eliminierung durch die Reaktion von Interesse bevorzugt an nur eines von Substrat und Produkt bindet, ist diese Bindung und die daraus folgende Veränderung der Fluoreszenzpolarisation ein Indikator für den Fortschritt der Reaktion von Interesse.
II. Testverfahren
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion einer chemischen, biochemischen oder biologischen Reaktion bereit, wie dies in den Ansprüchen dargelegt ist. Dieses Verfahren umfasst die Bereitstellung eines ersten Reagensgemischs, das ein erstes Reagens mit einer Fluoreszenzmarkierung umfasst. Ein zweites Reagens wird in das erste Reagensgemisch eingeführt, um ein zweites Reagensgemisch her zustellen. Der zweite Reagens kann im Allgemeinen mit dem ersten Reagens reagieren oder anderweitig wechselwirken, um ein fluoreszenzmarkiertes Produkt zu ergeben, das eine deutlich unterschiedliche Ladung als das erste Reagens aufweist. Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "unterschiedliche Ladung" oder "deutlich unterschiedliche Ladung", dass die Nettoladung des Produkts sich von jener des ersten Reagens in einem Ausmaß unterscheidet, das ausreicht, um die unterschiedliche Bindung des Substrats und des Produkts an eine hierin beschriebene polyionische Verbindung zu ermöglichen. Diese Ladungsdifferenz kann ein Ladungsanteil sein, der im Durchschnitt über das gesamte Reagensmolekül verteilt ist. Jedoch unterscheiden sich Substrat und Produkt bei jenem pH, bei dem der Test durchgeführt wird, bevorzugter- und typischerweise um mindestens eine Ladungseinheit. Beispielsweise hat ein Produkt, das entweder eine einfach positive oder eine einfach negative Nettoladung aufweist, eine deutlich unterschiedliche Ladung als ein erstes Reagens mit einer neutralen Nettoladung, wie der Ausdruck hierin gebraucht wird. Ebenso weist ein Produkt mit zwei positiven Ladungen eine deutlich unterschiedliche Ladung als das erste Reagens mit einer positiven Ladung auf. Vorzugsweise weist ein Produkt, das über eine deutlich unterschiedliche Ladung als das erste Reagens verfügt, einen Nettoladungsunterschied von mindestens zwei Ladungseinheiten, in bestimmten Fällen sogar weit mehr als nur zwei Ladungseinheiten auf, z.B. in den Nucleinsäureanwendungen, die weiter unten detaillierter beschrieben werden.
Ein Polyion wird entweder nur mit dem ersten oder zweiten Reaktionsgemisch oder mit beiden kontaktiert – abhängig von der Art des durchgeführten Tests und den Eigenschaften des Produkts, das durch die Reaktion von Interesse hergestellt wird. Da die Reaktion von Interesse ein Produkt erzeugt, das eine vom Substrat deutlich unterschiedliche Ladung aufweist, tritt dieses Produkt mit dem Polyion ganz anders in Wechselwirkung als das Substrat, z.B. durch erhöhte oder verminderte Wechselwirkung/Bindung. Die Bindung oder das Fehlen von Bindung hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Fähigkeit des Produkts, die emittierte Fluoreszenz zu depolarisieren. Genauer gesagt und wie weiter unten detailliert beschrieben, weist das relativ kleine erste Reagens eine verhältnismäßig hohe Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit auf. Diese Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit zeichnet für die Fähigkeit einer fluo reszierenden Verbindung verantwortlich, bei Anregung mit polarisiertem Licht depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren. Jedoch verringert die Bindung einer großen polyionischen Verbindung an ein kleines fluoreszierendes Molekül die Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit dieses Moleküls bedeutend schränkt und dessen Fähigkeit, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren, ein.
Das Ausmaß an Fluoreszenzpolarisation im zweiten Reagensgemisch wird dann mit dem Ausmaß an Fluoreszenzpolarisation des ersten Reagensgemischs verglichen. Durch Vergleich dieser Werte kann die Fluoreszenzmenge gemessen werden, die von dem an das Polyion gebundenen Material emittiert wird. Das Test wird – wie später detaillierter beschrieben – beispielsweise durch Einstellung von pH, Ionenstärke oder dergleichen so gesteuert, dass sich nur eines von erstem Reagens und Produkt an das Polyion binden kann. Folglich wird die Änderung der Fluoreszenzpolarisation dazu genutzt, ein quantitatives Maß für die Menge des erzeugten Produkts oder des verbrauchten ersten Reagens zu berechnen und ist somit ein Maß für die Reaktion.
Die Grundlagen der Anwendung von Fluoreszenzpolarisationsmessungen als Verfahren zur Messung der Bindung zwischen verschiedenen Molekülen sind relativ einfach. Kurz gesagt, wenn ein fluoreszierendes Molekül mit einer polarisierten Lichtquelle angeregt wird, emittiert das Molekül Fluoreszenzlicht in einer fixen Ebene, beispielsweise wird unter der Voraussetzung, dass das Molekül räumlich fixiert ist, das emittierte Licht auch polarisiert. Da jedoch das Molekül typischerweise im Raum rotiert und taumelt, variiert die Ebene, in der das Fluoreszenzlicht emittiert wird, mit der Rotation des Moleküls (auch Rotationsdiffusion des Moleküls genannt). Anders gesagt wird die emittierte Fluoreszenz im Allgemeinen depolarisiert. Je schneller ein Molekül in Lösung rotiert, desto stärker wird es depolarisiert. Umgekehrt, je langsamer das Molekül in Lösung rotiert, desto weniger depolarisiert wird oder desto polarisierter ist es. Der Polarisationswert (P) eines bestimmten Moleküls ist proportional zur "Rotationskorrelationszeit" des Moleküls oder proportional zur Zeit, die ein Molekül benötigt, um sich um einen Winkel von 57,3° (1 Radiant) zu drehen. Je kürzer die Rotationskorrelationszeit, desto schneller rotiert das Molekül und desto weniger Polarisation ist zu beobachten. Je länger die Rotationskorrelationszeit, desto langsamer rotiert das Molekül und desto stärkere Polarisation ist zu beobachten. Die Rotationsrelaxationszeit steht mit der Viskosität (η), der absoluten Temperatur (T), dem Molvolumen (V) und der Gaskonstanten (R) in Zusammenhang. Die Rotationskorrelationszeit wird allgemein nach folgender Formel berechnet: Rotationskorrelationszeit = 3ηV/RT (1)
Wie aus der oben angeführten Gleichung ersichtlich, steht die Rotationsrelaxationszeit, und daher auch der Polarisationswert, direkt mit dem Molvolumen in Zusammenhang, wenn Temperatur und Viskosität konstant gehalten werden. Dementsprechend ist der Fluoreszenzpolarisationswert umso höher, je größer das Molekül ist, und umgekehrt ist der Fluoreszenzpolarisationswert umso geringer, je kleiner das Molekül ist.
Bei der Durchführung von Fluoreszenzbindungstests wird ein typischerweise kleines, fluoreszenzmarkiertes Molekül, z.B. ein Ligand, ein Antigen etc., mit einer relativ schnellen Rotationskorrelationszeit zur Bindung an ein viel größeres Molekül eingesetzt, z.B. an ein Rezeptorprotein, einen Antikörper etc., das eine viel langsamere Rotationskorrelationszeit aufweist. Die Bindung des kleinen, markierten Moleküls an das größere Molekül erhöht die Rotationskorrelationszeit der markierten Spezies, d.h. des markierten Komplexes, gegenüber dem freien, ungebundenen, markierten Molekül bedeutend (d.h. verringert sein Rotationsausmaß). Dies hat entsprechende Auswirkungen auf den detektierbaren Polarisationswert. Genauer gesagt zeigt der markierte Komplex weit stärkere Fluoreszenzpolarisation als das ungebundene, markierte Molekül.
Im Allgemeinen wird der Fluoreszenzpolarisationswert anhand der folgenden Formel berechnet: P = [I(||) – I(⫗)]/[I(||) + I(⫠)] (2)
Darin steht I(||) für die Fluoreszenz, die in der zum Anregungslicht parallelen Ebene detektiert wird, und I(⫠) steht für die Fluoreszenz, die in der zum Anregungslicht senkrechten Ebene detektiert wird.
Bei der Durchführung von Screening-Tests, z.B. auf potenzielle Inhibitoren, Verstärker, Agonisten oder Antagonisten der fraglichen Bindungsfunktion, wird die Fluoreszenzpolarisation des Reaktionsgemischs in Gegenwart und Abwesenheit verschiedener Verbindungen verglichen, um zu bestimmen, ob diese unterschiedlichen Verbindungen irgendwelche Auswirkungen auf die Bindungsfunktion von Interesse haben. Ganz besonders im Falle der Gegenwart von Inhibitoren der Bindungsfunktion nimmt die Fluoreszenzpolarisation ab, weil mehr freie, markierte Liganden im Test vorhanden sind. Hingegen führen Verstärker der Bindungsfunktion zu einem Anstieg der Fluoreszenzpolarisation, weil mehr Komplexe und weniger freie, markierte Liganden im Test vorliegen.
Bevorzugte Verfahren dieser Erfindung umfassen üblicherweise die Verwendung von Fluoreszenzpolarisationsdetektion, z.B. zur Detektion von Veränderungen des Ausmaßes an depolarisierter Fluoreszenz, die vom Reaktionsgemisch infolge einer bestimmten Reaktion emittiert wird. Jedoch sind auch andere Fluoreszenzdetektionsmodelle im Kontext der Erfindung von Nutzen. Beispielsweise wurde herausgefunden, dass zusätzlich zur Veränderung des Ausmaßes an vom Reaktionsgemisch emittierter depolarisierter Fluoreszenz, die Bindung der Polyionen in diesem Gemisch ebenso Auswirkungen auf den Wert der gesamten vom Reaktionsgemisch emittierten Fluoreszenz bzw. der Fluoreszenzintensität haben kann. So kann in den allgemeinsten Aspekten der Erfindung nach der Reaktion lediglich eine Änderung einer Reihe von Fluoreszenzeigenschaften detektiert werden.
Wie oben angeführt verwenden die Testverfahren der vorliegenden Erfindung typischerweise ein erstes Reagens, das eine fluoreszenzmarkierenden Gruppe aufweist. Die Art des ersten Reagens hängt allgemein von der Art des durchgeführten Tests ab. Typischerweise sind die Tests, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, Enzymaktivitätstests. Das erste Reagens umfasst ein Substrat, das durch die Reaktion von Interesse modifiziert wird, z.B. durch Erweiterung oder Verringerung oder eine Veränderung der chemischen Struktur des ersten Reagens. Spezifische Beispiele für solche Substrate umfassen z.B. Kinasesubstrate mit phosphorylierbaren Gruppierungen, z.B. Serin-, Threonin- und Tyrosin-Phosphorylierungsstellen und dergleichen, phosphorylierte Substrate für Phosphataseenzyme, Amino- oder Keto-enthaltende Substrate, die mit Aminotransferasen reagieren, zu Carboxyl konvertierte Alkohole (z.B. über Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase), sowie Substrate für: Sulfatasen, Phosphorylasen, Esterasen, Hydrolasen (z.B. Proteasen), Oxidasen und dergleichen.
Das erste Reagens kann entweder positiv oder negativ oder auch neutral geladen sein – abhängig von der Art des Tests, der durchgeführt werden soll. Die Fluoreszenzmarkierung auf dem ersten Reagens kann aus einer Reihe von verschiedenen fluoreszenzmarkierenden Verbindungen ausgewählt werden. Im Allgemeinen sind solche fluoreszenzmarkierenden Materialien beispielsweise von Molecular Probes (Eugene, Oregon) im Handel erhältlich. Fluorescein- oder Rhodaminderivate sind für die hierin beschriebenen Testverfahren üblicherweise besonders gut geeignet. Diese Fluoreszenzmarkierungen werden mit dem ersten Reagens beispielsweise unter Anwendung bekannter Bindungschemie kovalent gebunden. Für eine Erörterung von Markierungsgruppen und deren Chemie siehe z.B. die veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/00231.
Wie ebenfalls oben erwähnt wurde, reagiert das zweite Reagens mit dem ersten, tritt damit in Wechselwirkung bzw. assoziiert oder verbindet sich damit, um ein fluoreszierendes Produkt zu bilden, das eine vom ersten Reagens deutlich unterschiedliche Ladung aufweist. So wie das erste Reagens enthält dieses zweite Reagens gegebenenfalls ein Element eines speziellen Bindungspaares, z.B. das Element, das komplementär zum ersten Reagens ist, vorausgesetzt, das Hybrid aus den zwei Elementen des Bindungspaares, d.h. aus dem ersten Reagens und dem zweiten Reagens, trägt eine Ladung, die von der Ladung der ersten Reagens-Elements des Bindungspaares deutlich unterschiedlich ist. In vielen Fällen umfasst dies ein zweites Reagens, das geladen ist, während das erste Reagens neutral ist, oder ein zweites Rea gens, das stark geladen ist, während das erste Reagens nur mäßig geladen ist. Alternativ dazu bewirkt die Bindung des ersten an das zweite Reagens eine Konformationsänderung, die ein geladenes Produkt erzeugt, oder eine Bindung an oder Markierung von geladene(n) Reste(n) auf dem ersten Reagens.
Da das Produkt, das durch die Wechselwirkung des ersten und des zweiten Reagens eine andere Ladung aufweist als das erste Reagens alleine, tritt es mit anderen geladenen Molekülen unterschiedlich in Wechselwirkung. Ganz besonders polyionische Verbindungen, die eine beträchtliche Zahl an Ladungen aufweisen, wechselwirken generell mit geladenen Materialien auf ladungsabhängige Art und Weise. Im Fall der vorliegenden Erfindung werden große Polyion-Verbindungen eingesetzt, um das Produkt (oder in manchen Fällen das erste Reagens) mit einer relativ großen Verbindung zu "markieren", die Einfluss auf die Fähigkeit des Produkts nimmt, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren.
Zu den bevorzugten Polyionen für die vorliegende Erfindung zählen Polyaminosäuren, z.B. Proteine, Polypeptide, d.h. Polylysin, Polyhistidin und Polyarginin. Andere für die vorliegende Erfindung nützliche Verbindungen sind organische Polyionen, d.h. Polyacrylsäure, Polycarbonsäuren, Polyamine (z.B. Polyethylamin), Polysulfonsäuren (z.B. Polystyrolsulfonsäure), Polyphosphorsäure (z.B. Polyvinylphosphorsäure), oder Copolymere beliebiger oder aller dieser Verbindungen, z.B. gemischte Polymere dieser Polyaminosäuren und dergleichen. Diese Polyionen sind im Vergleich zum ersten und/oder zweiten Reagens und/oder jenem Produkt, das im Test von Interesse verwendet wird, typischerweise relativ groß. Als solches kann die Größe des Polyions in Abhängigkeit von der Größe des ersten und/oder zweiten Reagens und/oder des Produkts variieren. Typischerweise kann die Größe des Polyions von etwa 5 kD bis etwa 1.000 kD variieren, bevorzugt von 10 kD bis etwa 200 kD, noch bevorzugter von 10 kD bis etwa 100 kD. Im Fall von Polyaminosäuren ergibt dies typischerweise ein Polymer mit einer Länge von etwa 50 bis etwa 10.000 Aminosäuremonomeren, vorzugsweise einer Länge von 100 bis etwa 1.000 Monomeren.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polyionen können allgemein mit den anderen Komponenten des Reaktionsgemischs auf nichtspezifische, ladungsabhängige Weise wechselwirken. Im Fall einer nichtspezifischen Wechselwirkung ist klar, dass die gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Polyionen nicht die Gegenwart einer spezifischen Erkennungsstelle im Produkt (oder Substrat) erfordern. Diese nichtspezifische Wechselwirkung bietet daher breitere Anwendbarkeit der Tests der vorliegenden Erfindung. Wie ebenfalls schon erwähnt wurde wechselwirkt das Polyion mit dem Produkt (oder Substrat) auf ladungsabhängige Weise. In der Folge können im Fall von titrierbaren Polyionen Pufferbedingungen erforderlich sein, die die Gegenwart von für diese Wechselwirkung verwendeten Ladungen ermöglichen. Typischerweise weist das Polyionenmaterial einen isoelektrischen Punkt (pI) auf, der für ein signifikantes Ladungsausmaß bei dem für die Testbedingungen relevanten pH-Wert sorgt. Typischerweise weisen Puffer, in denen die Tests der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, typischerweise einen pH-Wert im physiologisch relevanten Bereich auf, z.B. von einem pH-Wert von etwa 6 bis zu einem pH-Wert von etwa 8, bei dem das Ladungsausmaß der Polyion-Verbindungen ausreichend hoch ist, damit diese Polyion-Verbindungen mit geladenen Reagenzien wechselwirken können. Jedoch kann natürlich der Ladungswert und somit auch der Grad der Wechselwirkung zwischen einem Polyion und einem Produkt (oder Substrat) allgemein angepasst werden, indem der Puffer, in dem diese Elemente vorgelegt werden, eingestellt wird, wodurch der Ladungswert von Polyion oder Produkt oder von beiden beeinflusst wird. Routinemäßige Feineinstellung der Reaktion wird gegebenenfalls ebenso dazu eingesetzt, jegliche Tests zu optimieren, um optimale Reaktionsgeschwindigkeiten sowie Wechselwirkung zwischen der Polyionkomponente und dem Produkt (oder Substrat) zu erzielen.
Die unterschiedliche Wechselwirkung zwischen dem Polyion und dem fluoreszierenden Produkt, verglichen mit seiner Wechselwirkung mit dem ersten fluoreszierenden Reagens, wird in der Folge dazu genützt, die Menge des hergestellten Produkts zu vergleichen. Konkret emittiert eine relativ kleine fluoreszierende Verbindung, z.B. das erste Reagens, generell relativ depolarisierte Fluoreszenz, wenn sie mit polarisiertem Anregungslicht angeregt wird. Dies ist allgemein auf die schnellere Rotationsdiffusion oder "Spin" dieser kleineren Verbindungen zurückzuführen. Größere Verbindungen weisen andererseits einen langsameren Spin auf und emittieren daher eher relativ polarisierte Fluoreszenz, wenn sie mit einem polarisierten Anregungslicht angeregt werden. Durch die Markierung des Produkts mit einer großen Markierung in Form eines Polyions wird die Fähigkeit des Produkts, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren, verändert. Diese Eigenschaft wird in der Folge detektiert und als Maß für die Reaktion des ersten und des zweiten Reagens quantifiziert. Typischerweise stellt die detektierte Fluoreszenzpolarisation oder der P-Wert ein Maß für das Verhältnis zwischen gebundener Markierung und freier Markierung bereit, obwohl die Ergebnisse der Tests auch als Differenz zwischen der Fluoreszenzpolarisation vor der Reaktion und jener nach der Reaktion bestimmt werden können. Die Differenz ist ein Indikator für die Geschwindigkeit und/oder die Vollständigkeit der Reaktion.
1 veranschaulicht auf schematische und allgemeine Weise die Testverfahren der vorliegenden Erfindung. Diese Abbildungen dienen nur dem Zwecke der Veranschaulichung und sollen die vorliegende Erfindung nicht einschränken. Kurz gesagt, wie 1 zeigt, wird ein fluoreszenzmarkiertes erster Reagens 102 bereitgestellt. Das erste Reagens hat eine relativ hohe Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit. Das erste Reagens 102 wird mit einem zweiten Reagens, z.B. Enzym I, kombiniert, das entweder die Addition einer geladenen Gruppe 104 vermittelt oder selbst diese Gruppe bildet, die sich mit dem ersten Reagens 102 zu einem geladenen Produkt 106 verbindet. Das resultierende geladene Produkt hat typischerweise eine Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit, die sich nicht nennenswert von jener des ersten Reagens unterscheidet.
Das Produkt wird dann mit einem relativ großen Polyion 108 kontaktiert, das sich mit dem geladenen Fluoreszenzprodukt 106 verbindet. Das resultierende Polyion/geladene Fluoreszenzprodukt 110 weist im Vergleich zum ursprünglichen ersten Reagens eine erheblich verringerte Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit auf. Wie oben beschrieben ist dieser Unterschied in der Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit beispielsweise mit Verfahren zur Fluoreszenzpolarisationsdetektion quantitativ messbar.
Obwohl die hierin beschriebenen Verfahren generell unter Bezug auf das Polyion beschrieben werden, das sich mit dem Produkt der Reaktion von Interesse verbindet, wirken diese Verfahren auch in die entgegengesetzte Richtung. Speziell wird gegebenenfalls das erste Reagens mit dem Polyion verbunden, mit all den damit einhergehenden Charakteristiken. Die Reaktion von Interesse verändert infolge bei der Herstellung eines Produkts die Ladung des ersten Reagens. Das Produkt zeigt dann im Vergleich zum ersten Reagens verringerte oder eliminierte Wechselwirkung mit dem Polyion. Diese reduzierte Wechselwirkung bewirkt dann – relativ zum ersten Reagens – eine geänderte Fähigkeit des Produkts, polarisierte Fluoreszenz zu emittieren. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, dass der Test ein heterogenes Format verwendet, z.B. die Einführung des Polyions nach der Durchführung der Reaktion von Interesse aufgrund möglicher störender Wirkungen des Polyions auf die Reaktion von Interesse. Verfahren zur Durchführung der Testverfahren der Erfindung sowohl in homogenen als auch heterogenen Formaten werden weiter unten detaillierter beschrieben.
Der Wert der Fluoreszenzpolarisation des Produkts stellt dann einen Hinweis auf die Menge der Fluoreszenzmarkierung bereit, die an das Polyion gebunden ist, z.B. als Verhältnis von gebundener zu freier Markierung. Typischerweise werden Fluoreszenzpolarisationsdaten allgemein als Verhältnis zwischen der Differenz von paralleler und senkrechter Fluoreszenzemission und der Summe dieser Fluoreszenzemissionen angegeben. Folglich, je kleiner die Differenz zwischen diesen Fluoreszenzemissionen, umso depolarisierter sind beispielsweise die Emissionen und umso kleiner ist der Polarisationswert. Hingegen ergeben polarisiertere Emissionen höhere Zahlen. Wie oben erwähnt wird durch den Vergleich der Testergebnisse der Polarisationswert (P) für das Reaktionsgemisch bestimmt. Der Anteil an gebundener Fluoreszenz, der z.B. mit dem Polyion assoziiert ist, wird wie folgt bestimmt: Fb = (P – Pr)/(Pb – Pr) (3)
Darin ist P_b der P-Wert der gebundenen Spezies, und P_r ist der P-Wert der freien Spezies. Folglich kann der Polarisationswert als absolutes quantitatives Maß für das Verhältnis zwischen Produkt und Substrat verwendet werden, wobei der P-Wert für vollständig gebundene und für vollständig freie Markierungen bestimmt wurde oder bereits bekannt ist. Alternativ dazu kann wie oben angemerkt die Fluoreszenzpolarisation vor und nach der Reaktion gemessen werden, wobei die Differenz zwischen den beiden als Indikator für die Menge an produziertem Produkt verwendet wird. Wie oben erwähnt funktionieren die Testverfahren auch für das umgekehrte Testformat, wo sich beispielsweise das Polyion mit dem ersten Reagens verbindet, jedoch nicht mit dem fluoreszierenden Produkt. In diesem Fall wird die Differenz zwischen der Fluoreszenzpolarisation des ersten Reagens und jener des Produkts bestimmt.
Der P-Wert dient als Indikator für die Reaktion von Interesse, z.B. durch Angabe der Menge an erzeugtem Produkt. Wie später detaillierter beschrieben wird, kann, sobald eine Testreaktion messbar ist, dieses Test in einer Reihe verschiedener Anwendungen, unter anderem in der Diagnostik aber insbesondere zum Screening auf potenzielle Inhibitoren oder Verstärker der Reaktion von Interesse verwendet werden. Dies ist besonders nützlich beim Screening von Verbindungsbanken auf pharmakologisch relevante Targets, die eine oder mehrere der hierin beschriebenen Reaktionen nützen, z.B. Bindung, Enzymmodifikation und dergleichen.
Obwohl hier generell eine Detektion der Fluoreszenzpolarisation beschrieben wird, ist es ganz klar, dass eine Reihe von Detektionsmodellen angewendet werden kann, welche die Rotationsgeschwindigkeit eines Moleküls oder die Translation oder laterale Diffusion eines Moleküls detektieren, die Aufschluss über die Größe des Moleküls gibt. Beispiele für Verfahren zur Detektion der Molekülrotation sind Kernresonanzspektroskopie, Elektronenspinresonanzspektroskopie und Triplettzustand-Absorptionsanisotropie. Beispiele für Verfahren zur Detektion der Translationsrate von Molekülen sind beispielsweise Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzerholung nach Photobleaching und Magnetresonanz-Spinaustausch-Spektroskopien.
Wie oben wiederholt angemerkt wurde, können die Verfahren der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, eine Reihe verschiedener Arten biologisch oder biochemisch relevanter enzymvermittelter Reaktionen zu testen. Bindungsreaktionen und Hybridisierungsreaktionen sind als Alternativbeispiele inkludiert. Bei Bindungsreaktionen wird das erste Reagens, das eine eine Fluoreszenzmarkierung trägt, mit einem zweiten Reagens kontaktiert, das sich an das erste bindet, um ein fluoreszenzmarkiertes Produkt herzustellen. Das zweite Reagens weist typischerweise einen so hohen Ladungswert auf, dass das Produkt aus der Bindung des zweiten Reagens an das erste Reagens eine Ladung aufweist, die sich von der Ladung des ersten Reagens alleine deutlich unterscheidet.
Ein einfaches Beispiel für solch einen Bindungstest ist ein Nucleinsäurehybridisierungstest. Genauer gesagt werden durch die Bestimmung der Gegenwart einer speziellen Nucleinsäuresequenz oder -untersequenz in einer Probe oder einer Target-Nucleinsäure häufig Target-Nucleinsäuren mit kürzeren Nucleinsäuresonden abgefragt, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, welche die Sequenz oder Untersequenz von Interesse im Target ergänzt und so an diese hybridisieren kann. Wenn die Sonde an die Target-Sequenz hybridisiert, ist die Gegenwart der Untersequenz von Interesse bewiesen. Bereits beschriebene Hochdurchsatz-Verfahren haben im Allgemeinen erfordert, dass zumindest eine Sonde bzw. die Target-Sequenz immobilisiert ist, z.B. auf einem festen Träger oder in einer bestimmten Position in einer Oligonucleotid-Anordnung (siehe z.B. US-A-5.142.854 und 5.744.305). Obwohl einige lösungsbasierte Hybridisierungsdetektionsverfahren beschrieben worden sind, erfordern diese typischerweise für die abzufragende Sequenz speziell synthetisierte Reagenzien, z.B. FRET-Farbstoffpaare, Hybridisierungssonden oder dergleichen.
Das erste Reagens ist typischerweise ein im Wesentlichen ungeladenes bzw. positiv geladenes Nucleinsäureanalogon, das eine Fluoreszenzmarkierung trägt. Passende Nucleinsäureanaloga sind allgemein bekannt und umfassen z.B. Peptidnucleinsäuren (PNAs), Methylphosphonat-Polymere und kationische Nucleinsäureanaloga. Beispielsweise enthalten PNAs im Gegensatz zu den hochgeladenen Glykophosphat-Rückgraten von Nucleinsäuremolekülen im Allgemeinen ein ungeladenes Peptidrückgrat, auf dem Nucleobasen vorhanden sind. PNAs werden aufgrund ihrer leichten kommerziellen Verfügbarkeit als auch aufgrund ihrer günstigen Hybridisierungseigenschaften in Bezug auf komplementäre Nucleinsäurestränge, z.B. höhere Schmelz punkte etc., generell bevorzugt. Da diese Nucleinsäureanaloga neutral oder in einigen Fällen positiv geladen sind, gehen sie keine ladungsbasierte Bindung mit der Polykation-Komponente des Tests ein, die im Fall von Nucleinsäuretests aus positiv geladenen Polyionen besteht. Es ist klar, dass eine wichtige Besonderheit des Nucleinsäureanalogons ist, dass es nicht alleine mit der Polyion-Komponente wechselwirken kann. Typischerweise bedeutet dies, dass das Nucleinsäureanalogon im Wesentlichen ungeladen ist, z.B. eine unzureichende Ladung aufweist, um mit dem Polyion wechselwirken zu können. In vielen Fällen wird das Analogon selbstverständlich einen gewissen Grad an Ladung aufweisen, z.B. mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert sein, oder es verfügt über dieselbe Art von Nettoladung wie etwa das Polyion, d.h. entweder positiv oder negativ, um Wechselwirkung zu verhindern. Beispielsweise kann das Analogon im Fall von Nucleinsäuretests generell positiv geladen oder im Wesentlichen ungeladen sein.
Da Nucleinsäuren stark geladene Spezies sind, wird ein im Wesentlichen ungeladenes oder positiv geladenes Nucleinsäureanalogon als erstes Reagens verwendet. Dies ermöglicht eine Unterscheidung zwischen der freien Sonde und der an die Targetsequenz hybridisierten Sonde anhand der vom Hybrid getragenen Ladung aufgrund der Gegenwart der Targetsequenz. Obwohl sich das Polyion mit der gesamten Target-Sequenz verbindet, einschließlich jenem Teil, der nicht mit der Sonde hybridisiert, ist diese Wechselwirkung für den Wissenschafter unsichtbar, weil das Ergebnis dieser Wechselwirkung keine Fluoreszenzmarkierung trägt. Dieser Nucleinsäurehybridisierungstest wird in 2 schematisch veranschaulicht.
Es wird gezeigt, dass eine Target-Nucleinsäure 202 (schematisch dargestellt) mit einer fluoreszierenden Sonde 204 (die Fluoreszenzmarkierung ist mit * bezeichnet) abgefragt wird, die typischerweise ein positiv geladenes oder im Wesentlichen ungeladenes Nucleinsäureanalogon, z.B. eine PNA-Sonde, umfasst. Die Sonde wird so gewählt, dass sie komplementär zu einer bestimmten Nucleotidsequenz, z.B. der Sequenz von Interesse, ist, sodass die Sonde selektiv an diese Sequenz hybridisiert, wenn sie in der Target-Nucleinsäure 202 enthalten ist. Alleine weist die Sonde aufgrund ihrer kleinen Größe eine relativ hohe Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit auf, wie durch Pfeil 206 schematisch veranschaulicht wird, wodurch stärker depolarisierte Fluoreszenz emittiert wird.
Die in Bild I veranschaulichte Reaktion zeigt jenen Fall, in dem die Target-Sequenz 202 die Sequenz von Interesse enthält, sodass die Sonde 204 an die Targetsequenz 202 hybridisiert, um ein erstes Hybrid 208 zu bilden. Aufgrund der Tatsache, dass das Hybrid im Vergleich zur Sonde größer ist, ergibt diese Hybridisierungsreaktion, wie durch Pfeil 210 angezeigt wird, eine Reduktion der Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit der fluoreszenzmarkierten Verbindung (in diesem Fall des Hybrids). Jedoch ist aufgrund der flexiblen Natur von Nucleinsäuren sowie des stufenweisen Anstiegs der Größe des Hybrids gegenüber der Größe des Targets diese Reduktion möglicherweise nicht deutlich und möglicherweise nicht leicht detektierbar. Gemäß den Vergleichsvfahren wird dieses Signal (P) jedoch effizient verstärkt, indem an das Hybrid eine polyionische Verbindung 212 addiert wird. Speziell Nucleinsäuren, d.h. die Targetsequenz, sind aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphat/Zucker-Rückgrate stark geladene Spezies. Folglich existiert diese Ladung sogar dann, wenn die Nucleinsäure in doppelsträngiger Form vorliegt.
Wenn eine Polyion-Verbindung, z.B. das Polykation 212, d.h. Polylysin, an das Hybrid 208 addiert wird, verbindet es sich mit dem Hybrid 208 zu einem Assoziationskomplex 214 und verringert, wie durch Pfeil 222 angegeben, die Rotationsdiffusion des Gesamtkomplexes 214 deutlich. Diese Differenz ist leichter detektierbar.
Im Gegensatz dazu zeigt die in Bild II veranschaulichte Reaktion jenen Fall, in dem die Target-Sequenz 202 nicht die zur Sequenz der Fluoreszenzsonde 204 komplementäre Sequenz von Interesse enthält. Als solche können die Sonde und die Target-Sequenz nicht hybridisieren, und die Rotationsdiffusion der fluoreszierenden Komponente (der nichthybridisierten Sonde) bleibt wie durch Pfeil 216 veranschaulicht unverändert. Weiters verbindet sich das Polykation-Polyion, wenn es zur Reaktion hinzugefügt wird, wiederum mit der stark geladenen Target-Sequenz zu einem Assoziationskomplex 218. Jedoch verbindet sich das Polykation aufgrund des ungeladenen oder gleich geladenen Charakters der fluoreszierenden Sonde 204 nicht mit der Sonde. Somit bleibt die Rotationsdiffusion der fluoreszierenden Verbindung (wiederum der nichthybridisierten Sonde 204), wie durch Pfeil 220 veranschaulicht, unverändert. Folglich sind die Fluoreszenzemissionen der Reaktion im Fall der Hybridisierung, d.h. wenn die Sequenz von Interesse im Target vorhanden ist, bei Anregung mit polarisiertem Anregungslicht im Vergleich zur nichthybridisierten Sonde deutlich polarisiert. Es gibt hingegen keine Veränderung des Werts der Fluoreszenzpolarisation wenn keine Hybridisierung erfolgt, d.h. die Sequenz von Interesse nicht enthalten ist. Dementsprechend ist eine Änderung der Fluoreszenzpolarisation ein Indikator für die Gegenwart der Sequenz von Interesse.
Die Verfahren und Systeme der Alternativbeispiele sind auch bei der Durchführung einer Reihe von anderen Bindungstests nützlich, wo der resultierende Komplex eine deutlich unterschiedliche Ladung als die Ladung des fluoreszenzmarkierten Elements des Bindungspaares aufweist. Beispielsweise dienen die Verfahren der Alternativbeispiele in einem Rezeptorbindungstest, in dem ein neutraler, fluoreszierender Ligand an den geladenen, unmarkierten Rezeptor gebunden wird, der Verstärkung des Fluoreszenzpolarisationssignals des Komplexes durch Bindung einer großen Polyion-Verbindung an diesen Komplex. Genauer gesagt ist der Komplex mit der gebundenen Polyion-Verbindung wesentlich größer, obwohl der Komplex alleine eine hierin beschriebene Fluoreszenzpolarisationsreaktion ergibt. Es ist klar, dass gemäß vorliegender Erfindung eine große Anzahl an Tests durchgeführt werden kann. Eine viel größere Anzahl an Tests kann leicht konfiguriert werden, um gemäß diesen Verfahren zu funktionieren, z.B. wenn der gebundene Komplex eine deutlich unterschiedliche Ladung aufweist als ein fluoreszenzmarkierter freier Bestandteil des endgültigen Komplexes.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind beim Testen auf Enzymaktivität von Nutzen, wenn diese Aktivität ein Produkt ergibt, das eine deutlich unterschiedliche Ladung aufweist als das Substrat, auf welches das Enzym einwirkt. Ein Beispiel für eine Klasse von Enzymtests, die für die Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind jene, die Phosphatgruppen an geeignete Substanzen hinzufügen oder davon entfernen, z.B. Kinase- und Phosphatase-Tests. Das Interesse an diesen Aktivitäten basiert hauptsächlich auf ihrer Rolle bei der Vermittlung einer Reihe von biologisch relevanten In-vivo-Reaktionen. Ganz besonders Kinase- und Phosphatase-Reaktionen sind oft Signalereignisse vor oder während komplexen Zellverhaltens wie Überleben und Proliferation. Als solche sind ihre Aktivitäten bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen dieses Verhalten schlecht funktioniert, z.B. Krebs und dergleichen, von besonderem Interesse.
Wie oben erwähnt ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich, wenn die Aktivität von Kinase-Enzymen getestet werden soll. Kinaseenzyme funktionieren typischerweise durch Hinzufügung einer Phosphatgruppe an ein phosphorylierbares Substrat, z.B. Protein, Peptid, Nucleosid, Kohlenhydrat etc. Da Phosphatgruppen stark geladen sind, bedingt ihre Hinzufügung an ein bestimmtes Substrat typischerweise eine bedeutende Änderung der Ladung des Produkts gegenüber dem Substrat. Wie bei den oben beschriebenen Tests kann diese Änderung der Ladung des Produkts gegenüber jener des Substrats durch Zusatz einer Polyion-Verbindung genutzt, die einen deutlichen Unterschied in der Fluoreszenzpolarisation des Produkts gegenüber dem Substrat bewirkt.
Kurz gesagt wird ein phosphorylierbares Substrat mit einer oben beschriebenen fluoreszenzmarkierenden Gruppe bereitgestellt. Das phosphorylierbare Substrat kann neutral oder geladen sein. Bevorzugte Substrate sind unter den relevanten Testbedingungen neutral. Zum Beispiel ist ein mit Rhodamin markiertes Substrat für Proteinkinase A (PKA) im Handel allgemein von Promega Inc. erhältlich, während andere fluoreszierende phosphorylierbare Substrate von Research Genetics, Inc. bezogen werden können.
Da das fluoreszierende phosphorylierbare Substrat typischerweise relativ klein ist, z.B. weniger als 2 kD, hat es eine relativ hohe Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit und emittiert daher depolarisierte Fluoreszenz, wenn es mit polarisiertem Licht angeregt wird. Wenn es in Gegenwart eines Phosphatdonors, z.B. ATP, mit einem Kinaseenzym kontaktiert wird, wird das Substrat phosphoryliert und erhält zwei zusätzliche negative Ladungen pro aufgenommenes Phosphat. Diese –2-Nettoladung bildet besonders im Fall des vorher nicht geladenen Substrats eine Grundlage für die Wechselwirkung des Produkts mit einer Polyion-Verbindung, z.B. einem Polykation wie Polylysin oder Polyhistidin. Wenn sich das Polyion mit dem phosphoryliertem Substrat verbindet, verringert es die Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit bedeutend und reduziert so die Fluoreszenzdepolarisationsgeschwindigkeit; z.B. erhöht es den Fluoreszenzpolarisationswert. Diese Polarisationsveränderung wird dann detektiert und zur Quantifizierung der Kinasereaktion eingesetzt.
Eine schematische Darstellung dieser Reaktion wird in 3 gezeigt. Wie demonstriert wird, wird das fluoreszenzmarkierte phosphorylierbare Substrat 302 in Gegenwart von Phosphat 304, z.B. in Form von ATP, mit einem Kinaseenzym 306 in Kontakt gebracht. Die Reaktion liefert das phosphorylierte Produkt 308. Sowohl das fluoreszierende Substrat 302 als auch das phosphorylierte fluoreszierende Produkt 308 haben aufgrund ihrer geringen Größe relativ hohe Rotationsdiffusionsgeschwindigkeiten. Das phosphoryliere fluoreszierende Produkt wird dann mit einem Polykation in Kontakt gebracht. Bevorzugte Polykationen sind Polyaminosäuren wie Polylysin, Polyhistidin oder dergleichen, wobei Polyhystidin am meisten bevorzugt wird. Das Polykation verbindet sich daraufhin mit dem negativ geladenen, phosphorylierten fluoreszierenden Produkt und beinflusst somit seine Größe und seine Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit drastisch, die dann wie hierin beschrieben detektiert wird. Es versteht sich, dass die Polyion-Komponente alternativ ein großes Molekül umfassen kann, z.B. ein Protein oder dergleichen, das mit mehrwertigen Metallkationen, z.B. Fe³⁺, Ca²⁺, Ni²⁺ und Zn²⁺, verbunden ist. Beispiele für solche Moleküle sind Proteine, die Metallchelate bilden und diese Ionen oder dergleichen chelatieren. Speziell haben diese Metallionen eine relativ hohe Affinität für Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelgruppen. Folglich können sie einem großen Molekül (wie einem Polyion) signifikante Bindungsaffinität für Phosphatgruppen in Nucleinsäuren oder in phosphorylierten Substraten und dergleichen, sowie für andere Gruppen, die Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefelgruppen enthalten, verleihen und so jene Wechselwirkung hervorrufen, die eingesetzt wird, um wie hierin beschrieben die Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit einer fluoreszierenden Spezies bedeutend zu verlangsamen.
Die vorliegende Erfindung ist auch zum Testen auf die entgegengesetzte Reaktion geeignet, speziell jene Phosphatasereaktion, die eine Phosphatgruppe von einem phosphorylierten Substrat entfernt. Die Reaktion erfolgt im Wesentlichen auf jenem Weg, der entgegensetzt zu dem in 3 gezeigten Weg verläuft und wird in 4 schematisch veranschaulicht. Kurz gesagt wird die phosphorylierte fluoreszierende Verbindung 308, die in diesem Fall das Substrat ist, mit der Polykation-Verbindung 310 in Kontakt gebracht, um den assoziativen Komplex 312 zu ergeben, in dem sich das Polykation mit den durch die Phosphatgruppe hinzugefügten Ladungen verbindet. Wie oben unter Hinweis auf 3 erwähnt wurde, verfügt dieser Komplex über eine geringe Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit. Wenn auf diesen Komplex ein Phosphataseenzym 414 einwirkt, führt dies zur Abspaltung der geladenen Phosphatgruppe und des damit verbundenen Polykations 404 von der fluoreszierenden Komponente 302, die in diesem Fall das Produkt ist. Wenn das fluoreszierende Produkt nicht mehr mit der großen Polykation-Verbindung verbunden ist, weist es eine stark erhöhte Rotationsdiffusionsgeschwindigkeit auf, emittiert z.B. depolarisierte Fluoreszenz. Diese Änderung der Fluoreszenzpolarisation wird wie hierin beschrieben detektiert. Wie oben erwähnt kann der Test in manchen Fällen vorzugsweise in einem heterogenen Format durchgeführt werden, z.B. wenn die Polyion-Komponente nach der Reaktion von Interesse hinzugefügt wird, um jegliche nachteilige Auswirkungen der Gegenwart des Polyions auf die Reaktion zu vermeiden.
Obwohl die Möglichkeit, eine Reihe von Tests durchzuführen, an sich nützlich ist, sind die spezifischen Anwendungen dieser Tests am wertvollsten. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit, die Auswirkungen von potenziellen pharmazeutischen Kandidatenverbindungen auf die oben erwähnten verschiedenen Aktivitäten zu testen. Speziell in pharmazeutischen Verfahren zur Entdeckung neuer Medikamente werden große Banken chemischer Verbindungen generell auf pharmakologisch relevante Targets gescreent. Diese Targets können Rezeptoren, Enzyme, Transporter und dergleichen umfassen. Es ist eine Reihe von Screening-Tests und -Systemen beschrieben worden. Siehe z.B. die veröffentlichte Internationale Patentanmeldung WO 98/00231.
Kurz gesagt kann eine spezielle, biologisch oder biochemisch relevante Reaktion in Gegenwart und in Abwesenheit einer zu screenenden Verbindung durchgeführt und die Wirkung der Verbindung bestimmt werden. Speziell wenn die Reaktion durch die Gegenwart der Testverbindung verlangsamt oder blockiert wird, wird die Verbindung als Inhibitor der Reaktion identifiziert. Wenn hingegen die Reaktion in Gegenwart der Testverbindung rascher bzw. in stärkerem Ausmaß abläuft, wird die Verbindung als Beschleuniger der Reaktion identifiziert. Diese Screeningtests werden sodann für eine große Anzahl verschiedener Verbindungen, entweder nacheinander oder gleichzeitig, durchgeführt, um die Entdeckung von potenziellen Effektoren der Reaktion von Interesse zu beschleunigen.
III. Test-Systeme
Die Alternativbeispiele stellen Testsysteme bereit, die zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren verwendet werden. Typischerweise umfassen die hierin beschriebenen Testsysteme einen Fluidbehälter, in den die Reagenzien zur Durchführung des Tests eingefüllt werden. Der Fluidbehälter umfasst typischerweise eine erste Reaktionszone mit einem darin angeordneten ersten Reagensgemisch, das ein erstes Reagens mit einer Fluoreszenzmarkierung und ein zweites Reagens, das mit dem ersten reagiert, um ein fluoreszenzmarkiertes Produkt mit einer deutlich unterschiedlichen Ladung als jene des ersten Reagens herzustellen, sowie eine Polyion-Verbindung enthält.
5 veranschaulicht schematisch ein Gesamttestsystem, das zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Kurz gesagt umfasst das Gesamtsystem 500 einen oben beschriebenen Reaktionsbehälter 502. Ein Detektor oder Detektionssystem 504 neben dem Behälter angeordnet und steht in Sensorkommunikation mit dem Behälter. Die Wendung "in Sensorkommunikation" bezieht sich im Allgemeinen auf den Detektor, der so zum Behälter positioniert ist, dass er ein spezielles Signal von diesem Behälter empfangen kann. Im Fall von optischen Detektoren, z.B. Fluoreszenz- oder Fluoreszenzpolarisationsdetektoren bedeutet Sensorkommunikation typischerweise, dass der Detektor ausreichend nahe am Behälter angeordnet ist, damit optische Signale, z.B. Fluoreszenzsignale, zur geeigneten Detektion dieser Signale an den Detektor übermittelt werden. Typischerweise wird hier eine Linse, ein Strahlengang oder ein anderes Detektionselement, z.B. ein CDD, das auf einen relevanten Bereich des Behälters fokussiert ist, verwendet, um diese optischen Signale effizient aufzunehmen und aufzuzeichnen.
Der Detektor 504 wird typischerweise mit einer geeigneten Datenspeicher- und/oder Datenanalyseeinheit, z.B. einem Computer oder einem anderen Prozessor, verbunden, der die vom Behälter erhaltenen Daten allgemein auf eine für den Benutzer verständliche Art und Weise speichern, analysieren und anzeigen kann, z.B. Display 508. Bei bestimmten Ausführungsformen, z.B. bei jenen, die Mikrofluidikbehälter verwenden, wird der Computer 506 gegebenenfalls mit einer geeigneten Controllereinheit 510 verbunden, welche die Bewegung von Fluidmaterialien in den Kanälen des Behälters der Mikrofluidikvorrichtung und/oder die relative Position des Behälters 502 und des Detektors 504, z.B. über eine x-y-z-Translationsstufe, steuert.
Der Behälter umfasst typischerweise eine Detektionszone sowie einen Detektor, der in Sensorkommunikation mit der Detektionszone steht. Der Detektor ist typischerweise für die Detektion eines Fluoreszenzpolarisationswert der Reagenzien in der Detektionszone konfiguriert.
Wie hierin verwendet kann der Behälter eine Reihe von Formen aufweisen. Beispielsweise kann der Behälter einfach ein(e) Reaktionsgefäß, Well, Röhrchen, Küvette oder dergleichen sein. Alternativ kann der Behälter eine Kapillare oder einen Kanal umfassen, und zwar entweder alleine oder in einem integrierten Fluidiksystem, das ein oder mehrere Fluidikkanäle, -kammern oder dergleichen umfasst.
Im Fall von einfachen Reaktionsgefäßen, Wells, Röhrchen, Küvetten oder dergleichen beziehen sich die Reaktionszone und die Detektionszone typischerweise auf denselben Fluid enthaltenden Teil des Behälters. Zum Beispiel werden in jenem Teil der Küvette, der Fluids enthält, Reagenzien vermischt, umgesetzt und dann detektiert. Typischerweise können Multiplexbehälter verwendet werden, um die Durchfüh rung der Tests, z.B. Screening-Tests zu beschleunigen. Beispiele für solche Behälter sind z.B. Multiwellplatten, d.h. 96-Well-, 384-Well-, oder 1536-Well-Platten.
Für Ausführungsformen, die auf Kapillaren oder Kanälen basieren, können die Reaktionszone und die Detektionszone denselben Fluid enthaltenden Teil des Behälters umfassen. Jedoch sind die Reaktionszone und die Detektionszone in vielen Ausführungsformen getrennte Teile des Behälters, die Fluids enthalten. Insbesondere können Reagenzien in einem Teil des Behälters vermischt und umgesetzt werden, und in der Folge in eine spezielle Detektionszone befördert werden, woraufhin die Reaktionsprodukte etc. detektiert werden.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Behälter eine Mikrofluidikvorrichtung. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Mikrofluidikvorrichtung" auf eine Vorrichtung oder Körperstruktur, die zumindest eine Fluidikkomponente, z.B. einen Kanal, eine Kammer, eine Vertiefung oder dergleichen umfasst oder enthält, die zumindest eine Querschnittsdimension zwischen etwa 0,1 und 500 μm aufweist, wobei diese Kanäle und/oder Kammern oft zumindest eine Querschnittsdimension von zwischen etwa 0,1 und 200 μm aufweisen, in manchen Fällen zwischen etwa 0,1 und 100 μm und oft zwischen etwa 0,1 und 20 μm. Solche Querschnittsdimensionen umfassen z.B. Breite, Tiefe, Höhe, Durchmesser oder dergleichen. Typischerweise werden Strukturen mit diesen Dimensionen auch als "Mikromaßstab" bezeichnet. Mikrofluidikvorrichtungen enthalten zumindest eine(n) und vorzugsweise mehr als eine(n) in einer einzigen Körperstruktur vorgesehene(n) Kanal und/oder Kammer. Solche Kanäle/Kammern können getrennt und einzeln vorliegen oder alternativ auch in Fluidverbindung stehen. Diese Fluidverbindungen können über Kanäle, Kanalschnittpunkte, Ventile oder dergleichen bereitgestellt werden. Kanalschnittpunkte können in einer Reihe von Formaten vorliegen, einschließlich von Kreuzungspunkten, T-förmigen Schnittpunkten oder in Form beliebiger anderer Strukturen, durch die zwei Kanäle in Fluidverbindung mit einander stehen.
Aufgrund ihrer Steuerbarkeit, sind die Ausführungsformen von Mikrofluidikvorrichtungen bei der Durchführung von hierin beschriebenen heterogenen Testformen besonders nützlich. Reaktionen werden insbesondere in einem ersten Teil des Kanalnetzwerks im Mikromaßstab durchgeführt. Die Reaktionsprodukte werden dann in einen anderen Teil des Kanalnetzwerkes befördert, oder es werden zusätzliche Komponenten in den ursprünglichen Teil des Kanalnetzwerkes eingebracht, um sich dort mit den Reaktionsprodukten zu vermischen. Zum Beispiel kann die Polyion-Komponente der hierin beschriebenen Testverfahren nach der Reaktion von Interesse hinzugefügt werden, um sicherzustellen, dass sie die Reaktion nicht stört. Mikrofluidiksysteme eröffnen die Möglichkeit, die verschiedenen Reagenzien durch die verschiedenen Kanäle der Vorrichtung zu bewegen, was ihre genaue Messung und zeitgerechten Zusatz ermöglicht. Ein einfaches Beispiel: Eine Phosphatase-Reaktion kann mit einem phosphorylierten Substrat in einer ersten Kanalregion einer Mikrofluidikvorrichtung durchgeführt werden, wodurch eine Phosphatgruppe, z.B. ATP, und das nicht phosphorylierte Produkt sowie nichtumgesetztes Substrat erhalten werden. Das Gemisch wird dann mit der Polyion-Komponente, z.B. Polyhistidin, entweder durch Beförderung des Reaktionsgemischs in einen separaten Kanal, das das Polyion enthält, oder durch Einführung des Polyions in das Reaktionsgemisch im ursprünglichen Kanalsegment vermischt. Das resultierende Gemisch wird dann an einem Detektionspunkt, an dem die Fluoreszenzpolarisation gemessen wird, vorbeibewegt.
Die Körperstruktur der hierin beschriebenen Mikrofluidikvorrichtungen umfasst typischerweise eine Aggregation zweier oder mehrerer separater Komponenten, welche die Mikrofluidikvorrichtung, die z.B. die hierein beschriebenen Kanäle und/oder Kammern enthält, bilden, sofern sie auf geeignete Weise angepasst oder verbunden werden. Typischerweise werden die hierin beschriebenen Mikrofluidikvorrichtungen als Aggregat von Substratschichten hergestellt. Insbesondere umfassen solche bevorzugten Vorrichtungen einen oberen, unteren und inneren Teil, wobei der innere Teil die Kanäle und Kammern der Vorrichtung im Wesentlichen definiert.
6 zeigt eine aus zwei Schichten bestehende Körperstruktur 610 für eine Mikrofluidikvorrichtung. In bevorzugten Aspekten umfasst der untere Teil der Vorrichtung 612 ein festes Substrat, das im Wesentlichen eine ebene Struktur aufweist und zumindest eine im Wesentlichen flache obere Deckfläche 614 aufweist. Eine Reihe von Substratmaterialien können für den unteren Teil verwendet werden. Typischerweise werden die Substratmaterialien basierend auf ihrer Verträglichkeit mit bekannten Mikrofabrikationstechniken, z.B. Photolithographie, nasschemischem Ätzen, Laserablation, Luftabrasion, Spritzgussverfahren, Prägung und anderen Techniken ausgewählt, da die Vorrichtungen im Mikrometerbereich hergestellt werden. Die Substratmaterialien werden im Allgemeinen anhand ihrer Verträglichkeit mit der gesamten Reihe an Bedingungen ausgewählt, denen die Mikrofluidikvorrichtungen ausgesetzt sein können, einschließlich extremer pH-Werte, Temperaturen, Salzkonzentrationen und Anlegung elektrischer Felder. Dementsprechend können die Substratmaterialien in einigen bevorzugten Ausführungsformen Materialien umfassen, die typischerweise mit der Halbleiterindustrie in Zusammenhang stehen, in der solche Mikrofabrikationstechniken für gewöhnlich angewendet werden, einschließlich z.B. auf Kieselerde basierender Substrate, wie z.B. Glas, Quarz, Silicon oder Polysilicon, sowie anderer Substratmaterialien, z.B. Galliumarsenid und dergleichen. Im Fall von Halbleitermaterialien ist es oft wünschenswert, eine isolierende Ummantelung oder Schicht, z.B. Siliziumoxid, über dem Substratmaterial bereitzustellen, insbesondere bei jenen Anwendungen, in denen elektrische Felder an die Vorrichtung oder ihren Inhalt angelegt werden sollen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Substratmaterialien Polymermaterialien, z.B. Kunststoffe, wie etwa Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (TEFLON^TM), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon, Polystyrol, Polymethylpenten, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylidenfluorid, ABS (Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymer) und dergleichen. Solche Polymersubstrate werden einfach unter Einsatz verfügbarer Mikrofabrikationstechniken wie oben beschrieben oder aus mikrofabrizierten Mastern unter Anwendung bekannter Formverfahren, wie z.B. Spritzgussverfahren, Prägung, Stanzen oder dergleichen, hergestellt. Solche Polymersubstratmaterialien werden aufgrund ihrer einfachen Herstellung, ihrer geringen Kosten und ihrer Verfügbarkeit sowie aufgrund ihrer allgemeinen Reaktionsträgheit bei den meisten extremen Reaktionsbe dingungen bevorzugt. Diese Polymermaterialien können wiederum behandelte Oberflächen umfassen, z.B. derivatisierte oder überzogene Oberflächen, um ihre Nützlichkeit innerhalb des Mikrofluidiksystems zu erhöhen, z.B. durch Bereitstellung erhöhter Fluidsteuerung, z.B. wie in US-A-5.885.470 beschrieben.
Die Kanäle und/oder Kammern der Mikrofluidikvorrichtungen werden typischerweise in der oberen Deckfläche des unteren Substrats oder Bereichs 612 (obwohl sie auch in einer oder in beiden oberen Deckflächen des unteren Substrats oder in der unteren Oberfläche des oberen Substrats angefertigt werden können) als Furchen oder Einkerbungen 616 im Mikromaßstab unter Einsatz der oben beschriebenen Mikrofabrikationstechniken angefertigt. Der obere Teil oder Substrat 618 umfasst auch eine erste ebene Oberfläche 620 und eine zweite Oberfläche 622 gegenüber der ersten ebenen Oberfläche 620. Bei den Mikrofluidikvorrichtungen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren angefertigt wurden, umfasst der obere Teil eine Reihe von darin vorgesehenen Öffnungen, Löchern oder Ports 624, z.B. von der ersten ebenen Oberfläche 620 zur zweiten Oberfläche 622 gegenüber der ersten ebenen Oberfläche.
Die erste ebene Oberfläche 620 des oberen Substrats 618 wird dann gepaart, z.B. wird sie mit der ebenen Oberfläche 614 des unteren Substrats 612 in Kontakt gebracht und damit verbunden, wodurch die Furchen und/oder Einkerbungen 616 in der Oberfläche des unteren Substrats bedeckt und dicht verschlossen werden, um an der Schnittstelle dieser beiden Komponenten Kanäle und/oder Kammern (d.h. den inneren Teil) der Vorrichtung zu formen. Die Löcher 624 im oberen Teil der Vorrichtung sind so ausgerichtet, dass sie von den Furchen und Einkerbungen im unteren Substrat weg mit zumindest einem/-r der Kanäle und/oder Kammern in Verbindung stehen, die im inneren Teil der Vorrichtung gebildet werden. In der fertiggestellten Vorrichtung dienen diese Löcher als Reservoirs, welche die Einführung von Fluids oder Materialien in die Kanäle und Kammern des inneren Teils der Vorrichtung erleichtern, und Ports bereitstellen, an denen Elektroden in der Vorrichtung mit Fluids in Kontakt gebracht werden können, wodurch die Anlegung von elektrischen Feldern entlang der Kanäle der Vorrichtung ermöglicht wird, um den Fluidtransport in der Vorrichtung zu steuern und zu lenken.
In vielen Ausführungsformen umfassen die Mikrofluidikvorrichtungen ein optisches Detektionsfenster, das sich über eine(n) oder mehrere Kanäle und/oder Kammern der Vorrichtung erstreckt. Optische Detektionsfenster sind typischerweise transparent, sodass sie ein optisches Signal vom Kanal oder von der Kammer übertragen können, über den/die sie sich erstrecken. Optische Detektionsfenster können ganz einfach ein Bereich einer transparenten Deckschicht sein, z.B. wenn die Deckschicht aus Glas oder Quarz oder aus einem transparenten Polymermaterial, z.B. PMMA, Polycarbonat etc., besteht. Alternativ werden dort wo opake Substrate zur Herstellung von Vorrichtungen verwendet werden, transparente, aus den oben genannten Materialien hergestellte Detektionsfenster separat in der Vorrichtung angefertigt.
Wie später detaillierter beschrieben wird, können diese Vorrichtungen in einer Reihe von Anwendungen genützt werden, einschließlich z.B. bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Screenings zur Bestimmung von Arzneimitteln, in Immuntests, in der Diagnostik, der Genanalyse und dergleichen. Als solche umfassen die hierin beschriebenen Vorrichtungen oft Ports oder Reservoirs zur Einführung von mehrerer Proben zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Einführung und Analyse von mehreren Proben. Alternativ können diese Vorrichtungen an einen Port zur Probenzufuhr angeschlossen werden, z.B. an einen Pipettierer, der mehrere Proben nacheinander in die Analysevorrichtungen einführt. Beispiele für solche Systeme zur Einführung von Proben werden z.B. im US-A-5.779.868 und den veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen WO 98/00705 und WO 98/00231 beschrieben. Eine schematische Darstellung einer Mikrofluidikvorrichtung, die einen externen Probenpipettierer enthält, wird in 7 gezeigt und später beschrieben.
Bei manchen Substraten, z.B. Glas, Quarz oder Kieselerde, ist es gelegentlich wünschenswert, ein Beschichtungsmaterial in die Kanäle der Mikrofluidikvorrichtung einzuführen. Dies soll primär den Grad der Wechselwirkung zwischen der Polyion-Komponente und der geladenen Oberfläche des Substrats verringern. Jedes bekannte Beschichtungsmaterial ist in dieser Hinsicht nützlich, einschließlich Polymer-Beschichtungsmaterialien, z.B. lineare Polyacrylamide, z.B. Polydimethylacrylamide (PDMA) und dergleichen, die typischerweise in Elektrophoreseanwendungen genützt werden (siehe z.B. US-A-5.948.227, 5.567.292 und 5.264.101). Solche Polymere können an Kieselsäure adsorbiert oder kovalent an die Oberfläche der Substrate gebunden werden, z.B. durch Einführung einer Epoxidgruppe in die Polymerkette [siehe z.B. Chiari et al., HPCE Konferenz, März (2000)], um die Oberflächenladungen auf dem Substrat, das mit der Polyion-Spezies im Reaktionsgemisch wechselwirken kann, zu maskieren.
Kurz gesagt wird eine Mikrofluidikvorrichtung 700 bereitgestellt, die z.B. jener ähnelt, die unter Bezug auf 6 beschrieben wurde und eine Körperstruktur 702 aufweist, die ein Netzwerk innenliegender Kanäle 704 umfasst, die mit einer Reihe von Reservoirs 706 innerhalb der Körperstruktur 702 verbunden sind. Die verschiedenen Reservoirs dienen dazu, verschiedene Reagenzien in die Kanäle 704 der Vorrichtung einzuführen. Ein Kapillarelement 708 ist mit der Körperstruktur 702 so verbunden, dass der Kanal 710, der sich innerhalb dieser Körperstruktur befindet und das Kapillarelement 708 entlang verläuft, in Fluidverbindung mit dem Kanalnetzwerk 704 in der Körperstruktur steht. Dieses Kapillarelement 708 wird dann dazu verwendet, eine Reihe verschiedener Proben- oder Testmaterialien nacheinander aufzuziehen und in der Vorrichtung zu analysieren.
Wie oben beschrieben basieren die Verfahren der vorliegenden Erfindung typischerweise auf einer Änderung des Fluoreszenzpolarisationswerts des Reaktionsgemischs als Folge der Reaktion von Interesse. Es wird also typischerweise ein geeignetes Detektionssystem genutzt, um die polarisierte von der depolarisierten emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden. Im Allgemeinen detektiert ein solches Detektionssystem Fluoreszenzemissionen, die in derselben Ebene wie das polarisierte Anregungslicht emittiert werden, und Fluoreszenzemissionen, die in einer anderen Ebene als in jener des Anregungslichts emittiert werden, typischerweise gesondert.
8 zeigt ein Beispiel für ein Detektionssystem. Wie gezeigt wird, umfasst der Fluoreszenzpolarisationsdetektor eine Lichtquelle 804, die in einer für die im Testsystem enthaltenen Fluoreszenzverbindungen geeigneten Anregungswellenlänge Licht erzeugt. Typischerweise werden kohärente Lichtquellen wie Laser, Laserdioden und dergleichen aufgrund der stark polarisierten Natur des von ihnen erzeugten Lichts bevorzugt. Das Anregungslicht wird durch einen optionalen Polarisationsfilter 806 geleitet, der Licht nur in einer Ebene, z.B. polarisiertes Licht, durchlässt. Das polarisierte Anregungslicht wird dann durch einen Strahlengang, z.B. einen dichroitischen Spiegel 810 und ein Mikroskopobjektiv 812 (und gegebenenfalls einen Referenzstrahlteiler 808) geleitet, der das polarisierte Licht auf den Probenbehälter fokussiert (in der Mikrofluidikvorrichtung 802 als Kanal dargestellt), in dem die zu testende Probe vorgesehen ist.
Die von der Probe emittierte Fluoreszenz wird dann gesammelt, z.B. durch das Objektiv 812 und dann durch den dichroitischen Spiegel 810 zurück geleitet, der die emittierte Fluoreszenz weitergibt und das reflektierte Anregungslicht reflektiert, wodurch die beiden getrennt werden. Die emittierte Fluoreszenz wird dann durch einen Strahlteiler 814 geleitet, wo ein Teil der Fluoreszenz durch einen Filter 816 gelenkt wird, der die Fluoreszenz in der zur Ebene des Anregungslichts parallelen Ebene filtert und die senkrechte Fluoreszenz zu einem ersten Lichtdetektor 818 leitet. Der andere Teil der Fluoreszenz wird durch einen Filter 820 geführt, der die auf die Ebene des Anregungslichts senkrechte Fluoreszenz filtert, wodurch die parallele Fluoreszenz auf einen zweiten Lichtdetektor 822 geleitet wird. Bei alternativen Ausführungsformen wird der Strahlteiler 814 durch einen polarisierten Strahlteiler, z.B. ein Glan-Primsa, ersetzt, sodass die Filter 816 und 820 nicht notwendig sind. Diese Detektoren 818 und 822 sind dann typischerweise mit einem geeigneten Schreiber oder Prozessor verbunden (in 8 nicht dargestellt), wo das Lichtsignal aufgezeichnet und/oder, wie unten detaillierter beschrieben, verarbeitet wird. Signalverstärkerröhren (PMTs) werden im Allgemeinen als Lichtdetektoren zur Quantifizierung des Lichts bevorzugt, es können aber auch andere Lichtdetektoren, z.B. Photodioden oder dergleichen, verwendet werden.
Der Detektor wird normalerweise mit einem Computer oder einem anderen Prozes sor verbunden, der von den Lichtdetektoren Daten empfängt und über die geeigneten Programme verfügt, um die Werte jedes Detektors zu vergleichen, um so das Polarisationsausmaß der Probe bestimmen zu können. Insbesondere umfasst der Computer typischerweise Software-Programme, die als Input die Fluoreszenzintensitäten jedes einzelnen der verschiedenen Detektoren, z.B. parallele und senkrechte Fluoreszenz, empfangen. Die Fluoreszenzintensität wird dann für jeden der Detektoren verglichen, um einen Fluoreszenzpolarisationswert zu erhalten. Ein Beispiel für einen solchen Vergleich ist durch folgende Gleichung gegeben: P = [I(||) – (⫠)]/[I(||) + I(⫠)]C (4)wie oben, mit der Ausnahme, dass ein Korrekturfaktor (C) inkludiert ist, der Polarisationsabweichungen des Detektionsinstruments korrigiert. Der Computer bestimmt den Fluoreszenzpolarisationswert für die Reaktion von Interesse. Aus diesem Polarisationswert und basierend auf den Polarisationswerten für freie und ungebundene Fluoreszenz berechnet der Computer das Verhältnis von gebundener zu freier Fluoreszenz. Alternativ dazu werden die Polarisationswerte vor und nach der Reaktion verglichen und eine Polarisationsdifferenz (ΔP) bestimmt. Die berechneten Polarisationsdifferenzen können dann als Absolutwerte verwendet werden, z.B. um potentielle Effektoren einer bestimmten Reaktion zu identifizieren, oder sie können mit Polarisationsdifferenzen verglichen werden, die in der Gegenwart von bekannten Inhibitoren oder Beschleunigern der Reaktion von Interesse erreicht werden, um den Grad der Hemmung oder Förderung der Reaktion von Interesse durch eine bestimmte Verbindung zu messen.
9 zeigt ein Flussdiagramm für die vom Computer unter Einsatz der oben im Text beschriebenen Softwareprogramme ausgeführten Prozesse. Es wird gezeigt, dass der programmierte Prozess bei Schritt 902 beginnt, wo der Computer die Fluoreszenzintensitätsdaten für die nichtumgesetzten Reagenzien in der Reaktionszone (z.B. in Behälter 502 aus 5) von den zwei Detektoren, z.B. die Detektoren 818 und 820 aus 8, erhält. Der Fluoreszenzpolarisationswert (P) wird dann in Schritt 904, z.B. anhand der hierin beschriebenen Gleichungen, berechnet. In Schritt 906 erhält der Computer von den beiden Detektoren für die umgesetzten Reagenzien Fluoreszenzintensitätsdaten. In Schritt 908 wird wiederum der P-Wert für die umgesetzten Reagenzien berechnet. In Schritt 910 werden die P-Werte für die umgesetzten und die nichtumgesetzten Reagenzien verglichen, z.B. wird ein Wert vom anderen subtrahiert, um einen ΔP-Wert für die Reaktion zu erhalten. An dieser Stelle kann der ΔP-Wert als Maß für die Reaktion, z.B. ihre Geschwindigkeit oder Vollständigkeit, angegeben werden. Gegebenenfalls kann der ΔP-Wert jedoch mit einem standardisierten ΔP-Wert, d.h. einer Reaktion mit einer bekannten Geschwindigkeit, einem bekannten Grad der Hemmung oder Beschleunigung verglichen werden, z.B. in Schritt 912. Durch diesen Vergleich interpoliert oder extrapoliert der Computer gegebenenfalls ein quantitatives Maß für die Reaktion, deren Grad der Hemmung oder Förderung, welche quantitative Messung dem Wissenschafter dann z.B. in Schritt 914 angezeigt wird. Wie oben erwähnt umfasst der Computer gegebenenfalls einen bestimmten Polarisationswert für vollständig freie und für vollständig gebundene Fluoreszenz. In diesem Fall ist die Bestimmung der Fluoreszenzdifferenzen nicht nötig, wodurch mehrere Programmschritte ausgelassen werden können. In diesem Fall erhält der Computer die Fluoreszenzdaten vom Detektor für das Reaktionsgemisch. Der Computer berechnet dann einfach den P-Wert für das Reaktionsgemisch und bestimmt das Verhältnis von gebundener zu freier Fluoreszenz (z.B. gemäß obiger Gleichung (3)). Das Verhältnis dient dann zur Quantifizierung der Reaktion.
Im Fall von Hochdurchsatz-Screeningtestsystemen gibt die Computer-Software gegebenenfalls den Befehl, ein spezielles gescreentes Ergebnis mit einer speziellen Probe oder einem Ort der Probennahme zu korrelieren. Dies ermöglicht dem Wissenschafter, die jeweils in den Tests verwendeten Reagenzien zu identifizieren.
10 zeigt einen Computer und eine Architektur, die für die vorliegende Erfindung typischerweise geeignet sind. Insbesondere 10A zeigt ein Beispiel für ein Computersystem, das dazu verwendet werden kann, die Software, die zur Umsetzung der Verfahren der Erfindung verwendet wird, auszuführen, oder das gemeinsam mit den Vorrichtungen und/oder Systemen der Erfindung verwendet werden kann. Computer system 1000 umfasst typischerweise ein Display 1002, einen Bildschirm 1004, ein Gehäuse 1006, eine Tastatur 1008, und eine Maus 1010. Maus 1010 hat gegebenenfalls einen oder mehrere Knöpfe zur Interaktion mit einer graphischen Benutzeroberfläche (GUI). Gehäuse 1006 beherbergt typischerweise ein CD-ROM-Laufwerk 1012, einen Systemspeicher und ein Festplattenlaufwerk (siehe 10B), die gegebenenfalls dazu verwendet werden, Softwareprogramme zu speichern und abzurufen, welche die Verfahren der Erfindung umsetzen, und/oder den Betrieb der Vorrichtungen und Systeme der Erfindung, die Daten zur Verwendung mit der Erfindung und dergleichen zu kontrollieren. Obwohl CD-ROM 1014 als exemplarisches lesbares Computerspeichermedium dargestellt ist, können auch andere lesbare Computerspeichermedien, einschließlich Diskette, Bandspeicher, Flashspeicher, Systemspeicher und Festplatte, verwendet werden. Zusätzlich kann ein Datensignal in Form einer Trägerwelle (z.B. in einem Netzwerk wie dem Internet, Intranet und dergleichen) als lesbares Computerspeichermedium verwendet werden.
10B zeigt auf schematische Weise ein Blockdiagramm des oben beschriebenen Computersystems 1000. Wie in 10A umfasst Computersystem 1000 Monitor oder Display 1002, Tastatur 1008 und Maus 1010. Das Computersystem 1000 umfasst typischerweise auch Subsysteme, wie z.B. einen zentralen Prozessor 1016, Systemspeicher 1018, Fixspeicher 1020 (z.B. eine Festplatte), ein Wechselspeichermedium 1022 (z.B. ein CD-ROM-Laufwerk), Displayadapter 1024, Soundkarte 1026, Lautsprecher 1028 und Netzwerkschnittstelle 1030. Andere für die Verwendung mit dieser Erfindung verfügbare Computersysteme können weniger bzw. zusätzliche Subsysteme umfassen. Zum Beispiel umfasst ein anderes Computersystem gegebenenfalls mehr als einen Prozessor 1014.
Die Systembus-Architektur des Computersystems 1000 wird durch Pfeile 1032 veranschaulicht. Jedoch veranschaulichen diese Pfeile jegliches Verbindungsmodell, das zur Verbindung der Subsysteme dient. Zum Beispiel könnte ein lokaler Bus zur Verbindung des zentralen Prozessors mit dem Systemspeicher und dem Displayadapter verwendet werden. Das in 10A dargestellte Computersystem 1000 ist ein Beispiel für ein Computersystem, das für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Es können auch weitere Computerstrukturen mit anderen Subsystem-Konfigurationen verwendet werden, einschließlich eingebettete Systeme wie On-Board-Prozessoren auf der Controller-Detektor-Instrumentierung und Strukturen für Internetanwendungen, wenn das System über einen Internetanschluss mit dem Hauptprozessor verbunden ist.
Das Computersystem umfasst typischerweise die geeignete Software für den Empfang von Benutzerbefehlen, entweder in Form von Eingaben der Benutzer in festgelegte Parameterfelder, z.B. in eine GUI, oder in Form von vorprogrammierten Befehlen, z.B. vorprogrammiert für eine Reihe verschiedener spezieller Operationen. Die Software konvertiert dann diese Befehle in die Sprache, die geeignet ist, um den Befehl zur Inbetriebnahme des optionalen Materialtransportsystems und/oder zur Kontrolle, Manipulation, Speicherung etc. der vom Detektionssystem empfangenen Daten zu geben. Speziell erhält der Computer typischerweise Daten vom Detektor, interpretiert sie und stellt sie entweder in einem oder mehreren für den Benutzer verständlichen oder benutzerfreundlichen Formate, z.B. Diagrammen von Rohdaten, berechneten Dosis-Response-Kurven, Enzymkinetikkonstanten und dergleichen bereit, oder er verwendet die Daten, um weitere Controllerbefehle gemäß der Programmierung, z.B. zur Kontrolle von Fließgeschwindigkeiten, angewendeten Temperaturen, Reagenskonzentrationen etc., zu initiieren.
Wie oben beschrieben kann die vorliegende Erfindung in einer Mikrofluidikvorrichtung oder einem Mikrofluidiksystem ausgeführt werden. Es ist dabei allgemein erwünscht, ein Mittel oder System zur Bewegung des Materials durch, zwischen und in den verschiedenen Kanälen, Kammern und Zonen dieser Vorrichtungen bereitzustellen. Gegebenenfalls wird eine Reihe von Materialtransportverfahren gemeinsam mit diesen Mikrofluidikvorrichtungen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird etwa die Materialbewegung durch die Kanäle einer Vorrichtung durch Anlegung von Druckunterschieden in jenen Kanälen, durch die Materialfluss gewünscht ist, verursacht. Dies wird gegebenenfalls durch die Ausübung von positivem Druck auf ein Ende eines Kanals oder die Ausübung von negativem Druck auf das andere Ende erreicht. In komplexen Kanalnetzwerken können kontrollierte Fließgeschwindigkeiten in jedem der verschiedenen, miteinander verbundenen Kanäle durch den Einbau von Ventilen und dergleichen innerhalb der Struktur der Vorrichtung kontrolliert werden, z.B. um den Fluss durch einen bestimmten Kanal zu stoppen oder zu starten. Alternativ dazu können die Kanalwiderstände angepasst werden, um die Geschwindigkeit, das Timing und/oder das Volumen der Materialbewegung durch verschiedene Kanäle vorzugeben, sogar unter dem Einfluss eines einzigen angelegten Druckunterschieds, z.B. eines Vakuums, das auf einen einzigen Kanalanschluss angelegt wird. Beispiele für solche Kanalnetzwerke werden z.B. in den US-Patentanmeldungen 09/238467, US2002-0019059, eingereicht am 28. Jänner 1999, und 09/233.700 (US-A-6.150.119), eingereicht am 19. Jänner 1999 und 09/277367 (US-A-6.500.323), eingereicht am 26. März 1999, gegeben.
Alternativ dazu können für Mikrofluidikanwendungen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, Systeme für den kontrollierten elektrokinetischen Transport verwendet werden. Diese Form elektrokinetischen Transports wird in US-A-5.858.195 (Ramsey) detaillierter beschrieben. Diese Systeme für elektrokinetischen Materialtransport und Materiallenkung umfassen jene Systeme, die auf der elektrophoretischen Mobilität geladener Spezies innerhalb des an die Struktur angelegten elektrischen Felds basieren. Solche Systeme werden genauer als elektrophoretische Materialtransportsysteme bezeichnet. Andere Systeme für elektrokinetische(n) Materiallenkung und -transport basieren auf dem elektroosmotischen Fluss von Fluids und Materialien innerhalb einer Kanal- oder Kammerstruktur, der aus der Anlegung eines elektrischen Felds auf solche Strukturen resultiert. Kurz gesagt, wenn ein Fluid in einem Kanal angeordnet wird, der eine Oberfläche mit geladenen funktionellen Gruppen, z.B. Hydroxylgruppen in geätzten Glaskanälen oder Glas-Mikrokapillaren aufweist, können diese Gruppen ionisiert werden. Bei funktionellen Hydroxylgruppen führt diese Ionisierung, z.B. bei einem neutralen pH-Wert, zur Freisetzung von Protonen von der Oberfläche in das Fluid zur Schaffung einer Protonenkonzentration nahe der Grenzfläche zwischen Fluid und Oberfläche, oder in einer positiv geladenen Hülle um den im Kanal befindlichen Fluidkörper. Die Anlegung eines Spannungsgradienten über die gesamte Länge des Kanals hat zur Folge, dass die Protonenhülle sich in Richtung des Spannungsabfalls, d.h. in Richtung der negativen Elektrode, bewegt.
"Kontrollierte(r) elektrokinetische(r) Materialtransport und Materiallenkung" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf die oben beschriebenen elektrokinetischen Systeme mit aktiver Kontrolle der an mehreren, d.h. mehr als zwei, Elektroden angelegten Spannungen. Anders gesagt regulieren solche kontrollierten elektrokinetischen Systeme gleichzeitig Spannungsgradienten, die an zumindest zwei einander schneidende Kanäle angelegt werden. Insbesondere die hierin beschriebenen bevorzugten Mikrofluidikvorrichtungen und -systeme umfassen eine Körperstruktur, die zumindest zwei einander schneidende Kanäle oder Fluidleitungen umfassen, z.B. miteinander verbundene eingeschlossene Kammern, deren Kanäle zumindest drei ungeschnittene Enden umfassen. Der Schnittpunkt zweier Kanäle ist ein Punkt, an dem zwei oder mehrere Kanäle in Fluidverbindung miteinander stehen. Dieser umfasst T-Schnittstellen, Kreuzungspunkte, "Wagenrad"-Schnittpunkte mehrerer Kanäle oder jegliche andere Kanalgeometrie, wo zwei oder mehrere Kanäle miteinander in einer solchen Fluidverbindung stehen. Ein ungeschnittenes Ende eines Kanals, ist ein Punkt, an dem ein Kanal nicht infolge eines Schnitts dieses Kanals mit einem anderen Kanal endet, z.B. ein T-Schnittpunkt. In bevorzugten Aspekten umfassen die Vorrichtungen zumindest drei einander schneidende Kanäle, die zumindest vier ungeschnittene Enden umfassen. In einer Grundstruktur mit Kanalkreuzung, bei der ein einziger horizontaler Kanal von einem einzigen vertikalen Kanal geschnitten und gekreuzt wird, bewirkt kontrollierter elektrokinetischer Materialtransport die kontrollierte Lenkung des Materialflusses durch die Schnittstelle, indem eingeschränkte Flüsse aus den anderen Kanälen an der Schnittstelle bereitgestellt werden. Wenn zum Beispiel der Transport eines ersten Materials durch den horizontalen Kanal, z.B. von links nach rechts, über die Schnittstelle mit dem vertikalen Kanal gewünscht wird. Einfacher elektrokinetischer Materialfluss dieses Materials über die Schnittstelle könnte durch die Anlegung eines Spannungsgradienten über die Länge des horizontalen Kanals erzielt werden, d.h. Anlegung einer ersten Spannung an das linke Ende dieses Kanals und einer zweiten, niedrigeren Spannung an das rechte Ende dieses Kanals, oder indem das rechte Ende (ohne Anlegung einer Spannung) ungeerdet gelassen wird. Jedoch führt diese Art von Materialfluss über die Schnittstelle zu einem erheblichen Ausmaß an Diffusion an der Schnittstelle, die sowohl auf natürliche Diffusions eigenschaften des im verwendeten Medium transportierten Materials als auch auf Konvektionseffekte an der Schnittstelle zurückzuführen ist.
Im kontrollierten elektrokinetischen Materialtransport ist das über die Schnittstelle transportierte Material durch schwachen Fluss aus den Seitenkanälen, z.B. den oberen und den unteren Kanal, eingeschränkt. Dies wird erreicht, indem ein schwacher Spannungsgradient den Weg des Materialflusses entlang angelegt wird, z.B. vom oberen oder unteren Ende des vertikalen Kanals zum rechten Ende. Die Folge ist ein "gequetschter" Materialfluss an der Schnittstelle, was die Diffusion des Materials in den vertikalen Kanal verhindert. Das gequetschte Materialvolumen an der Schnittstelle kann anschließend in den vertikalen Kanal injiziert werden, indem ein Spannungsgradient über die Länge des vertikalen Kanals angelegt wird, d.h. vom oberen Ende zum unteren Ende. Um jegliches Ausbluten von Material aus dem horizontalen Kanal während dieser Injektion zu vermeiden, wird ein schwacher Fluss in die Seitenkanäle zurückgeleitet, wodurch es zu einem "Rückzug" des Materials aus der Schnittstelle kommt.
Zusätzlich zu Modellen gequetschter Injektion wird kontrollierter elektrokinetischer Materialtransport verwendet, um virtuelle Ventile ohne mechanische oder bewegliche Teile zu schaffen. Speziell in Bezug auf die oben beschriebene Schnittstelle wird der Materialfluss von einem Kanalsegment zu einem anderen, z.B. vom linken Arm zum rechten Arm des horizontalen Kanals, gegebenenfalls durch einen kontrollierten Fluss aus dem vertikalen Kanal, z.B. vom unteren Arm zum oberen Arm des vertikalen Kanals, effizient reguliert, gestoppt und reinitiiert. Speziell im "Aus"-Modus wird das Material vom linken Arm über die Schnittstelle und in den oberen Arm transportiert, indem auf das linke und das obere Ende ein Spannungsgradient angelegt wird. Ein einschränkender Fluss wird vom unteren Arm zum oberen Arm gelenkt, indem auf diesem Weg (vom unteren Ende zum oberen Ende) ein ähnlicher Spannungsgradient angelegt wird. Gemessene Materialmengen werden dann vom linken Arm in den rechten Arm des horizontalen Kanals gelenkt, indem der angelegte Spannungsgradient von links nach oben, nach links und nach rechts umgeschaltet wird. Der Zeitumfang und der angelegte Spannungsgradient geben die Menge des Materials vor, das auf diese Art und Weise abgegeben wird. Obwohl dies zur Veranschaulichung einer Vierwegkreuzungsstelle dient, können diese Systeme für kontrollierten elektrokinetischen Materialtransport leicht für komplexere miteinander verbundene Kanalnetzwerke, z.B. Anordnungen von miteinander verbundenen parallelen Kanälen, adaptiert werden.
Ein Beispiel für ein System, das diese Art von elektrokinetischem Transportsystem in einer Mikrofluidikvorrichtung verwendet, z.B. wie in 7 dargestellt, ist in 11 zu sehen. Wie dargestellt umfasst das System 1100 eine Mikrofluidikvorrichtung 700, die ein integriertes Pipettierer/Kapillar-Element 708 enthält. Jedes der Reservoirs 706 mit elektrischem Anschluss weist eine separate, darin angeordnete Elektrode 1128–1136 auf, die z.B. mit dem Fluid in den Reservoirs in Kontakt steht. Jede der Elektroden 1128–1136 ist mit einem elektrischen Controller 508 operativ verbunden, der mehrere verschiedene Spannungen und/oder Ströme durch die verschiedenen Elektroden leiten kann. Die zusätzliche Elektrode 1138, die ebenfalls operativ mit dem Regler 1108 verbunden ist, wird so positioniert, dass sie, wenn das Kapillarelement 708 in das Material getaucht wird, in elektrischem Kontakt mit dem zu testenden Material steht, z.B. in der Multiwellplatte 502. Beispielsweise kann Elektrode 1138 eine elektrisch leitende Beschichtung auf Kapillare 708 sein, die mit einer elektrischen Leitung verbunden ist, die mit Controller 508 operativ verbunden ist. Alternativ dazu kann Elektrode 1138 einfach einen Elektrodendraht umfassen, der benachbart zur Kapillare liegt, sodass er zusammen mit dem Ende des Kapillarelements 708 in das Probenmaterial eintaucht bzw. damit in Kontakt kommt. Ersatzweise kann die Elektrode als leitende Beschichtung auf der Materialquellen-Vertiefung oder als leitendes Material, aus dem die Quellenvertiefung hergestellt wurde, mit der Materialquelle verbunden sein. Die Anlegung eines elektrischen Felds erfordert dann einfach das Kontaktieren des elektrischen Leiters mit dem Material der Quellenvertiefung oder der Beschichtung. Aus verschiedenen Vertiefungen der Multiwellplatte 502 werden von weiteren Materialien Proben gezogen, indem eine oder mehrere von Platte 502 und Vorrichtung 700 relativ zueinander bewegt werden, bevor der Pipettierer 1138 in eine Vertiefung eingetaucht wird. Eine solche Bewegung wird für gewöhnlich erreicht, indem eine oder mehrere von Vorrichtung 700 und Multiwellplatte 502 auf eine Translationsebene, z.B. die schematisch veranschaulichte x-y-z-Translationsebene 1142 gebracht wird.
In einer weiteren optionalen Anwendung können Hybrid-Materialtransportverfahren und -systeme angewendet werden. Kurz gesagt basiert eine Ausführungsform solcher Hybridsysteme auf der Verwendung von elektrokinetischen Kräften zur Herstellung von Druckunterschieden in Mikrofluidiksystemen. Solche Hybridsysteme kombinieren die Steuerbarkeit elektrokinetischer Systeme mit den Vorteilen der auf Druck basierenden Systeme, z.B. dem Fehlen von elektrophoretischen Vorspannungseffekten. Solche Hybridsysteme werden z.B. in der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung WO 99/16162 beschrieben. Andere Hybridsysteme setzen gegebenenfalls elektrokinetische Kräfte ein, um Material in einen Abschnitt des Kanalnetzwerks zu bewegen, während in anderen Abschnitten des Kanalnetzwerkes Kräfte eingesetzt werden, die auf Druck basieren.
Eine Reihe anderer Systeme, z.B. Rotor-Systeme, Messstabsysteme, Spotted-Array-Systeme und dergleichen, kann zur Ausführung der vorliegenden Erfindung ebenfalls ohne Einschränkung verwendet werden.
IV. Set und Reagenzien
Die Reagenzien zur Durchführung der Verfahren können gegebenenfalls in Form eines Sets bereitgestellt werden, um die Anwendung dieser Tests für den Benutzer zu erleichtern. Diese Sets umfassen typischerweise Anleitungen zur Durchführung des vorliegenden Tests und umfassen gegebenenfalls den Flüssigkeitsbehälter, z.B. die Küvette, die Multiwellplatte, die Mikrofluidikvorrichtung etc., in dem die Reaktion durchgeführt wird.
Typischerweise umfassen die im Set enthaltenen Reagenzien das erste Reagens, das die Fluoreszenzmarkierung trägt, sowie die Polyion-Verbindung. Diese Reagenzien können in Glasfläschchen zur Umfüllung durch den Benutzer oder in vorabgefüllten Glasfläschchen oder Ampullen bereitgestellt werden, die einfach vereinigt wer den, um das geeignete Reaktionsgemisch zu erhalten. Die Reagenzien können in flüssiger und/oder gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden und können geeignete Pufferlösungen zur Verdünnung und/oder Rehydratisierung der Reagenzien umfassen. Für gewöhnlich werden alle Reagenzien und Anwendungen in einer einzigen Schachtel, Tasche oder dergleichen einsatzbereit verpackt.
V. Beispiele
Beispiel I: Detektion eines phosphorylierten Produkts mithilfe von Fluoreszenzpolarisation
Eine Aliquote eines neutral geladenen phosphorylierten Substrats (Fluorescein-QSPKKG-CONH₂) wurde über Nacht mit ATP und CDK2 (Cyclin-abhängiger Kinase) inkubiert. Das Gemisch wurde dann mittels standardisierter Kapillarelektrophorese-Verfahren analysiert und ergab vollständigen Umsatz von Substrat zu Produkt. Es wurde auch eine negative Kontrolle (kein Enzym) hergestellt. Die beiden Reaktionsgemische wurden in einem 50 mM TAPS-Puffer, pH 9,0, verdünnt (1:40). Die Fluoreszenzpolarisationswerte wurden durch Anregung der Proben bei 490 nm und durch Messung der emittierten Fluoreszenz bei 520 nm in einer Küvette eines zur Messung der Fluoreszenzpolarisation ausgerüsteten Fluorimeters, gemessen. Aliquoten einer Poly-D-lysin-Lösung und Wasser wurden zugesetzt (jede zugesetzte Aliquote erhöhte die Poly-D-lysin-Konzentration um 6 μM). Die Ergebnisse des Tests sind in 12A veranschaulicht, welche die Fluoreszenzpolarisation der Probe über der zugesetzten Menge an Poly-D-lysin darstellt.
Wie gezeigt wird, betrug die Fluoreszenzpolarisation sowohl des Substrats (Quadrat) als auch des Produkts (Raute) bei Fehlen von Polylysin etwa 38 Millipolarisationseinheiten (mP). Nach Zugabe von Polylysin nahm die Fluoreszenzpolarisation des Produkts signifikant zu (auf 72 und dann nach Zugabe eines großen Überschusses an Polylysin auf etwa 100 mP). Die Fluoreszenzpolarisation des Substrats stieg nur auf etwa 42 mP.
Die 12B–12E sind grafische Darstellungen der Fluoreszenzpolarisation verschiedener Proteinkinase-A-(PKA-) und Proteinkinase-C-(PKC-)Substrate in Gegenwart von zunehmenden Polyarginin-Konzentrationen. Speziell wurde eine Reihe von PKC-Substraten und deren phosphorylierte Derivate in Gegenwart von zunehmenden Polyarginin-Konzentrationen auf Fluoreszenzpolarisation getestet. Die folgenden Substrate und ihre phosphorylierten Derivate wurden in Konzentrationen von 125 nM verwendet. Die nichtphosphorylierten Peptide sind in jeder der 12B–E durch Quadrate dargestellt, wohingegen die phosphorylierten Peptide durch Rauten dargestellt sind. In jedem Fall ergibt das phosphorylierte Substrat einen höheren Polarisationswert. Die verwendeten Peptide sind folgende:
Beispiel 2: Differenzierung der Produktkonzentrationen unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisation
Es wurden weitere Experimente unter Einsatz von Polyhistidin anstelle von Polylysin durchgeführt: In diesem Fall war der verwendete Puffer 50 mM BisTris, pH 6,5, das Molekulargewicht des verwendeten Polyhistidins betrug 15800 Da (von Sigma Chemical, St. Louis, Missouri).
Es wurden Gemische, die variierende Verhältnisse von Substraten und Produkten zweier Serin/Threonin-Kinasen, CDK2 und Proteinkinase A (PKA), enthielten, hergestellt. Das CDK-Substrat war: Fluor-LRRASLG, wobei der C-Terminus entweder eine Carboxyl-Gruppe oder eine Carbonsäureamid-Gruppe war. Diese Gemische wurden als Modelle für Kinasereaktionen bei variierenden Substratumsätzen verwendet. Die sen Gemischen aus Substrat und Produkt wurden Aliquoten einer Polyhistidin-Lösung und Wasser hinzugefügt. Die Konzentration dieser wässrigen Stammlösung betrug etwa 1,3 mM, und die Endkonzentration lag zwischen 10 und 25 mM.
Durch Anregung bei 490 nm und Detektion der emittierten Fluoreszenz bei 520 nm (beide Substrate waren mit Fluorescein markiert) wurden wiederum Fluoreszenzpolarisationswerte erhalten. Die 13 und 14 zeigen die Ergebnisse dieser Versuche. Kurz gesagt sind die 13 und 14 grafische Darstellungen der Fluoreszenzpolarisation in relativ zum Substrat zunehmenden Konzentrationen des phosphorylierten Produkts (angegeben als % Umsatz). Im Fall von 13 sind das Substrat und Produkt Modellsubstrate/-produkte einer CDK2, während 14 ähnliche Daten für PKA-Substrat/Produkt-Gemische (z.B. wie oben beschrieben) darstellt. Wie ersichtlich ist, ist eine sehr gute lineare Abhängigkeit zwischen dem Fluoreszenzpolarisationssignal und den % Umsatz von Substrat zu Produkt zu beobachten. Folglich ist das Verfahren sehr gut geeignet, um den Fortschritt von Kinase-Reaktionen zu verfolgen, sowie für das Screening chemischer Bibliotheken auf Kinase-Inhibitoren.
Proteinkinase A (PKA) und weitere Proteinkinasen wurden in ähnlichen Testverfahren getestet, aber unter Verwendung von Substraten, die für jede Kinase maßgeschneidert wurden, sowie unter Einsatz von Polyarginin als Polyion-Komponente. Speziell wurden fünf verschiedene fluoreszenzmarkierte Peptide hergestellt, die Sequenzen für die Substraterkennung für drei verschiedene Serin- oder Tyrosin-Kinaseenzyme enthielten. Die verschiedenen Substrate wiesen in ihrem nicht phosphorylierten Zustand bei einem pH von 7,5 Nettoladungen von +2 bis –1 auf. Diese Ladungen ergeben somit jeweilige phosphorylierte Produkte mit Ladungen von 0 bis –3.
Die verschiedenen Peptide wurden mit den entsprechenden Kinasen in Gegenwart von ATP behandelt und der Umsatz wurde mittels kapillarelektrophoretischer Trennung von Substrat und Produkt sowie unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisation bestimmt. Alle Proben ergaben eine gute Korrelation zwischen dem KE- und dem FP-Detektionsverfahren. 15. zeigt als Beispiel die Korrelation zwischen KE- und FP-Detektion von PKBα.
Beispiel 3: Verfolgung des zeitlichen Verlaufs von Enzymreaktionen unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisation
Es wurde ein weiterer PKA-Test mit variierenden ATP-Konzentrationen (0 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM und 32 μM) in 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 500 nM Polyarginin, 184 nM PKA, und 125 nM Kemptid-Substrat (FI-LRRASLG-COO^–) durchgeführt. Die resultierenden Tests wurden eine Zeit lang überwacht, um die Wirksamkeit des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens der vorliegenden Erfindung auf die Überwachung des Verlaufs der Reaktionszeiten zu bestimmen. 16 ist eine grafische Darstellung der Fluoreszenzpolarisation über der Reaktionszeit für jede der verschiedenen ATP-Konzentrationen im Reaktionsgemisch. Wie ersichtlich ist, ergeben zunehmende ATP-Konzentrationen im Allgemeinen höhere Reaktionsgeschwindigkeiten. In allen Fällen, mit Ausnahme der Kontrolle, nehmen die Fluoreszenzpolarisationswerte im Zeitverlauf zu. Insbesondere je mehr die Reaktionen fortschreiten, desto mehr wird vom Fluoreszenzsubstrat durch die addierten Phosphatgruppen geladen, wodurch stärkere Bindung von Polyarginin ermöglicht wird, sowie die damit verbundenen Änderungen der Fluoreszenzpolarisation (z.B. polarisierter, weniger depolarisiert). 17 ist eine grafische Darstellung der anfänglichen Geschwindigkeit über der ATP-Konzentration, die eine charakteristische kinetische Darstellung für die getestete Reaktion ergibt. Diese kinetischen Daten wurden dann in einem Lineweaver-Burke-Diagramm (18) verwendet, um die Km des jeweiligen Kinase-Enzyms zu bestimmen.
Beispiel 4: Testen der Phosphatase-Aktivität unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisation
Die Verfahren zur Fluoreszenzpolarisationsdetektion der vorliegenden Erfindung wurden auch zur Überwachung des zeitlichen Verlaufs eines Phosphatasetests verwendet. Kurz gesagt wurde ein Fluoreszenzsubstrat für ein bekanntes Phosphataseenzym in einen Testpuffer aus 50 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM DTT, 200 mM NaCl und 300 nM Polyarginin eingebracht. Es wurde eine Zeit lang der relative Fluoreszenz polarisationswert für eine Kontrollreaktion (kein Enzym) und ein Reaktionsgemisch mit verschiedenen Phosphataseenzym-Konzentrationen überwacht. 19 ist eine grafische Darstellung der Kontroll- und Enzymtestgemische. Wie ersichtlich ist, nehmen die relativen Fluoreszenzpolarisationswerte in Gegenwart von Phosphataseenzym mit der Zeit ab. Insbesondere ergibt das Gemisch mit der Zeit weniger polarisierte Fluoreszenz aufgrund der Tatsache, dass aufgrund der Entfernung der geladenen Phosphatgruppe auf dem Substrat, welche die Polyarginin-Bindung erleichtert, weniger Polyarginin mit dem fluoreszierenden Substrat wechselwirkt.
Beispiel 5: Testen auf Proteaseaktivität unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisation
Die Fluoreszenzpolarisationsdetektionsverfahren der vorliegenden Erfindung wurden auch für Proteasetests demonstriert. Insbesondere wurde mit diesen Verfahren ein Chymotrypsintest zwar unter Einsatz eines fluoreszierenden, neutral geladenen Chymotrypsin-spezifischen Substrats (FI-EGIYGVLFKKK-CONH₂) durchgeführt, das an einem Ende eine fluoreszierende Gruppe und am anderen Ende einen Polylysin-Schwanz trägt. Die Spaltung des oben genannten Substrats durch Chymotrypsin ergibt speziell FI-EGIY mit einer Nettoladung von –4 und GVLFKKK mit einer Nettoladung von +4. Wie hierin beschrieben assoziiert ein Polykation bevorzugt mit dem am stark negativ geladenen fluoreszierenden Teil der Reaktionsprodukte, was eine Verschiebung der Fluoreszenzpolarisation dieses markierten Teils ergibt. Kurz gesagt wurde der Test in 50 mM HEPES-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, 5 mM CaCl₂, 500 nM Chymotrypsin-Substrat, 1 μM Polyarginin durchgeführt. Es wurden drei getrennte Tests durchgeführt, ein Kontrolldurchlauf ohne Enzyme und zwei Testdurchläufe mit unterschiedlichen Enzymkonzentrationen (0,125 μg/ml und 1,25 μg/ml Chymotrypsin). 20 ist eine grafische Darstellung der Fluoreszenzpolarisation über der Zeit für jeden der verschiedenen Testdurchläufe. Wie gezeigt wird, ergab der Kontrolldurchlauf (Rauten) im Zeitverlauf keine Zunahme des Werts polarisierter Fluoreszenz, während die niedrige Chymotrypsin-Konzentration (0,125 μm/ml, große Quadrate, mittlere Linie) und die höhere Chymotrypsin-Konzentration (1,25 μg/ml, kleine Quadrate, obere Linie) im Zeitverlauf zunehmende Polarisationswerte erga ben, wobei die höhere Enzymkonzentration einen schnelleren anfänglichen Anstieg ergab. Zunehmende Werte polarisierter Fluoreszenz zeigen stärkere Wechselwirkung von Polyarginin mit dem negativ geladenen fluoreszierenden Teil des Substrats an, sobald der positiv geladene Terminus durch Spaltung mit Chymotrypsin entfernt wurde.
Alternativbeispiel 6: Nucleinsäurehybridisierungstest unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisationsdetektion
Die Testverfahren wurden auch zur Detektion einer Nucleinsäurehybridisierungsreaktion verwendet. Dieser Test ist aufgrund des Fehlens einer abzufragenden immobilisierten Target-Sequenz besonders interessant. Insbesondere wurde der gesamte Test in Lösung durchgeführt.
In Hybridisierungsversuchen mit den DNA-Targets 192 und 182 wurde ein Fluorescein-markiertes Peptid-Nucleinsäuremolekül 202 verwendet. PNAs sind im Handel im Allgemeinen von der Applied Biosystems Division der Perkin-Elmer Corporation (Poster City, Kalifornien) erhältlich. Die Sequenz dieser Moleküle ist untenstehend angeführt. Im Fall des PNA-Moleküls zeigt die angegebene Sequenz die analoge Sequenz eines DNA-Moleküls. Die Sequenzen der drei Moleküle sind die folgenden:
Die DNA-Sequenz 192 enthält 13 Basen (fett gedruckt), die vollständig komplementär zur PNA-Sonde 202 sind, während 182 ein nichtkomplementäres Oligonucleotid ist.
Eine Lösung, die 1 μM PNA 202 in 50 mM HEPES pH 7,5 enthielt, wurde entweder mit 5 μM von 192 oder 5 μM von 182 vermischt. Die Gemische wurden etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann in die Küvette eines zur Fluoreszenzmessung ausgestatteten Fluorimeters gefüllt. Die Messungen wurden unter Einsatz von 490 nm zur Anregung und 520 nm zur Detektion der Fluoreszenzemission durchgeführt. Die Fluoreszenzpolarisationswerte wurden erst ohne und dann in Gegenwart von Poly-L-lysin-hydrobromid mit einem Molekulargewicht von etwa 70–100 kD (Sigma Chemicals) aufgezeichnet. Das Poly-L-lysin wurde aus einer Stammlösung in Wasser (etwa 440 μM) zugesetzt. Die Endkonzentrationen des Poly-L-lysins betrugen 4,4 und 8,8 μM. Die resultierenden Fluoreszenzpolarisationswerte sind in 21 dargestellt.
Es ist ersichtlich, dass für das Gemisch, das 202 und nichtkomplementäres 182 enthielt, ein Polarisationswert von 86 mP erzielt wurde. Dieser Wert stieg in Gegenwart von Poly-L-lysin auf 140 mP an. Hingegen zeigte das 202-Hybrid mit der komplementären 192-Sequenz einen Polarisationswert von etwa 100 mP ohne (in 21 nicht dargestellt) und von 229 mP in Gegenwart von Poly-L-lysin. Diese Ergebnisse zeigen, dass Fluoreszenzpolarisation in Gegenwart von Poly-L-lysin dazu verwendet werden kann, die Bildung spezieller PNA/DNA-Hybride in Lösung zu detektieren. Solche Tests werden einfach zum Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens einer speziellen Sequenz in einer Probe eingesetzt, z.B. beim Sequenzieren mittels Hybridisierung, Sequenzüberprüfung, Screening auf Sequenzvarianten, z.B. Polymorphie, d.h. SNPs, STRs und dergleichen.
Alternativbeispiel 7: Detektion einzelner Nucleotidsubstitutionen
Die Testverfahren wurden dazu eingesetzt, unterschiedliche Hybridisierung einer Nucleinsäuresonde an eine perfekt komplementäre Target-Sequenz sowie an eine Target-Sequenz, die eine Einzelbasenvariation enthält, z.B. einen Einzelnucleotidpolymorphismus ("single nucleotid polymorphism", SNP), zu detektieren. Speziell wurde eine fluoresceinierte PNA-Sonde mit einer zu einer Untersequenz einer Targetsequenz komplementären Sequenz dazu eingesetzt, auf das Target, das die Unterse quenz enthielt, sowie auf ein Target, in dem eine innere Base der Untersequenz durch eine andere Base ersetzt war, zu sondieren.
Die 5'→3'-Sequenzen der PNA-Sonde (PNA 7637), die Target-DNA-Sequenz (DNA 244) und die in einer Base fehlgepaarte Target-DNA-Sequenz (DNA 245) waren die folgenden:
Die zur PNA-Sonde komplementären Untersequenzen der DNA-Targets sind fett gedruckt. Die Position des SNP ist unterstrichen dargestellt.
Die PNA-Sonde 7637 wurde in einer Endkonzentration von 250 nM in einem Reaktionsvolumen von 400 μl eingesetzt. Der verwendete Puffer war 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl. Die Lösung enthielt auch Poly-L-lysin in einer Konzentration von etwa 3 μM. 1-μl-Aliquoten der DNA-Targets 244 und 245 wurden der PNA-Lösung schrittweise zugesetzt, und die Fluoreszenzpolarisation (Anregung 490 nm, Emission 520 nm) wurde nach Zusatz jeder einzelnen Aliquote aufgezeichnet. Die Daten dieses Versuchs sind in 22 dargestellt. Das perfekt komplementäre Target/Sonden-Gemisch (Rauten) zeigte deutlich höhere Fluoreszenzpolarisationswerte als das Einzelbasenfehlpaarungsgemisch (Quadrate), was darauf schließen lässt, dass ein höheres Maß an Hybridisierung erfolgt war. Wie ebenfalls ersichtlich ist, erreichte die Hybridisierung im perfekt komplementären Beispiel einen konstanten Wert bei etwa 1 M Überschuss der Targetsequenz. Thermische Denaturierungsversuche wurden auch in Gegenwart von Polylysin durchgeführt, während in den Reaktionsgemischen Änderungen der Fluoreszenzpolarisation überwacht wurden. Insbesondere wurden drei verschiedene Target-DNA-Moleküle mit den folgenden Sequenzen verwendet:
Jedes Target wurde mit jeder von drei verschiedenen fluoresceinierten PNA-Sonden mit den folgenden Sequenzen (9-mer, 11-mer, 13-mer) abgefragt und zunehmenden Temperaturen ausgesetzt, während die Fluoreszenzpolarisationswerte der Gemische überwacht wurden:
Jedes Reaktionsgemisch wurde dann zunehmenden Temperaturen ausgesetzt, während der Fluoreszenzpolarisationswert überwacht wurde. Die 23A, B und C zeigen das jeweilige Target, das mit jeder der drei verschiedenen Sonden abgefragt wurde. Die Datenpunkte stellen Durchschnittsdaten aus drei verschiedenen Versuchen dar. Alle Schmelzkurven werden normalisiert, wobei die Schmelzkurven der PNA-Sonden alleine von jenen Schmelzkurven subtrahiert wurden, die in Gegenwart der DNA-Target-Sequenzen erzeugt wurden.
Wie zu erwarten ist, wird die Schmelzkurve umso weiter herausgedrängt, je länger die PNA-Sonde verwendet wird. Speziell zeigt 23A einen niedrigeren Schmelzpunkt für das Target und die Sonde (9-mer) als 23B (11-mer) und 23C (13-mer). Außerdem ist für jede Target-Sequenz eine klare Unterscheidung zwischen den perfekt gepaarten Hybriden (Rauten) und den Einzelbasenfehlpaarungshybriden (Quadrate und Dreiecke) festzustellen, wobei die C/T-Fehlpaarung von den beiden dargestellten am stärksten destabilisiert, d.h. die stärkste Verschiebung der Schmelzkurve verursacht. Dieses Beispiel zeigt ganz klar die Empfindlichkeit, mit der die derzeit beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um zwischen Einzelnucleotiddifferenzen zwischen Target-Sequenzen, z.B. SNPs etc., unterscheiden zu können.
Obwohl die oben beschriebenen Tests Fluoreszenzpolarisationsdetektion verwendeten, wurde auch festgestellt, dass diese Testverfahren bei Hybridisierung Änderungen der Fluoreszenzintensität verursachen. Insbesondere Einzelnucleotidsubstitutionstests wie die oben beschriebenen wurden an zwei verschiedenen Nucleinsäuresequenzen durchgeführt. Es wurde jeweils eine zum Wildtyp komplementäre PNA-Sonde (250 nM) sowie eine, die über eine Einzelbasensubstitution verfügte, verwendet, um die Target-Sequenz zu sondieren (in 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl), gefolgt von einer Behandlung mit Poly-L-lysin (3,3 μM). Die Gemische wurden zunehmenden Konzentrationen der Target-Sequenz ausgesetzt, und die Fluoreszenzpolarisation und Gesamtfluoreszenzintensität wurden gemessen. 24 ist eine grafische Darstellung der Fluoreszenzintensität sowie der Fluoreszenzpolarisation für jedes der getesteten perfekten Hybride und jede der getesteten Einzelbasenfehlpaarungen. Wie zu sehen ist, stellen sowohl Fluoreszenzintensität als auch Fluoreszenzpolarisation eine Grundlage für die Unterscheidung zwischen der perfekten Paarungsreaktion und der Einzelbasenfehlpaarungsreaktion bereit.
Sofern nicht speziell anders angegeben, beziehen sich die hierin angegebenen Konzentrationswerte auf die Konzentration einer bestimmten Komponente, wenn diese Komponente einem Gemisch oder einer Lösung zugesetzt wurde – unabhängig von jeglicher Umsetzung, Dissoziation, Reaktion dieser Komponente, um diese Komponente zu verändern oder in eine oder mehrere verschiedene Spezies überzuführen, sobald sie dem Gemisch oder der Lösung zugesetzt wurde. Die hierin beschriebenen Verfahrensschritte sind im Allgemeinen in beliebiger Reihenfolge durchführbar, sollte keine spezielle Reihenfolge angegeben werden oder keine Reihenfolge von Interesse aus dem Kontext der angeführten Schritte hervorgehen. Typischerweise ist die angeführte Reihenfolge der Verfahrensschritte eine bevorzugte Reihenfolge.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch Abbildungen und Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses detailliert beschrieben wurde, ist offensichtlich, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Messung der Aktivität eines Enzyms, umfassend: das Kontaktieren eines fluoreszenzmarkierten Substrats mit einem Enzym, um ein Gemisch herzustellen, das ein fluoreszenzmarkiertes Produkt umfasst, worin das Produkt und das Substrat unterschiedliche Bindungsaffinitäten für ein Polyion aufweisen, das mehrwertige Metallkationen aufweist, die basierend auf einem Ladungsunterschied zwischen dem Produkt und dem Substrat damit assoziiert sind; das Kontaktieren des Gemisches mit dem Polyion, worin sich das Polyion vorzugsweise mit einem von Produkt und Substrat bindet; und das Bestimmen einer Konzentration des Produkts, das durch die Aktivität des Enzyms produziert wird, durch Messen von Bindung des Polyions an das Produkt unter Verwendung von Fluoreszenzintensitätsdetektion und/oder Fluoreszenzpolarisationsdetektion.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym in der Lage ist, die chemische Struktur des Substrats durch Zusatz dazu, Subtraktion davon oder Änderung seiner chemischen Struktur zu modifizieren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Substrat ein phosphoryliertes Substrat umfasst und das Enzym ein Phosphataseenzym umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Substrat ein Amino- oder Keto-hältiges Substrat umfasst und das Enzym eine Aminotransferase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Substrat ein Substrat, ausgewählt aus einer Sulfatase, einer Phosphorylase, einer Esterase, einer Hydrolase, einer Oxidase oder einem Analog davon, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Ladungsunterschied zwischen dem Produkt und dem Substrat das Resultat eines Unterschieds der Menge an O-, N- oder S-Gruppen, die im Produkt und im Substrat vorhanden sind, ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Bestimmungsschritt unter Verwendung von Fluoreszenzpolarisationsdetektion durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Bestimmungsschritt unter Verwendung von Fluoreszenzintensitätsdetektion durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren zur Messung der Aktivität eines Kinaseenzyms bestimmt ist und Folgendes umfasst: das Bereitstellen eines Reaktionsgemisches, das eine fluoreszenzmarkierte phosphorylierbare Verbindung, ein Kinaseenzym und eine Phosphatdonorgruppe umfasst, worin das Kinaseenzym in der Lage ist, ein Phosphat aus der Phosphatdonorgruppe zur phosphorzlierbaren Verbindung zu transferieren, um ein phosphoryliertes Produkt zu bilden; das Kontaktieren des phosphorylierten Produkts mit einem Molekül, das mehrwertige Metallkationen aufweist, die damit assoziiert sind; und das Bestimmen einer Konzentration an phosphoryliertem Produkt durch Nachweisen der Menge an Fluoreszenzintensität, die vom Reaktionsgemisch emittiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren zur Messung der Aktivität eines Phosphataseenzyms bestimmt ist und Folgendes umfasst: das Bereitstellen eines Reaktionsgemisches, das eine fluoreszenzmarkierte phosphorylierte Verbindung, ein Phosphataseenzym und ein Molekül mit mehrwertigen Metallkationen, die damit assoziiert sind, umfasst; und das Bestimmen einer Konzentration an dephosphoryliertem Produkt, das durch die Aktivität des Phosphataseenzyms gebildet wird, durch Nachweisen der Menge an Fluoreszenzintensität, die vom Reaktionsgemisch emittiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Fluoreszenzintensität proportional zur Menge an dephosphoryliertem Produkt im Reaktionsgemisch steigt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 9, worin die mehrwertigen Metallkationen das Molekül, zumindest teilweise auf einem Ladungsunterschied zwischen dem Produkt und den mehrwertigen Metallkationen basierend, an das Produkt binden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 9, worin die mehrwertigen Metallkationen das Molekül, zumindest teilweise auf einer Affinität zwischen den mehrwertigen Metallkationen und einer mit dem Produkt assoziierten Phosphatgruppe basierend, an das Produkt binden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 9, worin die Verbindung ein Serin-, Tyrosin- oder Threoninsubstrat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, ferner umfassend das Einführen von zumindest einer ersten Testverbindung in das Reaktionsgemisch und das Vergleichen der Menge an Fluoreszenzintensität, die vom Reaktionsgemisch in Gegenwart der Testverbindung emittiert wird, mit der Menge an Fluoreszenzintensität, die vom Reaktionsgemisch in Abwesenheit der Testverbindung emittiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, ferner umfassend das Wiederholen der Schritte des Bereitstellens, Einführens und Vergleichens mit einer Vielzahl an verschiedenen Testverbindungen.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das Molekül ein Polymer umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die mehrwertigen Metallkationen dreiwertige Metallkationen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die dreiwertigen Metallkationen Fe³⁺ umfassen.