DE60027542T2

DE60027542T2 - Methoden zur herstellung immunologischer reagentien positionsspezifisch für phosphorylierungen

Info

Publication number: DE60027542T2
Application number: DE60027542T
Authority: DE
Inventors: W. Carl Stony Brook ANDERSON; Ettore Montgomery APPELLA; Kazuyasu Munakata-gun SAKAGUCHI
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Brookhaven Science Associates LLC
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Brookhaven Science Associates LLC
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: BR0008977A; HUP0105309A3; NZ512868A; IL144471A; HUP0105309A2; US6309863B1; CA2360511C; EP1147137B9; JP2003517451A; AU767969B2; NO20013636L; WO2000043422A1; EP1147137A4; AU3582800A; UA73109C2; ATE324382T1; ZA200105520B; NO20013636D0; EP1147137B1; JP3891542B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Proteinphosphorylierung ist wichtig bei der Regulierung einer großen Vielzahl von zellulären Prozessen. Regulierung von Proteinaktivität durch Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten wird stark verwendet. Histidin-, Arginin- und Lysinreste von Proteinen werden ebenfalls durch zelluläre Prozesse phosphoryliert, jedoch ist die Signifikanz aufgrund der Schwierigkeit der Untersuchung dieser hoch instabilen Modifikationen unbekannt. Die Bestimmung und Quantifizierung von Veränderungen im Phosphorylierungszustand eines Proteins sind von großer Nutzbarkeit bei Studien seiner funktionellen Signifikanz.
Standardverfahren zur Messung des Zustands der Proteinphosphorylierung beinhalten typischerweise das vorhergehende Markieren der zugegebenen Phosphateinheit durch Einbringen eines radioaktiven Isotops von Phosphor (als Phosphat). Solche Phosphorylierungsproben leiden unter verschiedenen methodischen Fallstricken, einschließlich Gesundheitsrisiken und Abfallproblemen, im Zusammenhang mit den hohen Mengen an [³²P] Pi, die für die Vormarkierungsexperimente erforderlich sind, der Mühe, mit regulierten Substanzen zu arbeiten und dem Mangel an Stellenspezifität, wenn verschiedene Stellen in einem Protein oder einer Peptineinheit phosphoryliert werden. Als ein Ergebnis für diese Rückschläge steigen immunochemisch-basierte Verfahren zur Bestimmung des Proteinphosphorylierungszustands in der Popularität. Der Grad an Empfindlichkeit und Selektivität, der mit immunochemischer Methodologie erreichbar ist, macht sie zu einer attraktiven Alternative (Matsui et al., J. Cell. Bio. 140: 647–657 (1998), Conrad et al., Hybridoma 16: 167–173 (1997)).
Phosphorylierungszustandsabhängige monoklonale Antikörper, die für eine Vielzahl von Zytoskelettalproteinen spezifisch sind, wurden hergestellt und charakterisiert. Diese Antikörper wurden durch Immunisierungsprotokolle isoliert, in welchen das spezifische Ziel von phosphorylierten Epitopen nicht der vornehmliche Gegenstand war. Jüngst wurden kleine synthetische Phosphopolypeptide verwendet, um die Chance zur Planung von Antikörperproduktion zu Epitopen an den Phosphorylierungsstellen zu verbessern (Sakaguchi et al., Genes and Dev. 12: 2831–2841 (1998), Matsu et al., J. Cell. Bio. 140: 647–657 (1998), Chen et al., FASEB J. 2: A550 (1988), Czernik et al., Methods in Enzymology 201: 264–283 (1991)). Obwohl direkter, leidet dieses Verfahren nach wie vor unter der Einschränkung von schneller Dephosphorylierung des Polypeptidantigens aufgrund von Immunisierung, welche den Titer der phosphorspezifischen Antikörper reduziert. Dies ist insbesondere ein Problem, wenn ein Antigen verwendet wird, das Phosphoserin und Phosphothreonin enthält, von denen beide gewöhnlich beträchtlich weniger stabil sind als Phosphotyrosin
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern zur Verfügung, welche spezifisch mit einem Polypeptid reagieren, das an einer bestimmten Aminosäure phosphoryliert ist. Verfahren zur Erzeugung von sowohl monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern werden zur Verfügung gestellt. Das Verfahren beinhaltet das Zur-Verfügung-Stellen eines Polypeptids, das ein Mimetikum des phosphorylierten Aminosäurerestes enthält. Das Mimetikum hat Antigendeterminanten, die auch in der natürlichen phosphorylierten Aminosäure vorhanden sind. Das Polypeptidantigen wird durch Standardverfahren verwendet, um sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper zu erzeugen, die mit dem natürlichen phosphorylierten Polypeptid kreuzreagieren und einen spezifischen phosphorylierten Zustand des Polypeptids spezifisch erkennen.
Das Mimetikum enthält eine nicht hydrolysierbare Bindung zwischen dem Kohlenstoffatom und dem Phosphoratom (der Phosphatgruppe). In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Bindung eine CF₂-Gruppe. Einbringen dieser Bindungsgruppe in Phosphoserin erzeugt das mimetische F₂Pab. F₂Pab wird anstelle von Phosphoserin in einer Polypeptidsequenz verwendet, die aus p53 erhalten wird, um Antikörper herzustellen, die eine spezifische Phosphorylierungsstelle von p53 erkennen. In einer anderen Ausführungsform wird die CF₂-Bindungsgruppe in Phosphothreonin eingebracht, um das mimetische F₂Pmb herzustellen. In einer anderen Ausführungsform wird die CF₂-Bindung in Phosphotyrosin eingebracht, um das mimetische F₂Pmp herzustellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 repräsentiert Analoga von Phosphoserin und Phosphothreonin.
2 repräsentiert Analoga von Phosphotyrosin.
3 ist eine Diagrammdarstellung von Daten, die aus ELISA erhalten werden, unter Verwendung von affinitätsgereinigtem pAbF15-Antikörper nach Durchgang durch eine (p53(Ac-11–22)Cys)-Säule, um Antikörper zu verringern, die mit dem nicht phosphorylierten Peptid kreuzreagieren.
4 ist eine Diagrammdarstellung von Daten, die aus ELISA erhalten werden, unter Verwendung von affinitätsgereinigtem pAbF15-Antikörper nach Durchgang durch eine (p53(Ac-32–43)(37P)Cys)-Säule, um Antikörper zu verringern, die mit p53 kreuzreagieren, das an Serin 37 phosphoryliert ist.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass Phosphopeptidmimetika, die zuvor als Phosphataseinhibitoren verwendet wurden, antigen sind (Burke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 129–134 (1994), Chen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 216: 976–984)). Spezieller entlockt ein Mimetika, das in ein Polypeptid eingebracht ist, welches dann dazu verwendet wird, ein Tier zu impfen, um eine Immunantwort zu erzeugen, Antikörper zu antigenen Determinanten hervor, die zumindest zum Teil auf dem Mimetika lokalisiert sind. Die vorliegende Erfindung basiert auch auf der Entdeckung, dass die Antikörper, die gegen das Mimetikum erzeugt werden, mit dem natürlichen Phosphopeptid kreuzreagieren. Diese Kreuzreaktivität zeigt, dass Mimetika antigene Determinanten besitzen, die sehr stark jenen aus den natürlichen Phosphopeptiden ähneln, wenn sie im Kontext der gleichen begleitenden Aminosäuren präsentiert werden. Die auf die Mimetikumpeptide hin erzeugten Antikörper haben ausreichende Bindungsaktivität und -spezifität für die natürlichen phosphorylierten Polypeptide, um als Werkzeuge bei immundiagnostischer Identifikation des Phosphoproteins zu dienen, aus dem die antigene Aminosäuresequenz erhalten wurde. Diese Entdeckungen haben zur vorliegenden Erfindung geführt, die Verfahren zur Herstellung und Isolation von immunologischen Reagenzien zur Verfügung stellt, welche einen bestimmten phosphorylierten Zustand eines vorher bestimmten Proteins identifizieren.
Die chemische Struktur eines Phosphopeptid-Mimetikums, das für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet ist, muss dem natürlichen phosphorylierten Rest nahe angenähert sein, der nachgeahmt werden soll und muss auch chemisch stabil sein (d.h. Beständigkeit gegen Dephosphorylierung durch Phosphatasen). Dies wird erreicht durch ein synthetisches Molekül, das die Aminosäurenatomstruktur enthält, mit einer nicht hydrolysierbaren Bindung an eine Phosphateinheit anstelle der natürlich auftretenden Sauerstoffbrücke. In einer bevorzugten Ausführungsform verbindet eine CF₂-Gruppe die Aminosäure mit dem Phosphat. Mimetika von verschiedenen Aminosäuren, die in der Natur phosphoryliert werden, können durch diese Annäherung erzeugt werden. Mimetika von Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin werden durch Einsetzen der CF₂-Bindung am passenden Kohlenstoff in die Phosphateinheit erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform ersetzt das mimetische Molekül L-2-Amino-4-diethylphosphono-4,4-difluorbutansäure (F₂Pab) Phosphoserin (Otaka et al., Tetrahedron Letters 36: 927–930 (1995)), L-2-Amino-4-phosphono-4,4-difluor-3-methylbutansäure (F₂Pmb) ersetzt Phosphothreonin und L-2-Amino-4-phosphono-difluormethyl-phenylalanin (F₂Pmp) ersetzt Phosphotyrosin (Akamatsu et al., Bioorg. & Med. Chem. 5: 157–163 (1997)) in einem antigenen Polypeptid (1 und 2). In einer alternativen Ausführungsform wird die Sauerstoffbrücke der natürlichen Aminosäure durch eine Methylengruppe ersetzt (1 und 2).
Die Synthese von F₂Pab wird beschrieben von Otaka et al., Tetrahedron Lett. 36: 927–930 (1995). Die Synthese von F₂Pmp wird beschrieben von Smyth et al., Tetrahedron Lett. 35: 551 (1994) und Akamatsu et al., Bioorg. & Med. Chem. 5: 157–163 (1997). Synthese von F₂Pmb wird erreicht durch Verfahren analog zur F₂Pab-Synthese unter Verwendung eines Rückgrat-Precursors, der eine zusätzliche Methylgruppe hat.
Um immunologische Reagenzien zu erzeugen, die für ein vorher bestimmtes Phosphoprotein spezifisch sind, wird das (die) geeignete(n) Mimetikum (Mimetika) in ein synthetisches Peptid eingebracht, das zu der Sequenz korrespondiert, welche den (die) phosphorylierten Rückstand (Rückstände) umgibt. Verfahren für dieses Einbringen sind bekannt oder für den Fachmann anderweitig erhältlich. Die Länge der Sequenz, die für die Erzeugung von phosphospezifischen Antikörpern erforderlich ist, kann von dem speziellen Phosphoprotein, das untersucht wird, abhängen. Allgemein ist die Gegenwart einer Sequenz korrespondierend zu 3 oder 4 Resten, die den Phosphorest flankieren, ausreichend, um die erforderliche Spezifität zu erzeugen. In einer Ausführungsform beinhaltet das Polypeptidantigen eine Tandemwiederholungseinheit dieser Sequenz, in welcher das geeignete Mimetikum eingebracht ist. Spaceraminosäuren können zwischen die wiederholte Sequenz eingebracht werden, um die Antigenverarbeitung und -präsentation zu erleichtern. Das Polypeptid kann durch chemische Synthese von jedem Fachmann durch Anwendung von Routineexperimenten hergestellt werden. Wie im Beispiel-Abschnitt Bereich, der folgt, detailliert angegeben, kann ein Polypeptidantigen mit der durch Sequenz-ID NR: 1 spezifizierten Aminosäuresequenz, die unten aufgeführt ist, verwendet werden, um polyklonale Antikörper zu erzeugen, die p53 erkennen, das an Serin 15 phosphoryliert ist. Verschiedene Phosphopeptide, die zu anderen natürlichen Serinphosphorylierungsstellen von p53 korrespondieren, wurden erfolgreich verwendet, um phosphospezifische Antikörper zu erzeugen (Sakaguchi et al., Genes and Dev. 12: 2831–2841 (1998)). Experimente, die im Beispiel-Abschnitt präsentiert werden, zeigen, dass Polypeptidantigene, die F₂Pab anstelle von natürlichem Phosphoserin enthalten, ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, um phosphospezifische Antikörper zu erzeugen. Diese Polypeptidantigene, die unten aufgeführt sind, werden durch die Sequenz-ID NRN: 2–10 beschrieben.
SEQ-ID NR: 1

Pro-Leu-F₂Pab-Gln-Glu-Thr-Ala-Pro-Leu-F₂Pab-Gln-Glu-Thr-Ala-Cys

SEQ-ID NR: 2

Met-Gly-Glu-Pro-Gln-F₂Pab-Asp-Pro-Ser-Val-Glu-Pro-Cys

SEQ-ID NR: 3

Pro-Gln-Ser-Asp-Pro-F₂Pab-Val-Glu-Pro-Pro-Leu-Ser-Cys

SEQ-ID NR: 4

Glu-Pro-Pro-Leu-F₂Pab-Gln-Glu-Thr-Phe-Ser-Asp-Leu-Cys

SEQ-ID NR: 5

Ser-Gln-Glu-Thr-Phe-F₂Pab-Asp-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Cys

SEQ-ID NR: 6

Pro-Glu-Asn-Asn-Val-Leu-F₂Pab-Pro-Leu-Pro-Ser-Gln-Ala-Cys

SEQ-ID NR: 7

Leu-Ser-Pro-Leu-Pro-F₂Pab-Gln-Ala-Met-Asp-Asp-Leu-Cys

SEQ-ID NR: 8

Asn-Asn-Thr-Ser-Ser-F₂Pab-Pro-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Cys

SEQ-ID NR: 9

Cys-Lys-Lys-Gly-Gln-Ser-Thr-F₂Pab-Arg-His-Lys-Lys-Leu-Met-Phe

SEQ-ID NR: 10

Cys-Phe-Lys-The-Glu-Gly-Pro-Asp-F₂Pab-Asp

Das Mimetikum enthaltende Polypeptid kann weiterhin modifiziert werden durch noch stärkeres Angleichen an das natürliche Produkt oder alternativ, um die Antigenität voranzutreiben. Solche Modifikationen beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt darauf, enzymatische Modifikationen, chemisches Schützen oder Entschützen, Denaturierung und chemische Kopplung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid an das Trägerprotein gekuppelt, das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämacyanin (keyhole limpet hemocyanin). Andere Trägerproteine können substituiert werden, einschließlich zum Beispiel Rinderserumalbumin, Ovalbumin und gereinigtes Proteinderivat von Tuberkulin. Chemisches Kuppeln kann zum Beispiel unter Verwendung irgendeines bifunktionellen Reagenzes erreicht werden.
Einmal hergestellt und geeignet modifiziert wird das Polypeptidantigen dazu verwendet, um ein Tier unter Bedingungen zu impfen, die eine Immunantwort entlocken. Produkte der Immunantwort werden isoliert und auf Komponenten gescreent, die mit antigenen Determinanten kreuzreaktiv sind und anderenfalls allein gegenüber dem Phosphoprotein. Diese Bestandteile werden isoliert und als Reagenzien verwendet, um einen speziellen Phosphorylierungszustand des Proteins zu identifizieren, von dem die Polypeptidantigensequenz erhalten wurde.
Immunisierung des Tiers zur Verwendung der Herstellung der immunologischen Reagenzien wird allgemein als eine abgemessene Serie von Impfungen ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das natürliche Phosphopeptidkonjugat in einer oder mehreren Endimpfungen (Verstärkungen) verwendet. Von diesem Schritt wird erwartet, dass er die Anzahl der B-Zellen erhöht, die die am meisten geeigneten Antikörper erzeugen, ohne eine ungebührliche Synthese von Antikörpern zu stimulieren, die mit dem nicht phosphorylierten Peptid reaktiv sind, das aus der Stimulierung der Antikörpersynthese durch das dephosphorylierte Peptid resultiert. Diese Verstärker werden gemäß herkömmlicher Techniken durchgeführt und können empirisch weiter optimiert werden.
Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung und Isolation von polyklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein Protein oder Polypeptid binden, das an einem zuvor bestimmten Aminosäurerest phosphoryliert ist, unter Verwendung von Phosphopeptid-Mimetika, die in Polypeptide als Antigen eingebracht werden. Polyklonale Antikörper werden hergestellt durch Immunisierung eines Tieres mit einem Immunogen, hergestellt wie oben beschrieben, unter Verwendung von herkömmlichen Techniken (s. zum Beispiel Harlow and Lane (Hrsg.), Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988)). Kurz gesagt wird das immunisierte Tier unter Bedingungen gehalten, bei denen Antikörper, die mit dem Immunogen reaktiv sind, hergestellt werden. Es wird Blut aus dem Tier gesammelt, wenn es einen gewünschten Antikörpertiter erreicht hat. Das Serum, welches die Antikörper enthält, wird von den anderen Blutbestandteilen abgetrennt. Alternativ kann Antikörper enthaltende Aszitesflüssigkeit eingebracht und aus dem immunisierten Tier isoliert werden. Das polyklonale Antikörper enthaltende Serum oder Aszitenflüssigkeit kann wahlweise weiter in Fraktionen von speziellen Arten von Antikörpern (zum Beispiel IgG oder IgM) getrennt werden.
Da das verwendete Peptidantigen antigene Determinanten enthält, die sowohl das phospho- als auch das nicht phosphorylierte Protein gemein haben, enthält das durch dieses Verfahren erzeugte Serum üblicherweise einen Untersatz von Antikörpern, die spezifisch an das Phosphoprotein binden und auch einen Untersatz von Antikörpern, die unabhängig vom Phosphorylierungszustand binden. Solche unerwünschten Bindungsaktivitäten können aus dem Antiserum durch herkömmliche Techniken beseitigt oder verringert werden (Czernik et al., Methods in Enzymology 201: 264–283 (1991)). Falls notwendig, können monospezifische Antikörper aus dem Serum unter Verwendung der antigenen Determinante durch Affinitätsreinigung (zum Beispiel durch Affinitätschromatographie) oder umgekehrt durch Verringern des Serums von allen anderen Antikörperaktivitäten gereinigt werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung und Isolation von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein zuvor bestimmtes Phosphoproteinepitop binden, unter Verwendung von Phosphopeptid-Mimetika, eingebracht in Polypeptide als Antigen. Monoklonale Antikörper, die Hybridomas absondern, werden unter Verwendung des oben beschriebenen Antigens mit herkömmlichen Techniken hergestellt (s. zum Beispiel Harlow and Lane (Hrsg.), Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988)). In einer bevorzugten Ausführungsform werden phosphospezifische monoklonale Antikörper hergestellt durch Murinhybridomas, die durch Fusion von: a) einem Mausmyelom oder -hybridoma, das keinen Antikörper abscheidet, mit b) einer Murin-Spleenzelle, die Antikörper abscheidet, gebildet wird, erhalten von einer Maus, die mit einem Mimetikum enthaltenden Polypeptid-Antigen immunisiert wurde.
Typischerweise werden einige Mäuse mit einer ersten Injektion eines Antigens immunisiert, gefolgt von einer Anzahl von Verstärkungsinjektionen. Während oder nach dem Immunisierungsverfahren werden Seren von den Mäusen gescreent, um Mäuse zu identifizieren, die eine wesentliche Immunantwort gebildet haben. Für ausgewählte Mäuse werden die Spleenzellen erhalten und Fusionen ausgeführt. Geeignete Fusionstechniken beinhalten zum Beispiel die Sendai-Virustechnik (Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975)) oder das Polyethylenglykol-Verfahren (Kennet, „Monoclonal Antibodies, Hybridomas – A New Dimension in Biological Analysis", Hrsg. Kennet, McKern und Bechtol, Plenum Press, NY (1980)).
Die resultierenden Hybridomas werden dann auf die Produktion von Antikörpern gescreent, die für das Antigen spezifisch sind. Verschiedene Proben können für das Screening verwendet werden und entweder mit dem phosphomimetischen Polypeptid-Antigen oder dem natürlichen phosphorylierten Polypeptid-Antigen ausgeführt werden. Eine geeignete Screeningtechnik ist ein Festphasen-Radioimmunoassay. Eine Festphase wird hergestellt durch Koppeln des geeigneten Antigens an eine unlösliche Matrix. Das Immunadsorbens wird in Kontakt gebracht mit Kulturüberständen von Hybridomas. Nach einem Zeitraum der Inkubation wird die feste Phase von dem Überstehenden abgetrennt, dann mit einem markierten Antikörper gegen Murin-Immunoglobulin in Kontakt gebracht. Eine Markierung, die mit dem Immunadsorbens assoziiert ist, zeigt die Gegenwart von Hybridomaprodukten, die gegenüber dem Antigen reaktiv sind.
Die monoklonalen Antikörper können in großen Mengen hergestellt werden durch Injektion von Antikörper produzierenden Hybridomas in die Bauchhöhle von Mäusen und nach einer geeigneten Zeit Ernten des aszitischen Fluids aus der Maus. Die monoklonalen Antikörper werden dann aus dem Fluid isoliert. Alternativ können die Antikörper hergestellt werden durch Kultivieren der Hybridomas in vitro und Isolation der ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper aus dem Kulturmedium direkt. Verfahren der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um immunologische Reagenzien herzustellen, die spezifisch sind entweder für einen bekannten oder einen vermuteten Proteinphosphorylierungszustand. Wenn für einen bekannten Phosphorylierungszustand spezifisch, können die Antikörper verwendet werden, um die Phosphorylierung unter verschiedenen Bedingungen eng zu überwachen (zum Beispiel Zellzyklus, hormonale Stimulierung oder Stress). Alternativ werden phosphospezifische Antikörper hergestellt für einen vermuteten natürlich auftretenden Phosphorylierungszustand. Diese immunologischen Reagenzien können verwendet werden, um das physiologische Auftreten eines vermuteten Phosphorylierungszustandes zu bestätigen oder auszuschließen.
Ergebnisse, die im folgenden Beispielbereich präsentiert werden, zeigen, dass die oben beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in der Isolierung von Antikörpern resultieren, die an spezielle Phosphoreste binden, unabhängig von den flankierenden Aminosäuresequenzen. Solche Antikörper treten auf, wenn sie entweder als monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt werden. Diese Antikörper zeigen eine Bindung an den speziellen Phosphorest, die weitgehend unabhängig ist von der flankierenden Aminosäuresequenz. Die Antikörper können identifiziert werden und, falls notwendig, durch ihre Fähigkeit, an Phosphoreste von Polypeptidsequenzen zu binden, die mit dem anfänglichen Antigen nicht verwandt sind, gereinigt werden. Solche Antikörper stellen wertvolle Untersuchungswerkzeuge zur Verfügung. Eine Verwendung für diese Antikörper ist in einem Kinase-Assay auf Immunobasis, die auf einen großen Bereich von Proteinen anwendbar ist.
Es wird durch den Fachmann erkannt, dass die Lehren der vorliegenden Erfindung auf die Isolierung von phosphospezifischen Antikörpern angewendet werden können, die durch die Anwendung von einfachen Routineexperimenten auf Systeme hergestellt werden, die anders sind als die oben beschriebenen. Ein solches Beispiel ist die Verwendung eines Mimetikum enthaltenden Antigens, um eine kombinatorische Bücherei auf Antikörper zu screenen, die Bindungsaktivität zeigen. Die vorliegende Offenbarung ist dazu gedacht, diese und verwandte Anwendungen zu umfassen.
Erläuternde Beispiele
Erzeugung von polyklonalen Antikörpern
Antikörper, die für p53 spezifisch sind, das an Serin 15 phosphoryliert ist, werden aus Hyperimmunserum durch Passieren des Serums über eine Serie von Polypeptidgebundenen Säulen affinitätsgereinigt. Eine anfängliche Durchleitung des Serums über eine Säule enthält ein Polypeptid aus p53-Resten 11–22, phosphoryliert an Serin 15, angereichert mit p53-spezifischen Antikörpern. Die gebundenen Antikörper werden eluiert und dann durch Überleiten über eine Säule, die nicht phosphoryliertes p53-Polypeptid enthält, von Antikörpern befreit, die nicht spezifisch für Phosphoserin sind. Der Durchfluss wird aufgefangen und charakterisiert.
Bindungsspezifität des erhaltenen Antiserums wird bestimmt durch Enzymgebundenes Immunoabsorberassay (ELISA) unter Verwendung von Polypeptiden p53(1–39), p53(1–39)15P und p53(25–63)37P. Spezifische Bindung an beide phosphorylierte Polypeptide wird bei Antikörperverdünnungen von weniger als 1 : 320 (3) festgestellt, mit mehr Bindungen an p53(1–39)15P bei allen Konzentrationen. Bindung an nicht phosphoryliertes Polypeptid ist bei allen Konzentrationen unbedeutend. Die Kreuzreaktivität des Antiserums an das p53(25–63)37P-Polypeptid zeigt die Gegenwart von nicht spezifischen Phosphoserin-Antikörpern.
Um das Antiserum von den nicht spezifischen Phosphoserin-Antikörpern zu befreien, wird das Antiserum über eine Säule aus p53(Ac-32–43(37P)Cys) gegeben. Der erhaltene, nicht gebundene Durchfluss wird wie oben untersucht und es wird gefunden, dass er hochspezifisch für p53 ist, das an Serin 15 phosphoryliert ist (4). Reaktivität und Spezifität für das p53-Serin 15 wird durch Immunoblot-Analyse bestätigt unter Verwendung von nicht phosphoryliertem p53 und p53, das enzymatisch an Serin 15 durch Proteinkinase DNA-PK phosphoryliert ist.
Die Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch natürlich phosphorylierte Polypeptide erkennen, aus Peptid-Antigen, das mit F₂Pab für Phosphoserin substituiert ist zeigt, dass F₂Pab als ein wirksames Phosphoserin-Mimetikum funktioniert, wenn es als Antigen verwendet wird. Wichtig ist auch, dass diese Ergebnisse zeigen, dass Peptide, in die F₂Pab eingebracht wurde, wenn sie als Antigen verwendet werden der notwendigen Antigen-Verarbeitung und -Präsentation unterliegen, was für das Einbringen von B-Lymphozyten in die Produktion von spezifischen Antikörpern erforderlich ist. Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen, dass F₂Pab, das in ein Antigen eingebracht ist, verwendet werden kann, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch eine spezielle Stelle der Phosphorylierung innerhalb eines Peptids erkennen und auch Antikörper mit einer breiteren Erkennung von Phosphoserinen im Allgemeinen.
Das erfolgreiche Erzeugen von polyklonalen Antikörpern, die für Phosphoserine spezifisch sind, unter Verwendung von F₂Pab-Mimetikum, so wie hier beschrieben, zeigt, dass Immunisierung von Mäusen oder anderen Tieren mit Polypeptid enthaltendem F₂Pab, durch andere Standardverfahren, auch in der Stimulierung und klonalen Expansion von B-Lymphozyten resultiert, um Antikörper herzustellen, die spezifisch sind für einen natürlich phosphorylierten Rest, Polypeptid oder Protein. Solche B-Lymphozyten können isoliert werden und in der Herstellung von Hybridomas verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, die spezifisch für Phosphoproteine sind.
Erfindungsgemäße Verfahren
Herstellung von Immunserum. Das Polypeptid, das als Antigen verwendet wird, ist durch SEQ-ID NR: 1 spezifiziert. Das Polypeptid besteht aus 15 Resten, die Sequenz korrespondiert zu einer Sieben-Aminosäure-Sequenz der p53-Aminosäurereste 13–19, die zweimal wiederholt wird und das Phosphoserin-F₂Pab-Mimetikum anstelle von Serin 15 enthält, wobei das Polypeptid einen zusätzlichen carboxyterminalen Cysteinrest zusätzlich zu der p53-Aminosäuresequenz hat. Das Polypeptid wird chemisch hergestellt unter Verwendung von t-Boc-Chemie auf einem Applied Biosystems 430A-Peptidsynthetisierer gemäß Herstellererfordernissen, mit der Ausnahme, dass Boc-F₂Pab (Et2)-OH manuell unter Verwendung von t-Boc-Chemie gekoppelt wird. Die Zusammensetzung der Peptidkette erfolgt durch Standardverfahren (Synthetic Peptides, G. Grant (Hrsg.), W. H. Freeman & Co., New York (1992)). Abspaltung des Peptids aus dem Harz und Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen wird ausgeführt unter Verwendung eines Zwei-Schritt-Entschützungsverfahrens (Otaka et al., Tetrahedron Lett. 36: 927–930 (1995)). Die Peptide werden durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) auf einer Vydac C-8-Säule mit 0,05% TFA/Wasser-Acetonitril gereinigt.
Das Polypeptid wird über den carboxyterminalen Cysteinrest an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) gekoppelt. Das erhaltene KLH-F₂Pab-Peptidkonjugat wird verwendet, um ein Kaninchen durch Standardverfahren zu immunisieren. Kurz gesagt wird dem Kaninchen 500 μg des Peptidkonjugats, vermischt mit Hilfsstoff, an den Tagen 0, 7 und 14 subkutan injiziert. Vollständiger Freund's Hilfsstoff wird für die erste Injektion und unvollständiger Freund's Hilfsstoff für die weiteren Injektionen verwendet. Blut wird an Tag 21 gesammelt. Nach Tag 21 wird die Immunisierung und Blutsammlung wöchentlich fünf Wochen lang wiederholt.
Erzeugung von Polypeptiden für die Affinitätschromatographie.
Polypeptide aus 13 Aminosäuren, korrespondierend zur menschlichen p53-Sequenz der Reste 11 bis 22 und mit einem zusätzlichen carboxyterminalen Cysteinrest werden chemisch durch Standardverfahren synthetisiert, nicht phosphoryliert: (p53(Ac-11–22Cys)) oder phosphoryliert an Serin 15 (p53(Ac-11–22(15P)Cys)). Polypeptid, das zu der menschlichen p53-Sequenz der Reste 32 bis 43 mit carboxyterminal-addiertem Cysteinrest korrespondiert, wird als an Serin 37 phosphoryliert synthetisiert: (p53(Ac-32–43(37P)Cys)).
Peptide werden durch Festphasenverfahren mit Fmoc-Chemie synthetisiert (Synthetic Peptides, G. Grant (Hrsg.), W. H. Freeman & Co., New York (1992)) unter Verwendung eines Applied Biosystems 430A Peptid-Synthetisierers (Foster City, CA). Phosphoserinreste werden als Fmoc-Ser(PO(ObzIOH)-OH eingebracht (Novabiochem, San Diego, CA) (Wakamiya et al., Chem. Lett. 6: 1099–1102 (1994)). Abspaltung des Peptids aus dem Harz und Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen wird ausgeführt unter Verwendung von Reagenz K (TFA : Phenol : Thioanisol : H₂O : EDT = 82,5 : 5 : 5 : 5 : 2,5) über 3 Stunden bei Raumtemperatur (King et al., Int. J. Pept. Protein Res. 36: 255–266 (1990)). Die Peptide werden durch HPLC auf einer Vydac C-8-Säule gereinigt (Hesperia, CA) mit 0,05% TFA/Wasser-Acetonitril, oder auf einer pH-stabilen Vydac C-8-Säule (Hesperia, CA) mit 0,2% Hexafluoraceton-NH₄OH, pH 7,0/Acetonitril (für 1–39 Peptide). Die Masse der Peptide wird durch Elektrosprühionisations-Massenspektrometrie auf einem Finnigan MAT SSQ 7000 (Finnigan MAT, San José, CA) bestätigt.
Erzeugng von Polypeptid-gebundenen Säulen. Die Polypeptide (p53(Ac-11–22Cys)), (p53(Ac-11–22(15P)Cys)) und (p53(Ac-32–43(37P)Cys)) werden gemäß den Anweisungen, die durch die Hersteller zur Verfügung gestellt werden, an Sulfolink (Pierce Chemical Co.) gekoppelt. Die erhaltenen Sulfolink-Konjugate werden verwendet, um drei Säulen zu erzeugen, jede gepackt mit einem der Polypeptid-Sulfolink-Konjugate.
Affinitätsreinigung Antikörper, die spezifisch für p53 sind, das an Serin 15 phosphoryliert ist, werden aus hyperimmunem Kaninchenserum durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Serie von Peptid-gebundenen Säulen gereinigt. Das Serum wird zunächst durch eine (p53(Ac-11–22(15P)Cys)-Säule geleitet. Nach dem Waschen werden die adsorbierten Antikörper mit ImmunoPure IgG-Elutionspuffer (Pierce Chemical Co.) eluiert und werden sofort durch Zugabe von 1 M Tris-Puffer (pH 9,5) neutralisiert. Das Eluat wird über eine (p53(Ac-11–22Cys)-Säule geleitet, um Antikörper zu entfernen, die nicht phosphoryliertes p53 binden. Der nicht gebundene Durchfluss wird gesammelt und dann über eine (p53(Ac-32–43(37P)Cys))-Säule geleitet, um ihn von Antikörpern zu befreien, die an Phosphoserine binden, unabhängig von ihrer Position in einem Polypeptid.
Antikörperanalyse Affinitätsgereinigte Antikörperpreparationen werden auf ihre Bindung an die Polypeptide p53(1–39), p53(1–39)15P oder p53(1–39)37P durch ELISA-Assay untersucht, wie in der Pierce Chemical Technical Library und in Engvall et al., Immunochemistry 8: 871–875 (1971) beschrieben. Platten werden mit den bezeichneten Polypeptiden durch Verdünnen des Polypeptids in Natriumcarbonat-Bicarbonat-Puffer beschichtet, pH 9,6 (1,59 g Na₂CO₃, 2,93 g NaHCO₃ je Liter, pH eingestellt mit HCl) auf 1 μg/ml und 50 oder 100 ng (50 oder 100 μl) werden bei 4°C über Nacht oder für etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Peptidlösung wird dann entfernt und die Platten werden durch Inkubation mit 1% BSA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Polypeptid beschichtete Vertiefungen werden mit Antikörperverdünnungen zwischen 1/10 und 1/1.000 inkubiert. Gebundene Antikörper werden bestimmt durch Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, gefolgt von Zugabe des HRP-Substrats ABTS (2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)). HRP-Oxidation des ABTS erzeugt grünfarbiges Produkt, das verwendet wird, um die Antikörpergegenwart zu identifizieren. Die Menge des Kaninchen-IgG, das an die polypeptidbeschichtete Platte gebunden ist, wird bestimmt durch Messen der optischen Dichte der Mischung bei 405 nm (OD₄₀₅). Die Ergebnisse werden durch getrennte ELISA-Assay und Punktblots („Western"-Blots) bestätigt.
Polypeptide, die bei der ELISA-Analyse verwendet werden, werden durch Fmoc-Chemie wie oben beschrieben hergestellt. Längere Peptide werden durch ein Fragmentkondensationsverfahren synthetisiert (Sakamoto et al., Int. J. Peptide Protein Res. 48: 429–442 (1996)).

Claims

Verfahren zur Isolierung von polyklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein Polypeptid binden, das an einer bestimmten Aminosäure phosphoryliert ist, wobei man: a) ein synthetisches Polypeptid bereitstellt, das ein Mimetikum des bestimmten Aminosäurerestes umfasst, wobei das synthetische Polypeptid in einem physiologisch akzeptablen Träger formuliert ist, und wobei das Mimetikum chemisch stabil sein muss, was mit einem synthetischen Molekül erreicht wird, das die Aminosäurestruktur mit einer nicht hydrolisierbaren Bindung an einen Phosphatrest anstelle der natürlich vorkommenden Sauerstoffbrücke umfasst; b) ein Tier mit dem synthetischen Polypeptid von Schritt a) immunisiert; c) das Serum oder die Aszitesflüssigkeit vom immunisierten Tier von Schritt b) sammelt und aufbereitet; d) auf die Gegenwart von Antikörpern screent, die spezifisch für das phosphorylierte Polypeptid sind; und e) falls nötig, Antikörper, die spezifisch für das phosphorylierte Polypeptid sind, durch herkömmliche Methoden weiter anreichert.
Verfahren von Anspruch 1, wobei Antikörper, die spezifisch für das phosphorylierte Polypeptid sind, weiter angereichert werden durch: a) Affinitätsaufreinigung; und/oder b) Depletion von beigemischten Antikörpern, die ungewünschte Bindungsaktivitäten zeigen.
Verfahren zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein Polypeptid binden, das an einem bestimmten Aminosäurerest phosphoryliert ist, wobei man: a) ein synthetisches Polypeptid bereitstellt, das ein Mimetikum der bestimmten phosphorylierten Aminosäure umfasst, wobei das synthetische Polypetid in einem physiologisch akzeptablen Träger formuliert ist; b) ein Tier mit dem synthetischen Polypeptid von Schritt a) immunisiert; c) B-Zellen von dem Tier von Schritt b) sammelt; d) Hybridomas durch Fusionierung von B-Zellen von Schritt c) mit Myelomzellen generiert; e) die Hybridomas von Schritt d) auf die Produktion von Antikörpern screent, die spezifisch für das phosphorylierte Polypeptid sind; f) die in Schritt e) identifizierten Hybridomas isoliert und züchtet; und g) monoklonale Antikörper aus den isolierten Hybridomas von Schritt f) isoliert.
Verfahren von Anspruch 1 oder 3, wobei das Binden der Antikörper an das phosphorylierte Polypeptid: a) abhängig ist von den Aminosäuresequenzen, die die phosphorylierte Aminosäure flankieren; oder b) unabhängig ist von den Sequenzen, die die phosphorylierte Aminosäure flankieren.
Verfahren von Anspruch 1 oder 3, wobei das Tier ferner mit einem natürlichen Phosphopeptid-Konjugat immunisiert wird, das eine geeigneten Aminosäuresequenz als Verstärkung beinhaltet.
Verfahren von Anspruch 1 oder 3, wobei das synthetische Polypeptid von Schritt a) vor der Immunisierung von Schritt b) modifiziert wird; und wobei die Modifizierung gegebenenfalls durch Kopplung des Polypeptids an ein Trägerprotein, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämacyanin (keyhole limpet hemacyanin; KLH), Rinderserumalbumin (bovine serum albumine; BSA), Ovalbumin und gereinigtem Proteinderivat (purified protein derivate; PPD) von Tuberkulin besteht, mittels irgendeines bifunktionellen Reagenzes erfolgt.
Verfahren von Anspruch 1 oder 3, wobei der bestimmte phosphorylierte Aminosäurerest aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Serin, Threonin und Tyrosin besteht.
Verfahren von Anspruch 1 oder 3, wobei das Mimetikum eine nicht hydrolisierbare Bindung eines Kohlenstoffatoms an eine Phosphatgruppe enthält.
Verfahren von Anspruch 8, wobei die nicht hydrolisierbare Bindung eine CF₂-Gruppe umfasst; und wobei gegebenenfalls: a) F₂Pab ein Mimetikum für Phosphoserin ist; b) F₂Pmp ein Mimetikum für Phosphotyrosin ist; und/oder c) F₂Pmb ein Mimetikum für Phosphothreonin ist.
Verfahren von Anspruch 1 oder 3, wobei das synthetische Polypeptid von Schritt a) eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der Aminosäuresequenz von p53 ableitet; und wobei gegebenenfalls das Polypeptid das in SEQ ID NO: 1 spezifizierte ist; oder aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den SEQ ID Nos: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 besteht.