DE60026729T2

DE60026729T2 - Verfahren zur modifikation von ausgewählten zellen in einer magnetischen zelltrennungsäule

Info

Publication number: DE60026729T2
Application number: DE60026729T
Authority: DE
Inventors: Stefan Miltenyi; Mario Assenmacher; Jürgen Schmitz
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-09-02
Also published as: ATE320314T1; EP1207961B1; AU778569B2; US6468432B1; CA2383791C; AU1294801A; JP4612982B2; EP1207961A2; CA2383791A1; WO2001017687A2; DE60026729D1; JP2003508073A; WO2001017687A3; ES2260063T3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung von Hochgradienten-Magnetzellseparations-(HGMS)-Techniken bei einem Verfahren zum Modifizieren selektionierter Zellen.
HINTERGRUND
Der Stand der Technik wendet sich verschiedenen Methoden und Techniken zum Modifizieren von Zellen außerhalb des Körpers zu. Die Oberflächenfärbung von Zellen durch die Anlagerung von Antikörpern, die an fluoreszierende Komponenten gebunden sind, stellt eine häufige Modifikation dar. Die intrazelluläre Färbung nach der Fixierung ist ebenfalls verbreitet. Mit diesen Färbungen können Kappa- und Lambda-Leichtketten angezielt und für die Analyse auf monoklonale Tumorzellpopulationen eingesetzt werden. Zwar sind Färbungen dieser Art häufig spezifisch, doch können die Zellen auf unzählige nicht-spezifische Weisen modifiziert werden, wie etwa durch Aussetzen einem pharmakologischen oder chemischen Agens, Behandeln mit einem Hormon oder einer anderen Verbindung, die für die Vermittlung einer zellulären Aktivität bekannt ist, oder Transfizieren mit Genen, um ein rekombinantes Produkt zu erhalten. Die Techniken der Zellmodifikation weisen somit ein forschungsorientiertes wie auch ein behandlungsorientiertes Potential auf.
Im Stand der Technik werden Modifikationen wie die Färbung entweder mit Zellen in Suspension oder mit Monoschichten der Zellen vorgenommen, die an verschiedenen Oberflächen immobilisiert sind (wie etwa einem Mikroskopträger), um dem modifizierenden Agens den Zugang zu allen Zellen gleichermaßen zu ermöglichen. Ein derartiges Färben oder anderweitiges Modifizieren von Zellen ist im Fachgebiet bekannt.
Beispiele für jüngste Fortschritte in der Monoschicht-Modifikation sind angegeben bei Lebkowski, et al., Isolation, Activation, Expansion and Gene Transduction of Cell Based Therapeutics Using Polysterene Immunoaffinity Devices, in Cell Separation Methods and Applications, Recktenwald, et al., Hrg. (1998) und in US-Patent-Nr. 5 912 177. Diese Verfahren können jedoch zeitaufwändig sein und beziehen oftmals vielfache Waschschritte ein, was ein potentielles Risiko für einen Zellverlust schafft. Diese Verfahren sind besonders problematisch, wenn geringe Anzahlen an Zellen beteiligt sind.
Im Stand der Technik wird die Modifikation von Zellen in Aggregatformen (wie etwa dem nach einer Zentrifugation entstandenen Pellet) nicht empfohlen. Vernetzungsmittel wie Formaldehyd führen zu ähnlichen Problemen, da die Zellen voneinander getrennt werden müssen, um eine irreversible Verklumpung zu verhindern.
Sehr häufig ist in der Praxis die Modifikation eines Zelltyps innerhalb eines heterogenen Gemischs oder Suspension, wie etwa Lymphe oder Blut, gewünscht, da im Anschluss an die Modifikation dieser spezielle Zelltyp untersucht oder dem Patienten als Teil eines Behandlungs- oder Testschemas zurückgegeben werden soll. Unter diesen Umständen kann die Modifikation von anderen Zellen als der angezielten Klasse nachteilige Wirkungen zeigen. Verschiedene Methoden der Zellseparation sind entwickelt worden, um diese Anforderungen zu erfüllen.
Ein Überblick über die derzeit im Fachgebiet bestehenden Zellseparationstechniken ist angeboten in Cell Separation Methods and Applications, Recktenwald, et al., Hrg. (1998). Eine angewendete Zellseparationstechnik bezieht die magnetische Zellseparation ein, wobei die Zielzellen mit einem magnetischen Marker markiert und dann selektiv in einer Kammer oder Säule rückgehalten werden, die einem Magnetfeld ausgesetzt ist. Kantor, et al. (1998, Magnetic Cell Sorting with Colloidal Superparamagnetic Particles, in Cell Separation Methods & Applications); Gee (1998, Immunomagnetic Cell Separation Using Antibodies and Superparamagnetic Microspheres in Cell Separation Methods & Applications); und Miltenyi, S., US-Patent-Nr. 5 411 863, beschreiben die Magnetzellseparationstechniken. Für die Hochgradienten-Magnetseparation wird typischerweise eine heterogene Suspension, die selektionier te Zellen in Bindung an magnetische Marker enthält, durch eine Säule geleitet, wobei die selektionierten Zellen magnetisch an der Säule oder an einer paramagnetischen Matrix innerhalb der Säule haften bleiben können. Der Rückstand der Suspension wird eluiert, wobei die selektionierten magnetisierten Zellen an der Säule gebunden verbleiben. Wird das Magnetfeld entfernt, so können die selektionierten Zellen eluiert werden.
Die Verfahren der nicht-magnetischen Zellseparation können zur Vereinfachung der Zellmodifikation angewendet werden. Zu diesen Verfahren zählen Immunaffinitäts-Zellseparationstechniken, die oftmals weniger bevorzugt sind als die magnetischen Zellseparationsmethoden, da erstere oftmals zu einem erhöhten Zellverlust als auch einem erhöhten Verbrauch an Reagenz und einer erhöhten Salzkonzentration führen, was eine Dialyse des Eluats erforderlich machen kann. Lebkowski, et al. (1998, Isolation, Activation, Expansion, and Gene Transduction of Cell-Based Therapeutics Using Polystyrene Immunoaffinify Devices, in Cell Separation Methods and Applications) beschreiben eine Methode, bei der selektionierte Klassen von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) durch Immunoaffinitätsprozesse positiv selektioniert werden können, bei denen die selektionierten Zellen durch monoklonale Antikörper oder Lektine, die kovalent an Polystyrolstrukturen gebunden sind, immobilisiert und dann kultiviert, aktiviert oder genetisch modifiziert werden, solange sie immobilisiert sind. Eine ähnliche Methode zum Modifizieren von Stammzellen ist in US-Patent-Nr. 5 912 177 beschrieben. Ein zentraler Nachteil dieser Methoden ist jedoch, dass sie die selektionierten Zellen an eine flache oder anderweitig zweidimensionale Oberfläche binden, was einen beträchtlichen Oberflächenbereich relativ zur Anzahl der auszuwählenden Zellen erforderlich macht. Die Zellen müssen eine Monoschicht bilden, wie in 1 veranschaulicht. Weiterhin werden die für die Selektion verwendeten Antikörper am Element selbst fixiert, wobei diese Techniken ein spezifisches Element oder Struktur für jedes gewünschte Ziel erfordern. Darüber hinaus kann die Freisetzung und Resuspendierung der selektionierten Zellen aus diesen Strukturen ein zeitaufwändiger Vorgang sein.
Die Magnetzellseparationstechniken sind zum Immobilisieren von Zellen verwendet worden, wie beschrieben in US-Patent-Nr. 5 622 831 und US-Patent-Nr. 5 876 593.
US-Patent-Nr. 5 622 831 erfordert einen komplizierten Schaltmechanismus zur Freisetzung und Resuspendierung der immobilisierten Zellen, und US-Patent-Nr. 5 876 593 verwendet keine Säule, sondern erfordert statt dessen das Immobilisieren der Zellen als einer im Wesentlichen eindimensionalen Monoschicht.
In WO-A-94/11078 ist ein Element mit einer Sammelstruktur, wie z.B. ein ferromagnetischer Draht, der als ein magnetischer Flussverstärker wirkt, und immobilisierte magnetisch markierte Zellen in einer im Wesentlichen eindimensionalen Monoschicht beschrieben. Eine HGMS-Säule ist nicht beschrieben.
In US-A-5 691 208 ist ein verbesserter magnetischer Separationsapparat beschrieben, der einen verminderten Lufteinfang und nicht-spezifische Bindung im Vergleich zu anderen Geräten aufweist.
In EP-A-0 670 185 wird nicht das Modifizieren von Zellen im an einer HGMS-Säule zurückgehaltenen Zustand beschrieben, wie vorliegend beansprucht. Es werden Methoden zur magnetischen Markierung von Zellen beschrieben, die aus einer Zellpopulation unter Verwendung des magnetischen Elements entfernt werden sollen, d.h. durch Bindung eines magnetischen Partikels an ein Zelloberflächenmolekül.
In WO-A-97/17611 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem magnetisch anziehbare Partikel, die eine Affinität für eine gewünschte Spezies (z.B. Mikroorganismus) aufweisen, an einen festen Träger durch magnetische Kräfte angezogen werden. Bei einem nachfolgenden Schritt wird eine Probe, die die Spezies enthält, an die Partikel herangebracht, die an dem festen Träger immobilisiert sind. Die magnetisch anziehbaren Partikel werden an dem festen Träger während des Zeitraums festgehalten, in welchem sie mit einer Probe kontaktiert werden, die die einzufangende Spezies enthält.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modifizieren selektionierter Zellen bereitgestellt, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Aufgeben einer Population von Zellen auf eine Hochgradienten-Magnetseparationssäule, wobei die Säule eine Matrix umfasst, die mehr als 50% des Gesamtvolumens der Säule ausmacht, wobei die Population von Zellen magnetisch markierte selektionierte Zellen umfasst;
(b) Rückhalten der magnetisch markierten selektionierten Zellen in der Säule, während unmarkierte Zellen durchpassieren dürfen;
(c) Waschen der selektionierten Zellen, während die selektionierten Zellen durch die Säule rückgehalten werden; und
(d) Modifizieren der selektionierten Zellen, während die selektionierten Zellen durch die Säule rückgehalten werden; wobei Schritt (c) optional ist.

In noch einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung außerdem den zusätzlichen Schritt des Aufbringens der entfernten, selektionierten Zellen auf eine zweite Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule, sodass die selektionierten Zellen durch die zweite Säule rückgehalten werden, und außerdem Modifizieren der selektionierten und durch die zweite Säule rückgehaltenen Zellen.
Vorteilhafterweise beträgt das Volumen der Matrix mehr als 60% des Gesamtvolumens der Säule.
Die Matrix kann vorteilhafterweise ferromagnetische Kügelchen umfassen.
Die selektionierten Zellen können aus der Säule nach ihrer Modifikation durch Entfernen des Magnetfeldes entnommen werden.
Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Modifizieren das intrazelluläre Färben der selektionierten Zellen; Permeabilisieren der selektionierten Zellen; Markieren der magnetisch markierten selektionierten Zellen mit einer zweiten Markierung; Binden einer biologisch reaktiven Verbindung an die selektionierten Zellen; Transfizieren der selektionierten Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein Gen von Interesse umfasst; Hinzufügen eines Enzyms zu den selektionierten Zellen; Hinzufügen eines pharmakologischen Agens zu den selektionierten Zellen; Hinzufügen eines biologischen oder chemischen Agens zu den selektionierten Zellen; oder Hinzufügen vielfacher modifizierender Agenzien. Bei einigen Ausführungsformen umfasst die biologisch reaktive Verbindung Antikörper, Liganden, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Polynukleotide, Oligonukleotide, Lektine, Lipide oder Enzyme.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Zellen, die gemäß den Lehren nach dem Stand der Technik von Lebkowski, et al. immobilisiert sind.
2 zeigt ein Flussdiagramm eines typischen Modifikationsprozesses gemäß der vorliegenden Erfindung.
3A–3B zeigen eine Reihe von darstellenden Zeichnungen. 3A zeigt ein Gemisch von markierten und unmarkierten Zellen, die auf eine Magnetzellseparationssäulen-Vorrichtung aufgebracht werden (wobei nördliche und südliche Magnetfelder gezeigt sind), welche die Elution der unmarkierten Zellen und Rückhaltung der markierten Zellen in der Säule zulässt. 3B zeigt die Säule nach Entfernung des Magnetfelds und die Elution der markierten Zellen in eine separate Suspension.
4A–4C zeigen eine Reihe von FACS-Dot-Plots bezüglich der Ergebnisse aus Beispiel 1, die die intrazelluläre Färbung der Lambda-Leichtkette in isolierten Myelomzellen (U266), gespikt in periphere mononukleare Blutzellen, zeigen. 4A zeigt CD138.PE gg. PI-Färbung von PMBC, gespikt mit U266-Myelomzellen vor der Auftrennung auf einer MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule; 4B zeigt die CD138.PE-Färbung gg. FL3 (der FL3-Kanal des Durchflusszytometers sammelt fluoreszierendes Licht bei gleich oder größer als 650 nm) einer fixierten positiven Zellfraktion nach einer zweiten Auftrennung auf einer MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule unter Steuerung (Gating) auf CD138-positive Zellen; und 4C zeigt die intrazelluläre Färbung der humanen Immunglobulin-Lambda-Leichtkette gg. CD138.PE-Färbung an gesteuerten (gated) Zellen.
5A–5D zeigen eine Reihe von FACS-Dot-Plots bezüglich der Ergebnisse aus Beispiel 2, die die Isolierung von CD138+-Plasmazellen aus der Leukapherese eines Myelom-Patienten zeigen. 5A zeigt die CD138.PE-Färbung lebender Leukozyten vor der Auftrennung auf einer MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule gg. FL1-H (der FL1-H-Kanal des Durchflusszytometers sammelt fluoreszierendes Licht zwischen 525–545 nm); 5B zeigt die CD138.PE-Färbung lebender Leukozyten nach der Auftrennung auf der MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule gg. FL1-H; 5C zeigt die Engwinkelstreulicht- (Forward Scatter) (FSC) gg. Seitwärtsstreulicht-(Sideward Scatter)(SSC)-Signale der Leukozyten vor der Auftrennung; und 5D zeigt die FSC/SSC-Signale der positiven Zellfraktion.
6A–6D zeigen eine Reihe von FACS-Dot-Plots bezüglich der Ergebnisse aus Beispiel 2, die die intrazelluläre Färbung von Kappa/Lambda-Leichtketten in isolierten Plasmazellen von Myelom-Patienten zeigen. 6A und 6B zeigen die CD138.PE-Färbung gg. FL3-Autofluoreszenz der positiven Fraktion der fixierten Zellen nach der zweiten Auftrennung auf einer MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule mit Gating (gemäß R1) an CD138-positiven Zelten; 6C zeigt die intrazelluläre Färbung der humanen Immunglobulin-Lambda-Leichtkette gg. CD138.PE-Färbung an gesteuerten (gated) Zellen; und 6D zeigt die intrazelluläre Färbung der humanen Immunglobulin-Kappa-Leichtkette gg. CD138.PE-Färbung an gesteuerten (gated) Zellen.
7A–7B zeigen eine Reihe von Dot-Plots bezüglich der Ergebnisse aus Beispiel 3. 7A zeigt die Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC-Färbung der Zellen, die auf einer MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule gefärbt wurden; und 7B zeigt die Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC-Färbung von Zellen, die außerhalb einer MACS^® Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule gefärbt wurden.
8A–8E zeigen eine Reihe von FACS-Dot-Plots bezüglich der Ergebnisse aus Beispiel 4, die die Färbung von Oberflächen-Ig auf die CD138-MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation hin zeigen. 8A zeigt die Färbung von CD19.Cy5^TM gg. CD138.PE vor der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation; 8B zeigt die Färbung von CD19.Cy5^TM gg. CD138.PE der positiven Zellfraktion nach der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation; 8C zeigt die Oberflächen-IgA.FITC-Färbung gg. CD138.PE der positiven Zellfraktion, gesteuert (gated) auf CD138-positive Zellen; 8D zeigt die Oberflächen-IgM.FITC-Färbung gg. CD138.PE der positiven Zellfraktion, gesteuert (gated) auf CD138-positive Zellen; und 8E zeigt die Oberflächen IgG.FITC-Färbung gg. CD138.PE der positiven Zellfraktion, gesteuert (gated) auf CD138-positive Zellen.
9A–9C zeigen eine Reihe von FACS-Dot-Plots bezüglich der Ergebnisse aus Beispiel 5, die die Immunphänotypisierung der Lymphozyten auf die CD45 MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation aus Vollblut hin zeigen. 9A zeigt die FSC/SSC-Signale der positiven Zellfraktion mit Gating auf Lymphozyten; 9B zeigt die Färbung von CD19.PE gg. LDS der positiven Zellfraktion mit LDS-Gate auf nukleierte Zellen; und 9C zeigt die Färbung von CD4.FITC gg. CD19.PE der positiven Zellen, gesteuert (gated) durch R1 und R2.
10 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Photographie einer Eisenkügelchen-Matrix auf einer MS+-Säule mit an der Matrix gebundenen magnetisch markierten CD8+-Zellen.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Modifizieren selektionierter Zellen bereit, indem die in einer Hochgradienten-Magnetzellseparations-(HGMS)-Säule zurückgehaltenen selektionierten Zellen modifiziert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft die positive Selektion, das heißt die Modifikation einer spezifischen Zellpopu lation, die einer direkten Selektion unterzogen worden ist. Durch Ausführen der Verfahren an einer Population von Zellen, wie etwa Vollblut, die die selektionierten Zellen umfasst, kann die selektionierte Zellpopulation angereichert werden. Bei der vorliegenden Erfindung ist die Zahl der erforderlichen Schritte im Vergleich zum Stand der Technik, bei dem die Anreicherungs- und Modifikationsprozesse separat vorgenommen werden, wesentlich vermindert.
Die Erfindung wendet ein HGMS-Säulenelement oder -Methodik an, das eine Spezifität für die selektionierten Zellen oder markierten selektionierten Zellen erlauben soll. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist die erhöhte Zellkonzentration, die mit dem HGMS-System verwendet werden kann, und die verminderte Zahl der Schritte bei dem Verfahren. Zum Beispiel wird bei einigen Aspekten der Erfindung eine Probe, wie etwa Vollblut, direkt von einem Organismus erhalten, werden Zellen selektioniert, z.B. durch magnetische Markierung in Vollblut, wird das Vollblut auf eine HGMS aufgebracht, werden die an der Säule rückgehaltenen selektionierten Zellen modifiziert und dann die modifizierten, selektionierten Zellen eluiert und zur Analyse ohne einen dazwischenliegenden Zentrifugierschritt übergegangen, was die Möglichkeit der Automatisierung und Verminderung des Potentials für einen Zellverlust bietet.
Ein anderer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit der Temperaturkontrolle während des Verfahrens. Die HGMS kann in einem Inkubator oder Kühlschrank und/oder unter Verwendung von Puffern bei der gewünschten Temperatur ablaufen. Die Verwendung einer HGMS-Matrix, umfassend eine wärmeleitende Matrix, einschließlich beispielsweise Stahlkügelchen, Stahlwolle oder anderer Kügelchen, bietet die Möglichkeit zur Kontrolle der Temperatur während des Verfahrens.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist der, dass die Zellen schnell von Phase zu Phase auf der HGMS-Säule geleitet werden können, das heißt von der mobilen Phase zur immobilen Phase oder von der immobilen Phase zur mobilen Phase, indem das Magnetfeld an- und ausgeschaltet wird oder indem das Magnetfeld verändert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das Magnetfeld durch Bewegen der Säule relativ zum Magnetfeld, oder alternativ durch Modifizieren eines Elektromagnets, eingestellt werden.
Definitionen
Wie hierin verwendet, handelt es sich bei „selektionierten Zellen" um jene Zellen, die der Fachmann zu modifizieren wünscht. Typischerweise werden die Zellen irgendeine Charakteristik tragen, die sie von anderen Zellen in einer heterogenen Suspension unterscheidet und die ihre Markierung und Auftrennung möglich machen wird. Gemäß der Erfindung werden die selektionierten Zellen an einer HGMS-Säule rückgehalten, während des an der Säule rückgehaltenen Zustands modifiziert und dann eluiert.
„Rückhaltung" der selektionierten Zellen gewährleistet, dass die selektionierten Zellen in der Säule zurückbleiben, wohingegen unerwünschte Zellen entfernt werden. Typischerweise erfolgt die Rückhaltung der selektionierten Zellen durch Immobilisation.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Immobilisieren" der selektionierten Zellen in einer Magnetzellseparationssäule auf die Rückhaltung der Zellen in der Säule in einer im Wesentlichen fixierten Position.
„Entfernen" der selektionierten Zellen aus einer magnetischen Zellseparationssäule beinhaltet das Eluieren der selektionierten Zellen im Anschluss an die Rückhaltung oder Immobilisation. In Situationen, bei denen eine hohe Reinheit der selektionierten Zellen erwünscht ist, können die selektionierten Zellen entfernt und in einem geeigneten Puffer resuspendiert werden. Alternativ können die selektionierten Zellen entfernt und der ursprünglichen Suspension nach der Modifikation der selektionierten Zellen in der Säule rückgegeben werden, wie hierin beschrieben.
Wie hierin verwendet, stellt „Markieren" den Prozess des Befestigens eines Markers an den Zellen dar, wobei ermöglicht wird, dass jene Zellen, manchmal nach einer weiteren Prozessierung, aus einer heterogenen Suspension abgetrennt und/oder nachgewiesen, analysiert oder ausgezählt werden. Markierungen können, brauchen aber nicht, spezifisch auf die selektionierten Zellen gezielt werden. Zu diesen Markern oder Markierungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, farbige, radioaktive, fluoreszierende oder magnetische Moleküle oder Partikel, die an Antikörper oder andere biologische Moleküle oder Partikel konjugiert sind, deren Bindungsfähigkeit an Zellen oder zelluläre Komponenten bekannt ist. Antikörper werden oftmals als Markierungskomponenten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Anzielung spezifischer Zelltypen verwendet. Zu weiteren biologisch reaktiven Markierungskomponenten, die als Alternativen zu Antikörpern dienen können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, genetische Sonden, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Zucker, Polynukleotide, Enzyme, Coenzyme, Cofaktoren, Antibiotika, Steroide, Hormone oder Vitamine.
Wie hierin verwendet, bedeutet das „magnetische Markieren" einer Zelle die Befestigung einer magnetischen Markierung an einer Zelle, wobei solch eine Markierung durch Anheften eines Partikels oder Moleküls mit magnetischen Eigenschaften an jener Zelle erreicht wird. Bei einer Ausführungsform umfasst die magnetische Markierung einen Antikörper, der an einen magnetischen Partikel konjugiert ist. Magnetische Markierungen, die einen an einen magnetischen Partikel konjugierten Antikörper umfassen, sind kommerziell beziehbar von Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland). Solch eine Markierung kann wahlweise auch einen fluoreszierenden oder radioaktiven Partikel oder Komponente umfassen.
Wie hierin verwendet, ist eine „Magnetzellseparationssäule" eine Hochgradienten-Magnetseparations-(HGMS)-Säule. HGMS-Säulen sind zum Beispiel beschrieben bei Miltenyi, S., US-Pat. Nr. 5 411 863, mit dem Titel „Methods and Materials for Improved High Gradient Magnetic Separation of Biological Materials" und sind kommerziell beziehbar von Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland).
Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer „Hochgradienten-Magnetzellseparation" um ein Verfahren zur selektiven Rückhaltung magnetischer Materialien in einer Kammer oder Säule, die einem Magnetfeld ausgesetzt ist, das auch auf nicht-magnetische Ziele angewendet werden kann, die selektiv mit magnetischen Partikeln markiert sind. In Gegenwart eines über die Kammer angelegten magnetischen Gradienten wird das magnetisch markierte Ziel in der Kammer rückgehalten. Enthält die Kammer eine Matrix, so wird das magnetisch markierte Ziel an die Matrix gebunden. Materialien, die keine magnetischen Markierungen aufweisen, wandern durch die Kammer. Die rückgehaltenen Materialien können dann eluiert (entfernt) werden, indem die Stärke des Magnetfeldes verändert oder dieses entfernt wird. Bei magnetisch markierten Zielen ist die Freisetzung auch mittels anderer Methoden möglich, wie etwa bei magnetischen Kügelchen, die außerdem eine enzymatische Spaltstelle umfassen, wobei die enzymatische Spaltung (entweder innerhalb oder außerhalb der Säule) die magnetischen Ziele freisetzt. Alternativ können die rückgehaltenen Materialien zum Beispiel durch Verändern des pH-Werts oder Verändern der Ionenstärke freigesetzt werden. Der Vorgang der Rückhaltung und Freisetzung der selektionierten Zellen ist in 3A–3B veranschaulicht. Das Magnetfeld kann entweder durch einen Permanentmagnet oder durch einen Elektromagnet bereitgestellt werden. Die Selektivität für ein gewünschtes Zielmaterial wird durch den spezifischen Bindungspartner geschaffen, der an den magnetischen Partikel konjugiert ist. Die Kammer, durch die das Magnetfeld gelegt ist, ist oftmals mit einer Matrix aus einem Material mit einer entsprechenden magnetischen Empfänglichkeit versehen, um einen hohen lokalen Magnetfeldgradienten in der Kammer in Volumen nahe der Oberfläche der Matrix zu induzieren. Dies erlaubt die Rückhaltung von eher schwach magnetisierten Partikeln. Siehe Miltenyi, S., US-Patent-Nr. 5 411 863.
Vorzugsweise wird als der magnetischen Zellseparationssäule eine Säule verwenden, die ein hohes Volumen an Matrix enthält. Die Matrix wird zur Erzielung eines starken lokalen Magnetfeldgradienten bereitgestellt und besteht häufig aus einem ferromagnetischen Material wie einer Polymer-beschichteten Stahlwolle. Vorzugsweise wird eine dicht gepackte Matrix aus ferromagnetischen Kügelchen, beschichtet mit einem biokompatiblen Polymer, verwendet. Siehe Kantor, et. al, Magnetic Cell Sorting with Colloidal Superparamagnetic Particles in Cell Separation Methods and Applications (1998). Das Matrixvolumen beträgt mehr als 50% des gesamten Säulenvolumens, und vorzugsweise mehr als 60% des gesamten Säulenvolumens. Handelsübliche MS+ oder VS+-Säulen (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland), die Eisenkügelchen-Matrizes enthalten, liefern eine hohe Kapazität an gebundenen Zellen bei einem geringen freien Säulenvolumen, wie in Tabelle 1 ausgeführt.
Tabelle 1
Nach der Immobilisation innerhalb der Säule können die selektionierten Zellen vom Fachmann modifiziert werden, solange sie rückgehalten werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das „Modifizieren" von Zellen auf jeglichen Prozess einer physikalischen, biologischen oder chemischen Veränderung der selektionierten Zellen gegenüber ihrem vorherigen Zustand. Beispiele der Modifikationen innerhalb des Rahmens der Erfindung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Markierung von Zellen (mit solchen Markierungen wie Antikörpern oder fluoreszierenden oder radioaktiven Markern oder biologischen Liganden und Substraten), die intrazelluläre Färbung, Oberflächenfärbung, Fixierung, Permeabilisation, genetische Rekombination, Aktivierung, Transfektion, Infektion und weitere zelluläre Veränderungen, die durch Anwenden von Enzymen, biologischen Modifikatonen oder pharmakologischen oder chemischen Agenzien bewirkt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „modifizierendes Agens" breit auf jegliches Agens, das zur Bewirkung einer Modifikation fähig ist. Zu solchen modifizierenden Agenzien können, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper, Liganden, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Polynukleotide, Lektine, Lipide, biologische Modifikatoren, Fixiermittel, pharmakologische Agenzien, chemische Agenzien, Permeabilisator, intrazelluläre Färbungen, Oberflächenfärbungen, Expressionsvektoren und Enzyme zählen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Fixierung" oder „Fixieren" auf jeglichen Prozess, der einer Konservierung einer Zelle in einem bestimmten Zustand dient, was vorzugsweise zur Aufrechterhaltung einer exakten Darstellung der Struktur der Zelle in vivo führt, wie etwa durch Beibehaltung ihrer ursprünglichen Größe, einen minimalen Verlust an zellulären Materialien oder der Beibehaltung der Reaktivität ihrer intrazel lulären Bestandteile. Bevorzugte Fixiermittel umfassen Formaldehydlösungen, Formalin, Glutaraldehyd und andere. Die Formaldehyd-Fixierung umfasst vorzugsweise einen Inkubationsschritt, wobei der Formaldehydlösung Zeit zum Durchdringen der Zellen bei einer optimalen Temperatur gegeben wird. Obschon die Formaldehyd-Fixierung erreicht werden kann, solange die Zellen in einer Zellseparationssäule rückgehalten werden, wird dies vorzugsweise an den Zellen vor der Aufbringung auf die Säule vorgenommen. Die Fixierung kann vor oder nach der magnetischen Markierung vorgenommen werden. Nach den Fixierungs- und Inkubationsschritten können die Zellen direkt auf die Zellseparationssäule für die Auftrennung und für die weitere Modifikation an der Säule aufgebracht werden. Dies reduziert die Bildung von Aggregaten, was auftreten kann, wenn die Fixierung an in einer Säule immobilisierten Zellen vorgenommen wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „intrazelluläre Färbung" auf den Prozess des Bindens einer Markierung an ein intrazelluläres Molekül, Komponente oder Struktur, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Proteine, Enzyme, Nukleotide, Chromosomen, Immunglobuline oder Immunglobulin-Komponenten oder Membranen. Typischerweise werden die Zellen vor der intrazellulären Färbung permeabilisiert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Permeabilisierung" einer Zelle auf einen Vorgang, welcher den Zugang zum zellulären Cytoplasma oder zu intrazellulären Molekülen, Komponenten oder Strukturen einer Zelle erleichtert. Die Permeabilisierung kann mittels jeglicher im Fachgebiet bekannten Methode vorgenommen werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Exposition an Formaldehyd, Ethanol oder Detergenzien. Saponin in Puffer ist gemäß der Erfindung erfolgreich angewendet worden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Transfektion" auf die genetische Modifikation kultivierter Zellen durch die Aufnahme von DNA, welche gewöhnlich in Form von Plasmiden oder anderen Arten von DNA-Vektoren, die die Gene von Interesse enthalten, eingebracht wird. Die Transfektion kann mittels jeglicher im Fachgebiet bekannter Methode erfolgen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Calciumphosphat- oder DEA-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder durch die Verwendung viraler Vektoren, wie etwa adenoviraler oder retroviraler Vektoren.
Ein wie hierin verwendeter „Vektor" ist ein kleines Träger-DNA-Molekül, in das eine DNA-Sequenz zur Einführung in eine Wirtszelle inseriert werden kann, wo sie repliziert und/oder exprimiert werden wird. Vektoren können von Plasmiden, Bakteriophagen oder Pflanzen- oder Tierviren abgeleitet sein.
Wie hierin verwendet, ist ein „biologischer Modifikator" jegliche biologische Verbindung, die zur Hervorbringung einer Reaktion oder Veränderung in der Aktivität einer lebenden Zelle fähig ist. Solche Modifikatoren können die zelluläre Aktivität beschleunigen oder entschleunigen, die Mitose stimulieren oder verzögern, bestimmte Gene aktivieren oder desaktivieren, die Zellempfänglichkeit oder Durchlässigkeit erhöhen oder vermindern oder andere Veränderungen bewirken. Zu Beispielen der biologischen Modifikatoren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmakologische Agenzien, Cytokine, Interleukine, Hormone, Wachstumsfaktoren und weitere interzelluläre oder intrazelluläre Signale.
Wie hierin verwendet, sind „pharmakologische Agenzien" jegliche aus einer Reihe von Substanzen, die für die Behandlung von Erkrankungen oder Dysfunktionen verfügbar sind.
Wie hierin verwendet, sind „chemische Agenzien" jegliche aus einer Reihe von Substanzen, die eine chemische Reaktion mit einer Zelle bewirken. Zu Beispielen der chemischen Agenzien zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Säuren, Basen, Färbemittel und Lösungsmittel.
HGMS und Modifikation der selektionierten Zellen
Die Erfindung wird vorzugsweise bewerkstelligt, indem zunächst selektionierte Zellen mit einer Markierung markiert werden, umfassend einen magnetischen Partikel von typischerweise 20–100 nm Durchmesser. Solche Mikrokügelchen sind kommerziell beziehbar als magnetische Mikrobeads, die kovalent an eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern konjugiert sind (z.B. MicroBeads von Miltenyi Biotec GmbH, Fried rich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland), wobei die Markierung mittels im Fachgebiet bekannter Methoden erreicht wird. Zu diesem Stadium kann auch eine Fluoreszenz-Markierung der selektionierten Zellen vorgenommen werden. Wenn möglich, werden die Zellen vorzugsweise zu diesem Stadium gewaschen und in einem geeigneten Puffer, z.B. PBS/BSA/EDTA, suspendiert.
Die magnetisch markierten, selektionierten Zellen werden dann auf eine Hochgradienten-Magnetzellseparations-(HGMS)-Säule aufgebracht. HGMS-Säulen sind beschrieben in US-Patent-Nr. 5 411 863 und kommerziell beziehbar als MACS^®-Hochgradienten-Magnetseparationssäulen von Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland). Es kann jedoch jegliche im Fachgebiet bekannte Hochgradienten-Magnetzellseparation gemäß dieser Erfindung verwendet werden.
Die Magnetzellseparationssäule hält die selektionierten Zellen in der Säule zurück, wobei unmarkierte Zellen (oder anderes unerwünschte Material) durchlaufen darf. Typischerweise enthält die Säule eine ferromagnetische Matrix und wird in ein starkes externes Magnetfeld platziert, wobei die markierten, selektionierten Zellen magnetisch an der Matrix in der Säule immobilisiert werden. Vorzugsweise wird die Säule gewaschen, solange die Zellen immobilisiert sind, um die Homogenität der rückgehaltenen Zellpopulation zu erhöhen.
Solange selektiv in der Säule rückgehalten, sind die selektionierten Zellen relativ homogen. Dies bietet ein optimales Setting für die selektive Modifikation dieser Zellen, da die Konzentration des Modifikationsmittels minimiert werden kann bei gleichzeitiger Maximierung der Effizienz der Modifikation. Darüber hinaus können aufeinander folgende oder vielfache Modifikationen gemäß der Erfindung vorgenommen werden. Zum Beispiel können die immobilisierten Zellen modifiziert, gespült und dann angefärbt werden, bevor sie aus der Säule eluiert werden. Alternativ können die immobilisierten Zellen modifiziert, gespült und entfernt, außerhalb der Säule behandelt und wieder auf eine Säule aufgebracht, immobilisiert und angefärbt und dann nochmals entfernt werden. Die Modifikation kann eine Fixierung und/oder Permeabilisierung umfassen, woraufhin eine weitere Modifikation, z.B. eine intrazelluläre Fär bung, vorgenommen werden kann. Zu weiteren Modifikationen zählen eine Oberflächenfärbung, wie oben und in den folgenden Beispielen beschrieben. Ein Flussdiagramm, das diesen Prozess beschreibt, ist in 2 bereitgestellt.
Der Bereich der Modifikationen ist nicht auf analytische oder Färbeprotokolle beschränkt; vielmehr kann jegliche im Fachgebiet bekannte zelluläre Modifikation gemäß dieser Erfindung adaptiert werden. So liegt zum Beispiel die Modifikation durch Anwenden irgendeines Modifikationsmittels, biologischen Modifikators, pharmakologischen Agens, chemischen Agens oder Enzyms an den in der Säule rückgehaltenen Zellen innerhalb des Rahmens der Erfindung. Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, doch nicht zur Beschränkung, des Rahmens der Erfindung bereitgestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1: Fixierung und kombinierte intrazelluläre und Oberflächenfärbung von CD-138-positiven peripheren mononuklearen Blutzellen
Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden mit Zellen der CD138-exprimierenden U266-Myelomzelllinie in einem Verhältnis von 200:1 gemischt, was 0,5% U266-Zellen unter den PBMCs ergab. 5 × 10⁷ Zellen wurden mit Maus-Anti-CD138 mAb B-B4-konjugierten MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) in 1000 μl PBS/BSA/EDTA (Puffer) für 15 Minuten bei 8°C markiert. Phycoerythrin-konjugierter Maus-Anti-CD138 mAb B-B4 (CD138.PE) (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) wurde für weitere 5 Minuten bei 8°C hinzugefügt. Die Zellen wurden gewaschen und in 500 μl Puffer resuspendiert.
CD138-positive Zellen wurden mit dem MACS^®-Magnetzellseparationssystem (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) angereichert. Die magnetisch markierte Zellsuspension wurde auf eine Separationssäule in einer MiniMACS-Separationseinheit (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) pipettiert. Die Zellsuspensi on durfte durchlaufen und die Säule wurde mit 3 × 500 μl Puffer gewaschen. Der Ablauf wurde als einer negativen Fraktion gesammelt. Die Säule wurde vom Separator entfernt und auf einem geeigneten Röhrchen platziert. 0,5 ml PBS/EDTA, enthaltend 2% Formaldehyd (Merck), wurde oben auf eine Säule pipettiert, und magnetisch markierte Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült. Die eluierten Zellen wurden für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und direkt auf die obere Öffnung einer zweiten Separationssäule in einer MiniMACS-Separationseinheit aufgebracht. Die Zellsuspension durfte durchlaufen und die Säule wurde mit 2 × 500 μl Puffer, enthaltend 0,5% Saponin (Saponin-Puffer von Serva, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Deutschland) gewaschen. Der Ablauf wurde als einer negativen Fraktion gesammelt. Dann wurden 100 μl Saponin-Puffer, enthaltend 10 μg/ml Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC (Southern Biotechnology Associates (SBA) 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, USA) und 2 μg/ml Phycoerythrin-konjugierter Maus-Anti-CD138 mAb B-B2 (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) auf die Säule aufgebracht und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde mit 1 × 500 μl Saponin-Puffer gewaschen. Die Säule wurde vom Separator entfernt und auf einen geeigneten Behälter zum Erhalt des Eluats platziert. 0,5 ml Puffer wurden oben auf die Säule pipettiert, und die magnetisch markierten Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült.
Parallel dazu wurden CD138-positive Zellen um zwei Runden der MiniMACS-Separation zum Vergleich der Auftrennleistungen angereichert.
Die Ausgangszellen (d.h. vor der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation), die negativen Zellfraktionen (der ersten als auch der zweiten MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation) und die positiven Zellfraktionen der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. FACScan und CELLQuest Research-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) wurden für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. Tote Zellen und Zelltrümmer wurden entsprechend ihren Streueigenschaften und der Färbung mit Propidiumiodid (PI: 0.3 μg/ml) für lebende Zellen ausgeschlossen.
Die Ergebnisse sind in 4A–4C gezeigt. 4A zeigt die CD138.PE gg. PI-Färbung der Zellen vor der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation. Bei der Kontrollauftrennung wurden CD138-positive Zellen bis zu 52% Reinheit unter allen (ungated) Zellen angereichert (entsprechend einer 98%-igen Reinheit der Lebendzellen), CD138-positive Zellen wurden auf 64% Reinheit unter allen (ungated) Zellen in der Auftrennung einschließlich der Fixierung und intrazellulären Färbung angereichert. 4B zeigt die CD138.PE-Färbung gg. FL3-Autofluoreszenz der fixierten positiven Zellfraktion nach einer zweiten MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation mit Gating an CD138-positiven Zellen. Der FL3-Kanal des Durchflusszytometers sammelt fluoreszierendes Licht bei gleich oder größer 650 nm. 4C zeigt die intrazelluläre Färbung der humanen Immunglobulin-Lambda-Leichtkette gg. CD138.PE-Färbung an gesteuerten (gated) Zellen. Nahezu alle CD138-positiven Zellen exprimieren intrazelluläre Lambda-Leichtketten, wie für U266-Zellen berichtet. Ebenso waren die Rückgewinnungen an CD138+-Zellen in den positiven Fraktionen bei beiden Auftrennungen mit 81% bzw. 91% sehr ähnlich. Somit waren die Auftrennleistungen für beide Fälle gleichwertig.
Beispiel 2: Fraktion und intrazelluläre Färbung der Leukapherese-Probe
Eine Leukapherese-Probe eines Multiples Myelom-Patienten wurde mit Maus-Anti-CD138 mAb B-B4-konjugierten MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) in PBS/BSA/EDTA (Puffer) für 15 Minuten bei 8°C markiert. Phycoerythrin-konjugierter Maus-Anti-CD138 mAb B-B4 (CD138.PE) (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) wurde für weitere 5 Minuten bei 8°C zugesetzt. Die Zellen wurden gewaschen und in 2 ml Puffer resuspendiert. CD138 wird an normalen als auch malignen Plasmazellen exprimiert.
CD138-positive Zellen wurden mit der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation angereichert. Die magnetisch markierte Zellsuspension wurde oben auf eine VS+-Separationssäule in einer MidiMACS-Separationseinheit (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) pipettiert, woraufhin die Zellsuspension durchlaufen durfte und die Säule mit 3 × 3 ml Puffer gewa schen wurde. Der Ablauf wurde als einer negativen Fraktion gesammelt. Die Säule wurde vom Separator entfernt und auf einem geeigneten Röhrchen platziert. 5 ml PBS/EDTA wurden oben auf eine Säule pipettiert, und magnetisch markierte Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült. Ein Teil der Zellen wurde direkt in eine zweite Runde der MiniMACS-Separation eingebracht. Dem anderen Teil der Zellen (5 × 10⁵ Zellen in 1 ml) wurde das selbe Volumen an Puffer, enthaltend 4% Formaldehyd (Merck) zugesetzt und dies für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Zellen in zwei Proben aufgeteilt und direkt oben auf die beiden Separationssäulen in 2 MiniMACS-Separationseinheiten aufgebracht. Die Zellsuspensionen durften durch die Säule wandern, woraufhin die Säulen mit 2 × 500 μl Puffer, enthaltend 0,5% Saponin (Saponin-Puffer, Serva, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Deutschland) gewaschen wurden. Die Abläufe wurden als negative Fraktionen gesammelt. Dann wurden 100 μl Saponin-Puffer, enthaltend 2 μg/ml CD138.PE und 10 μg/ml Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, USA) auf eine Säule aufgebracht, und 100 μl Saponin-Puffer, enthaltend 2 μg/ml CD138.PE und 10 μg/ml Ziege-Anti-Human-Kappa.FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, USA), wurde auf die andere aufgebracht. Beide Säulen wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säulen wurden mit 1 × 500 μl Saponin-Puffer und 1 × 500 μl Puffer gewaschen. Die Säulen wurden von den Separatoren entfernt und auf geeigneten Röhrchen platziert. 0,5 ml Puffer wurde oben auf jede Säule pipettiert, und die magnetisch markierten Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült.
Die Ausgangszellen (d.h. vor der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation), die negativen Zellfraktionen (der ersten als auch der zweiten MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation) und die positiven Zellfraktionen der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. FACScan und CELLQuest-Research-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) wurden für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. Tote Zellen und Zelltrümmer wurden entsprechend den Streueigenschaften und der Färbung mit Propidiumiodid (PI: 0,3 μg/ml) für Lebendzellen ausgeschlossen.
Die Ergebnisse sind in 5A–5D und 6A–6D gezeigt. 5A und 5B zeigen die CD138.PE-Färbung der Lebendzellen vor und nach der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation. 6A und 6B zeigen die CD138.PE-Färbung gg. FL3-Autofluoreszenz der positiven Fraktion der fixierten Zellen nach der zweiten MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation mit Gating an CD138-positiven Zellen. Die Dot-Plots 6C und 6D zeigen die intrazelluläre Färbung der humanen Immunglobulin-Lambda (6C) oder -Kappa-Leichtkette (6D) gg. CD138.PE-Färbung an gesteuerten (gated) Zellen. Etwa 96% der CD138-positiven Zellen exprimieren die intrazelluläre Kappa-Leichtkette, und dementsprechend exprimieren 4% der CD138-positiven Zellen die intrazelluläre Lambda-Leichtkette, was das Vorhandensein einer monoklonalen Tumorzellpopulation anzeigt.
Beispiel 3: Selektive intrazelluläre Färbung der U266-Zellen aus einer heterogenen Suspension
Zellen der Karzinomzelllinie SKBR3 wurden mit Zellen der Myelomzelllinie U266 bei einem Verhältnis von 1:1 gemischt. 2 × 10⁶ Zellen wurden mit Maus-Anti-CD138 mAb B-B4-konjugierten MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) und Maus-Anti-Humanepithel-Antigen (HEA) MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) in 100 μl PBS/BSA/EDTA (Puffer) für 15 Minuten bei 8°C markiert. Die Zellen wurden gewaschen und in 1 ml Puffer resuspendiert. Dann wurde 1 ml Puffer, enthaltend 4% Formaldehyd (Merck), zugegeben und dies für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die magnetisch markierte und fixierte Zellsuspension wurde direkt auf eine Separationssäule in einer MiniMACS-Separationseinheit pipettiert. Die Zellsuspension durfte durch die Säule laufen, und die Säule wurde mit 2 × 500 μl Puffer, enthaltend 0,5% Saponin (Saponin-Puffer, Serva, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Deutschland) gewaschen. Der Ablauf wurde als einer negativen Fraktion gesammelt. Dann wurden 100 μl Saponin-Puffer, enthaltend 10 μg/ml Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, USA) auf die Säule aufgebracht und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde vom Separator entfernt und auf einen geeigneten Behälter zum Auffangen des Eluats platziert. 0,5 ml Puffer wurde oben auf die Säule pipettiert, und die magnetisch markierten Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült.
Parallel dazu wurden 2 × 10⁶ Zellen in Puffer, enthaltend 2% Formaldehyd (Merck), für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden mit Saponin-Puffer gewaschen, in 15 μl Saponin-Puffer, enthaltend 10 μg/ml Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, USA) resuspendiert und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit Saponin-Puffer gewaschen und in Puffer resuspendiert.
Die Kontrollprobe und die positiven Zellfraktionen aus der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. FACScan und CELLQuest-Research-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) wurden für die durchflusszytometrische Analyse verwendet.
Die Ergebnisse sind in 7A–7B und in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. 7A und 7B zeigen die Ziege-Anti-Human-Lambda.FITC-Färbung der Zellen, die an der Säule (7A) oder außerhalb der Säule (7B) gefärbt worden waren. In beiden Proben exprimieren etwa 50% der Zellen die intrazelluläre Kappa-Leichtkette, wie für U266-Zellen berichtet, bei sehr ähnlichen Färbeintensitäten (Tabelle 2). Somit ist die Färbung der Zellen an der Säule mindestens so wirksam wie die Färbung in Suspension.
Tabelle 2 Mittlere Intensität der Fluoreszenz-Färbung der
Beispiel 4: Oberflächenfärbung verschiedener Ig-Klassen an CD138-Zellen, einschließlich einer Streptavidin/Biotin-Bindung
4 × 10⁸ periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden mit Maus-Anti-CD138 mAb B-B4-konjugierten MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) in 2 ml PBS/BSA/EDTA (Puffer) für 30 min bei 8°C markiert. Die Zellen wurden gewaschen und in 2 ml Puffer resuspendiert.
CD138-positive Zellen wurden mit dem MACS^®-Magnetzellseparationssystem (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) angereichert. Die magnetisch markierte Zellsuspension wurden oben auf eine Separationssäule in einer MiniMACS-Separationseinheit pipettiert, woraufhin die Zellsuspension durchlaufen durfte und die Säule mit 3 × 500 μl Puffer gewaschen wurde. Der Ablauf wurde als einer negativen Fraktion gesammelt. Die Säule wurde vom Separator entfernt und auf einen geeigneten Behälter zum Auffangen des Eluats platziert. 1,5 ml Puffer wurden oben auf die Säule pipettiert, und die magnetisch markierten Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült. Die eluierten Zellen wurden aufgeteilt und direkt oben auf drei verschiedene Separationssäulen (a, b und c) in MiniMACS-Separationseinheiten appliziert. Die Zellsuspensionen durften durch die Säulen laufen, woraufhin jede Säule mit 2 × 500 μl Puffer gewaschen wurde. Die Abläufe wurden als negative Fraktionen gesammelt. Daraufhin wurden 100 μl Puffer, enthaltend Phycoerythrin-konjugierten Maus-Anti-CD138 mAb B-B4 (CD138.PE) (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland), Maus-Anti-CD19.Cy5 und (a) 5 μg/ml Maus-Anti-Human-IgA.Biotin, (b) 5 μg/ml Maus-Anti-Human-IgM.FITC oder (c) 2 μg/ml Maus-Anti-Human-IgG.FITC (alle erhalten von Southern Biotechnology Associates, SBA 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, USA) jeweils auf die verschiedenen Säulen aufgebracht und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Säule wurde mit 500 μl Puffer gewaschen. Für (a) wurden weitere 100 μl Puffer, enthaltend 2 μg/ml Streptavidin.FITC, aufgebracht, gefolgt von einer Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur und einem Waschschritt mit 500 μl Puffer. Die Säulen wurden vom Separator entfernt und auf einen geeigneten Behälter zum Auffangen des Eluats platziert. 0,5 ml Puffer wurde oben auf jede Säule pipettiert, und die magnetisch markierten Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült.
Die Ausgangszellen (d.h. vor der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation) und die positiven Zellfraktionen der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. FACScan und CELLQuest-Research-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) wurden für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. Tote Zellen und Zelltrümmer wurden entsprechend den Streueigenschaften und der Färbung mit Propidiumiodid (PI; 0,3 μg/ml) ausgeschlossen.
Der Großteil, nämlich etwa 50% der CD138+-Zellen aus den normalen PBMC exprimieren Oberflächen-IgA, während etwa 32% Oberflächen-IgM exprimieren und etwa 3% Oberflächen-IgG exprimieren.
Beispiel 5: Oberflächenfärbung von CD19 gg. CD4-Lymphozyten im Anschluss an die CD45-Isolierung direkt aus Vollblut
1 ml heparinisiertes menschliches Blut wurde mit 20 μl humanen CD45-MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) für 30 Minuten bei Raumtemperatur markiert. Dann wurde 1 ml PBS/EDTA zugegeben.
CD45-positive Zellen wurden dann mit dem MACS^®-Magnetzellseparationssystem (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Deutschland) angereichert. Die magnetisch markierte Zellsuspension wurde oben auf eine Separationssäule in einer MiniMACS-Separationseinheit pipettiert. Die Zellsuspension durfte durch die Säule laufen, woraufhin die Säule mit 2 × 500 μl Puffer gewaschen wurde. Der Ablauf wurde als einer negativen Fraktion gesammelt. Dann wurden 100 μl Puffer, enthaltend Phycoerythrin-konjugierten CD19 mAb (CD19.PE) und FITC-konjugierten CD4 mAb (CD4.FITC) auf die Säule aufgebracht und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde mit 500 μl Puffer gewaschen. Die Säule wurde vom Separator entfernt und auf einen geeigneten Behälter zum Sammeln des Eluats platziert. 0,5 ml Puffer wurden oben auf jede Säule pipettiert, und die magnetisch markierten Zellen wurden unter Verwendung eines Tauchkolbens herausgespült.
Die positive Zellfraktion der MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. FACScan und CELLQuest-Research-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) wurden für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. Tote Zellen, nicht-nukleierte Zellen und Zelltrümmer wurden entsprechend den Streueigenschaften (R1-Gating) und der Färbung mit Propidiumiodid (PI, 0,3 μg/ml) und LDS 751 (1 μg/ml) (R2-Gating) ausgeschlossen.
Wie in 9C gezeigt, können CD19+-B-Zellen, CD4++-T-Zellen und CD4dim-Monozyten eindeutig in der positiven Fraktion unterschieden werden. Es liegt keine wesentliche Anzahl an doppelt-positiven Zellen vor, wie zu erwarten gewesen wäre, wenn verschiedene Subtypen von CD45+-Lymphozyt-artigen B-Zellen, T-Zellen oder Monozyten stabile Aggregate auf die CD45-MACS^®-Hochgradienten-Magnetzellseparation und Färbung an der Säule hin bilden würden.
10 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Photographie einer Eisenkügelchen-Matrix einer MS+-Säule mit an die Matrix gebundenen magnetisch markierten CD8+-Zellen. 10 zeigt, dass die Zellen nicht homogen verteilt über die gesamte Matrixoberfläche sind, sondern auf bestimmte Bereiche konzentriert sind. Die Zellen sind nicht als eine Monoschicht immobilisiert. Statt dessen befinden sich viele Zellen häufig in sehr dichter Nachbarschaft.
Obschon die vorangegangene Erfindung anhand von Erläuterung und Beispiel zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses ausführlich beschrieben worden ist, wird für Fachleute des Gebiets erkennbar sein, dass gewisse Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können. Daher sollten die Beschreibung und die Beispiele nicht als Beschränkung des Rahmens der Erfindung, der durch die Ansprüche im Anhang definiert ist, verstanden sein.

Claims

Verfahren zum Modifizieren ausgewählter Zellen, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Aufgeben einer Population von Zellen auf eine Hochgradienten-Magnetseparationssäule, wobei die Säule eine Matrix umfasst, die mehr als 50% des Gesamtvolumens der Säule ausmacht, wobei die Population von Zellen magnetisch markierte ausgewählte Zellen umfasst; (b) Rückhalten der magnetisch markierten ausgewählten Zellen in der Säule, während unmarkierte Zellen durchpassieren dürfen; (c) Waschen der ausgewählten Zellen, während die ausgewählten Zellen durch die Säule rückgehalten werden; und (d) Modifizieren der ausgewählten Zellen, während die ausgewählten Zellen durch die Säule rückgehalten werden; wobei Schritt (c) optional ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Volumen der Matrix mehr als 60% des Gesamtvolumens der Säule beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Modifizieren das intrazelluläre Anfärben der ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Durchlässigmachen der ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren ein zweites Markieren der ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Binden einer biologisch reaktiven Verbindung an die ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die biologisch reaktive Verbindung Antikörper, Liganden, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Polynukleotide, Oligonukleotide, Lektine, Lipide oder Enzyme umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Transfizieren der ausgewählten Zellen mit einem Expressionsvektor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Zuführen eines Enzyms zu den ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Zuführen eines pharmakologischen Agens zu den ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Zuführen eines biologischen Modifikators zu den ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Zuführen eines chemischen Agens zu den ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifizieren das Zuführen eines ersten und eines zweiten modifizierenden Mittels zu den ausgewählten Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches außerdem den Schritt des Entfernens der ausgewählten Zellen aus der Säule nach ihrer Modifikation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Entfernen durch Entfernen des magnetischen Feldes erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, weiterhin umfassend das Aufgeben der entfernten, ausgewählten Zellen auf eine zweite Hochgradienten-Magnetseparationssäule, so dass die ausgewählten Zellen durch die zweite Säule rückgehalten werden; und das weitere Modifizieren der ausgewählten Zellen, die durch die zweite Säule rückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 16, außerdem umfassend den Schritt des Entfernens der ausgewählten Zellen aus der zweiten Säule nach ihrer weiteren Modifikation.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Matrix ferromagnetische Kügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die ferromagnetischen Kügelchen mit einem biokompatiblen Polymer überzogen sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Population von Zellen menschliche Blutzellen umfasst.