DE60020119T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Wirksstoffskandidaten und zur Bestimmung ihrer pharmakokinetischen Parametern - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Wirksstoffskandidaten und zur Bestimmung ihrer pharmakokinetischen Parametern Download PDF

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Description

  • TECHNISCHER BEREICH
  • Diese Erfindung richtet sich allgemein auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten und im Spezielleren auf ein Verfahren zum Messen der Bindungswechselwirkung zwischen einem Wirkstoffkandidaten und erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomolekülen eines Biosensors, um einen Bindungswechselwirkungsparameter des Wirkstoffkandidaten zu bestimmen, und dann vergleichen des Bindungswechselwirkungsparameters mit einem vorbestimmten Wirkstoffkorrelationsgraphen (z.B. einem mathematischen Ausdruck), um mindestens einen pharmakokinetischen Parameter abzuschätzen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Mehrere experimentelle Techniken werden derzeit verwendet, um chemische, physikalische und biologische Eigenschaften, die mit Substanzen mit geringem Molekulargewicht, insbesondere in Zusammenhang mit der Arzneimittelforschung, verbunden sind, zu bestimmen. Zum Beispiel sind Forscher häufig beschäftigt mit der Bestimmung einer Vielzahl chemischer, physikalischer und biologischer Eigenschaften, die mit Wirkstoffkandidaten für Untersuchungszwecke bzw. Screeningzwecke verbunden sind. Die Bestimmung solcher Eigenschaften spielt häufig eine zentrale Rolle bei der Wirkstoffentwicklung und im Screeningverfahren.
  • Im Spezielleren ist seit langem erkannt worden, dass die Intensität und Dauer der pharmakologischen Wirkung eines systemisch wirkenden Wirkstoffes nicht nur Funktionen der Wirkstoff-eigenen Aktivität sind, sondern auch seiner Absorption, Verteilung, seines Metabolismus und der Exkretions-(ADME)-Charakteristika innerhalb des menschlichen Körpers. Diese sogenannten ADME-Charakteristika sind alle eng verbunden mit der wissenschaftlichen Disziplin, die als "Pharmakokinetik" bekannt ist. Pharmakokinetik wird allgemein bezeichnet als das Studium des zeitlichen Verlaufes (d.h. Kinetik), die verbunden ist mit den dynamischen Prozessen von ADME und eines Wirkstoffes und/oder seiner Metaboliten innerhalb eines lebenden Organismus und ist eng verbunden mit den Bereichen der Biopharmazeutika, Pharmakologie und Therapeutika.
  • Da der Körper den Transport von Wirkstoffmolekülen durch Membranen verzögert, sie in verschiedenen Verteilungskompartimenten verdünnt, sie in Metaboliten überführt und sie gegebenenfalls ausscheidet, ist es häufig schwierig, genau die pharmakologische Wirkung von vielversprechenden neuen Wirkstoffkandidaten vorherzusagen. Forscher verwenden jedoch üblicherweise Pharmakokinetik-ADME-Studien als ein Verfahren zum Vorhersagen der Wirksamkeit eines Arzneimittels an einer Wirkstelle innerhalb des Körpers.
  • Herkömmlicherweise verwendeten Forscher, die mit vorklinischen ADME-Studien beschäftigt sind, pharmakokinetische/mathematische Modelle, gekoppelt mit den tatsächlichen Wirkstoffkonzentrationsdaten von Blut (oder Serum oder Plasma) und/oder Urin, als auch Konzentrationsdaten aus verschiedenen Geweben, um das Verhalten und das "Schicksal" eines Wirkstoffs innerhalb eines lebenden Organismus zu charakterisieren. Nach Einschätzung des Fachmannes in der Technik basieren die mathematischen Gleichungen, die mit Pharmakokinetika verbunden sind, allgemein auf Modellen, die den Körper als Multikompartimentorganismus betrachten. In solchen Modellen wird angenommen, dass der Wirkstoff und/oder seine Metaboliten gleichmäßig in einem oder mehreren verschiedenen Fluiden/Geweben des Organismus verteilt werden. Jedes Konglomerat von Fluid oder Gewebe welches so wirkt, als wäre es kinetisch homogen, kann als "Kompartiment" bezeichnet werden. Jedes Kompartiment wirkt als ein isotropes Fluid, worin die eintretenden Moleküle des Wirkstoffes homogen verteilt werden und worin kinetische Abhängigkeiten von den dynamischen pharmakokinetischen Prozessen formuliert werden können als Funktionen der Mengen oder Konzentrationen des Wirkstoffes und der Metaboliten darin. Anders ausgedrückt, sind die konzeptiven Kompartimente des Körpers durch Barrieren getrennt, die die freie Diffusion von Wirkstoff zwischen ihnen verhindern; die Barrieren sind kinetisch so definierbar, dass die Transportrate des Wirkstoffs oder Metaboliten durch Membranbarrieren zwischen Kompartimenten eine Funktion z.B. der Mengen oder Konzentrationen des Wirkstoffs und der Metaboliten in den Kompartimenten, der Permeabilität verschiedener Membranen und/oder des Ausmaßes von Plasmaproteinbindung und allgemeiner Gewebebindung ist.
  • Im Spezielleren werden pharmakokinetische/mathematische Modelle üblicherweise von Pharmakokinetikern verwendet, um Wirkstoffabsorption, – verteilung, -metabolismus und – exkretion als Funktionen der Zeit innerhalb der verschiedenen Gewebe und Organe des Körpers darzustellen. In solchen Modellen wird die Bewegung des verabreichten Wirkstoffes durch den Körper exakt in mathematischen Ausdrücken beschrieben (z.B. durch einen Satz von Differentialgleichungen). Die Vorhersagefähigkeit solcher Modelle liegt in der geeigeneten Auswahl und Entwicklung mathematischer Funktionen, die die wesentlichen Faktoren, die den betrachteten kinetischen Prozess bestimmen, in Parameter fassen.
  • Zum Beispiel kann angenommen werden, dass sich ein Wirkstoff, der durch intravenöse Injektion verabreicht wird, schnell in dem Blutstrom verteilt. Ein pharmakokinetisches/mathematisches Modell, das diese Situation beschreibt, kann ein Behälter sein, der ein Volumen eines Fluids enthält, das rasch mit dem Wirkstoff äquilibriert. Da ein Teil des Wirkstoffs in dem Körper kontinuierlich als eine Funktion der Zeit eliminiert wird (z.B. ausgeschieden wird durch die Nieren und metabolisiert wird durch die Leber), kann die Konzentration des Wirkstoffs in dem hypothetischen Behälter durch zwei Parameter charakterisiert werden: (1) das Volumen des Fluids in dem Behälter, das den Wirkstoff verdünnen wird, und (2) die Eliminierungsrate des Wirkstoffs pro Zeiteinheit, wobei beide allgemein als konstant betrachtet werden. Wenn ein bekannter Satz von Wirkstoffkonzentrationen in dem Behälter zu verschiedenen Zeitintervallen z.B. durch Beprobung, bestimmt wird, dann kann das Volumen des Fluids in dem Behälter und die Rate der Wirkstoffeliminierung abgeschätzt werden. Die Information kann dann umgekehrt verwendet werden, um die Verteilung des Wirkstoffs innerhalb eines menschlichen Körpers vorherzusagen.
  • Theoretisch kann eine unbegrenzte Anzahl von Modellen konstruiert werden, um die kinetischen Prozesse der Wirkstoffabsorption, -verteilung, des Wirkstoffmetabolismus und der Wirkstoffexkretion innerhalb der verschiedenen Gewebe und Organe des menschlichen Körpers zu beschreiben. Im Allgemeinen jedoch ist die Anzahl geeigneter Modelle aufgrund praktischer Betrachtungen begrenzt, die mit Blut-, Gewebe- und/oder Organbeprobung verbunden sind. Als ein Ergebnis und entsprechend der Auffassung des Fachmanns in der Technik sind zwei Hauptmodelltypen durch Pharmakokinetiker entwickelt worden: (1) Kompartimentmodelle und (2) physiologische Modelle.
  • In pharmakokinetischen Kompartimentmodellen wird der Körper als eine Reihe von Kompartimenten dargestellt, die reversibel miteinander kommunizieren. Jedes Kompartiment ist nicht ein realer physiologischer oder anatomischer Bereich; jedes Kompartiment wird eher so betrachtet, dass es inklusive aller Gewebe ist, die einen ähnlichen Blutstrom und ähnliche Wirkstoffaffinität aufweisen. Zum Beispiel kann ein Kompartimentmodell aus einem oder mehreren periphären Kompartimenten bestehen, die Gewebe darstellen, die mit einem zentralen Kompartiment verbunden sind, das den Blutstrom darstellt. Nach dieser Auffassung bewegt sich der Wirkstoff dynamisch in das zentrale Kompartiment hinein und aus dem zentralen Kompartiment heraus und hinein in jedes der periphären Kompartimente und heraus aus jedem der periphären Kompartimente. Als solche können Ratenkonstanten verwendet werden, um den Gesamtratenprozess für Wirkstoffverteilung innerhalb jedes Kompartiments darzustellen. Kompartimentmodelle basieren im Allgemeinen auf linearen Annahmen, unter Verwendung linearer Differentialgleichungen, und sind besonders geeignet wenn wenig Information über die Gewebe und die entsprechenden Wirkstoffkonzentrationen vorliegt.
  • Im Gegensatz hierzu basieren pharmakokinetische physiologische Modelle auf bekannten anatomischen und physiologischen Daten, Daten die kinetisch beschrieben werden im Hinblick auf die tatsächlichen Blutstromvolumina, die für die Verteilung des Wirkstoffs zu den verschiedenen Stellen des Körpers verantwortlich sind. Da es viele Gewebeorgane im Körper gibt, muss jedes Gewebevolumen bestimmt werden und seine Wirkstoffkonzentration und Umwandlungsrate mathematisch beschrieben werden (Gewebe haben ähnliche Blutperfusionseigenschaften, werden jedoch typischerweise zusammengefaßt). Unglücklicherweise ist viel der Information, die erforderlich ist, um solche pharmakokinetischen physiologischen Modelle angemessen zu beschreiben, häufig experimentell schwer zu erhalten. Nichtsdestotrotz werden solche Modelle auf physiologischer Basis üblicherweise in Verbindung mit Tierdaten und maßstäblicher Interspeziesübertragungstechniken verwendet, um die Wirkstoffverteilung innerhalb eines menschlichen Körpers vorherzusagen.
  • Noch wichtiger ist jedoch, dass pharmakokinetische/mathematische Modelle und die Kenntnis der mit ihnen verbundenen ADME-Parameter eine extrem wichtige Rolle in der Wirkstoffentdeckung und -entwicklung spielen. Ein typisches Beispiel ist ein Wirkstoff, der aktiv ist nachfolgend auf intravenöse Verabreichung, jedoch beachtlich weniger aktiv bzw. wirksam ist nach vergleichbaren oralen Dosen. Bei Vorliegen geeigneter pharmakokinetischer Information kann erkannt werden (1) ob der Wirkstoff schlecht absorpiert wurde, um subtherapeutische Zirkulationsgehalte zu erhalten, oder (2) ob der Wirkstoff präsystemischen Metabolismus zu einem inaktiven Metaboliten zeigte. Solche Information kann ebenfalls dazu dienen nachfolgende Entscheidungen zu treffen, wie etwa (1) ob Wirkstoffabsorption verbessert werden kann durch Verändern der Salzform oder Formulierung, (2) ob die Möglichkeit zur Herstellung von Wirkstoffvostufen zu untersuchen ist oder (3) ob eine parenterale Verabreichungsroute zu betrachten ist.
  • Zusätzlich zu dem vorhergehenden werden die pharmakokinetischen/mathematischen Modelle allgemein ebenfalls so betrachtet, dass sie unter anderem besonders geeignet sind für: (1) Vorhersagen von Plasma-, Gewebe- und Urinwirkstoffgehalten mit einer Therapiedosis; (2) Berechnung der optimalen Therapiedosis für einen einzelnen Patienten; (3) Abschätzung der möglichen Akkumulation von Wirkstoffen und/oder Metaboliten; (4) Korrelation von Wirkstoffkonzentrationen mit pharmakologischer und toxikologischer Aktivität (d.h. Pharmakodynamiken); (5) Beurteilung von Unterschieden der Rate oder des Ausmaßes der Verfügbarkeit zwischen Formulierungen (d.h. Bioäquivalenz); (6) Beschreibung wie Veränderungen der Physiologie oder der Erkrankung die Absorption, Verteilung und/oder Eliminierung des Wirkstoffs beeinflussen; und (7) Erklärung von Wirkstoff-Wirkstoff- und Nahrungsmittel-Wirkstoff-Wechselwirkungen.
  • Schließlich sind pharmakokinetische ADME-Daten ebenfalls ein integraler Bestandteil des pharmakologischen Charakterisierungsverfahrens für vielversprechende neue Wirkstoffkandidaten geworden. Zulassungsbehörden, wie etwa die U.S. Food and Drug Administration, fordern nun (1) eine Bestimmung pharmakokinetischer ADME-Daten in Phase I von Wirkstoffstudien und (2) eine Vorlage pharmakokinetischer ADME-Daten als Teil einer New Drug Application (Anwendung neuer Wirkstoffe). In diesem Zusammenhang werden solche pharmakokinetischen ADME-Daten als wesentlich erachtet zum Vorhersagen des Verhaltens und des Schicksals des Arzneimittelkandidaten innerhalb des menschlichen Körpers.
  • Demgemäß besteht ein Bedarf in der Technik für verbesserte Verfahren zum Bestimmen einer oder mehrerer pharmakokinetischer Parameter, die verbunden sind mit Absorption, Verteilung, Metabolismus und Exkretion eines Wirkstoffkandidaten. Es besteht ebenfalls ein Bedarf für Geräte, die zum Ausführen solcher Verfahren geeignet sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und liefert weiterhin damit verbundene Vorteile.
  • WO 99/63333 (veröffentlicht nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung und daher nicht relevant für den erfindungsgemäßen Schritt gemäß Artikel 54(3) EPÜ) offenbart die Charakterisierung eines Analyten und/oder Liganden durch Bestimmen kinetischer Parameter für die biospezifische Wechselwirkung des Analyten mit einem Oberflächen-gebundenen Biosensorliganden in mehreren verschiedenen wässrigen charakterisierenden Lösungen, wie etwa sauren, basischen, ionischen, organischen, Detergenz- oder Chelatisierungslösungen. Durch Vergleich der Charakterisierung des Liganden und/oder Analyten mit einem Satz ähnlicher Charakterisierungen, die für eines oder mehrere vorbestimmte Testmoleküle zuvor bestimmt wurden, kann die Natur der Bindungsaktivität des Analyten oder Liganden vorhergesagt werden.
  • Giorgio, N., et al. (1966) offenbaren in der 87th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, Washington, 20.–24. April, Abstract 1230, die Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz (SPR), durchgeführt mit BioacoreTM-Technologie, um Zirkulationsgehalte von C225, ein monoklonaler chimärer Human/Maus-Antikörper, der mit hoher Affinität an den EGF-Rezeptor bindet. SPR wurde ebenfalls verwendet, um Anti-C225-Antikörperkonzentrationen zu bestimmen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Kurz dargestellt, richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten. Im Spezielleren offenbart diese Erfindung ein Verfahren zum Messen der Bindungswechselwirkung zwischen einem Wirkstoffkandidaten und zum Nachweisen Oberflächen-gebundener Biomoleküle eines Biosensors, um einen Bindungswechselwirkungsparameter des Wirkstoffkandidaten zu bestimmen und dann zum Vergleichen des Bindungswechselwirkungsparameters mit einem vorbestimmten Wirkstoffkorrelationsgraphen, um mindestens einen pharmakokinetischen Parameter des Wirkstoffkandidaten abzuschätzen. Der mindestens eine pharmakokinetische Parameter kann z.B. einer oder mehrere von ADME sein.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei pharmakokinetische Parameter des Wirkstoffkandidaten bestimmt und in einer noch weiteren Ausführungsform wird mindestens ein pharmakokinetischer Parameter und eine Löslichkeitseigenschaft des Wirkstoffkandidaten bestimmt. Solche pharmakokinetische Parameter und/oder eine Löslichkeitseigenschaft könnten bestimmt werden wenn die eine oder die mehreren erfassenden Oberflächen-gebundene Biomoleküle ausgewählt sind aus z.B. Liposomen, Plasmaproteinen, CYP 450 Enzymen, metabolischen Enzymen oder Transportproteinen.
  • Der Biosensor, der in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine Masseerfassungstechnik, wie etwa Oberflächenplasmonresonanz, verwenden. Darüber hinaus kann der Biosensor weiterhin einen Sensorchip umfassen, worin der Sensorchip ein Metall mit freien Elektronen umfasst, das eine erfassende Oberfläche aufweist, worin das Metall mit freien Elektronen, Kupfer, Silber, Aluminium oder Gold ist. Der Sensorchip kann weiterhin ein Hydrogel umfassen, das mit der Sensoroberfläche gekoppelt ist, worin das Hydrogel mehrere funktionelle Gruppen aufweist, und worin das eine oder die mehreren erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomoleküle) kovalent an das Hydrogel gebunden ist (sind).
  • In einer spezielleren Ausführungsform wird eine Sensoroberfläche offenbart, die zur Verwendung mit einem Biosensor eingerichtet ist, offenbart. Die Sensoroberfläche umfasst eine Hydrogelmatrixbeschichtung, gekoppelt an die obere Fläche der Sensoroberfläche, worin die Hydrogelmatrixbeschichtung mehrere funktionelle Gruppen aufweist. Mindestens zwei verschiedene Liposomen sind an die mehreren funktionellen Gruppen an diskreten und nicht benachbarten Stellen auf der Hydrogelmatrixbeschichtung der Sensoroberfläche bzw. erfassenden Oberfläche gebunden. In einer Ausführungsform ist die Sensoroberfläche ein Sensorchip und ein Metall mit freien Elektronen ist zwischen der Hydrogelmatrix und der oberen Oberfläche der Sensoroberfläche eingelagert.
  • In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird eine Vorrichtung offenbart zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten, worin die Vorrichtung einen Biosensor mit einem oder mehreren erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomolekülen, die damit verbunden sind, der in der Lage ist zum Messen mindestens eines Bindungswechselwirkungsparameters des Wirkstoffkandidaten, und einen Computerspeicher, der eine Datenstruktur aufweist zum Vergleichen des mindestens einen Bindungswechselwirkungsparameters mit mindestens einem mathematischen Ausdruck, korrelierend mit den Bindungswechselwirkungsdaten, die mit bekannten Wirkstoffverbindungen verbunden sind, die bekannte pharmakokinetische Parameter aufweisen, um eine Einschätzung mindestens eines pharmakokinetischen Parameter des Wirkstoffkandidaten vorzunehmen, umfasst.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die damit verbundenen Figuren ersichtlich werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A zeigt ein Sensorgramm, das für die Bindungsgrade im stationären Zustand beispielhaft ist, die mit einer ausgewählten Wirkstoff-Biomolekül-Wechselwirkung verbunden sind.
  • 1B zeigt einen vergrößerten Teil des Sensorgramms in 1A und zeigt Sensorgrammunregelmäßigkeiten.
  • 1C zeigt einen vergrößerten Teil des Sensorgramms von 1A, worin Masserefraktionsindexwirkungen eliminiert worden sind.
  • 2A zeigt eine einzelne "Senke" ("dip"), die die reflektierte Lichtintensität zeigt, die mit einer homogenen Sensoroberfläche verbunden ist.
  • 2B zeigt mehrere "Senken", die die nicht-gemittelten reflektierten Lichtintensitäten, die mit einer nicht-homogenen Sensoroberfläche verbunden sind, zeigen.
  • 2C zeigt eine Verbreiterung der "Senke" ("dip"), was die gemittelten reflektierten Lichtintensitäten zeigt, die mit einer nicht-homogenen Sensoroberfläche verbunden sind.
  • 3 zeigt ein Blockdiagramm auf hohem Niveau eines beispielhaften Computersystems zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • 4 zeigt einen Korrelationsgraphen mit bekannten KD-Werten für bekannte Verbindungen, aufgetragen entlang der Abszisse (d.h. die x-Achse) und entsprechend gemessenen KD-Werten, erhalten über den Biosensor, aufgetragen entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse) für neun Wirkstoffe mit bekannten Graden Plasmaproteinbindung.
  • 5 zeigt einen Korrelationsgraphen mit entsprechenden Bindungsgraden bei 100 μM (R 100 μM), dividiert durch das Molekulargewicht bekannter Wirkstoffverbindungen, aufgetragen entlang der Abszisse (d.h. die x-Achse) und entsprechende Humanserumalbuminbindungsprozentanteile, gemessen durch Äquilibrierungsdialyse, aufgetragen entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse).
  • 6 zeigt entsprechende Referenzbereinigte Sensorgrammspuren für jeden der drei Wirkstoffkandidaten A-C.
  • 7 zeigt einen Korrelationsgraphen mit bekannten in Menschen absorbierten Anteilen (FA%), aufgetragen entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse) und entsprechenden kalibrierten (d.h. Referenzbereinigt) Stationärszustandsbindungsgraden für jeden Wirkstoff bei 500 μM, aufgetragen entlang der Abszisse in einer 10-Logarithmusskala (d.h. die x-Achse).
  • 8 zeigt ein allgemeines Prinzip für Wechselwirkungsanalyse. Eine Sensorchipoberfläche wird in Kontakt mit der IFC (Integrated Fluidic Cartridge; Integrierte Fluidkartusche) und der Erfassungseinheit angeordnet. Kontinuierlich fließt Puffer durch die IFC und über die Oberfläche. Proben werden über die Oberfläche unter Verwendung des Autoinjektors injiziert und Veränderungen des Brechungsindex werden durch die Erfassungseinheit nachgewiesen.
  • Die 9a–9d zeigen das Folgende: (a) Injektion von Delavirdin gegenüber Referenz und HSA-Flusszelle. Ein hoher Ansprechgrad wurde erhalten, da die DMSO-Konzentration der Probe und des Untersuchungspuffers bei der Probenvorbereitung nicht exakt abgestimmt wurden. (b) Referenzdaten, subtrahiert von HSA-Daten. (c) Eine Reihe von 8 Kalibrierungslösungen (Laufpuffer mit verschiedenen DMSO-Konzentrationen) wurde zu Beginn und am Ende jedes Versuchs laufengelassen. Das Ansprechen der Kalibrierungslösungen, die aus der Referenzoberfläche erhalten wurden, deckten einen Bereich von –500 bis +1000 RU relativ zur Grundlinie ab. Eine DMSO-Kalibrierungskurve wurde entwickelt durch Auftragen des Unterschieds des Ansprechens zwischen HSA und der Referenz-Flusszelle (DMSO-Korrekturfaktor) gegenüber dem Ansprechen in der Referenz-Flusszelle. (d) Verbindungsansprechen wurden korrigiert für DMSO-Massedifferenzen über die Kalibrierungskurven.
  • 10 zeigt eine Dosis-Ansprech-Kurve von sechs Verbindungen, die an HSA binden. In (a) und (b) zeigen Warfarin und Naproxen monophasige Bindungskurven, erhalten durch Anpassen der Daten auf ein Stationärzustandsmodell. In (c) und (d) erscheinen die Bindung von Digitoxin und Ritonavir zweiphasig zu sein. Chinin und Rifampicin ergeben lineare Bindungskurven, (e) und (f). Die Kurven (c–f) wurden durch Anpassungen von vier Parametern erhalten und stellen keine KD-Anpassungen dar.
  • 11 zeigt Biosensordaten von Verbindungen, die an HSA binden, korreliert mit Daten, die mit anderen Techniken erhalten werden, auf die in Tabelle 7 Bezug genommen wird. (Die Literaturdaten für jede Verbindung variieren in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen).
  • 12 zeigt eine Aufreihung von Bindungsgraden von 19 Verbindungen. Der gleiche Satz von Verbindungen wurde auf der gleichen Sensoroberfläche doppelt klassifiziert, am Tag der HSA-Immobilisierung (gezeigt) und zweifach eine Woche später (nicht gezeigt). Diazepam und Warfarin wurden als Markerverbindungen verwendet, um HSA-Bindungsgrade in gering, mittel oder hoch einzuordnen. Warfarin wurde früh, in der Mitte und spät in jeder Untersuchung als eine Kontrolle der HSA-Bindungsaktivität injiziert. L, M und H bedeuten die Einteilung in geringen, mittleren und hohen Bindungsgrad, basierend auf angegebenen Literaturgraden der prozentualen Bindung.
  • 13 zeigt die Biosensordaten der AGP-Bindung, korreliert mit Daten, die mit anderen Techniken erhalten werden, die in der Diskussion angegeben sind. Vor der Immobilisierung wurde AGP (Sigma G-9885) mit PDEA (2-(2-Pyridinyldithio)ethanaminhydrochlorid von Biacore) modifiziert. AGP (200 ug/ml in 10 mM Na-Citrat, pH-Wert 3,6) wurde dann auf einen Grad von 7000 RU immobilisiert, unter Verwendung von Thiolkopplung (Löfas et al., "Methods for Site Controlled Coupling to Carboxymethyldextran Surfaces in Surface Plasmon Resonance Sensors", Biosensors & Bioelectronics, 10: 813–822 (1995)). Alle anderen Versuchsbedingungen waren die gleichen wie für die HSA-Korrelationsuntersuchung in 10.
  • 14 zeigt CYP2D6 und CYP2C19, immobilisiert in Flusszellen 3 und 2 auf 13000 bzw. 11000 RU.
  • 15 zeigt CYP2E und CYP3A4, immobilisiert in Flusszellen 2 und 3 auf 8500 bzw. 7300 RU.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Nachweisen eines Wirkstoffkandidaten und im Spezielleren auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen der Bindungswechselwirkung zwischen mindestens einem Wirkstoffkandidaten und erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomolekülen eines Biosensors, um einen Bindungswechselwirkungsparameter des Wirkstoffkandidaten zu bestimmen und dann Vergleichen des Bindungswechselwirkungsparameters mit einem vorbestimmten Wirkstoffkorrelationsgraphen (z.B. einem mathematischen Ausdruck, der zu einer Reihe bekannter Datenpunkten passt), um eine Einschätzung mindestens eines pharmakokinetischen Parameters vorzunehmen. Wenngleich viele spezifische Details bestimmter Ausführungsformen der Erfindung in der folgenden detaillierten Beschreibung und den begleitenden Figuren angegeben sind, wird der Fachmann in der Technik erkennen, dass die vorliegende Erfindung zusätzliche Ausführungsformen aufweisen kann oder die Erfindung ohne einige der hier beschriebenen Details durchgeführt werden kann.
  • Zur Klarstellung und Unterstützung des Verständnisses des vollen Bereichs der vorliegenden Erfindung wird ein kurzer Überblick über die Nomenklatur, die mit Pharmakokinetik verbunden ist, bereitgestellt. Entsprechend der Verwendung in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollen die folgenden pharmakokinetischen Ausdrücke weit ausgelegt werden und sollen ihre allgemein akzeptierten Bedeutungen haben, die unten angegeben sind. (Wie früher angegeben betrifft "Pharmakokinetik" die Untersuchung der Kinetiken, die mit den dynamischen Prozessen von Absorption, Verteilung, Metabolismus und Exkretion (ADME) eines Wirkstoffs und/oder seiner Metaboliten innerhalb eines lebenden Organismus verbunden sind).
  • "Absorption" betrifft den Prozess der Aufnahme einer Wirkstoffverbindung von der Stelle der Verabreichung in den systemischen Kreislauf. Der Übergang bzw. der Transfer bzw. Transport des Wirkstoffs durch das Intestinallumen wird im Allgemeinen als orale Absorption bezeichnet, während der Transport des Wirkstoffs durch eine externe physiologische Barriere als allgemeine Absorption bezeichnet wird. Wie hier offenbart, kann der pharmakokinetische Parameter der Absorption abgeschätzt werden aus Biosensordaten, die mit einem Sensorchip verbunden sind, der z.B. mehrere geeignete Liposomen, die darauf immobilisiert sind, aufweist.
  • "Verteilung" betrifft den Übergang einer Wirkstoffverbindung von der Stelle der Verabreichung in den gesamten systemischen Kreislauf und dann zu extrazellulärem und intrazellulärem Wasser und Geweben. Wirkstoffverteilung ist üblicherweise ein rascher und reversibler Prozess. Wie hier offenbart, können die pharmakokinetischen Verteilungsparameter von Biosensordaten eingeschätzt werden, die mit einem Sensorchip verbunden sind, z.B. mehreren geeigneten Plasmaproteinen, Liposomen und/oder Transportproteinen, die darauf immobilisiert sind.
  • "Metabolismus" betrifft die Summe aller chemischer Reaktionen für Biotransformation endogener und exogener Substanzen, welche in lebenden Zellen stattfinden. Wie hier offenbart, kann der pharmakokinetische Parameter des Metabolismus eingeschätzt werden aus Biosensordaten, die mit einem Sensorchip verbunden sind, der z.B. mehrere geeignete metabolische Enzyme, die darauf immobilisiert sind, aufweist.
  • "Exkretion" bzw. Ausscheidung betrifft die letztendliche Eliminierung oder das Austreten eines Wirkstoffs aus dem Körper. Wirkstoffexkretion umfasst sowohl passive Diffusion als auch relative spezifische Träger-vermittelte Exkretion. Wirkstoffe können unverändert oder als Metaboliten in Urin über die Nieren oder in Fäkalien über die Galle und/oder den Darm ausgeschieden werden. Flüchtige Verbindungen werden häufig in die Luft durch die Lungen abgegeben. Wie hier offenbart, kann der pharmakokinetische Parameter der Exkretion eingeschätzt werden aus Biosensordaten, die mit einem Sensorchip verbunden sind, der darauf immobilisiert ist, z.B. ein Antikörper, der spezifisch den Wirkstoff nachweist, als auch andere Proteine/Rezeptoren, die hohe Affinität/Spezifität gegenüber dem Wirkstoffkandidaten aufweisen. Solche Antikörper und Proteine/Rezeptoren können verwendet werden, um die Konzentration/Menge des Wirkstoffs in verschiedenen Körperfluiden (z.B. Urin/Fäkalien) und Gewebe zu quantifizieren, unter Verwendung eines direkten Bindungsassays.
  • Zusätzlich zu diesen ADME-Parametern ist die Löslichkeit eines Wirkstoffs ebenfalls eine wichtige Eigenschaft, die gemessen werden kann durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung. "Löslichkeit" betrifft die Fähigkeit von zwei Substanzen eine homogene Lösung oder ein Gemisch miteinander zu bilden. Löslichkeit ist wichtig für die Lösung von Wirkstoffen, die in fester Dosisform verabreicht werden. Wie hier offenbart, kann die Löslichkeit eines Wirkstoffkandidaten aus Sensorgrammunregelmäßigkeiten eingeschätzt werden, die mit Reflexionsminimum und einer Senken-Form von Biosensordaten verbunden sind.
  • Darüber hinaus und wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Parameter" einen konstanten oder variablen Ausdruck in einer Funktion (z.B. einen mathematischen Ausdruck), der die spezifische Form der Funktion bestimmt jedoch nicht notwendigerweise ihre allgemeine Natur. Zum Beispiel wird der konstante Ausdruck "a" in der Funktion f(x) = ax, worin "a" nur die Steigung der Linie bestimmt, die durch f(x) beschrieben wird, als Parameter bezeichnet. Als solcher betrifft der Ausdruck "Bindungswechselwirkungsparameter" diejenigen konstanten und variablen Ausdrücke, die mit der Bindungswechselwirkung zwischen einem Wirkstoffkandidaten und einem erfassenden Oberflächengebundenen Biomolekül verbunden sind und umfasst z.B. Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten als auch maximale Bindungskapazität. Ähnlich betrifft der Ausdruck "pharmakokinetischer Parameter" die konstanten und variablen Terme, die verbunden sind mit der Verteilung des Wirkstoffkandidaten innerhalb eines lebenden Organismus und umfasst z.B.: Verteilungsvolumen; Gesamtclearance; Proteinbindung; Gewebebindung; Metabolitenclearence; renale Clearence; hepatische Clearence; biliäre Clearence; intestinale Absorption; Bioverfügbarkeit, relative Bioverfügbarkeit; intrinsische Clearance; mittlere Verweilzeit; Maximalrate des Metabolismus; Michaelis-Menten-Konstante; Verteilungskoeffizienten zwischen Geweben und Blut (oder Plasma) wie etwa die Verteilungskoeffizienten, die mit der Blut-Gehirn-Schranke, Blut-Plazenta-Schranke, der Verteilung zwischen Blut und humaner Milch, Verteilung zwischen Blut und Fettgewebe und der Verteilung zwischen Blut und Muskel verbunden sind; Fraktion, die unverändert im Urin ausgeschieden wird; Anteil des Wirkstoffs, der systemisch in Metaboliten übergeführt wird; Eliminierungsratenkonstante; Halbwertszeit; und Sekretions-Clearance.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen durch die Verwendung eines Biosensors auf Affinitätsbasis durchgeführt werden. Der Fachmann in der Technik erachtet "Biosensoren" als analytische Vorrichtungen zum Analysieren kleinerer Mengen einer Probelösung, die einen interessierenden Analyten aufweist, worin der Analyt analysiert wird durch eine Detektionsvorrichtung, die ein Vielzahl von Detektionsverfahren verwenden kann. Solche Verfahren umfassen typischerweise, ohne darauf begrenzt zu sein, Massendetektionsverfahren, wie etwa piezoelektrische, optische, thermo-optische und Oberflächenakustikwellen (SAW)-Vorrichtungsverfahren und elektrochemische Verfahren, wie etwa potenziometrische, konduktometrische, amperometrische und Kapazitätsverfahren. Im Hinblick auf die optischen Erfassungs- bzw. Nachweisverfahren umfassen repräsentative Verfahren diejenigen, die Masseoberflächenkonzentrationen nachweisen, wie etwa optische Reflexionsverfahren, einschließlich sowohl interne als auch externe Reflexionsverfahren, Winkel-, Wellenlängen- oder Phasen-aufgelöst, z.B. Ellipsometrie und Evaneszenz-Wellenspektroskopie (EWS), die letztere umfassend Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Spektroskopie, Brewster-Winkelrefraktometrie, kritischer-Winkel-Refraktormetrie, Frustrated Totalreflektion (FTR), Evaneszenzwellenellipsometrie, interne Totoalstreuungsreflexion (STIR), optische Wellenleitersensoren, auf Evaneszenzwellen basierende Bilddarstellung wie etwa kritischer Winkel aufgelöste Darstellung, Brewster-Winkel aufgelöste Darstellung, SPR-Winkel aufgelöste Darstellung und dgl. Darüber hinaus können auch photometrische Verfahren, z.B. basierend auf Evanscenzfluoreszenz (TIRF) und Phosphoreszenz, ebenfalls verwendet werden, als auch Wellenleiterinterferometer.
  • In der detaillierten Beschreibung und den Beispielen, die folgen, wird die vorliegende Erfindung in Zusammenhang mit der SPR-Spektroskopie dargestellt. Jedoch versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf dieses Nachweisverfahren begrenzt ist. Es kann eher jedes Nachweisverfahren, das auf Affinität basiert, worin ein Analyt an einen Liganden bindet, der auf einer erfassenden Oberfläche immobilisiert ist, verwendet werden, vorausgesetzt, dass eine Änderung einer Eigenschaft der erfassenden Oberfläche gemessen wird und quantitativ kennzeichnend für die Bindung des Analyten an den darauf immobilisierten Liganden ist. In Zusammenhang mit der SPR-Spektroskopie wird eine beispielhafte Klasse von Biosensoren von Biacore AB (Uppsala, Schweden) unter dem Handelsnamen BICAORE® (hier nachfolgend als "das BIACORE-Instrument" bezeichnet) vertrieben. Solche Biosensoren verwenden eine Masseerfassungstechnik, die auf SPR basiert, um eine "Realzeit"-Bindungswechselwirkungsanalyse zwischen einem Oberflächen-gebundenen Liganden und einem interessierenden Analyten bereitzustellen.
  • Das BIACORE-Instrument umfasst eine lichtemittierende Diode, einen Sensorchip, der mit einer dünnen Goldfolie abgedeckt ist, eine integrierte Fluidpatrone und einen Photodetektor. Eintretendes Licht aus der Diode wird in der Goldfolie reflektiert und durch den Photodetektor nachgewiesen. Bei einem bestimmten Eintrittswinkel ("der SPR-Winkel") wird eine Oberflächenplasmonwelle in der Goldschicht aufgebaut, welche als ein Intensitätsverlust oder "Senke (Dip)" in dem reflektierten Licht nachgewiesen wird. Im Spezielleren und wie vom Fachmann in der Technik erachtet, ist das Phänomen der Oberflächenplasmonresonanz (SPR), das mit dem BIACORE-Instrument verbunden ist, abhängig von der Resonanzkopplung von Licht, das auf eine dünne Metallfolie auftrifft, mit Oszillationen der leitenden Elektronen, die Plasmone genannt werden, an der Metallfolienoberfläche. Diese Oszillationen führen zu einem evaneszenten Feld, welches sich von der Oberfläche in die Probelösung erstreckt. Wenn Resonanz auftritt, fällt die reflektierte Lichtintensität bei einem eng definierten Einfallswinkel, dem SPR-Winkel, ab, welcher abhängig ist, von dem Brechungsindex innerhalb der Reichweite des evaneszenten Feldes in der Nähe der Oberfläche.
  • Etwas anders dargestellt, ist Oberflächenplasmonresonanz ein optisches Phänomen, das in Verbindung mit interner Gesamtreflexion von Licht an einer Metallfolie-Flüssigkeit-Grenzfläche auftritt. Normalerweise wird Licht, das durch ein optisch dichteres Medium tritt, z.B. ein Glasprisma, total zurück eflektiert in das Prisma, wenn es eine Grenzfläche eines optisch weniger dichten Mediums, z.B. einen Puffer, erreicht, vorausgesetzt, dass der Eintrittswinkel größer als der kritische Winkel ist. Dies ist als innere Totalreflexion bekannt. Wenngleich das Licht vollständig reflektiert wird, bringt eine Komponente des einfallenden Lichtmoments, genannt die evaneszente Welle, eine Strecke in der Größenordnung von einer Wellenlänge in den Puffer ein. Die evaneszente Welle kann verwendet werden, um Moleküle nahe an der Grenzfläche anzuregen. Wenn das Licht monochromatisch und p-polarisiert ist und die Grenzfläche zwischen den Medien mit einer dünnen (ein Bruchteil der Lichtwellenlänge) Metallfolie beschichtet ist, wird die evaneszente Welle unter bestimmten Bedingungen mit freien oszillierenden Elektronen (Plasmone) in der Metallfolienoberfläche wechselwirken. Wenn die Oberflächenplasmonresonanz auftritt, geht Lichtenergie an die Metallfolie verloren und die reflektierte Lichtintensität wird so verringert.
  • Das Resonanzphänomen wird nur für Licht auftreten, das int einem eng definierten Winkel einfällt, welcher, wenn ansonsten alles konstant gehalten wird, abhängig ist von dem Brechungsindex in dem nahe der Oberfläche fließenden Puffer. Änderungen des Brechungsindex über etwa 1 μm von der Metallfolienoberfläche können so verfolgt werden durch kontinuierliches Beobachten des Resonanzwinkels. Ein Nachweisvolumen ist definiert durch die Größe des ausgeleuchteten Bereichs an der Grenzfläche und die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes. Es sollte festgehalten werden, dass kein Licht durch das Nachweisvolumen gelangt (die optische Vorrichtung auf einer Seite der Metallfolie weist Veränderungen des Brechungsindex im dem Medium auf der anderen Seite nach).
  • Wie oben angegeben, hängt der SPR-Winkel von dem Brechungsindex des Mediums nahe der Goldschicht ab. In dem BIACORE-Instrument wird typischerweise Dextran mit der Goldoberfläche gekoppelt, wobei der Ligand an die Oberfläche der Dextranschicht gebunden ist (eine detaillierte Diskussion von Matrixbeschichtungen für einen Biosensor, der Oberflächen erfasst, ist im U.S. Patent Nr. 5,436,161 bereitgestellt). Der interessierende Analyt wird in Lösungsform auf die Sensoroberfläche durch die Fluidpatrone eingespritzt bzw. injiziert. Da der Brechungsindex in der Nähe der Goldfolie von (1) dem Brechungsindex der Lösung (der konstant ist) und (2) der Menge des Materials, das an die Oberfläche gebunden ist, abhängt, kann die Bindungswechselwirkung zwischen dem gebundenen Liganden und dem Analyten als eine Funktion der Änderung des SPR-Winkels beobachtet werden.
  • Eine typische Ausgabe des BIACORE-Instruments ist ein "Sensorgramm", welches eine Auftragung des Ansprechens (gemessen in "Resonanzeinheiten" oder "RU") als eine Funktion der Zeit ist. Eine Erhöhung von 1000 RU entspricht einer Erhöhung der Masse auf der Sensoroberfläche von ungefähr 1 ng/mm2. Wenn eine Probe, die den Analyten enthält, mit der Sensoroberfläche in Kontakt tritt, wechselwirkt der Ligand, der an die Sensoroberfläche gebunden ist, mit dem Analyten in einem Schritt, der als "Assoziation" bezeichnet wird. Dieser Schritt wird auf dem Sensorgramm angezeigt durch eine Erhöhung der RU, wenn die Probe anfangs in Kontakt mit der Sensoroberfläche gebracht wird. Umgekehrt tritt "Dissoziation" normalerweise auf, wenn der Probestrom durch z.B. einen Pufferstrom ersetzt wird. Dieser Schritt wird auf dem Sensorgramm durch ein Abfallen der RU über die Zeit angezeigt, wenn Analyt von dem Oberflächengebundenen Liganden dissoziiert. Eine detaillierte Diskussion der technischen Aspekte des BIACORE-Instruments und des Phänomens von SPR kann im U.S. Patent Nr. 5,313,264 gefunden werden.
  • Zusätzlich kann eine detaillierte Diskussion der technischen Aspekte der Biosensorchips, die in Verbindung mit dem BIACORE-Instrument verwendet werden, im U.S. Patent Nr. 5,492,840 gefunden werden. Dieses Patent offenbart unter anderem, dass jeder Sensorchip mehrere erfassende Oberflächen aufweisen kann, und dass solche erfassenden Oberfläche in Reihe oder parallel bezüglich des Fluidprobenweges der Fluidpatrone angeordnet werden können. Dieses Patent offenbart auch, dass jede aus einer Vielzahl erfassender Oberflächen eines einzelnen Sensorchips an sich gebunden einen einzigartigen Typ von Liganden aufweisen kann, der in der Lage ist zur Wechselwirkung mit einem Analyten auf seine eigene charakteristische Art.
  • Zum Beispiel, und wie hier offenbart, kann jede der vier diskreten erfassenden Oberflächen des BIACORE-Instruments darauf immobilisiert Biomoleküle aufweisen, wie etwa Liposomen, Plasmaproteine, CYP 450 Enzyme, andere metabolische Enzyme und/oder Transport/Ausfluss-Proteine. Durch Immobilisieren eines oder einer ausgewählten Kombination von mindestens zwei verschiedenen Liposomen, Plasmaproteinen, CYP 450 Enyzmen, anderen metabolischen metabolischen Enzymen und/oder Transport/Ausfluss-Proteinen auf einer oder mehreren diskreten erfassenden Oberflächen eines Sensorchips können ein oder mehrere pharmakokinetische Parameter, die mit einem Wirkstoffkandidaten verbunden sind, leicht bestimmt werden. Im Spezielleren und in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist entdeckt worden, dass (1) eine Einschätzung eines "Absorptions"-Parameters eines Wirkstoffkandidaten vorgenommen werden kann aus den Bindungswechselwirkungen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem oder mehreren geeigneten Liposomen; (2) eine Einschätzung eines "Verteilungs"-Parameters eines Wirkstoffkandidaten vorgenommen werden kann aus den Bindungswechselwirkungen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem geeigneten Satz von Plasmaproteinen (z.B. spezifische und nicht-spezifische Gewebebindung und Gewebepermeabilität); (3) eine Einschätzung eines "Metabolismus"-Parameter eines Wirkstoffkandidaten vorgenommen werden kann aus den Bindungswechselwirkungen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem geeigneten Satz metabolischer Enzyme; und (4) eine Einschätzung eines "Exkretions"-Parameters eines Wirkstoffkandidaten vorgenommen werden kann aus den Bindungswechselwirkungen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem geeigneten Satz von Transportproteinen.
  • In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen geeignete Lipsomen zum Einschätzen eines "Absorptions"-Parameters eines Wirkstoffkandidaten organische Verbindungen, die von natürlichen oder synthetischen Lipidmolekülen abstammen, wie etwa Glycerophospholipide, Glyceroglycolipide, Sphingophospholipide und Sphingoglycolipide und aus den Klassen Phosphatidylcholin, Phosphatidyletanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylsäure, Phosphatidylinositol, Galactopyranosid, Digalactopyranosid, Ceramidphosphatidylcholin, Ceramidphosphatidyletanolamin, Ceramidphosphatidylserin, Ceramidphosphatidylglycerol, Ceramidphosphatidylsäure, Ceramidphosphatidylinositol, Sphingomyelinmoleküle, Glucosylceramide, Glucocerebroside, Galactoceramide, Galactocerebroside, Gaglioside, Monoacylphosphatidylcholin, Cardiolipinmoleküle, die gebunden sein können an gesättigte oder ungesättigte Fette oder Fluorkohlenstoffketten im Bereich von acht bis vierundzwanzig Kohlenstoffatomen in der Länge, worin Fettketten, die an die Kopfgruppe gebunden sind, gleich oder verschieden in der Struktur sein können, Cholesterol, Lanosterol, Ergosterol, Stigmasterol, Sitosterol und Derivate davon, die in Lipidmembranen eingebracht werden können, N,N-Dimethyl-N-octadecyl-1-octadecanammoniumchlorid oder-bromid, (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, Diacetylphosphat, N-[2,3-Dihexadecycloxy)prop-1-yl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, Bolaamphiphile, Polyglycerolmonoalkylether, Polyethoxymonoalkylether als auch Liposom-bildende Moleküle aus den Klassen amphiphiler Polymere, Aminosäuren, Kronetherverbindungen und Di(acyloxy)dialkylsilane. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung und dergleichen können auf der erfassenden Oberfläche durch die Technik, die in Beispiel 1 offenbart ist, immobilisiert werden.
  • Geeignete Plasmaproteine zum Einschätzen eines "Verteilungs"-Parameters eines Wirkstoffkandidaten umfassen Proteine, wie etwa Immunglobulin G (7s-y-Globulin), IgG; Immunglobulin A, IgA; Sekretions-IgA, s IgA; Immunglobulin M (19s-y-Globulin) IgM; Immunglobulin D, IgD; Immunglobulin E, IgE; α1-Antitrypsin, α1 P1, α1 A; α1-Antichymotroypsin, (α1X-Glycoprotein), α1 X; Inter-α-Trypsininhibitor, 1αTI; Antithrombin III, (Heparin-Cofaktor) AT III; α-Thiolproteinaseinhibitor (LMW-Kininogen) αTPI; C1-Inaktivator, C1-Esteraseinhibitor (α2-Neuraminoglycoprotein) C1 INA: α2-Makroglobulin; α2M; α2-Antiplasmin, α2AP; Cystatin C (Post-y-Globulin; y-Trace-Protein (y-Spurenprotein)); C1q (11S-Protein); C1r; C1s; C2; C3 (β1C-Globulin), C4 (β1E-Globulin); C5 (β1F-Globulin); C6; C7; C8; C9; Faktor B, (C3-Proaktivator; β2-Glycoprotein II; Glycin-reiches β-Glycoprotein); Faktor D (C3-Proaktivatorkonvertase); Properdin, P; Faktor I, (C3b-Inaktivator); C4-Bindungsprotein; Fibrinogen, FI, Prothrombin, F II; Faktor V (Proaccelerin); FV; Faktor VII, (Proconvertin); F VII; Faktor VIII: C (antihämophiler Faktor) F VIII; C; Faktor VIII – verwandtes Antigen; FV III: Rag (von Willebrand-Faktor) (VWF); Faktor IX (Christmas Faktor) F IX; Faktor X, (Stuart-Power-Faktor) F X; Faktor XI (Plasmathromboplastinvorläufer) F XI; Faktor XII (Hageman-Faktor) F XII; Faktor XIII (Fibrinstabilisierungsfaktor) F XIII; Kinigogen mit hohem Molekulargewicht (HMW) (Fitzgerald-Faktor); Prekallikrein (Fletcher-Faktor); Plasminogen; Protein C; Protein S; Albumin, ALB; Haptoglobin, HP, Hp 1-1, Hp 2-1, Hp 2-2; Prealbumin (Transthyretin , Thyroxin bindendes Präalbumin); Retinolbindungsprotein RBP; Thyroxinbindungsglobulin TBG; Transcortin (Corticosteoridbindungsglobulin) CBG; Sexualhormonbindungsglobulin (Steroidbindungs-β-Globulin), SHBG; Vitamin D-Bindungsprotein (Gc-Globulin, Gruppen-spezifische Komponente) VDBP; Transcobalamin I, TC I; Transcobalamin II, TC II; Transferrin (Siderophilin) TF; Ferritin; Hemopexin, HPX; Apolipoprotein A, Apo A1, Apo A-II; Apolipoprotein B, Apo B-48, Apo B-100; Apolipoprotein C; Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III; Apolipoprotein E, Apo E; Apolipoprotein (a) apo (a); Serum Amyloid A, SAA; α-Fetoprotein, AFP; α1-Säureglycoprotein (Orosomucoid) α1 AG; Ceruloplasmin, CP; Serum-Amyloid P Protein (9,5S α1-Glycoprotein; α1-Makroglobulin) SAP; α2-HS-Glycoprotein, α2 HS, Fibronectin (kalt unlösliches Globulin) FN, C-reaktives Protein, CRP; β2-Mikroglobulin, β2 M; Schwangerschafts-spezifisches β1-Glycoprotein, SP1; α1-Mikroglobulin, α1 M. Die Plasmaproteine der vorliegenden Erfindung und dergleichen können immobilisiert werden auf der erfassenden Oberfläche durch die Verwendung bekannter Immobilisierungstechniken, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Geeignete metabolische Enzyme zum Einschätzen eines "Metabolismusparameter" und/oder eines "Exkretions"-Parameters eines Wirkstoffkandidaten umfassen Cytochrom P450-Enyzme, ausgewählt aus der Klasse von Cytochrom P450-Enzymen mit einer aktiven Stelle, gekennzeichnet durch einen Protoporphyrin IX-Eisenkomplex mit Thiolat eines Cysteins des Enzyms, der als der fünfte Ligand für Eisen dient. Geeignete CYP 450 Enzyme umfassen CYTOCHROM P450, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A1, 2A2, 2A3, 2A4, 2A5, 2A6, CYP2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 2B5, 2B6, CYP2C1, 2C2, 2C3, 2C4, 2C5, 2C6, 2C7, 2C8, 2C9, 2C10, 2C11, 2C12, CYP2D1, 2D2, 2D3, 2D4, 2D5, 2D6, CYP2E1, CYP3A1, 3A2, 3A3, 3A4, 3A5, 3A7, CYP4A1, 4A2, 4A3, 4A4, CYP4A11, CYP P450 (TXAS), CYP P450 11 A (P450scc), CYP P450 17(P45017a), CYP P450 19 (P450arom), CYP P450 51 (P45014a), CYP P450 105 A1, CYP P450 105B1. Andere wichtige metabolische Enzyme umfassen Glutathionthioether, Leukotrien C4, Butyrylcholinesterase, humane Serumparaoxonase/Arylesterase, N-Acetyltransferase, UDP-Glucuronosyltransferase (UDPGT) Isoenzyme, TL PST, TS PST, Wirkstoffglucosidierungskonjugationsenzym, die Glutathion-S-Transferasen (GSTs) (RX: Glutathion-R-Transferase), GST1, GST2, GST3, GST4, GST5, GST6, Alkoholdehydrogenase (ADH), ADH I, ADH II, ADH III, Aldehyddehydrogenase (ALDH), Cytosole (ALDH1), Mitochondriale (ALDH2), Monoaminoxidase, MAO: Ec 1.4.3.4, MAOA, MAOB, Flavin-enthaltende Monoaminoxidase, Enzymsuperoxiddismotase (SOD), Katalase, Amidasen, N1, – Monoglutathionylspermidin, N1, N8-bis(Glutathionyl)spermidin, Thioester, GS-SG, GS-S-Cystein, GS-S-Cysteinylglycin, GS-S-O3H, GS-S-CoA, GS-S-Proteine, S-Carboanhydrase III, S-Actin, Mercaptide, GS-Cu(I), GS-Cu(II)-SG, GS-SeH, GS-Se-SG, GS-Zn-R, GS-Cr-R, Cholinesterase, lysosomale Carboxypeptidase, Calpaine, Retinoldehydrogenase, Retinylreduktase, Acyl-CoA-Retinolacyltrunderase, Folathydrolasen, Proteinphosphate (pp) 4 st, PP-1, PP-2A, PP-2Bpp-2C, Deamidase, Carboxyesterase, Endopeptidasen, Enterokinase, neutrale Endopeptidase E.C.3.4.24.11, neutrale Endopeptidase, Carboxypeptidase, Dipeptidylcarboxypeptidase, ebenfalls genannt Peptidyldipeptidase A, oder Angiotensin-Konvertierungsenzym (ACE) E.C.3.4.15.1, Carboxypeptidase M, g-Glutamyltranspeptidase E.C.2.3.2.2, Carboxypeptidase P, Folatkonjugase E.C.3.4.12.10, Dipeptidasen, Glutathiondipeptidase, Membran Gly-Leu-Peptidasen, Zink-stabile Asp-Leu-Dipeptidase, enterocytische intrazelluläre Peptidasen, Aminotripeptidase E.C.3.4.11.4, Aminodipeptidase E.C.3.4.13.2, Prodipeptidase Arg-selektive Endoproteinase; die Familie der Bürstensaumhydrolasen (brush border hydrolases), Endopeptidase-24.11, Endopeptidase-2(meprin), Dipeptidylpeptidase IV, Membrandipeptidase GPI, Glycosidasen, Sucraseisomaltase, Lactaseglycosylceraminidase, Glucoamylasemaltase, Trehalase, Carbohydraseenzyme, Alfa-Amalyse (Pankreas), Disaccharidasen (allgemein), Lactasephlorizinhydrolase, Säugercarbohydrasen, Glucoamylase, Sucrase-Isomaltase, Lactaseglycosylceramidase, enzymatische Quellen von ROM, Xanthinoxidase, NADPH-Oxidase, Aminoxidasen, Aldehydoxidase, Dihydroorotatdehydrogenase, Peroxidasen, humane Pankreasexokrinenzyme, Trpysinogen 1, Trypsinogen 2, Trypsinogen 3, Chymotrypsinogen, proElastase 1, proElastase 2, Protcase E, Kallikreinogen, proCarboxypeptidase A1, proCarboxypeptidase A2, proCarboxypeptidase B1, proCarboxypeptidase B2, Glycosidase, Amylase, Lipasen, Triglycaridlipase, Collipase, Carboxylesterhydrolase, Phospholipase A2, Nukleasen, Dnase I, Ribonukleotidreduktase (RNRs), Wistar-Ratten-Exokrinpankreasproteine, Markierungsprotein IEP, A1 Amylase 1, A2 Amylase 2, Lipase, CEL Carboxylesterlipase, PL Prophospholipase A, T1 Trpysinogen 1, T2 Trypsinogen 2, T3 Trypsinogen 3, T4 Trypsinogen 4, C1 Chymotrypsinogen 1, C2 Chymotrypsinogen 2, PE1 Proelastase 1, PE2 Proelastase 2, PCA Procarboxypeptidase A1, PCA1 Procarboxypeptidase A2, PCB1 Procarboxypeptidase B1, PCB2 Procarboxypeptidase B2, R Ribonuklease, LS Lithostatin, Charakteristika von UDPGT-Isoenzymen, gereinigt aus Rattenleber, 4-Nitrophenol UDPGT, 17b-Hydroxysteroid UDDPGT, 3-a-Hydroxysteroid UDPGT, Morphin UDPGT, Billirubin UDPGT, Billirubinmonoglucuronid, Phenol UDPGT, 5-Hydroxytryptamin UDPGT, Digitoxigeninmonodigitoxid UDPGT, 4-Hydroxybiphenyl UDPGT, Östron UDPGT, Peptidasen, Aminopeptidase N, Aminopeptidase A, Aminopeptidase P, Dipeptidylpeptidase IV, b-Casomorphin, Angiotensin-konvertierendes Enzym, Carboxypeptidase P Angiotensin II, Endopeptidase-24.11, Endopeptidase-24.18 Angiotensin I, Substanz P (deamidiert), Exopeptidase, 1. NH2-Terminus Aminopeptidase N (EC 3.4.11.2), Aminopeptidase A (EC 3.4.11.7), Aminopeptidase P (EC 3.4.11.9), Aminopeptidase W (EC 3.4.11.-), Dipeptidylpeptidase IV (EC 3.4.14.5), g-Glutamyltranspeptidase (EC 2.3.2.2), 2. COOH-Terminus Anglotensinkonvertierendes Enzym (EC 3.4.15.1), Carboxypeptidase P (EC 3.4.17.-), Carboxypeptidase M (EC 3.4.17.12), 3. Dipeptidase mikrosomale Dipeptidase (EC 3.4.13.19), Gly-Leu-Peptidase , Zink-stabile Peptidase, Endopeptidase Endopeptidase 24.11 (EC 3.4.24.11), Endopeptidase-2 (EC 3.4.24.18, PABA-Peptidhydrolase, Meprin, Endopeptidase-3, Endopeptidase (EC 3.4.21.9), GST A1-1, Alpha, GST A2-2 Alpha, GST M1a-1a Mu, GST M1b-1b Mu, GST M2-2 Mu, GST M3-3 Mu, GST M4-4 Mu, GST M5-5 Mu, GST P1-1 Pi, GST T1-1 Theta, GST T2-2 Theta, mikrosomale Leukotrien C4-Synthase, UGT-Isozyme, UGT1.1, UGT1.6, UGT1.7, UGT2.4, UGT2.7, UGT2.11, Pankreasenzyme, Elastase, Aminopeptidase (Dipeptidylaminopeptidase (IV), Chymotrypsin, Trypsin, Carboxypeptidase A, Methyltransferasen, O-Methyltransferasen, N-Methyltransferasen, S-Methyltransferasen, Catechol-O-methyltransferasen, MN-Methyltransferase, S-Sulphotransferasen, Mg2+-ATPase, Wachstumsfaktorrezeptoren, alkalische Phosphatase, ATPasen, Na, K+ATPase, Ca2+-ATPase, Leucinaminopeptidase, K+-Kanal. Die metabolischen Enzyme der vorliegenden Erfindung und dergleichen können immobilisiert werden auf der erfassenden Oberfläche durch die Verwendung bekannter Immobilisierungstechniken, die dem Fachmann in der Technik bekannt sind.
  • Geeignete Transportproteine zum Einschätzen eines "Exkretions"- (als auch eines Austritts-, Absorptions-, Verteilungs-)Parameters für einen Wirkstoffkandidaten umfassen Glucose a. Na+-Glucosecotransp GLUT 1, b. facilitative Transporter, GLUT 1-5, GLUT-2, neutrale Aminosäuretransporter, Na+-unabhängiges System L Aminosäuretransporter, kationische Aminosäure, Y+-kationische L-Aminosäuretransporter, Dipeptide H+-Contransport, Nukleoside, Na+-abhängig und faszilativ, Taurin-, Na+- und Cl–-abhängig, Gallensäure Na+/Gallensäurecotransporter, Na+-unabhängiger Gallensäuretransporter, ABC-Transporter, faszilativer Prostaglandin-Transporter, Na+/H+-Austauscher-Antiporter, Phosphat Na+/Pi-Cotransporter, Sulfat Na+-Cotransporter, Transporter für Neurotransmitter, Norepinephrin Na+/Cl–-Cotransporter, Dopamin Na+/Cl–-Cotransporter, Serotonin Na+/Cl–-Cotransporter, GABA, GAT-1, Na+/Cl–-abhängig, Glycin, Na+/Cl–-abhängig, Glutamat Na+-Cotransporter, K+/OH–-Gegentransport, ABC-Transporter, P-Glycoprotein (MDR1, MDR2 oder MDR3), Cl–-Kanal (CFTR), antigene Peptide, TAP1- und TAP2-Heterodimer, Lungenresistenzprotein (LRP), Multiwirkstoffresistenzprotein 1 (MRP1), Multiwirkstoffresistenzprotein 2 (MRP2 oder cMOAT), Multiwirkstoffresistenzprotein 3 (MRP3), Multiwirkstoffresistenzprotein 4 (MRP4), Multiwirkstoffresistenzprotein 5 (MRP5), Multiwirkstoffresistenzprotein 6 (MRP6), mrp (Maus), EBCR (Kaninchen), C. elegans mrpl (Nematode), C. elegans mrp2 (Nematode), MRP6 (human), YCF1 (Hefe), AtMRP1 (Arabidopsis), SUR1 (human), sur2 (Ratte, Maus), YOR1/YRS1 (Hefe), LtpgpA (Leishmania), hepatisches Aminosäuretransportsystem, neutrale Aminosäuretransporter, MeA1B, Dicarboxylaminosäuren, neutrale Aminosäuren (verzweigt), b-Aminosäuren, langkettige Fettsäuren, Monoglyceride, L-Lysophosphatidylcholin, Transportproteine für Bilirubin, Bilitranslocase (BTL), organisches Anionenbindungsprotein (OABP), BSP/Bilirubinbindungsprotein, Signalrezeptor- und Transduktionshydrolasen, ATPasen, Na+-abhängiger/unabhängiger Gallensäuretransport, Bilirubin/BSP-Träger (Cl-abhängig), SO/OH-Austauscher Cl– -Kanal Na+/H+-Austauscher, Na+/HCO3-Cotransport, GSH-, GSSH-, GS-Konjugatträger, SO4/HCO3 Austauscher, Na+-abhängiger Aminosäuretransport, dipolare Aminosäuretransporter, basische Aminosäuren, Cystin, Iminosäuren Cl–, b-Aminosäuren Cl–, azide XAG Aminosäuren K+, A dipolare α-Aminosäuren, dipolare Aminosäure mit drei und vier Kohlenstoffen, voluminöse, hydrophobe, dipolare L-Aminosäuren, y+-basische Aminosäuren, Folattransporter, cbl-Transportproteine, Na+-K–-ATPase, Gallensäuretransporter (BAT), Proteinkinase C, Na+/I–-Sympoter (NIS); Gallensalzaustragspumpe (BSEP, cBAT, SPGP); Darmgallensäuretransporter; Purin-selektive Na+-abhängige Nukleosidtransporter (hSPNTI); Pyrimidinselektive Na+-abhängige Nukleosidtransporter (cNTI); Mitoxantron-Transporter (MXR1 und MXR2); Intestinaler Oligopeptidtransporter (PepT1); Renaler Oligopeptidtransporter (PepT2); Bruskrebsresistenzprotein (BCRP). Die Transport/Austritts-Proteine der vorliegenden Erfindung und dergleichen können immobilisiert werden auf der erfassenden Oberfläche durch die Verwendung bekannter Immobilisierungstechniken, die dem Fachmann in der Technik bekannt sind.
  • Wie oben angegeben, ist entdeckt worden, dass die pharmakokinetischen Parameter von Absorption, Verteilung, Metabolismus und Exkretion (ADME) eines Wirkstoffkandidaten bestimmt werden können aus den Bindungswechselwirkungen zwischen den Wirkstoffkandidaten und geeigneten erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomolekülen (z.B. von verschiedenen Liposomen, Plasmaproteinen, CYP 450-Enzymen oder anderen metabolischen Enzymen und/oder Transport/Austritts-Proteinen, wie etwa denjenigen, die oben identifiziert worden sind) eines Biosensors. Das heißt die Bindungswechselwirkungen zwischen einem Wirkstoffkandidaten und einem oder mehreren erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomolekülen, ausgewählt aus Liposomen, Plasmaproteinen, CYP 450 Enzymen oder metabolischen Enzymen und Transport/Austritt-Proteinen, kann gemessen werden durch das BIACORE-Instrument, um einen Bindungswechselwirkungsparameter des Wirkstoffkandidaten zu bestimmen. Der abgeschätzte Bindungswechselwirkungsparameter kann dann umgekehrt mit einem vorbestimmten Wirkstoffkorrelationsgraphen verglichen werden, um einen oder mehrere aus Absorptions-, Verteilungs-, Metabolismus- und Exkretions-"pharmakokinetischen Parametern" des Wirkstoffkandidaten abzuschätzen. Darüber hinaus kann der pharmakokinetische Parameter des Wirkstoffkandidaten z.B. ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Verteilungsvolumen; Gesamt-Clearance, Proteinbindung; Gewebebindung; metabolisches Clearance; renales Clearance; hepatisches Clearance; biliäres Clearance; intestinale Absorption; Bioverfügbarkeit; relative Bioverfügbarkeit; intrinsische Clearance; mittlere Verweilzeit; Maximalrate des Metabolismus; Michaelis-Menten-Konstante; Verteilungskoeffizienten zwischen Gewebe und Blut (oder Plasma), wie etwa diejenigen Verteilungskoeffizienten, die mit der Blut-Gehirn-Schranke, Blut-Plazenta-Schranke, der Verteilung zwischen Blut und humaner Milch, Verteilung zwischen Blut und Fettgewebe und der Verteilung zwischen Blut und Muskel verbunden sind; Fraktion, die unverändert in Urin ausgeschieden wird; Wirkstofffraktion, die systemisch in Metaboliten übergeführt wird; Eliminierungsratenkonstante; Halbwertszeit; und Sekretions-Clearance; wobei jedes von diesen bestimmt werden kann aus geeigneten Sensorgrammen der ausgewählten Wirkstoff-Biomolekül-Wechselwirkung (alternativ können sie bestimmt werden durch Extraktion von Zählvektoren (score vectors) durch prinzipielle Komponentenanalyse aus digitalisierten Wechselwirkungsprofilen, als auch durch andere bekannte multivariante Verfahren).
  • Zum Abschätzen einer scheinbaren Gleichgewichtskonstante zwischen einem Wirkstoffkandidaten und ausgewählten erfassenden Oberflächen-gebundenen Biomolekülen kann die folgende Vorgehensweise verwendet werden. Als erstes kann eine Konzentrationsreihe (z.B. 0, 20, 50, 100, 500 und 1.000 μM) des Wirkstoffkandidaten hergestellt werden und sequenziell in einen Biosensor eingespritzt werden, der einen Sensorchip aufweist, der operativ damit verbunden ist, worin der Sensorchip eine erfassende Referenzoberfläche und mindestens eine erfassende Oberfläche mit Oberflächen-gebundenen Biomolekülen aufweist. Die relativen Ansprachen bei Stationärzustandsbindungsgraden für jeden Wirkstoffkonzentrationsgrad können dann gemessen werden. Aufgrund der Masserefraktionsindexverteilungen von Lösungsmitteladditiven in dem Laufpuffer des Biosensors kann ein Korrekturfaktor berechnet (über bekannte Kalibrierungsverfahren) und angewendet werden, um korrigierte relative Ansprachen bzw. Response zu ergeben. Die korrigierten relativen Ansprachen für jede Wirkstoffkonzentration können dann mathematisch beurteilt werden, wie für den Fachmann in der Technik bekannt, um die scheinbare Gleichgewichtskonstante zu bestimmen.
  • Im Spezielleren kann die scheinbare Gleichgewichtskonstante (KD) zwischen den Wirkstoffkandidaten und den ausgewählten erfassenden Oberflächengebundenen Biomolekülen berechnet werden durch Anpassen der gemessenen Gleichgewichts-(Req)-Daten und bekannter Wirkstoffkonzentration (C)-Daten in die Gleichung (1): Req = C*Rmax/(C + KD) + Kompensation (1),worin Rmax die maximale Bindungskapazität der erfassenden Oberfläche ist. Alternativ kann die scheinbare Gleichgewichtskonstante (KD) berechnet werden aus nur zwei Konzentrationen (d.h. C1 und C2) des Wirkstoffkandidaten durch Verwendung der Gleichung (2): KD = (ReqC1/C1 – ReqC2/C2)/(ReqC2- ReqC1) (2)
  • Die abgeschätzte scheinbare Gleichgewichtskonstante (KD) oder der Bindungsgrad bei einer spezifischen molaren Wirkstoffkonzentration kann dann umgekehrt verglichen werden mit einem Korrelationsgraphen eines vorbestimmten Wirkstoffs, um ein oder mehrere aus Absorptions-, Verteilungs-, Metabolismus und Exkretionsparameter des Wirkstoffkandidaten zu bestimmen.
  • In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft ein vorher bestimmter Wirkstoffkorrelationsgraph einen mathematischen Ausdruck oder eine Funktion, die entwickelt worden ist aus Bindungswechselwirkungsdaten, die mit bekannten Wirkstoffverbindungen verbunden sind. Zum Beispiel kann ein Korrelationsgraph entwickelt werden, worin bekannte Bindungswechselwirkungsparameter (z.B. scheinbare Gleichgewichtskonstanten und/oder Bindungsgrade bei spezifischen molaren Wirkstoffkonzentrationen) für bekannte Verbindungen entlang der Abszisse (d.h. die x-Achse) aufgetragen werden und entsprechende gemessene Bindungswechselwirkungsparameter, die durch den Biosensor erhalten werden, entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse) aufgetragen werden, oder umgekehrt. Anders ausgedrückt, ist die Korrelationsauftragung eine graphische Darstellung eines mathematischen Ausdrucks, der bekannte und gemessene Affinitätsdaten korreliert.
  • Durch Vergleichen des abgeschätzten Bindungswechselwirkungsparameters, der aus der ausgewählten Wirkstoffbiomolekülwechselwirkung erhalten wird, mit dem mathematischen Ausdruck (d.h. Korrelationsgraph), der aus bekannten und gemessenen Affinitätsdaten korreliert, ist überraschenderweise entdeckt worden, dass eine Abschätzung bzw. Einschätzung eines pharmakokinetischen ADME-Parameters, der mit dem Wirkstoffkandidaten verbunden ist, genau vorhergesagt werden kann. Zusätzlich ist durch Immobilisieren einer ausgewählten Kombination von mindestens zwei verschiedenen Liposomen, Plasmaproteinen, CYP 450-Enyzmen, anderen metabolischen Enzymen und/oder Transport-Austritts-Proteinen, auf einer oder mehreren diskreten erfassenden Oberflächen eines Sensorchips, weiterhin überraschenderweise entdeckt worden, dass mindestens zwei pharmakokinetische Parameter, die mit einem Wirkstoffkandidaten verbunden sind, leicht bestimmt werden können. Darüber hinaus können durch Immobilisieren einer ausgewählten Kombination verschiedener Liposomen, Plasmaproteine, CYP 450-Enzymen, anderer metabolischer Enzyme und/oder Transport/Austritts-Proteinen auf den erfassenden Oberflächen des Biosensors, wie etwa in einer vorbestimmten Reihe verschiedener Punkte von Biomolekülen, ein ADME-Muster oder Profil, wie etwa eine Wirkstoffkandidat-Charakterisierungsmatrix, leicht entwickelt werden. Solche ADME-Profile sind von großer Nützlichkeit für Zwecke des Wirkstoffscreenings.
  • Zusätzlich zum Bestimmen eines oder mehrerer pharmakokinetischer Parameter durch Überwachen der Brechungsindexveränderungen eines Biosensors, wie oben offenbart, kann die Löslichkeit eines Wirkstoffkandidaten auch gleichzeitig bestimmt werden (zusammen mit dem einen oder den mehreren pharmakokinetischen Parametern) durch Überwachen des Minimus, Maximums oder Zentrums des Wirkstoff-Biomolekül-Wechselwirkungssignals (wie z.B. offenbart in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO97/09618). Im Spezielleren kann die Löslichkeit des Wirkstoffkandidaten aus Unregelmäßigkeiten, als auch aus Reflexionsminimum (Rmin)- und Senken-Formdaten, gezeigt in dem Sensorgramm der Wirkstoff-Biomolekül-Wechselwirkung, abgeschätzt/identifiziert werden. Im Allgemeinen wird die Konzentration, bei welcher Präzipitation auftritt, als Löslichkeitsgrenze bezeichnet. Es kann wichtig sein, diese Eigenschaft zu messen, da sie zeigen kann, dass der Wirkstoffkandidat eine größere Affinität aufweist als auf andere Art angezeigt.
  • Löslichkeitsprobleme des Wirkstoffkandidaten können nachgewiesen werden, da unlösliche Teilchen (d.h. Präzipitate) dazu neigen, an die sie erfassenden Oberfläche-gebundenen Biomoleküle zu binden, wobei bewirkt wird, dass die erfassende Oberfläche nicht homogen ist. (Eine homogene Oberfläche hat die gleiche Oberflächenkonzentration überall, während eine nicht-homogene Oberfläche Konzentrationsstörungen aufweist). Eine nicht-homogene erfassende Oberfläche misst tatsächlich mehrere Brechungsindizes, welche alle zusammen in dem Detektor des Biosensors gemittelt werden. Diese mehrfachen Messungen aus einer einzelnen, jedoch nicht homogenen erfassenden Oberfläche neigen dazu, dass sie zu einer Erhöhung des Reflexionsminimums und einer Verbreiterung der damit verbundenen Senke führen.
  • Eine Darstellung, wie Sensorgrammunregelmäßigkeiten verwendet werden können, um Löslichkeitsprobleme (d.h, das Vorliegen von Präzipitaten) zu identifizieren, ist in den 1A–C gezeigt. Im Spezielleren sind die Stationärzustandsbindungsgrade, die mit einer ausgewählten Wirkstoff-Biomolekül-Wechselwirkung verbunden sind, allgemein in 1A gezeigt. Durch Vergrößern oder "Zoomen" in dem oberen Bereich des Sensorgramms, das ein Spiegelbild der Stationärzustandsbindung ist, werden die Sensorgrammunregelmäßigkeiten offensichtlicher, wie in der entsprechenden 1B gezeigt. Die Sensorgrammunregelmäßigkeiten werden noch offensichtlicher durch Verwendung von Referenz-bereinigten Daten (d.h. Masserefraktionsindexeffekte sind eliminiert worden), wie in der entsprechenden 1C gezeigt.
  • Eine Darstellung dessen, wie Reflexionsminimum (Rmin)- und Senkenform-Daten verwendet werden können, um Löslichkeitsprobleme zu identifizieren (d.h. das Vorliegen von Präzipitaten), ist in den 2A–C gezeigt. Im Spezielleren weist eine homogene Oberfläche die gleiche Oberflächenkonzentration überall auf und wird daher zu einer einzelnen "Senke" ("Dip") in Bezug auf die reflektierte Lichtintensität führen, wie in 2A gezeigt. Wenn Präzipitate an die erfassende Oberfläche binden, wird die erfassende Oberfläche nicht homogen, was dazu neigt zu einer Erhöhung des Reflektionsminimus und einer Verbreiterung der Senke zu führen, die damit verbunden sind, wie in den 2B bzw. 2C gezeigt.
  • Basierend auf den vorstehenden Verfahren zum Nachweisen eines Wirkstoffkandidaten können Forscher nun gleichzeitig mehrere verschiedene pharmakokinetische Parameter des Wirkstoffkandidaten messen, als auch die Löslichkeit des Wirkstoffkandidaten beurteilen, durch Verwenden eines einzelnen analytischen Instruments. Die vorliegende Erfindung vereinfacht und verbessert die Wirkstoffentdeckungs- und Entwicklungsrate, da wichtige pharmakokinetische Parameter nun leicht in einem relativ frühen Stadium des Verfahrens erhalten werden können.
  • Zusätzlich zu den vorstehenden Verfahren ist die vorliegende Erfindung ebenfalls auf Vorrichtungen gerichtet, die eingerichtet sind, um solche Verfahren durchzuführen. Im Spezielleren umfassen die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung einen Biosensor mit einer erfassenden Oberfläche, die damit verbunden ist, und ein Computersystem, das die Einbeziehung der Schritte, die mit den hier offenbarten Verfahren verbunden sind, erleichtert. Der Computer umfasst einen Computerspeicher, der eine Datenstruktur enthält, die geeignet ist zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten; die Datenstruktur umfasst Bindungswechselwirkungsdaten, die mit bekannten Wirkstoffverbindungen verbunden sind, sodass die Datenstruktur verwendet werden kann, um eine Einschätzung mindestens eines pharmakokinetischen Parameters des Wirkstoffkandidaten vorzunehmen.
  • Der Computerspeicher, der eine Datenstruktur aufweist, die geeignet ist zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten, kann vollständiger dargestellt werden in Zusammenhang mit einem schematischen (High-Level) Computerblockdiagramm auf hohem Niveau, wie in 3 dargestellt.
  • Es wird gezeigt, dass ein solches Computersystem 300 ein oder mehrere zentrale Prozessoreinheiten (CPUs) 310, Eingabe/Ausgabe-Vorrichtungen 320 aufweist und dass der Computerspeicher eine Datenstruktur enthält, die geeignet ist zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten (Speicher) 330. Unter den Eingabe/Ausgabe-Vorrichtungen ist eine Speichervorrichtung 321, wie etwa ein Festplattenlaufwerk, und ein Laufwerk 322 für ein Computer-lesbares Medium, welches verwendet werden kann, um Softwareprodukte zu installieren, worin die Softwareprodukte auf einem Computer-lesbaren Medium bereitgestellt werden, wie etwa einer CD-ROM. Die Eingabe/Ausgabe-Vorrichtungen umfassen auch einen Netzwerkanschluss 323, durch welchen das Computersystem 300 mit anderen angeschlossenen Computersystemen, wie etwa Netzwerken, kommunizieren kann. Die Eingabe/Ausgabe-Vorrichtungen können auch eine Anzeige 324 und eine Dateneingabevorrichtung 325 enthalten.
  • Der Speicher 330 enthält vorzugsweise ein Betriebssystem 331, wie etwa MICROSOFT WINDOWS, um anderen Programmen Zugriff auf Quellen des Computersystems zu geben. Der Speicher 330 enthält vorzugsweise weiterhin die Software 332. Während der Computerspeicher, der eine Datenstruktur aufweist, die geeignet ist zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten vorzugsweise in einem Computersystem enthalten ist, wie oben beschrieben, wird der Fachmann in der Technik erkennen, dass er auch in Computersystemen aufgenommen sein kann, die verschiedene Konfigurationen aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung kann ein generiertes Datensignal verwenden, das eine Datenstruktur trägt, die geeignet ist zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten. Wie oben angegeben, umfasst die Datenstruktur Bindungswechselwirkungsdaten, die mit bekannten Wirkstoffverbindungen verbunden sind, sodass die Datenstruktur verwendet werden kann, um eine Einschätzung mindestens eines pharmakokinetischen Parameters des Wirkstoffkandidaten vorzunehmen.
  • Eine Sensorfläche, die eingerichtet ist zur Verwvendung mit einem Biosensor weist eine Hydrogelmatrixbeschichtung auf, gekoppelt mit der Oberseite der Sensoroberfläche, worin die Hydrogelmatrixbeschichtung mehrere funktionelle Gruppen aufweist, und mindestens zwei verschiedene Typen von Liposomen sind an die Mehrzahl der funktionellen Gruppen an diskreten und nicht benachbarten Stellen auf der Hydrogelmatrixbeschichtung der Sensoroberfläche gebunden (wie in Beispiel 1 offenbart). In Zusammenhang mit dem BIACORE-Instrument, wie oben beschrieben, ist die Sensoroberfläche vorzugsweise in der Form eines Sensorchips, worin der Sensorchip ein Metall mit freien Elektronen aufweist, das zwischen der Hydrogelmatrix und der oberen Oberfläche des Sensorchips eingelagert ist. Geeignete Metalle mit freien Elektronen umfassen in dieser Hinsicht Kupfer, Silber, Aluminium und Gold.
  • Die Sensoroberfläche kann eine lipophile Substanz aufweisen, die zwischen den verschiedenen Typen von Liposomen und den mehreren funktionellen Gruppen eingelagert ist, wobei die lipophile Substanz kovalent an die mehreren funktionellen Gruppen gebunden ist. Repräsentative lipophile Substanzen umfassen eine Alkylkette mit von 12 bis 24 Kohlenstoffatomen, wie etwa Stearylamin. Ähnlich umfassen repräsentative Liposomen 1,2-Dimyristol-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC). Die Sensoroberflächen dieser Erfindung können auch Nicht-Liposomenbiomoleküle, die damit assoziiert sind, aufweisen. Zum Beispiel können humanes Serumalbumin, CYP 450-Enzym, ein metabolisches Enzym und/oder ein Transportprotein an die Mehrzahl funktioneller Gruppen an diskreten und nicht-benachbarten Stellen auf der Hydrogelmatrixbeschichtung der Sensoroberfläche gebunden sein.
  • Zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung offenbaren die folgenden Beispiele spezifische verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • SIMULTANE MESSUNG VON LÖSLICHKEIT, PLASMAPROTEINBINDUNG, LIPOPHILIZITÄT UND INTESTINALABSORPTION FÜR DREI WIRKSTOFFKANDIDATEN A-C
  • Dieses Beispiel offenbart wie eine kombinierte Information aus jeder von vier verschiedenen Flusszellen eines Biosensors in einer Charakterisierungsmatrix dargestellt werden können, worin jeder der drei Wirkstoffkandidaten A-C ein Qualitätsmuster zeigt (d.h. HSA% gebunden, vorhergesagte Lipophilizität, Löslichkeit und vorhergesagte FA%), welches geeignet ist zur Auswahl von Leitwirkstoffverbindungen.
  • Herstellung des Sensorchips
  • Drei der vier diskreten erfassenden Oberflächen eines CM5-Sensorchips (Biacore AB, Uppsala, Schweden) wurden so modifiziert, dass der CM5-Sensorchip Oberflächen-gebundene Biomoleküle aufwies, wie unten in Tabelle 1 angegeben.
  • TABELLE 1 OBERFLÄCHEN-GEBUNDENE BIOMOLEKÜLE DES CM5-SENSORCHIPS
    Figure 00370001
  • Im Spezielleren, und um eine kovalente Bindung von Stearylamin an Oberfläche/Zelle Nr. 3 und 4 zu erreichen, wurde das folgende Verfahren verwendet. Ein CM5-Sensorchip wurde zuerst in einen BIACORE 3000 Biosensor (Biacore AB, Uppsala, Schweden) eingebracht. Der laufende Pufferfluss (isotonischer Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,0 (9,6 g Na2HPO4 – 2H2O, 1,7 g KH2PO4, 4,1 g NaCl auf 1 Liter)) mit 2 % Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde auf die Flusszellen 3 und 4 gerichtet, durch Verwendung geeigneter Softwarebefehle. Ein Gemisch von 0,2 M N-Ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimid und 50 mM N-Hydroxysuccinimid in Wasser wurde dann in den Biosensor eingespritzt, um über die Flusszellen 3 und 4 für eine Dauer von 10 Minuten zu fließen. Der CM5-Sensorchip wurde dann mit laufendem Puffer gewaschen, von dem Biosensor entfernt und in einer Petri-Schale auf der Oberseite eines mehrschichtigen Gewebepapiers angeordnet, das mit Ethanol befeuchtet worden ist. Die ausgesetzten erfassenden Oberflächen wurden dann mit 30 μl einer 10 mM Stearylaminlösung in 99 % Ethanol behandelt. Nach einer Dauer von weiteren 45 Minuten wurde der CM5-Sensorchip vorsichtig mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen. Als nächstes wurden die ausgesetzten erfassenden Oberflächen weiterbehandelt mit 50 μl einer 1M Ethanolaminlösung bei pH-Wert 8,5. Schließlich und nach einer Dauer von weiteren 10 Minuten wurden die erfassenden Oberflächen mit HBS-Puffer gewaschen.
  • Nachfolgend auf die kovalente Bindung von Stearylamin an die Oberfläche/Zelle Nr. 3 und 4 – und nachdem der CM5-Sensorchip, der gerade mit HBS-Puffer gewaschen worden war, trockengeblasen war mit Stickstoff und wieder in den Biosensor eingebracht worden war – wurden dann humanes Serumalbumin (HSA), DMPC-Liposomen und POPC-Liposomen (erhältlich von Sigma) auf Oberfläche/Zelle Nr. 2, 3 bzw. 4 eingefangen. Die folgenden Verfahren wurden verwendet, um diese Biomoleküle einzufangen.
  • Um humanes Serumalbumin einzufangen wurde der Fluss auf Flusszelle 2 durch Verwendung geeigneter Softwarebefehle gerichtet. Die erfassende Oberfläche der Flusszelle 2 wurde dann für eine Dauer von 7 Minuten mit EDC/NHS aktiviert. Als nächstes wurde humanes Serumalbumin mit 15 μg/ml in 10 mM Acetatpuffer, pH-Wert 5,2, für eine Dauer von 7 Minuten eingespritzt; dann wurde 1 M Ethanolamin, pH-Wert 8,5, für eine weitere Dauer von 7 Minuten eingespritzt. Dieses Verfahren führte zur Immobilisierung von 9–12 kRU humanem Serumalbumin an der erfassenden Oberfläche der Oberfläche/Zelle Nr. 2.
  • Zum Einfangen der beiden verschiedenen Liposomen wurde der Fluss zuerst auf die Flusszelle 3 gerichtet und 0,5–1 mM DMPC-Liposom wurden injiziert bis 5–7 kRU des DMPC-Liposoms eingefangen waren. Der Fluss wurde dann auf Flusszelle 4 gerichtet und 0,5–1 mM POPC-Liposom wurden injiziert bis 5–7 kRU des POPC-Liposoms eingefangen waren. Schließlich wurde das Flusssystem des Biosensors mit 100 mM NaOH gewaschen und die Autoinjektorleitung wurde mit 0,5 % SDS und 50 nM Glycin, pH-Wert 9,5, gewaschen, um Spuren von Lipiden zu entfernen.
  • Kalibrierungsverfahren
  • Zum Verbessern der Datenqualität durch Verringern von Masse-Brechungsindexbeiträgen aus dem DMSO-Lösungsmitteladditiv wurde ein Kalibrierungsverfahren verwendet. (Es ist zu festzuhalten, dass das Kalibrierungsverfahren varrierende Konzentration an DMSO erforderte). Aufgrund dessen, dass der laufende Puffer 2 % DMSO enthielt, wurde eine Reihe von 8 bis 10 Kalibrierungslösungen hergestellt, die variierende DMSO-Konzentrationen im Bereich von 1,5 % bis 3,0 % aufwiesen. Jede Kalibrierungslösung wurde sequenziell eingespritzt über jede der vier erfassenden Oberflächen, durch Verwendung des seriellen Injektionsmodus des Biosensors und die entsprechenden Stationärszustandsbindungsgrade wurden gemessen. Die relativen Ansprachen der erfassenden Referenzoberfläche der Flusszelle (FC1 mit unmodifiziertem CM5 als eine Referenzoberfläche) wurden dann von den entsprechenden Kalibrierungsansprachen der Ziel-erfassenden Oberflächen der Flusszellen 2, 3 bzw. 4 subtrahiert und aufgetragen als Funktionen der relativen Ansprachen. Aus diesen Auftragungen wurden Kalibrierungsfunktionen für jede der jeweiligen erfassenden Oberflächen berechnet.
  • Die Kalibrierungsfunktionen wurden dann verwendet, um geeignete Korrekturfaktoren für die Proben, die die drei Wirkstoffkandidaten A-C enthielten, zu berechnen. Das heißt, für die Proben, die die Wirkstoffkandidaten enthielten, wurden die relativen Ansprachen der Stationärszustandsbindungsgrade der erfassenden Referenzoberfläche (d.h. Signale von Flusszelle 1) gemessen und die entsprechenden Kalibrierungsfunktionen wurden verwendet, um Korrekturfaktoren zu berechnen, die für jeden Wirkstoffkandidaten geeignet sind. Die Korrekturfaktoren wurden dann angewendet (d.h. subtrahiert) auf die Unterschiede zwischen den Referenzansprachen und den Probeansprachen, um Ansprachen zu ergeben, worin die Masse-Brechungsindexverteilungen von DMSO-Lösungsmitteladditiv eliminiert waren.
  • Korrigierte relative Ansprachen der Wirkstoffkandidaten A-C
  • Der modifizierte CM5-Sensorchip (mit Oberflächen-gebundenen Biomolekülen, wie oben in Tabelle 1 angegeben), wurde verwendet, um die Bindungswechselwirkung der drei Wirkstoffkandidaten A-C zu messen. Konzentrationsreihen (d.h. 0, 20, 50, 100, 500 und 1000 μm) jedes Wirkstoffkandidaten wurden hergestellt und sequenziell im Reihen- bzw. seriellen Modus in den Biosensor eingespritzt, sodass vier Sensorgramme, die der jeweiligen Flusszelle entsprechen, entwickelt wurden. Korrigierte relative Ansprachen unter Stationärzustandsbindungsgraden für jede Wirkstoffkonzentration wurden für jede der erfassenden Zieloberflächen/Flusszellen bestimmt; solche Daten sind unten in den Tabellen 2-4 dargestellt.
  • TABELLE 2 WIRKSTOFFKONZENTRATIONSDATEN FÜR HUMANES SERUMALBUMIN
    Figure 00410001
  • TABELLE 3 WIRKSTOFFKONZENTRATIONSDATEN FÜR POPC-LIPOSOM
    Figure 00410002
  • TABELLE 4 WIRKSTOFFKONZENTRATIONSDATEN FÜR DMPC-LIPOSOM
    Figure 00410003
  • Analyse von Daten
  • Die korrigierten relativen Ansprachen für jede Wirkstoffkonzentration, wie oben angegeben in den Tabellen 2-4, wurden unter anderem abgestimmt auf Unterschiede bezüglich des Molekulargewichts der Wirkstoffkandidaten, als auch transformiert, um eine Korrelation mit anderen Eigenschaften zu erhöhen. Zum Beispiel wurde für jede erfassende Zieloberfläche/Flusszelle eine scheinbare Gleichgewichtskonstante (KD) berechnet durch Aufnahme der gemessenen Gleichgewichts-(Req)-Daten und bekannter Wirkstoffkonzentrationen (C)-Daten in Gleichung (3): Req = C*Rmax/(C + KD) + Kompensation (3)worin Rmax die maximale Bindungskapazität der erfassenden Oberfläche ist. In dem Anpassungsverfahren wurden Rmax, KD und die Kompensation berechnet.
  • Alternativ kann die scheinbare Gleichgewichtskonstante (KD) berechnet werden aus zwei Konzentrationen des Wirkstoffkandidaten, C1 und C2, durch Verwendung der Gleichung (4): KD = (ReqC1/C1 – ReqC2/C2)/(ReqC2 – ReqC1) (4)
  • In jedem Fall wurden die KD-Werte, die über den Biosensor erhalten wurden, nachfolgend mit bekannten KD-Werten korreliert, die berechnet sind aus angegebenen Humanserumalbuminbindungsprozentanteilen (d.h. angegebene Bindungsprozentanteile, die für bekannte Wirkstoffverbindungen angegeben worden sind), wobei eine Vorhersage des Ausmaßes der Proteinbindung für jeden der drei Wirkstoffkandidaten A-C ermöglicht wird. In anderen Worten ausgedrückt, wurde ein Korrelationsgraph, wie in 4 gezeigt, konstruiert, wobei bekannte KD-Werte für bekannte Verbindungen entlang der Abszisse (d.h. die x-Achse) aufgetragen wurden und entsprechende gemessene KD-Werte, die über den Biosensor erhalten wurden, entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse) aufgetragen wurden. Dieser Korrelationsgraph wurde dann verwendet, um das Ausmaß der Plasmaproteinbindung für jeden der drei Wirkstoffkandidaten A-C vorherzusagen (siehe unten).
  • Zusätzlich wurde für jede erfassende Zieloberfläche/Flusszelle eine auf das Molekulargewicht eingestellte Ansprache bei einem einzelnen Konzentrationsgrad als ein Schwellenwert zum Klassifizieren der Wirkstoffkandidaten A-C verwendet. Im Spezielleren wurde, wie in 5 gezeigt, ein Korrelationsgraph konstruiert, worin entsprechende Bindungsgrade bei 100 μM (R 100 μM), dividiert durch das Molekulargewicht der bekannten Wirkstoffverbindung, entlang der Abszisse (d.h. die x-Achse) aufgetragen und entsprechende Humanserumalbuminbindungsprozentanteile, gemäß Messung durch Gleichgewichtsdialyse wurden entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse) aufgetragen. Dieser Korrelationsgraph wurde dann verwendet, um zwischen starken und schwachen Serumalbuminbindungsmitteln für jeden der drei Wirkstoffkandidaten A-C zu unterscheiden.
  • Darüber hinaus wurden für jede Ziel-erfassende Oberfläche/Flusszelle Referenzbereinigte Sensorgrammspuren (z.B. FC2 minus FC1) entwickelt, um das Vorliegen von Präzipitaten (bewirkt durch geringe Löslichkeit) nachzuweisen. Im Spezielleren wurden Referenz-bereinigte Sensorgrammspuren für jeden der drei Wirkstoffkandidaten A-C, wie in 6 gezeigt, konstruiert. (Es ist festzuhalten, dass, wenn Präzipitate sich bilden und dann an die erfassende Oberfläche binden/assoziieren) das Ansprachesignal auf eine nicht-kontinuierliche Art abnehmen wird). Durch Analysieren der Konzentrationsreihen für jeden der drei Wirkstoffkandidaten A-C (wie in 6 gezeigt) wurde bestimmt, dass Wirkstoffkandidat A präzipitierte und daher relativ geringe Löslichkeit aufwies, während die Wirkstoffkandidaten B-C nicht präzipitierten und daher relativ hohe Löslichkeiten aufwiesen.
  • Schließlich, und wie unten in Tabelle 5 gezeigt, wurde die kombinierte Information aus jeder Ziel-erfassenden Oberfläche/Flusszelle tabellarisch, dargestellt in einer reduzierten Charakterisierungsmatrix, worin jeder Wirkstoffkandidat A-C ein Qualitätsmuster erhielt, das geeignet war zur Auswahl der Leitwirkstoffverbindungen (es ist festzuhalten, dass die vorhergesagte Lipophilizität und Fraktion, die absorbiert wird, vorhergesagt sind).
  • TABELLE 5 CHARAKTERISIERUNGSMATRIX FÜR DIE WIRKSTOFFKANDIDATEN A-C
    Figure 00440001
  • Basierend auf der vorhergehenden Charakterisierungsmatrix wurde bestimmt, dass Wirkstoffkandidat B die bevorzugte Verbindung war, aufgrund seines geringen Plasmaproteinbindungsgrades (HSA % gebunden < 90), mittlerer Lipophilizität (vorhergesagte Lipophilizität = 2), keiner identifizierten Löslichkeitsprobleme (Löslichkeit = OK) und akzeptabler Intestinalabsorption (vorhergesagter absorbierte Fraktion > 90).
  • BEISPIEL 2
  • GEZEIGTE KORRELATION ZWISCHEN BIOSENSORDATEN UND ABSORBIERTER FRAKTION BEI MENSCHEN (FA %)
  • Dieses Beispiel offenbart eine Korrelation zwischen Biosensordaten, erhalten durch das BIACORE-Instrument (d.h. BIACORE 3000) und bekannten Daten für den Anteil bzw. die Fraktion, die in Menschen absorbiert wird (FA%), für eine Anzahl verschiedener Wirkstoffe, worin der Korrelationsgraph geeignet ist für Wirkstoffkandidatenabsorptionsvorhersagen. – Im Spezielleren wurde ein Korrelationsgraph, wie in 7 gezeigt, konstruiert, der einen bekannten Anteil, der in Menschen absorbiert wird (FA%), zeigt, aufgetragen entlang der Ordinate (d.h. die y-Achse) und entsprechende kalibrierte (d.h. Referenz-bereinigte) Stationärszustandbindungsgrade für jeden Wirkstoff bei 500 μM, aufgetragen entlang der Abszisse in einer 10-Logarithmusskala (d.h. die x-Achse). In diesem Beispiel wiesen die erfassenden Oberflächen auf den Zielflusszellen jeweils 6000 RU POPC-GM3 Gangliosid (erhältlich von Sigma) eingefangen auf Stearylaminplatten auf. (Es ist festzuhalten, dass eine nichtmodifizierte erfassende Oberfläche auf einem CM5-Sensorchip als die Referenz verwendet wurde). Wie in 7 gezeigt, besteht ein hoher Korrelationsgrad zwischen den Biosensordaten und den bekannten Daten der Fraktion, die in Menschen absorbiert wird (FA%), wie durch den/die mathematischen Ausdruck/Funktion gezeigt wird, der/die auf die verschiedenen Datenpunkte angepasst wurde.
  • Darüber hinaus zeigt der Korrelationsgraph auch eine Klassifizierung der verschiedenen Substanzen, worin Absorption der Substanzen unter Verwendung der passiv transportierenden transzellulären Route durch den Darm angegeben werden durch h = hoch, m = mittel und l = gering, und worin Absorption unter Verwendung von aktivem Transport angegeben wird durch h-act = hoch, und worin Absorption von Substanzen mit Molekulargewichten < 200 unter Verwendung der parazellulären Route durch h-para = hoch bzw. m-para = mittel angegeben wird. (Es ist festzuhalten, dass Sulfasalazin eine Wirkstoffvorstufe ist, welche sich rasch im Darm zersetzt, was seine am Rande liegenden Eigenschaften erklärt; Piroxicam weist sehr geringe Löslichkeit <<<< 500 μM auf, was das Fehlen von Korrelation erklären kann).
  • BEISPIEL 3
  • BIOSENSORANALYSEN DER WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN IMMOBILISIERTEM HUMANEN SERUMALBUMIN UND WIRKSTOFFVERBINDUNGEN ZUR VORHERSAGE VON HSA
  • Viele Verbindungen binden reversibel an humanes Serumalbumin (HSA), α1-Säureglycoprotein (AGP) und andere Serumkomponenten. Die Affinität eines Wirkstoffs gegenüber Plasmaproteinen ist ein wichtiger Punkt beim Bestimmen eines pharmakokinetischen Gesamtprofils. Ein hohes Ausmaß Proteinbindung verringert die freie Konzentration und daher die physiologische Aktivität des Wirkstoffs. Zirkulation des Proteinwirkstoffkomplexes dient ebenfalls dazu, die Konzentration von freiem Wirkstoff zu ergänzen, da freier Wirkstoff aus dem Körper entfernt wird durch verschiedene Eliminierungsverfahren, und dadurch wird die Dauer der Wirkstoffwirkung verlängert. Daher ist das Ausmaß der Proteinbindung ein wichtiger Faktor bei der heiklen Ausgewogenheit zwischen vorgesehener physiologischer Aktivität und potenziellen Nebenwirkungen des Wirkstoffs. Idealerweise sollte die freie Konzentration von jedem Wirkstoffkandidaten in dem Blut des Patienten, für welchen der Wirkstoff vorgesehen ist, abgeschätzt werden. Frühe Abschätzungen der Proteinbindungsausmaße, als auch anderer ADME-Parameter werden nun wichtiger bei dem Verfahren zum Entdecken eines Wirkstoffs. Daher werden vereinfachte Ansätze zur Bestimmung der Proteinbindung in Betracht gezogen. Eine große Vielzahl von Verfahren und experimenteller Bedingungen werden für diesen Zweck verwendet. Verfahren umfassen Gleichgewichtsdialyse, Ultrafiltration, Ultrazentrifugation, spektroskopische Verfahren, Affinität- und Größenausschlusschromatographie und elektrophoretische Verfahren, wie dargestellt in der Übersicht von Oravcová (Oravcová et al., "Drug-Protein Binding Studies. New Trends in Analytical and Experimental Methodology", J. Chromatogr. 677:1–28 (1996) und Hage (Hage et al., "Review. Recent Advances in Chromatographic and Electrophoretic Methods for the Study of Drug-Protein Interactions", J. Chromatogr., 699:499–525 (1997)). Diese Verfahren beruhen entweder auf einer Separation von gebundenem und freiem Wirkstoff oder Protein oder auf einer Veränderung der intrinsischen Parameter, wie etwa der Mobilität des Proteins oder den spektroskopischen Eigenschaften eines Wirkstoff-Protein-Komplexes. Um die Untersuchungen von Wirkstoff-Protein-Wechselwirkungen zu vereinfachen, ist es ebenfalls üblich einzelne Proteine, HSA und/oder α1-Säureglycoprotein anstelle von Blut oder Plasma zu verwenden. Dieser Ansatz ist besonders geeignet, wenn viele Verbindungen auf Proteinbindung zu untersuchen sind. Darüber hinaus ist ebenfalls gezeigt worden, dass die Verwendung von immobilisiertem HSA in der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) genau die Bindung von Wirkstoffen an freies HSA zeigt. (Domenici et al., "Immobilized Serum Albumin: Rapid HPLC Probe of Stereoselective Protein Binding Interactions", Chirality 2:263–268 (1990) und Domenici et al., "Use of a Human Serum Albumin-Based Chiral Stationary Phase for High-Performance Liquid Chromatography for the Investigation of Protein Binding: Detection of the Allosteric Interaction Between Warfarin and Benzodiazepin Binding Sites", J. Pharm. Sci., 80, 164–169 (1991)).
  • Diese Ergebnisse ermutigten uns die Verwendung der Biosensortechnologie für Affinitätsanalysen und zum Einstufen der Bindung von Wirkstoffverbindungen an Oberflächen-immobilisiertes HSA zu untersuchen. Die Hauptvorteile der Biosensortechnologie (hier ein Oberflächenplasmonresonanzsensor, SPR-Sensor) sind, dass die Bindung direkt überwacht wird, ohne die Verwendung von Markern, der Probenverbrauch gering ist und die Analyse schnell und automatisiert ist. ((Jönsson et al., "Real-Time Biospecific Interaction Analysis. The Integration of Surface Plasmon Resonance Detection, General Biospecific Interface Chemistry and Microfluidics into one Analytical System", Advances in Biosensors, 2:291–336 (1992) und Szabo et al., "Surface Plasmon Resonance and its Use in Biomolecular Interaction Analysis", (BIA). Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699–705 (1995)). In diesem Beispiel zeigen wir ein neues Verfahren, basierend auf dem Einspritzen bzw. Injizieren von Verbindungen mit einer einzigen Konzentration, zum Klassifizieren von Verbindungen als starke, mittlere oder schwache HSA-Binder, durch Vergleichen ihres Bindungsausmaßes mit dem von ausgewählten Referenzverbindungen.
  • Materialien und Verfahren
  • Geräteausstattung: BIACORE 3000 von Biacore AB, Uppsala, Schweden, wurde verwendet, 8. Wechselwirkungsanalyse wurde bei 25 °C durchgeführt. Puffer. 67 mM isotonischer Phosphatpuffer mit 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO), pH-Wert 7,4, (9,6 g) Na2HPO4·2H2O, 1,7 g KH2PO4, 4,1 g NaCl auf 1 Liter) wurde als Laufpuffer während der Untersuchung verwendet. Immobilisierung von HSA: Der Sensorchip CM5 wurde für die Analyse verwendet. Der Sensorchip besteht aus einem Carboxymethyl-modifizierten Dextranpolymer, gebunden an einen goldüberzogenen Glasträger. (Johnsson et al., "Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran Modified Gold Surface for Biospecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance Sensors", Anal. Biochem., 198:268–277 (1991)). HSA (Sigma, im Wesentlichen frei von Fettsäure und Globulin, A 3782) mit 1 mg/ml wurde auf 15 ug/ml in 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,2 verdünnt und auf dem Sensorchip immobilisiert, unter Verwendung von Aminkopplung. Laufpuffer ohne DMSO wurde während der Immobilisierung verwendet. Die Oberfläche wurde aktiviert durch Einspritzen einer Lösung, die 0,2 M N-Ethyl-N'-dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) und 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) enthielt, für 7 Minuten. HSA wurde während 7 Minuten eingespritzt und die Oberfläche wurde dann blockiert durch Einspritzen von 1 M Ethanolamin bei pH-Wert 8,5 für 7 Minuten. 50 mM NaOH wurden eingespritzt in drei 30 Sekunden Pulsen, um nichtkovalent gebundenes HSA abzuwaschen und die Grundlinie zu stabilisieren. Schlussendliche Immobilisierungsgrade waren zwischen 9500 und 11000 RU (Resonanzeinheiten). Das Immobilisierungsverfahren wurde gefolgt von mehreren Waschungen mit Puffer, um die HSA-Oberfläche in dem DMSO-Laufpuffer zu äquilibrieren. Unmodifiziertes Dextran wurde als eine Referenzoberfläche verwendet. Um höchste Empfindlichkeit sicherzustellen, wurde die SPR-Detektoransprache vor Durchführen der Untersuchung normalisiert, durch Kalibrieren des Detektors bei verschiedenen Lichtintensitäten, unter Bedingungen von totaler interner Reflexion (automatisiertes Verfahren). Verbindungen: Naproxen, Sulphadimethoxin, Warfarin, Digitoxin, Diazepam, Naproxen, Pyrimethamin, Coumarin, Salicylsäure, Rifampicin, Phenytoin, Prednison, Chinin, Salbutamol, Dipyridamol, Timolol, Acebutulol, Atenolol, Alprenolol, Pindolol, Metoprolol und Propanolol waren von Sigma. Ketanserin war von Fluka. Ritonavir war ein Geschenk von Björn Claeson, Medivir. Delavirdin, Tolterodin, 5-HM und Tipranivir waren Geschenke von Pharmacia & Upjohn. Die Verbindungen wurden ausgewählt um: a) einen weiten Affinitätsbereich gegenüber HSA abzudecken, b) Binder an Hauptbindungsstellen zu umfassen, c) verschiedene Verbindungsklassen zu umfassen, d) einen Molekulargewichtsbereich aufzuweisen, e) falls möglich kommerziell verfügbar zu sein, siehe ebenfalls Tabelle 7. Die Verbindungen wurden aus 20 mM DMSO-Stammlösungen auf ihre Endkonzentration in Laufpuffer verdünnt. Die Verdünnung wurde so durchgeführt, dass der pH-Wert und die Konzentrationen von sowohl DMSO als auch Puffersubstanzen in Proben und Laufpuffer sorgfältig abgestimmt waren.
  • Kalibrierung von DMSO-Massedifferenzen zwischen Referenz- und HSA-Flusszellen
  • Das SPR-Signal spiegelt Änderungen des Brechungsindex (RI) an der Sensoroberfläche wider. RI-Änderungen sind eine Konsequenz der Bindungsereignisse nahe der Sensoroberfläche und stehen in Beziehung mit der Erhöhung der Masse auf der Oberfläche (Stenberg et al., "Quantitative Determination of Surface Concentration of Protein with Surface Plasmon Resonance using Radiolabeled Proteins", J. Colloid Interface Sci., 143:513–526 (1991)). Ein zusätzliches Signal wird erhalten, wenn die injizierte Probe einen RI aufweist, der sich von dem des Laufpuffers unterscheidet. Dieses Signal wird als Lösungsmitteleffekt bezeichnet. Wenn der Lösungsmitteleffekt klein ist (in der Größenordnung von einhundert RU) kann er normalerweise von dem Gesamtsignal eliminiert werden durch Subtraktion des Signals von der Referenzoberfläche (Karlsson et al., "Surface Plasmon Resonance Detection and Multi-Spot Sensing for Direct Monitoring of Interactions Involving Low Molecular Weight Analytes and for Determination of Low Affinities", Anal. Biochem., 288:274–280 (1995)). Jedoch kann die Einführung eines Lösungsmittels mit hohem Brechungsindex, wie etwa DMSO, zu starken Verschiebungen des Brechungsindex während der Injektion führen und bloße Subtraktion der Daten von der Referenzflusszelle reicht nicht mehr aus. Um diese Wirkungen zu korrigieren wurde ein DMSO-Kalibrierungsverfahren angewendet (9c).
  • Pufferlösungen mit variierenden Konzentrationen von DMSO (4,5 – 6 %) wurden aufeinanderfolgend über Referenz- und HSA-Oberflächen injiziert. Dies wurde durchgeführt zu Beginn und am Ende von jedem Versuch, unter Verwendung der gleichen Flussrate wie für die Untersuchung bzw. den Assay. Die Ansprachen der Kalibrierungslösungen, die aus der Referenzoberfläche erhalten werden, deckten einen Bereich von nicht größer als –500 bis +1000 RU relativ zur Grundlinie ab. Eine DMSO-Kalibrierungskurve wurde entwickelt durch Auftragen des Unterschieds der Ansprache zwischen HSA und Referenzflusszellen gegen die Ansprache der Referenzflusszelle. Die Kurve wurde verwendet zum Korrigieren von Anspracheausmaßen, die während Probeinjektion erhalten wurden.
  • Untersuchungsusgestaltung. Verbindungen wurden über die Referenz- und HSA-Flusszelle während einer Minute bei einer Flussrate von 30 μl/min injiziert. Jeder Zyklus bestand aus einer einminütigen Warteperiode zum Überwachen der Grundlinienstabilität, einer einminütigen Injektion der Verbindung, einer 35 Sekunden dauernden ungestörten Dissoziationsphase und einer Waschung des Flusssystems, ausgenommen die Sensoroberfläche, mit einem 1:1-Gemisch von DMSO und Wasser. Verbindungsansprachen in der Referenzflusszelle waren innerhalb des Bereichs der DMSO-Kalibrierungskurve, Extrapolation der Kalibrierungskurve wurde nicht angewendet. Eine Injektion von Laufpuffer wurde zwischen jeder Probe durchgeführt, um auf Verschleppungseffekte zu überprüfen. Acht DMSO-Kalibrierungslösungen wurden sequenziell injiziert, jede während 30 Sekunden, zu Beginn und am Ende von jedem Versuch.
  • Datenbeurteilung: Daten, die erhalten wurden in der Referenzflusszelle wurden von denjenigen subtrahiert, die erhalten wurden in der HSA-Flusszelle. Ansprachen auf Injektionen von Wirkstoffverbindungen und Kalibrierungslösung wurden zwischen Reportpunkten entgenommen, die bei 10 Sekunden gesetzt waren, vor Injektionsstart und 10 Sekunden vor dem Ende der Injektion. Diese Ansprachen wurden weiter korrigiert hinsichtliche DMSO-Effekten, durch Verwendung der Kalibrierungskurven (9) und die letztendlichen Ansprachewerte wurden in KD-Bestimmungen und in Einstufungsversuchen verwendet. Um eine Einschätzung von KD- und Ansprache-Werten bei Stellensättigung (Rmax) zu erhalten, wurden gemessene Ansprachewerte (Req), die mit verschiedenen Konzentrationen (C) der Verbindung erhalten wurden, angepasst an die Gleichung: Req/mw = C × Rmax/(C+KD) (5)
  • Diese Gleichung wurde früher erhalten für den allgemeinen Fall einer Analytbindung an einen immobilisierten Partner (Karlsson et al., "Kinetic Analysis of Monoclonal Antibody-Antigen Interactions with a New Biosensor Based Analytical System", J. Immunol. Methods, 145:229–240 (1991)) und liefert hier die Affinität und die Sättigungsansprache für eine Verbindung, die mit einer einzelnen Stelle von immobilisiertem Albumin wechselwirkt. Um einen Vergleich von Ansprachen, die erhalten werden mit Verbindungen mit varrierenden Molekulargewichten zu erleichtern, wurde Req/mw, d.h. die Stationärszustandsansprache dividiert durch das Molekulargewicht der Verbindung, in dem Anpassungsverfahren anstelle von Req verwendet. Bei Verwendung dieses Verhältnisses wurde der Sättigungsgrad Rmax als identisch für alle Verbindungen erachtet, die an eine einzelne Stelle von Albumin binden und Dosisansprachekurven verschiedener Verbindungen wurden daher gleichzeitig mit Rmax als ein globaler Parameter analysiert, d.h. gemeinsam für alle Verbindungen, und KD als ein lokaler Parameter, d.h. einzigartig für jede Verbindung.
  • Um durch dieses Verfahren berechneteKD zu vergleichen mit angegebenen Graden von %-Bindung wurde die Gleichgewichtsgleichung verwendet, [HSA] [Wirkstoff]/[HSA-Wirkstoffkomplex]=KD. Eine Konzentration von 0,68 mM HSA in Serum wurde angenommen. Mit x als die Gesamtkonzentration der Verbindung und p als der Teil, der gebunden ist: (0,68-. x p) × (x –x . p)x . p = KD. Nachfolgend auf eine Eingabe von p (p ist gleich %-gebunden/100) wurden KD- Werte für Gesamtwirkstoffkonzentrationen im Bereich von 0,1 nM bis 1 nM berechnet. Berechnete KD-Werte waren weitgehend unabhängig von der Gesamtwirkstoffkonzentration. Werte für ausgewählte Verbindungen sind in Tabelle 6 gezeigt.
  • In Einstufungsversuchen wurden Ansprachen, erhalten bei einer Konzentration von 80 μM, dividiert durch das Molekulargewicht der Verbindung, um einen Vergleich der Bindungsausmaße zu erlauben.
  • ERGEBNISSE
  • Sensorgramme und Kalibrierung von Lösungsmitteleffekten
  • Alle getesteten Verbindungen banden reversibel an immobilisiertes HSA. Während der Injektion wurde eine Stationärszustandsansprache innerhalb von wenigen Sekunden erreicht. Nach Ende der Injektion dissoziierten Wirkstoffverbindungen sehr rasch und das Signal kehrte nahezu unmittelbar zur Grundlinie zurück (9a und 9b). Unter den untersuchten Verbindungen blieb nur Tipranivir an der HSA-Oberfläche für mehr als zwei Minuten gebunden.
  • Um Fehler bei der Referenzsubtraktion bzw. Referenzbereinigung zu verringern, wurden Lösungsmitteleffekte hierfür durch Anwenden eines DMSO-Kalibrierungsverfahrens kompensiert (9c). Lösungsmitteleffekte von Proben lagen typischerweise im Bereich von –100 und 500 RU, was zu Korrekturfaktoren von –20 bis 10 RU führte. In früheren Studien ist gezeigt worden, dass Fehler durch verbleibendes Lösungsmittel sehr gering sind und zwischen +/– 3 RU liegen wenn Lösungsmitteleffekt größer als 2000 RU waren (Karlsson et al., "BIACORE Analysis of Drug Target Interactions. Direct und Competitive Binding Assays for Investigation of Interactions between Thrombin and Thrombin Inhibitors", Anal. Biochem., 278:1–13 (2000)).
  • Aktivität und Stabilität von immobilisiertem HSA.
  • Die Hauptwirkstoffbindungsstellen auf HSA blieben verfügbar nach Immobilisierung von HSA auf der Sensoroberfläche über ihre Amingruppen. Dies wurde gezeigt durch die Bindung von Warfarin (Zatón et al., "Binding of Coumarins to Site I of Human Serum Albumin. Effect of the Fatty Acis", Chemico-Biol. Int. 97:169–174 (1995)) an Stelle I (die Warfarinstelle), Naproxen (Cheruvallath et al., "A Quantitative Circular Dichroic Investigation of the Bindung of the Enantiomers of Ibuprofen and Naproxen to Human Serum Albumin", J. Pharm. Biomed. Anal., 15:1719–1724 (1997)) an Stellle II (die Benzodiazepinstelle) und durch Bindung von Digitoxin (Kragh-Hansen, U., "Relations between High-Affinity Binding Sites of Markers for Binding Regions on Human Serum Albumin", Biochem. J., 225:629–638 (1985)) an seine Stelle (10a–10c). Erwartungsgemäß standen Sättigungsgrade in Beziehung mit dem Molekulargewicht der Verbindungen. Digitoxin mit einem MG von 765 Da, Warfarin mit MG von 308 Da und Naproxen mit MG von 230 Da erreicht Sättigungsgrade nahe 70, 35 bzw. 15 RU. Diese Werte zeigten, dass hauptsächlich einzelne Stellen bei diesen Konzentrationen besetzt waren, mit Ausnahme von Ritronavir, worin die Ansprache eine Stöchiometrie von mehr als einem Ritronavirmolekül/HSA-Molekül zeigte (10d).
  • In Einstufungsversuchen wurde Warfarin zu einer positiven Kontrolle der HSA-Aktivität verwendet. Warfarin wurde früh, in der Mitte und spät in jedem Versuch injiziert. Referenz-bereinigte und kalibrierte Ansprachen von Warfarin eines Versuchs, der durchgeführt wurde am Tag der HSA-Immobilisierung und eines Versuchs, der sieben Tage später durchgeführt wurde auf derselben HSA-Oberfläche, sind in Tabelle 7 gezeigt.
  • Die Warfarin-Ansprache war stabil und auf dieser Oberfläche lagen die Ansprache grade im Bereich von 37,1 bis 41,8 RU, bei einer Standardabweichung von 1,6 RU.
  • KD-Bestimmungen
  • Dosis-Ansprachekurven, die erhalten wurden für Warfarin, Naproxen, Digitoxin, Ritonavir, Chinin und Rifampicin sind in 10 gezeigt. Für Warfarin- und Naproxen-Bindung traten monophasige und angenäherte Sättigungsgehalte bei niedrigen Konzentrationen auf. Für Ritonavir und zu einem gewissen Ausmaß Digitoxin zeigten Ansprachegrade eine biphasige Wechselwirkung. Chinin und Rifampicin ergaben lineare Dosisansprachekurven über einen weiten Konzentrationsbereich und es war nicht möglich, Sättigungsgrade einzuschätzen.
  • Bei gegebenen Dosis-Ansprachekurven in 10 war KD-Analyse problematisch. Um eine Einschätzung der Affinität vornehmen zu können, wurde die Analyse vereinfacht unter der Annahme a) dass HSA-Bindungsstellen gleichermaßen verfügbar waren, 2) dass nur Hochaffinitätsstellen besetzt waren bei Konzentrationen unter 40 μM und 3) dass Ansprachegrade normalisiert waren durch Teilen der gemessenen Ansprache (RU proportional zu g/m2) durch das Molekulargewicht (RU/MG proportional zu Mol/m2). Die mit diesen Annahmen erhaltenen KD Daten (aus Gleichung 1) zeigten, dass Verbindungen mit geringer und mittlerer Bindung an HSA höhere KD-Werte ergaben als Verbindungen mit hohem Bindungsgrad an HSA und legten eine gute Korrelation nahe zwischen angegebenen Prozent, die gebunden sind, und KD, jedoch mit begrenzter Auflösung von Verbindungen mit Bindungsgraden über 97 % Bindung (Tabelle 8).
  • Einstufung von Bindungsgraden, Vergleich von Biosensordaten mit herkömmlichen Techniken. Zum Einstufen von Verbindungen verwendeten wir einen einfacheren Ansatz durch Messen des Ausmaßes der Bindung bei einer Konzentration, die hoch genug ist, um ein vernünftiges Signal zu ergeben, jedoch gering genug, um eine Fehlinterpretation von Verbindungen zu ergeben, die an mehrere Bindungsstellen binden. Die Bindungsgrade von 19 Wirkstoffen mit Molekulargewichten zwischen 138 und 823 Da und mit angegebenen HSA- Bindungsgraden zwischen 8 und 99,9 % wurden durch zweifache Injektionen einer Einzelkonzentration (80 μM) von jedem Wirkstoff untersucht. Identische Versuche wurden am Tag der HSA-Immobilisierung und eine Woche später auf der gleichen HSA-Oberfläche durchgeführt. 11 zeigt die Korrelation zwischen Bindungsgraden, die am Tag der HSA-Immobilisierung erhalten werden, und dem angegebenen Ausmaß der HSA-Bindung. Zum Erhöhen der Auflösung der Verbindungen mit hoher Affinität wurden Werte auf einer logarithmischen Skala und einer 2-log10 (100 %-gebunden) Skala als eine Funktion der Biosensordaten aufgetragen.
  • In einer Screeningsituation bzw. Untersuchungssituation kann es geeignet sein Verbindungen als Marker für Bindemittel bzw. Binder mit mittlerem und hohem Ausmaß aufzunehmen. Die in 11 angegebenen Daten können dann erneut aufgetragen werden indem nur die Biosensordaten verwendet werden (12). Unter Verwendung von Diazepam mit einem angegebenen Bindungsgrad von 86,1 % und Warfarin mit einem angegebenen Bindungsgrad von 98 % als Markerverbindungen, könnten Wirkstoffe in Bindemittel bzw. Binder mit geringem, mittlerem und hohem Grad eingeteilt werden.
  • Beim Testen auf der gleichen HSA-Oberfläche wurden eine Woche später alle 19 Verbindungen in die gleichen Gruppen klassifiziert, ausgenommen für Salicylsäure, welche sich von mittel nach gering bei der zweiten Analyse veränderte. Die individuelle Einstufung innerhalb der Gruppe von Bindemitteln mit hohem Grad waren die gleichen wie am Tag der Immobilisierung. Innerhalb der mittel- und gering-Gruppe verschoben sich die Plätze einiger Verbindungen, jedoch nur Salicylsäure ging von mittel auf gering über.
  • Diskussion
  • Frühere Einschätzungen der pharmakokinetischen Eigenschaften können verwendet werden, um Daten zu ergänzen, die gefunden werden für die Wechselwirkung zwischen einer Verbindung und ihrem pharmakologischen Ziel.
  • Die kombinierten Daten können ein breiteres Verständnis der funktionellen Aspekte der Verbindungen liefern und dies kann geeignet sein sie zu Wirkstoffkandidaten zu entwickeln. Im Hinblick auf Proteinbindung ist es von besonderem Interesse Verbindungen zu identifizieren, die zu hohem Ausmaß an Plasmaproteine gebunden sind. Wir haben ein Screeningverfahren bzw. Untersuchungsverfahren entwickelt zum Einstufen der Bindung von Verbindungen an immobilisiertes HSA, das auf Biosensortechnologie beruht.
  • Die Verwendung verschiedener Methoden und experimenteller Bedingungen zur Bestimmung der HSA-Bindungsgrade variiert beachtlich und für einige Verbindungen, die in diesem Beispiel verwendet werden, waren die angegebenen Bindungsdaten manchmal widersprüchlich, wodurch eine klare Korrelationsuntersuchung schwierig gemacht wurde. Beispiele der Variationen angegebener Bindungsgrade umfassten Warfarin 98,0 % – 99,6 % (Ferrer et al., "The Binding of Benzopyranes to Human Serum Albumin. A Structure-Affinity Study", J. Protein. Chem. 17: 115–119 (1998); und Vestberg et al., "High-Affinity Binding of Warfarin, Salicylate and Diazepam to Natural Mutants of Human Serum Albumin Modified in the C-Terminal End", Biochem. Pharmacol. 44:1515-1521 (1992)), Diazepam 86,1 % – 98,2 % (McNamara et al., "The Protein Binding of Phenytoin, Propranolol, Diazepam and AL01576 (ein Aldosereduktaseinhibitor) in Human and Rat Diabetic Serum", Pharm. Res., 5:261–265 (1988); und Viani et al., "Binding of Diazepam, Salicylic Acid and Digitoxin to Albumin Isolated from Fetal and Adult Serum", Dev. Pharmacol., Ther., 17: 100–108 (1991)) und Salicylsäure 81,7 % – 90,5 % (Gahramani et al., "Pharmacokinetics and Drug Disposition; Protein Binding of Aspirin and Salicylate Measured by In Vivo Ultrafiltration", Clin. Pharmacol. Ther., 63:285–295 (1998); und Viani et al., "Binding of Diazepam, Salicylic Acid and Digitoxin to Albumin Isolated from Fetal and Adult Serum", Dev. Pharmacol. Ther., 17:100–108 (1991)). Für andere Verbindungen wurde nur ein Literaturwert gefunden, jedoch wäre sehr wahrscheinlich eine ähnliche Variation gefunden worden, wenn diese Verbindungen durch verschiedene Methoden untersucht worden wären. Trotz dieser Erkenntnisse war es möglich, Biosensordaten mit HSA-Bindungsgraden, die mit anderen Techniken bestimmt wurden, zu korrelieren.
  • Die Konzentration 80 μM wurde ausgewählt für Einstufungsversuche mit dem Zweck zum Aufzeigen der Einstufung von Verbindungen über den gesamten Affinitätsbereich. Bei dieser Konzentration waren die Ansprachen, die erhalten wurden für Verbindungen mit Bindungsgraden von weniger als 60 % noch gering, da jedoch viele Verbindungen eine begrenzte Löslichkeit aufweisen und da es gewünscht war den Einfluss von sekundären Bindungsstellen zu verringern, wurden höhere Konzentrationen nicht verwendet. Während der Herstellung dieses Manuskripts haben wir Hinweise beobachtet, dass die Konzentration auf 1040 μM verringert werden kann, wenn hauptsächlich die Identifizierung von hochgradigen Bindern im Zentrum des Interesses stand. Zum Unterscheiden zwischen Bindern mit geringer Affinität konnte ein alternativer Ansatz durch eine Inhibierungsstudie mit HSA in Lösung und wobei das Wirkstoffziel immobilisiert ist, verwendet werden.
  • Beim Vergleichen von Dosisansprachekurven und Beachten experimenteller Fehler einiger RU-Molekulargewicht-eingestellter Rmax-Werte, waren Werte, die mit Verbindungen erhalten wurden, die an verschiedene Stellen binden, ähnlich. Dies führte zu der Annahme, dass die Bindungsstellen gleichermaßen verfügbar waren. Dramatisch verschiedene Stellenverfügbarkeit hätte zu einer fehlerhaften Einstufung der Bindungsgrade geführt. Durch Verwendung von Warfarin und Diazepam als Referenzverbindungen wurde die Einteilung in hohen (> 95 %) oder geringen (< 80 %) Bindungsgrad erleichtert. Die Untersuchung von 12 zeigt, dass die angegebenen hochgradigen Binder Sulfadimethoxin und Ritonavir als Binder mittleren Grades klassifiziert wurden und Digitoxin war an der Grenze zwischen den Binder mittleren und hohen Grades. Der angegebene Wert von 99 Bindung für Ritonavir wurde in Plasma erhalten (Vacca, J. und Condra, J., "Clinically Effective HIV-1 Protease Inhibitors", DDT, 2:261–272 (1997)) und es ist weiter berichtet worden (Lazdins et al., "in Vitro Effect of Alpha1-Acid Glycoprotein on the Anti-Human Immunodeficiency Virus (HIV) Activity of the Protease Inhibitor CGP 61755: A Comparative Study with other Relevant HIV Protease Inhibitors", J. Infect. Dis., 175:1063–1070 (1997)) von einer 10–20-fachen Verringerung der Plasmabindung bei der Zugabe von AGP (α1-Säureglycoprotein), wodurch angezeigt wird, dass ein wesentlicher Teil der Plasmabindung an AGP vorliegt. Es könnte daher argumentiert werden, dass in dieser Hinsicht nur Sulfadimethoxin am Rande lag. Die Einstufung von Ketanserin als ein Binder mit geringem Ausmaß steht im Widerspruch zu dem angegeben Wert von 93,2 % (Meuldermans et al., "Plasma Protein Binding of Ketanserin and its Distribution in Blood", Arzneimittelforschung, 38:794–800 (1988)). Andere gaben eine geringere Bindung an, 90,6 % an Plasma (Trenk et al., "Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of the 5-HT2 Receptor Antagonist Ketanserin in Man", J. Cardiovasc. Pharm., 5:1034–1039 (1983)), wodurch ein geringer Bindungsgrad an HSA nahegelegt wird, jedoch ist weiterhin der Grund für die Diskrepanz zu diesem Zeitpunkt unbekannt.
  • Zusammen mit diesen Ergebnissen machen die ausgezeichnete Wiederholbarkeit der Warfarindaten und die Stabilität der HSA-Oberfläche das Biosensorverfahren gut geeignet zur Verwendung bei der Vorhersage von Proteinbindungsgraden. Ein besonderer Vorteil des vorliegenden Verfahrens war, dass Bindungsgrade, die mit einer Einzelinjektion der Verbindung erhalten werden zur Verwendung für die Korrelation verwendet werden könnten. Eine Platte mit 96 Vertiefungen für Verbindungen kann in 24 Stunden untersucht werden. Das Verfahren ist praktisch, es liefert die notwendige Information und eine komplizierte Analyse wird vermieden. Darüber hinaus können Einstufungsversuche ergänzt werden durch Konkurrenzuntersuchungen, um die Stellenspezifität zu bestimmen. In solchen Versuchen werden Verbindungen mit bekannter Stellenspezifität mit einem anderen Molekül konjugiert, um ihre Masse (und daher das Signal) zu erhöhen. Dieser Marker wird mit anderen Verbindungen gemischt und eine Konkurrenz für die Bindungsstelle wird erhalten (Karlsson, R., "Real Time Competitive Kinetic Analyses of Interactions between Low Molecular Weight Ligands in Solution and Surface Immobilised Receptors", Anal. Biochem., 221:142–151 (1994)).
  • Anfängliche Versuche zum Bestimmen von KD-Werten aus Biosensordaten zeigten, dass eine gewisse Information über die Anzahl von Bindungsstellen auf HSA erhalten werden könnte. Zum Berechnen von Daten für Binder mit geringer Affinität, wenn die Konzentration deutlich unterhalb der KD-Konzentration war, wurde Req/MG in dem Anpassungsverfahren verwendet. Rmax wurde dann als ein globaler Parameter verwendet, um die Anpassung zu erzwingen. Dies machte die KD-Werte logischer bzw. einheitlicher als einzelne Berechnungen von Rmax Werten für jede Verbindung. Jedoch war die Analyse ebenfalls komplex aufgrund von Schwierigkeiten beim Bestimmen von KD für Verbindungen mit mehreren Bindungsstellen. Trotz der Komplexizität bei der Affinitätsbestimmung enthält die Interpretation der Dosisansprachekurven für Hochaffinitätsbinder ein beachtliches Potenzial zum Erhalten einer stöchiometrischen Information.
  • Da die SPR-Technologie den Brechungsindex misst, ist es natürlich, dass zukünftige Versuche Untersuchungen umfassen wie Unterschiede der Brechungsindizes der Verbindungen die Analyse beeinflussen. Einige der Halogene sind dafür bekannt, dass sie hohen Brechungsindex aufweisen und wir haben festgestellt, dass Verbindungen, die z.B. Brom enthalten, höhere Ansprachewerte ergeben können als von dem Molekulargewicht erwartet. So können weitere Untersuchungen entlang dieser Linie verwendet werden, um die HSA-Bindungsdaten fein abzustimmen.
  • Die Möglichkeit zum Untersuchen der Wechselwirkungen mit anderen Plasmaproteinen, wie etwa AGP, ist in unserem Labor im Gange. Die ersten Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 13 gezeigt. Biosensordaten wurden korreliert gegen veröffentlichte AGP-Bindungsgrade von Tolterodin (Pahlman et al., "Serum Protein Binding of Tolterodine and its Major Metabolites in Humans and Several Animal Species", Biopharm. Drug Dispos., 20:91–99 (1999), Chinin (Wanwimolruk et al., "Plasma Protein Binding of Quinine: Binding to Human Serum Albumin, Alpha 1-Acid Glycoprotein and Plasma from Patients with Malaria", J. Pharm. Pharmacol., 44:806–811 (1992), sieben β-Adrenoceptor-Blockierungswirkstoffe (McDonnell et al., "Using Capillary Electrophoresis/Frontal Analysis to Screen Drugs Interacting with Human Serum Proteins", Electrophoresis, 19:448–454 (1998); und Belpair et al., "Binding of b-Adrenoceptor Blocking Drugs to Human Serum Albumin, to a1-Acid Glycoprotein and to Human Serum", Eur. J. Clin. Pharmacol., 22:253–256 (1982)) und Dipyridamol (MacGregor, T. und Sardi, E., "In Vitro Protein Behaviour of Dipyridamole", J. Pharm. Sci., 80:119–120 (1991)). Eine gute Korrelation der Bindung wurde beobachtet, mit der Ausnahme von Quinin, welches einen höheren Bindungsgrad aufwies im Vergleich mit anderen Techniken. Alle Versuchsbedingungen waren die gleichen wie für die HSA-Korrelationsversuche, ausgenommen die Immobilisierungschemie von AGP (13). Es wäre daher möglich, HSA und AGP in zwei verschiedenen Flusszellen zu immobilisieren, Verbindungen zu injizieren und Bindungsdaten für beide Proteine gleichzeitig zu erhalten.
  • TABELLE 6 VERBINDUNGEN, MOLEKULARGEWICHTE UND LITERATURSTELLEN FÜR HSA-BINDUNGSGRADE
    Figure 00610001
  • TABELLE 7 DATEN AUS ZWEI EINSTUFUNGSVERSUCHEN AUF DER GLEICHEN OBERFLÄCHE, DIE ERSTEN DATEN AM TAG DER HSA-IMMOBILISIERUNG UND DIE ZWEITEN 7 TAGE SPÄTER. WARFARIN (80 μM) WURDE FRÜH, IN DER MITTE UND SPÄT IN JEDER UNTERSUCHUNG INJIZIERT, UM DIE HSA-BINDUNGSAKTIVITÄT ZU ÜBERPRÜFEN.
    Figure 00620001
  • TABELLE 8 VERGLEICH DER LITERATURDATEN VON %-GEBUNDEN UND DER ENTSPRECHENDEN KD DES GLEICHGEWICHTSAUSDRUCKS WOBEI KD DURCH BIOSENSORANALYSE ERHALTEN WURDE.
    Figure 00620002
  • BEISPIEL 4
  • MÖGLICHKEIT DER IDENTIFIZIERUNG DES CYTOCHROM P450 ISOZYMS, DAS BEI DER BINDUNG EINER TESTSUBSTANZ BETEILIGT IST
  • Versuchsdurchführung
  • Die Versuche wurden auf einem Biacore 3000 Instrument durchgeführt, unter Verwendung eines CM5-Sensorchips. Der Laufpuffer enthielt 0,1 M Na/K-Phosphat (pH-Wert 7,5), 20 % Glycerol und 0,05 mM EDTA. Die Temperatur wurde bei 15 °C während des gesamten Versuchs gehalten.
  • Oberflächenvorbereitung
  • Die Chipoberfläche wurde aktiviert durch Injektion von 35 μl einer Lösung, die 5,75 g/l N-Hydroxysuccinimid und 37,5 g/l N-Ethyl-N'-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid enthielt. Die Proteine wurden dann immobilisiert durch Injizieren von 35 μl einer 10 ug/ml Lösung in einem Puffer, der 5 mM K-Phosphat (pH-Wert 6,8), 20 % Glycerol, 0,05 mM EDTA und 0,1 % Emulgen 913 enthielt. Nichtumgesetzte Oberflächengruppen wurden dann deaktiviert durch Injektion von 50 μl 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 0,15 M KCl und 20 % Glycerol. Die Flussrate während der Oberflächenvorbereitung war 5 μl/min. Die Oberfläche in der Referenzzelle wurde nicht aktiviert.
  • Analyse
  • Die Substanzen wurden in dem Laufpuffer in angegebenen Konzentrationen gelöst und bei einer Flussrate von 30 μl/min injiziert.
  • 14. CYP2D6 und CYP2C19 wurden in den Flusszellen 3 und 2 auf 13.000 bzw. 11.000 RU immobilisiert. Die Flusszelle 1 wurde als eine Referenz verwendet.
  • 15. CYP2E1 und CYP3A4 wurden in den Flusszellen 2 und 3 auf 8.500 bzw. 7.300 RU immobilisiert. Flusszelle 1 wurde als eine Referenz verwendet. Die Cytochrome P450 (CYP) sind eine Gruppe von Enzymen, die am Metabolismus vieler Wirkstoffsubstanzen beteiligt sind. Die Versuche zeigen die Möglichkeit der Identifizierung des Cytochrom P450-Isozyms, das an der Bindung einer Testsubstanz beteiligt ist. Dies ist ein wichtiger pharmakokinetischer Parameter, da er einen Rückschluss erlaubt, dass (i) die Substanz ein Potenzial hat, um die Pharmakokinetiken anderer Wirkstoffe, die dafür bekannt sind, dass sie durch das gleiche Isozym metabolisiert werden, beeinflussen und (ii) die Substanz selbst durch dieses Isozym metabolisiert werden kann. Die Substanzen, die in dem beschriebenen Versuch verwendet werden, Ketoconazol und Quinidin, sind dafür bekannt, dass sie spezifische Inhibitoren von CYP3A4 bzw. CYP2D6 sind. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die BIA-Untersuchung die Wechselwirkung dieser Substanzen mit ihren Zielen auf eine spezifische Art nachweisen kann.

Claims (20)

  1. Verfahren zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten mit einem Biosensor, der ein oder mehrere erfassende oberflächengebundene Biomoleküle aufweist, die damit verbunden sind, umfassend die Schritte: Messen der Bindungswechselwirkung zwischen dem Wirkstoffkandidaten und dem einen oder den mehreren erfassenden oberflächengebundenen Biomolekülen) des Biosensors zum Erhalten mindestens eines Bindungswechselwirkungsparameters des Wirkstoffkandidaten; und Vergleichen des mindestens einen Bindungswechselwirkungsparameters mit mindestens einem mathematischen Ausdruck, korrelierend mit den Bindungswechselwirkungsdaten, die mit bekannten Wirkstoffverbindungen verbunden sind, welche bekannte pharmakokinetische Parameter aufweisen, um eine Einschätzung mindestens eines pharmakokinetischen Parameters des Wirkstoffkandidaten vorzunehmen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der mindestens eine pharmakokinetische Parameter ein Absorptionsparameter, ein Verteilungsparameter, ein Metabolismusparameter oder ein Exkretionsparameter ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der mindestens eine pharmakokinetische Parameter Verteilungsvolumen, Gesamtclearance, Proteinbindung, Gewebebindung, metabolische Clearance, renale Clearance, hepatische Clearance, biliäre Clearance, intestinale Absorption, Bioverfügbarkeit, relative Bioverfügbarkeit, intrinsische Clearance, mittlere Verweilzeit, Maximalrate des Metabolismus, Michaelis-Menten- Konstante, Verteilungskoeffizienten zwischen Geweben und Blut oder Plasma, Fraktion, die unverändert in Urin ausgeschieden wird, Wirkstofffraktion, die systemisch in Metaboliten umgewandelt wird, Eliminierungsratenkonstante, Halbwertszeit oder Sekretionsclearance ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Verteilungskoeffizienten zwischen Geweben und Blut oder Plasma Verteilungskoeffizienten sind, die verbunden sind mit der Blut-Gehirn-Schranke, Blut-Plazenta-Schranke, der Verteilung zwischen Blut und humaner Milch, Verteilung zwischen Blut und Fettgewebe oder Verteilung zwischen Blut und Muskel.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin eine Abschätzung von mindestens zwei pharmakokinetischen Parametern des Wirkstoffkandidaten vorgenommen wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Vornehmen einer Abschätzung einer Löslichkeitseigenschaft des Wirkstoffkandidaten.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Biosensor eine Masseerfassungstechnik verwendet.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Masseerfassungstechnik Oberflächenplasmonresonanztechnik umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der mindestens eine mathematische Ausdruck, der korreliert mit Bindungswechselwirkungsdaten, die assoziiert sind mit bekannten Wirkstoffverbindungen, eine Funktion ist, die korreliert ist mit einer Vielzahl von Datenpunkten, die in einem kartesischen Koordinatensystem aufgetragen werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die mehreren erfassenden oberflächengebundenen Biomoleküle ausgewählt werden aus Liposomen, Plasmaproteinen, CYP 450-Enzymen, metabolischen Enzymen oder Transportproteinen.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Biosensor einen Sensorchip verwendet, umfassend: ein Hydrogel, das gekoppelt ist an die Sensoroberfläche, worin das Hydrogel mehrere funktionelle Gruppen aufweist und worin das eine oder die mehreren erfassenden oberflächengebundenen Biomoleküle an das Hydrogel gebunden sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Sensorchip weiterhin umfasst: ein Metall mit freien Elektronen, das eine Sensoroberfläche umfasst, worin das Metall mit freien Elektronen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Kupfer, Silber, Aluminium und Gold.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der Biosensor zum Nachweisen der Oberflächenplasmonresonanz geeignet ist, die mit dem Metall mit freien Elektronen verbunden ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Hydrogel ein Polysaccharid oder ein mit Wasser quellbares organisches Polymer ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Polysaccharid Dextran ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 11, worin die mehreren funktionellen Gruppen des Hydrogels des Sensorchips eine oder mehrere funktionelle Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Aldehyd-, Carbonyl-, Epoxy- oder Vinylgruppen umfassen.
  17. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Schritt des Messens das Nachweisen eines Signals umfasst, das mit einem reflektierten Lichtstrahl in Bezug auf die Zeit verbunden ist, worin der reflektierte Lichtstrahl eine Oberflächenplasmonresonanz mit dem Metall mit freien Elektronen entwickelt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Signal, das mit dem reflektierten Lichtstrahl verbunden ist, eine Resonanzkurve der Oberflächenplasmonresonanz definiert.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Signal, das mit dem reflektierten Lichtstrahl verbunden ist, ein Reflexionsminimum der Oberflächenplasmonresonanz definiert.
  20. Vorrichtung zum Untersuchen eines Wirkstoffkandidaten, worin die Vorrichtung einen Biosensor auf Affinitätsbasis, mit einem oder mehreren erfassenden oberflächengebundenen Biomolekülen, die damit verbunden sind, und welcher geeignet ist zum Messen mindestens eines Bindungswechselwirkungsparameters des Wirkstoffkandidaten, und einen Computerspeicher, der eine Datenstruktur aufweist zum Vergleichen des mindestens einen Bindungswechselwirkungsparameters mit mindestens einem mathematischen Ausdruck, korrelierend mit den Bindungswechselwirkungsdaten, die mit bekannten Wirkstoffverbindungen verbunden sind, welche bekannte pharmakokinetische Parameter aufweisen, um eine Einschätzung mindestens eines pharmakokinetischen Parameters des Wirkstoffkandidaten vorzunehmen, umfasst.
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