DE60018039T2

DE60018039T2 - Sensor und verfahren zum messen von cholesterin

Info

Publication number: DE60018039T2
Application number: DE60018039T
Authority: DE
Inventors: Motokazu Watanabe; Keiko Yugawa; Shiro Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1999-11-22
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2020-11-17
Also published as: CN1337005A; CA2356364A1; JP4646475B2; EP1150118A1; CA2356364C; EP1150118A4; CN1187609C; DE60018039D1; WO2001038862A1; EP1150118B1; US6342364B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor und ein Verfahren zum Ermitteln von Cholesterin, das in einem Lipoprotein niedriger Dichte in einer Probe wie etwa Blut, Serum oder Plasma mit eingeschlossen ist.
Stand der Technik
Die Konzentration von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte wurde als ein wichtiger Parameter bei der Diagnose von Hypercholesterolemie beobachtet.
Das Verfahren nach dem Stand der Technik ermittelt Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte durch differenzielle Ultrazentrifugation. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine spezielle Ausstattung und benötigt nachteilhafterweise eine lange Zeit zur Messung.
Ein typisches Ermittlungsverfahren ohne Verwendung der Ultrazentrifugation misst entsprechend die Gesamtkonzentration von Cholesterin in einer Probe, die Konzentration von Cholesterin in einem Lipoprotein hoher Dichte und die Konzentration von Triglycerid und berechnet die Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte gemäß der Friedewald'schen Gleichung. Falls die Probe jedoch eine hohe Konzentration an Triglycerid enthält besitzt dieses Verfahren geringe Vertrauensgrade bezüglich der Reproduzierbarkeit und der Genauigkeit.
Einige Verfahren zur Ermittlung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte unabhängig von der Konzentration an Triglycerid wurden ebenso vorgeschlagen.
Das erste vorgeschlagene Verfahren oxidiert nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte mit einem Enzym in Gegenwart von α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat, einem Magnesiumion und Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether und ermittelt die Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte basierend auf dem Grad der Farbentwicklung eines färbenden Gegenstands (siehe Clinical Chemistry, Vol. 44, S. 522 (1998)). Dieses Verfahren setzt α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat und ein Magnesiumion zur Reduzierung der Reaktivität des Enzyms mit Cholesterin in Chylomicron und Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte, das in der Probe mit umfasst ist, ein, während der Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether zur Reduzierung der Reaktivität des Enzyms mit Cholesterin in dem Lipoprotein hoher Dichte in der Probe eingesetzt wird.
Das zweite vorgeschlagene Verfahren oxidiert nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte mit einem Enzym in Gegenwart eines amphoteren Oberflächenaktiven Mittels und aliphatischer Amine mit entweder einer Carboxylgruppe oder einer Sulfonatgruppe und damit die Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein mit niedriger Dichte basierend auf dem Grad der Farbentwicklung einer färbenden Substanz (siehe offengelegte japanische Patentschrift Nr. Hei 10-84997). Dieses Verfahren reduziert die Reaktivität des Enzyms mit Cholesterin, das in anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein mit niedriger Dichte mit eingeschlossen ist, in der Gegenwart des amphoteren Oberflächenaktiven Mittels.
Das dritte vorgeschlagene Verfahren behandelt die Probe mit einen Polykation, um nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte mit einem Enzym zu oxidieren und ermittelt die Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte basierend auf dem Grad der Farbentwicklung einer färbenden Substanz (siehe US Patent Nr. 4,185,963).
Das vierte vorgeschlagene Verfahren setzt poröses Siliziumoxid zur Adsorbierung des Lipoproteins hoher Dichte ein und führt dazu, dass ein Polyanion/zweiwertiges Kation an das Chylomicron und das Lipoprotein niedriger Dichte bindet und einen unlöslichen Komplex ausbildet. Das Verfahren entfernt dann den Komplex als ein Präzipitat aus der Lösung, oxidiert nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte mit einem Enzym und ermittelt die Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte basierend auf dem Grad der Farbentwicklung einer färbenden Substanz (siehe US Patent Nr. 5,401,466).
Jedes der ersten vier vorgeschlagenen Verfahren, die vorstehend diskutiert wurden, ermöglicht die Ermittlung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte mit einer hohen Reproduzierbarkeit und einer hohen Genauigkeit, und zwar selbst in einer Probe mit einer hohen Konzentration an Triglycerid.
Jedes der ersten vier Verfahren ermitteln die Konzentration von Cholesterin basierend auf dem Grad der Farbentwicklung der färbenden Substanz. Diese Verfahren sind somit nicht zur Ermittlung von Cholesterin in ursprünglich gefärbten Proben wie Blutproben anwendbar. Für die Ermittlung mit hoher Reproduzierbarkeit und hoher Genauigkeit sieht das erforderliche Verfahren separat ein enzymfreies erstes Reagenz und ein enzymhaltiges zweites Reagenz vor, gibt zuerst nur das erste Reagenz zu der Probe zu und wartet für die Zugabe des zweiten Reagenz bis die Reaktion hinreichend fortgeschritten ist. Die Verfahren sind demgemäss sehr kompliziert und beschwerlich.
EP-A-0 884 392 und EP-A-0 856 586 offenbaren Biosensoren mit elektrochemischen Streifen zur Detektion von Cholesterin, umfassend ein Elektrodensystem, das auf einen isolierendem Substrat gemustert vorliegt, wobei die Arbeitselektrode mit einer Reagenzschicht mit einer Oxidaseenzymschicht und einem Rexoxvermittler beschichtet ist. Die EP-A-0 627 627 offenbart einen Trockenteststreifen für die LDL-Cholesterinbestimmung, in welchen Lipoproteine mit einer sehr niedrigen Dichte (vLDL) durch Anhaftung an zweiwertige Kationen oder Polyanionen, die in dem Trockenmatrixmaterial vorgesehen sind, entfernt werden. Die EP-A-0 913 484 offenbart ein Verfahren mit homogener flüssiger Phase zur Detektion von LDL-Cholesterin, in welchem die Probe mit Verbindungen wie etwa Cyclodextrinen, Dextransulfaten, Magnesiumionen, Oberflächenaktiven Mitteln aus Polyoxyethylenderivaten zur Ausbildung von wasserlöslichen Komplexen von vLDL-Cholesterin behandelt wird, welche von der Probe vor der LDL-Messung abgetrennt werden.
Offenbarung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit, die vorstehenden Nachteile zu eliminieren und somit einen Sensor bereitzustellen, der für die Messung in Blutproben anwendbar ist und die Bestimmung von Cholesterin in einem Lipoprotein niedriger Dichte mit hoher Reproduzierbarkeit und hoher Genauigkeit mittels einer einzigen Zuführung einer Probe, ohne separate Zugabe von zwei oder mehrere Reagenzien zu der Probe zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu erfordern, ermöglicht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ebenso, ein Verfahren zur Ermittlung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte vorzusehen.
Die vorliegende Erfindung ist auf einen Cholesterinsensor zur Ermittlung von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte gerichtet. Der Cholesterinsensor umfasst das Folgende: eine elektrisch isolierende Basisplatte; ein Elektrodensystem, das auf der Basisplatte angebracht ist und zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält; eine Enzymschicht, die auf der Basisplatte mit dem Elektrodensystem gebildet ist; und eine Reagenzschicht, die vor der Enzymschicht in einem Probezuführpfad zu dem Elektrodensystem angeordnet ist. Die Enzymschicht umfasst zumindest eine Oxidoreduktase und einen Elektronenvermittler. Die Reagenzschicht umfasst ein Reagenz, das an anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte haftet, um einen wasserlöslichen Komplex zu bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso einen Cholesterinsensor bereit, der das Folgende umfasst: eine elektrisch isolierende Basisplatte; ein Elektrodensystem, das auf der Basisplatte angebracht ist und zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält; eine Enzymschicht, die auf der Basisplatte mit dem Elektrodensystem gebildet ist; einen Filter, der vor der Enzymschicht in einem Probelösungszuführpfad zu dem Elektrodensystem angeordnet ist; und eine Reagenzschicht, die entweder auf dem Filter geträgert ist oder vor dem Filter in dem Probelösungszuführpfad angeordnet ist. Die Enzymschicht schließt zumindest eine Oxidoreduktase und einen Elektronenvermittler mit ein. Die Reagenzschicht schließt ein Reagenz, das zur Adsorption und/oder Agglutinaton anderer Lipoproteine als dem Lipoprotein niedriger Dichte fungiert, mit ein.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Ermittlung von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte vor. Das Verfahren schließt die folgenden Schritte mit ein:

(a) Zur Reaktionbringen einer Probe mit einem Reagenz oder einer Reagenzgruppe, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den nachfolgend spezifierten (i), (ii) und (iii) besteht:
(i) α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat, Magnesiumion und Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether,
(ii) ein amphoteres Oberflächenaktives Mittel und aliphatische Amine mit entweder einer Carboxylgruppe oder einer Sulfonatgruppe, und
(iii) Polykation; (b) anschließend zur Reaktionbringen der Probe mit einer Oxidoreduktase, die mit Cholesterin spezifisch reagiert, und mit einem Elektronenvermittler; und (c) elektrochemisches Oxidieren des Elektronenvermittlers, der in Schritt (b) reduziert worden ist, um so einen Oxidationsstromwert zu messen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich ebenso auf ein Verfahren zur Ermittlung von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte. Das Verfahren schließt die folgenden Schritte ein:

(a) Zur Reaktionbringen einer Probe mit einem Polyanion, einem zweiwertigen Kation und entweder einem Antikörper gegen Lipoprotein hoher Dichte oder Siliziumoxid (Silica);
(b) anschließend zur Reaktionbringen der Probe mit einer Oxidoreduktase, die mit Cholesterin spezifisch reagiert, und mit einem Elektronenvermittler; und
(c) elektrochemisches Oxidieren des Elektronenvermittlers, welcher in Schritt (b) reduziert worden ist, um so einen Oxidationsstromwert zu messen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Flussdiagramm, welches das Prinzip der Reaktionen zur Ermittlung der Konzentration von Cholesterin gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist eine vertikale Schnittansicht, die schematisch die Struktur eines Cholesterinsensors in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
3 ist eine auseinandergenommene perspektivische Ansicht, die den Cholesterinsensor des Beispiels 1 zeigt.
4 ist eine auseinandergenommene perspektivische Ansicht, die einen weiteren Cholesterinsensor in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung zeigt.
Bester Modus zur Durchführung der vorliegenden Erfindung Das erfindungsgemäße Verfahren, das Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte ermittelt, besitzt die folgenden Schritte:

(a) Zur Reaktionbringen einer Probe mit einem oder mehreren spezifischen Reagenzien;
(b) anschließendes zur Reaktionbringen der Probe mit einer Oxidoreduktase, welche spezifisch mit Cholesterin reagiert, und mit einem Elektronenvermittler; und
(c) elektrochemisches Oxidieren des Elektronenvermittlers, welcher in Schritt (b) reduziert worden ist, um so den Oxidationsstromwert zu messen und Cholesterin basierend auf dem Oxidationsstromwert zu ermitteln.

Der Schritt (a) wird als erstes diskutiert. Der Schritt (a) bringt die anderen Lipoproteine als das Lipoprotein niedriger Dichte, die in der Probe umfasst sind, mit einen oder mehreren spezifischen Reagenzien zur Reaktion, um so die Reaktion des Enzyms mit Cholesterin in den anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte zu unterdrücken. Hier kann die Probe Lipoprotein hoher Dichte, Lipoprotein niedriger Dichte, Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte und Chylomicron mit einschließen und kann zum Beispiel Blut, Serum oder Plasma sein.
Die vorliegende Erfindung richtet sich nicht auf die Absorption, sondern auf eine elektrochemische Technik für die Ermittlung von Cholesterin und ermöglicht somit die Bestimmung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte, selbst in gefärbten Blutproben und trüben Serum- und Plasmaproben.
Der Schritt (a) wird entweder durch die folgenden Schritte verwirklicht: (a-1) Anhaften von spezifischen Reagenz oder Reagenzien an andere Lipoproteine als dem Lipoprotein niedriger Dichte, die in der Probe umfasst sind, um einen wasserlöslichen Komplex zu bilden, um so die Reaktivität des Enzyms mit Cholesterin in den anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte zu reduzieren; und (a-2) Adsorbieren der anderen Lipoproteine als dem Lipoprotein niedriger Dichte, das in der Probe eingeschlossen ist, und/oder Agglutinieren durch spezifische Reagenzien.
Der Schritt (a-1) wird detaillierter beschrieben.
Der Schritt (a-1) setzt irgendein Reagenz oder eine Reagenzgruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den nachfolgend spezifizierten (i), (ii) und (iii):

(i) α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat, Magnesiumion und Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether,
(ii) ein amphoteres Oberflächenaktives Mittel und aliphatische Amine mit entweder einer Carboxylgruppe oder einer Sulfonatgruppe und
(iii) Polykation.

Falls das Polykation als das Reagenz eingesetzt wird, ist es bevorzugt, das Polykation mit der Probe in Gegenwart eines schwachen Ionenaustauschers zur Reaktion zu bringen. Der schwache Ionenaustausch adsorbiert das neutrale Lipid, das in der Probe eingeschlossen ist, und verhindert somit effektiv, dass das neutrale Lipid auf der Oberfläche der Elektrode adsorbiert und die Elektrodenreaktion stört.
Typische Beispiele des amphoteren Oberflächenaktiven Mittels schließen die Folgenden mit ein: Laurylbetain, Kokosnussölfettsäure, Amidopropylbetain, Amidopropylbetainlaureat, 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroethylimidazoliniumbetain und 2-Alkyl-N-carboxyethyl-Nhydroxyethylimidazoliniumbetain.
Typische Beispiele der aliphatischen Amine mit entweder einer Carboxylgruppe oder einer Sulfonatgruppe schließen die Folgenden mit ein: Alanin, Glutamin, Glutaminsäure, N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, N-Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure, 2-{4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl}ethansulfonsäure, 2-Morpholinoethansulfonsäure, Piperazin-l,4-bis (2-ethansulfonsäure), N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure, N-Cyclohexyl-3-aminopropansulfonsäure, N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropansulfonsäure, 3-{N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino}-2-hydroxypropansulfonsäure, 3-{4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl}propansulfonsäure, 2-Hydroxy-3-{4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl}propansulfonsäure, 3-Morpholinopropansulfonsäure, 2-Hydroxy-3-morpholinopropansulfonsäure, Piperazin-1,4-bis(2-hydroxy-3-propansulfonsäure), N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure, 2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure, N-(2-Acetamido)iminodiessigsäure, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin und N-{Tris(hydroxymethyl)methyl}glycin.
Aufgrund der gesteigerten Regulation der Reaktivität werden Acylpolikationen und Alkylpolykationen bevorzugt für das Polykation eingesetzt.
Im Schritt (a-1) haften die anderen Lipoproteine als das Lipoprotein niedriger Dichte, die in der Probe umfasst sind, an das Reagenz oder die Reagenzien zur Ausbildung eines wasserlöslichen Komplexes.
Dies verringert die Reaktivität der Oxidoreduktase mit Cholesterin in den anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte. In dem anschließenden Schritt (b) ist somit nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte in der Reaktion mit der Oxidoreduktase involviert.
Der Schritt (a-2) wird detaillierter beschrieben.
Der Schritt (a-2) ermöglicht die Adsorption der anderen Lipoproteine als das Lipoprotein niedriger Dichte, die in der Probe umfasst sind, und/oder die Agglutination mittels der Reagenzien zum Zwecke der Entfernung.
Dieser Schritt verwendet einen Antikörper gegen das Lipoprotein hoher Dichte oder Siliziumoxid, ein Polyanion und ein zweiwertiges Kation als diese Reagenzien. Das Lipoprotein hoher Dichte umfasst spezielle Apoproteine Apo A-I und Apo A-II, so dass der Antikörper gegen das Lipoprotein hoher Dichte ein Antikörper gegen Apo A-I oder A-II sein kann. Der Antikörper gegen das Lipoprotein hoher Dichte agglutiniert das Lipoprotein hoher Dichte, das in der Probe eingeschlossen ist. Die Funktionen des Polyanions und des zweiwertigen Kations agglutinieren das Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte und das Chylomicron, die in der Probe mit eingeschlossen sind. Dieses Verfahren trennt und entfernt demgemäss das Lipoprotein hoher Dichte, das Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte und das Chylomicron aus der Probe ab.
Das als Reagenz eingesetzte Siliziumoxid adsorbiert das Lipoprotein hoher Dichte, das in der Probe mit eingeschlossen ist, zur Abtrennung und für dessen Entfernung.
Im Schritt (a-2) bedeutet Filtration, dass ein Filter bevorzugt zur Abtrennung und Entfernung des agglutinierten Lipoproteins hoher Dichte, des Lipoproteins mit sehr niedriger Dichte und des Chylomicrons aus der Probe eingesetzt wird.
Da es zu keiner Störung mit der Enzymreaktion kommt kann jedes aus Dextransulfat, Heparin, Phosphorwolframsäure und Polyinylsulfat für das Polyanion bevorzugt eingesetzt werden.
Da es zu keiner Störung mit der Enzymreaktion kommt kann jedes aus der Gruppe eines Calciumions, eines Manganions und eines Magnesiumions für das zweiwertige Kation bevorzugt eingesetzt werden.
Im Schritt (a-2) werden die anderen Lipoproteine als das Lipoprotein niedriger Dichte, die in der Probe mit eingeschlossen sind, durch die Reagenzien adsorbiert und/oder agglutiniert und werden dadurch entfernt. Dieses Verfahren ermöglich, dass nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte in der Reaktion mit dem Enzym in dem laufenden Schritt (b) involviert ist.
Der Schritt (b) wird detaillierter beschrieben.
Der Schritt (b) führt zu einer Oxidation von nur dem Cholesterin, das in dem Lipoprotein niedriger Dichte in der Probe mit eingeschlossen ist, und zwar mittels einer Oxidoreduktase, welche spezifisch mit dem Cholesterin reagiert, und demgemäss reduziert er den Elektrodenvermittler.
Die Oxidoreduktase und der Elektronenvermittler, die hierin eingesetzt werden, können irgendwelche bekannten Substanzen sein, die herkömmlicherweise für die elektrochemische Ermittlung von Cholesterin eingesetzt werden.
Der Schritt (c) wird detaillierter diskutiert.
Der Schritt (c) oxidiert elektrochemisch den Elektronenvermittler, welcher in Schritt (b) reduziert worden ist, und misst den Oxidationsstromwert. Der beobachtete Oxidationsstromwert ermittelt die Cholesterinkonzentration in dem Lipoprotein niedriger Dichte.
Die erfindungsgemäße Technik ermittelt elektrochemisch die Konzentration von Cholesterin und ist somit für ursprünglich gefärbte Proben wie etwa Blutproben anwendbar.
Das Prinzip der für die Ermittlung der Cholesterinkonzentration eingesetzten Reaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 1 beschrieben.
Cholesterin in den Lipoproteinen, die in einer Probe mit eingeschlossen sind, wird meistens an Fettsäuren über die Esterbindung gebunden und sind in der Form von Cholesterinestern vorhanden. Cholesterinesterase 4 entestert (de-esterifies) Cholesterinester 1, um Cholesterin 2 zu ergeben (Verfahren I).
Oxidoreduktase 5 oxidiert Cholesterin 2, um oxidiertes Cholesterin 3 zu ergeben (Verfahren II). Diese Oxidationsreaktion reduziert gleichzeitig einen Elektronenvermittler (oxidierte Form) 6 (Verfahren III).
Das Anlegen einer Spannung zwischen einer Arbeitselektrode 8 und einer Gegenelektrode 9, um die Arbeitselektrode 8 positiv zu machen, oxidiert einen Elektronenvermittler (reduzierte Form) 7 an der Arbeitselektrode 8 (Verfahren IV). Der im Verfahren der Oxidation fließende elektrische Strom hängt von der Konzentration des Elektronenvermittlers (reduziert Form) 7 ab, welcher abhängig von der Konzentration von Cholesterin 2 ist. Die Messung des zwischen der Arbeitselektrode 8 und der Gegenelektrode 9 fließende elektrischen Stroms ermittelt demgemäss die Konzentration von Cholesterin 2.
Konkrete Beispiele des Sensors und des Verfahrens zur Ermittlung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte werden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
Beispiel 1
2 ist eine Schnittansicht, die schematisch die Struktur eines Sensors aus Beispiel 1 gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, und 3 ist eine auseinandergenommene perspektivische Ansicht, die den Sensor zeigt. Das Verfahren druckt mittels Siebdruck Silberpaste auf einer elektrisch isolierenden Basisplatte 11, die aus Polyethelenterephthalat aufgebaut ist, erwärmt und trocknet den Siebdruck, um Grundlagen für zwei Elektroden und damit verbundene Leitungen 12 und 13 zu erzeugen. Das Verfahren druckt dann mittels Siebdruck Kohlenstoffpaste zur Erzeugung einer Arbeitselektrode 14 und einer Gegenelektrode 15. Eine dielektrische Schicht 16, die auf die Basisplatte siebgedruckt worden ist, definiert die freigelegten Teile des Elektrodensystems.
Das Verfahren druckt anschließend Tinte mittels Siebdruck mit einem Natriumsalz aus Carboxymethylzellulose, welche ein wasserlösliches Polymer ist, um das Elektrodensystem einschließlich der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode abzudecken und trocknet den Siebdruck bei 50°C für 15 Minuten, um eine wasserlösliche Polymerschicht 21 zu erzeugen. Das Verfahren gibt dann eine wässrig gemischte Lösung mit Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und Kaliumhexacyanoferrat (III) tropfenweise hinzu, um die wasserlösliche Polymerschicht 21 zu bedecken, und trocknet bei 50°C für 15 Minuten, um eine Enzymschicht 22 zu erzeugen.
Irgendeines aus p-Benzochinon und seinen Derivaten, Phenazinmethosulfat, Methylenblau und Ferrocen und seinen Derivaten kann für den Elektronenvermittler eingesetzt werden.
Das Verfahren verbindet eine Abdeckung 19 mit einem darin ausgebildeten Luftventil 20 mit einem Spacer (Abstandshalter) 17 mit einem darin ausgebildeten Schlitz 18, fügt eine wässrig vermischte Lösung mit α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat, einem Magnesiumion und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether tropfenweise in eine durch den Schlitz 18 des Spacers 17 definierte Vertiefung und trocknet zur Erzeugung einer Reagenzschicht 23. Die Reagenzschicht 23 ist vor der Enzymschicht 22 in einem Probenlösungszuführpfad zu dem Elektrodensystem angeordnet.
Das Verfahren bindet dann die Basisplatte 11 mit der darauf ausgebildeten wasserlöslichen Polymerschicht 21 und der Enzymschicht 22 an das Abdeckelement, einschließlich der Abdeckung 19 und dem Spacer 17 mit der darauf ausgebildeten Reagenzschicht 23, um so den Biosensor zusammen zu bauen. In diesem Biosensor bildet der durch den Schlitz 18 des Spacers 17 definierte Hohlraum den Probelösungszuführpfad. Ein offenes Ende 18a des Schlitzes 18 bildet eine Öffnung des Probelösungszuführpfads oder einen Probeneinlass.
Falls zum Beispiel eine Blutprobe in Kontakt mit dem Probeneinlass gebracht wird, wird die Probe in das Luftventil 20 durch die Kapillarkräfte des Probelösungszuführpfads eingesaugt.
Das Verfahren kann einen Träger wie etwas einen Glasfilter an der Position der Reagenzschicht 23 fixieren, gibt die wässrige Lösung des vorstehenden Reagenz tropfenweise in den Träger oder auf die Oberfläche des Trägers und trocknet, um die Reagenzschicht auf dem Träger geträgert aufzubringen. Irgendeines aus Filterpapieren, Glasfiltern, Dünnschichtchromatographieträgern, Zellulosefasern, faserartigen Blättern aus Polymerverbindungen, Papieren und Kork kann als der Träger eingesetzt werden. Glasfilter und Zellulosefasern werden bevorzugt eingesetzt, da sie kaum Oxidoreduktase adsorbieren.
Die Anordnung der Trägerung von wenigstens einem aus dem Elektronenvermittler und der Oxidoreduktase zusammen mit dem Oberflächenaktiven Mittel steigert die Löslichkeit und verkürzt daher wünschenswerterweise die Reaktionszeit.
Die Anordnung der Ausbildung wenigstens eines der wasserlöslichen Polymerschicht, der Enzymschicht und der Reagenzschicht durch die Gefriertrocknungstechnik steigert die Löslichkeit und verkürzt dadurch Wünschenswerterweise die Reaktionszeit. Besonders wenn Reagenzschicht derart angeordnet ist, dass sie teilweise den Probelösungszuführpfad blockiert, wie es in dem veranschaulichten Beispiel gezeigt ist, ist es wünschenswert, eine poröse Reagenzschicht mittels der Gefriertrocknungstechnik auszubilden. Die poröse Reagenzschicht löst und absorbiert leicht die Probelösung, welche in Kontakt mit der Reagenzschicht kommt.
Im Folgenden wird ein Beispiel der Ermittlung der Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte in einer Blutprobe mit dem in vorstehender Art und Weise hergestellten Biosensor beschrieben. Das Messverfahren führt zuerst die Blutprobe durch den Probeneinlass. Die Reagenzschicht, die als erstes in Kontakt mit der Blutprobe kommt, die Enzymschicht und die wasserlösliche Polymerschicht werden in dieser Reihenfolge gelöst. α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat und ein Magnesiumion in der Reagenzschicht arbeiten kooperativ, um die Ausbildung eines wasserlöslichen Komplexes mit Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte und Chylomicron in der Blutprobe auszubilden. Der Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether in der Reagenzschicht arbeitet unter Ausbildung eines wasserlöslichen Komplexes mit dem Lipoprotein hoher Dichte in der Blutprobe. Dies reduziert die Reaktivität des Enzyms mit Cholesterin in den anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte.
Das Verfahren aktiviert dann die Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase als die Enzyme. Nur Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte wird der katalytischen Reaktion mit den Enzymen unterzogen. Dies ermöglicht die Ermittlung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte. Basierend auf dem Prinzip der in der 3 gezeigten Reaktionen ((1)) wandelt die Cholesterinesterase in der Enyzmschicht den Cholesterinester in dem Lipoprotein niedriger Dichte in freies Cholesterin um. Das durch die Funktion der Cholesterinesterase erzeugte freie Cholesterin und das ursprünglich in dem Lipoprotein niedriger Dichte vorhandene freie Cholesterin werden dann durch die Funktion der Cholesterinoxidase oxidiert. Gleichzeitig wird Kaliumhexacyanoferrat (III) in der Enzymschicht in Kaliumhexacyanoferrat (II) reduziert. Wenn eine vorbestimmte Zeit nach der Zuführung der Blutprobe verstrichen ist, legt das Verfahren eine Spannung von zum Beispiel 500 mV für 5 Sekunden zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode an, um die Arbeitselektrode positiv zu machen, und misst den elektrischen Stromwert nach 5 Sekunden. Dieser elektrische Stromwert wird als der Antwortwert gekennzeichnet.
Das Verfahren des Beispiels 1 ermittelt nicht die Konzentration von Cholesterin basierend auf dem Grad der Farbentwicklung einer färbenden Substanz und ermöglicht somit eine Ermittlung von Cholesterin selbst in ursprünglich gefärbten Proben, wie Blutproben. Die Reagenzschicht 23 ist räumlich von der Enzymschicht 22 getrennt. Die zu der Reagenzschicht 23 zugeführte Probe reagiert zuerst mit den Reagenzien in der Reagenzschicht 23 und erreicht dann die Enzymschicht 22, um mit der Oxidoreduktase und dem Elektronenvermittler in der Enzymschicht 22 zu reagieren. Diese Anordnung ermöglicht die Bestimmung von Cholesterin in in der Probe umfassten Lipoprotein niedriger Dichte mit hoher Reproduzierbarkeit und hoher Genauigkeit mit nur einer Zuführung der Probe ohne Erfordernis der komplizierten, beschwerlichen Operationen, dass separat mehrere Reagenzien zu der Probe bei unterschiedlichen Zeitpunkten hinzugegeben werden müssen.
Im Beispiel 1 wird die Kombination von α-Cyclodextrinsulfat, Dextransulfat, einem Magnesiumion und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolyether als die in der Reagenzschicht 23 umfasste Reagenzgruppe eingesetzt. Diese Reagenzgruppe kann durch andere Reagenzgruppen eines amphoteren Oberflächenaktiven Mittels und aliphatischen Amine entweder einer Carboxylgruppe oder einer Sulfonatgruppe ausgetauscht werden. Die Reagenzgruppe kann alternativ durch ein Polykation ausgetauscht werden. Im letzten Fall ist es bevorzugt, einen schwachen Ionenaustauscher zu dem Polykation hinzuzugeben. Irgendeines aus Acyl- und Alkylpolykationen wird bevorzugt für das Polykation eingesetzt. Ein besonders bevorzugtes Beispiel des Polykations ist Polyethylenimin.
Ein pH-Puffer kann zu der Reagenzschicht 23 hinzugegeben werden. Irgendeiner von Good's Puffern, wie 3-Morpholinopropansulfonsäure, 2-{4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl}ethansulfonsäure, 2-Morpholinoethansulfonsäure, und Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure) und Phosphatpuffer können für den pH-Puffer eingesetzt werden.
Beispiel 2
4 ist eine auseinandergenommene perspektivische Ansicht, die einen Cholesterinsensor aus Beispiel 2 gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Ein Hauptunterschied gegenüber Beispiel 1 ist, dass der Cholesterinsensor des Beispiels 2 einen Glasfilter verwendet.
Wie im Falle von Beispiel 1 werden die wasserlösliche Polymerschicht 21 und die Enzymschicht 22 auf dem Elektrodensystem der Arbeitselektrode 14 und der Gegenelektrode 15 auf der Basisplatte 11 erzeugt. Der Biosensor wird durch Kombinieren eines Spacers 37 mit einem darin ausgebildeten rechtwinkligen Durchgangsloch 38, einer Abdeckung 39 mit einem Luftventil 40 und einem darin ausgebildeten Probeneinlass 41, und einem Filter 43 mit der Basisplatte 11 vervollständigt.
Der Filter 43 ist vor der Enzymschicht 22 in dem Probelösungszuführpfad, der durch das Durchgangsloch 38 des Spacers 37 definiert wird, angeordnet. Eine durch den Probeneinlass 41 zugeführte Probelösung wird durch den Filter 43 absorbiert und durch den Probelösungszuführpfad zu dem Elektrodensystem durch Kapillarkräfte davon übertragen. Der Filter 43 ist mit einem Antikörper gegen das Lipoprotein hoher Dichte, Dextransulfat als dem Polyanion und einem Calciumion imprägniert.
Irgendeines aus Filterpapier, Zellulosfasern, faserartigen Blättern aus Polymerverbindungen, Membranfiltern, Sieben und Baumwolle kann für den Filter eingesetzt werden. Der Porendurchmesser des Filters liegt bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 0,5 μm.
Im Folgenden wird das Verfahren zur Ermittlung der Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte in einer Blutprobe mit diesem Biosensor beschrieben.
Das Messverfahren führt zuerst die Blutprobe durch den Probeneinlass 41 auf den Filter 43. Die Blutzellen in der Blutprobe werden durch den Filter 43 herausgefiltert und die Plasmakomponente geht durch das Luftventil 40 hindurch. Gleichzeitig agglutiniert der Antikörper gegen das Lipoprotein hoher Dichte in dem Filter das Lipoprotein hoher Dichte in der Blutprobe. Das agglutinierte Lipoprotein hoher Dichte wird auf den Sieben des Filters gehalten und erreicht nicht die Enzymschicht 22. Das Chylomicron und das Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte in der Blutprobe werden durch Dextransulfat und einem Calciumion in dem Filter agglutiniert. Das agglutinierte Lipoprotein wird auf den Sieben des Filters gehalten und erreicht nicht die Enzymschicht. Die den Enzymschicht erreichende Plasmakomponente umfasst somit nur das Lipoprotein niedriger Dichte unter den verschiedenen Lipoproteinen.
In der Enzymschicht 22 wirken Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase als die Enzyme auf das Lipoprotein niedriger Dichte und Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte wird der katalytischen Reaktion mit den Enzymen unterzogen. Auf der gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 wird dadurch die Konzentration von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte ermittelt.
Der Antikörper gegen das Lipoprotein hoher Dichte, der als das Reagenz zur Agglutinierung des Lipoproteins hoher Dichte eingesetzt wird, kann durch Siliziumoxid ersetzt werden, das das Lipoprotein hoher Dichte adsorbiert. Siliziumoxid adsorbiert das Lipoprotein hoher Dichte in der Probe und verhindert somit, dass das Lipoprotein hoher Dichte die Enzymschicht erreicht. In diesem Falle umfasst die die Enzymschicht erreichende Plasmakomponente ebenfalls nur das Lipoprotein niedriger Dichte unter den verschiedenen Lipoproteinen. Ein pH-Puffer kann ferner zu dem Filter 43 hinzugegeben werden.
Ähnlich zu dem Verfahren des Beispiels 1 ermittelt das Verfahren des Beispiels 2 nicht die Konzentration von Cholesterin basierend auf den Grad der Farbentwicklung einer färbenden Substanz und ermöglicht somit die Bestimmung von Cholesterin selbst in ursprünglich gefärbten Proben wie Blutproben. Die Reagenzien werden auf dem Filter 43 geträgert, welcher räumlich von der Enzymschicht 22 getrennt ist. Die auf den Filter zugeführte Probe reagiert zuerst mit den Reagenzien in dem Filter und erreicht dann die Enzymschicht 22, um mit der Oxidoreduktase und dem Elektronenvermittler in der Enzymschicht 22 zu reagieren. Diese Anordnung ermöglicht die Ermittlung von Cholesterin in dem Lipoprotein niedriger Dichte, das in der Probe umfasst ist, mit hoher Reproduzierbarkeit und hoher Genauigkeit mittels einer einmaligen Zuführung der Probe ohne Erfordernis der komplizierten und beschwerlichen Verfahren, nämlich dass mehrere Reagenzien zu der Probe zu unterschiedlichen Zeitpunkten separat hinzugegeben werden müssen.
In dem veranschaulichten Beispiel werden die Reagenzien auf dem Filter 43 geträgert. Die Reagenzien können jedoch separat von dem Filter angeordnet sein. In dieser modifizierten Struktur wird ein Membranfilter auf der Enzymschicht 22 ausgebildet und eine Reagenzschicht oder ein Träger mit den darauf geträgerten Reagenzien wird an der Position des Filters 43 angeordnet. Wenn die Reagenzien von dem Filter getrennt vorliegen, sollten die Reagenzien vor dem Filter in dem Probelösungszuführpfad zu dem Elektrodensystem angeordnet sein.
Im Beispiel 2 wird Dextransulfat für das Polyanion eingesetzt, das in dem Filter 43 als eines der Reagenzien eingeschlossen ist. Dextransulfat kann jedoch mit irgendeinem aus Heparin, Phosphorwolframsäure und Polyvinylsulfat ersetzt werden. Das für das zweiwertige Kation eingesetzte Calciumion kann durch ein Manganion oder ein Magnesiumion ausgetauscht werden.
In Beispiel 2 wird die Kombination des Antikörpers gegenüber dem Lipoprotein hoher Dichte, dem Polyanion und dem zweiwertigen Kation als die in dem Filter 43 umfasste Reagenzgruppe eingesetzt. Diese Reagenzgruppe kann durch eine weitere Reagenzgruppe aus Siliciumoxid, einem Polyanion und einem zweiwertigen Kation ausgetauscht werden. Im letzteren Fall wird bei in Kontaktbringen der Probe mit dem Filter 43 das Lipoprotein mit hoher Dichte in der Probe durch Siliciumoxid adsorbiert und erreicht nicht die Enzymschicht 22. Das Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte und das Chylomicron in der Probe werden agglutiniert und durch den Filter 43 herausgefiltert und erreichen somit nicht die Enzymschicht 22 auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend beschrieben.
In den Beispielen 1 und 2 ist die Basisplatte 11 aus Polyethylenterephthalat aufgebaut. Das Material der Basisplatte 11 ist jedoch nicht speziell beschränkt solange es elektrisch isolierenden Eigenschaft und etwas Steifheit besitzt. Zum Beispiel kann das Material irgendeines aus thermoplastischen Harzen wie Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und gesättigten Polyester und wärmehärtenden Harzen wie Harnstoffharz, Melaminharz, Phenolharz, Epoxidharz und ungesättigten Polyesterharz sein.
In den vorstehenden Beispielen werden die Elektroden durch Siebdrucken von Kohlenstoffpaste auf der Basisplatte 11 ausgebildet. Ein weiteres anwendbares Verfahren erzeugt Metallelektroden wie Palladium durch Dampfabscheidung oder Sputtern.
Die vorstehenden Beispiele setzen Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase für die Oxidoreduktase und Kaliumhexacyanoferrat (III) für den Elektronenvermittler ein. Irgendeine der anderen bekannten Substanzen kann anstelle dessen eingesetzt werden. Zum Beispiel kann Cholesterindehydrogenase durch Cholesterinoxidase ersetzt werden und p-Benzochinon kann für den Elektronenvermittler eingesetzt werden.
Es ist bevorzugt, dass die Enzymschicht 22 Cholesterinesterase mit einschließt. Ein oberflächenaktives Reagenz kann ferner zu der Enzymschicht 22 hinzugegeben werden, um die Auflösung von Cholesterin in dem Lipoprotein zu erleichtern.
Die wasserlösliche Polymerschicht wird über dem Elektrodensystem zum Zwecke des Schutzes der Elektroden erzeugt, obwohl sie nicht wesentlich ist.
Ein Träger mit den darauf geträgerten Reagenzien wird bevorzugt für die Reagenzschicht 23 in Beispiel 1 eingesetzt und im Falle des Trennens der Reagenzien von dem Filter 43 in Beispiel 2. Die Gegenwart des Trägers verlängert die Zeitdauer, für welche die Probe durch die Reagenzschicht hindurch passiert. Die verlängerte Zeitdauer ermöglicht die Reaktion der Reagenzien, die in der Reagenzschicht umfasst sind, mit den anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte, die in der Probe mit umfasst sind, um hinreichend fortzuschreiten bis die Probe die Enzymschicht 22 erreicht. Der Träger ist nicht speziell beschränkt solange er die Reagenzien darauf trägern kann. Typische Beispiele des Trägers schließen Glasfilter, Filterpapiere, Membranfilter, Siebe und Baumwolle mit ein. Die auf dem Träger geträgerten Reagenzien können in getrocknetem festen Zustand, im flüssigen Zustand oder im Gelzustand vorliegen.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Technik der vorliegenden Erfindung ist nicht die Messung basierend auf der Farbentwicklung einer färbenden Substanz und ermöglicht somit die Bestimmung von Cholesterin, das in Lipoprotein niedriger Dichte umfasst ist, selbst wenn gefärbte Proben wie Blutproben eingesetzt werden. Die Technik stellt die Bestimmung von Cholesterin, das in Lipoprotein niedriger Dichte umfasst ist, mit hoher Reproduzierbarkeit und hoher Genauigkeit durch nur einmalige Zuführung der Probe sicher. Die Technik der vorliegenden Erfindung erfordert nicht irgendwelche komplizierten, beschwerlichen Operationen und ist somit für einen Haushaltskit zur Messung von Cholesterin im Lipoprotein niedriger Dichte zweckmäßig.

Claims

Cholesterinsensor zum Ermitteln von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte, wobei der Cholesterinsensor aufweist: eine elektrisch isolierende Basisplatte; ein Elektrodensystem, das auf der Basisplatte angebracht ist und zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält; eine Enzymschicht, die auf der Basisplatte mit dem Elektrodensystem gebildet ist; und eine Reagensschicht, die vor der Enzymschicht in einem Probenlösungszufuhrpfad zu dem Elektrodensystem angeordnet ist, wobei die Enzymschicht zumindest eine Oxidoreduktase und einen Elektronenvermittler umfasst, und wobei die Reagensschicht ein Reagens umfasst, das an anderen Lipoproteinen als dem Lipoprotein niedriger Dichte haftet, um einen wasserlöslichen Komplex zu bilden.
Cholesterinsensor nach Anspruch 1, wobei die Reagensschicht α-Zyklodextrinsulphat, Dextransulphat, ein Magnesiumion und einen Polyoxiethylenpolyoxypropylenbλockblockcopolyäther umfasst.
Chalesterinsensor nach Anspruch 1, wobei die Reagensschicht ein Amphoteroberfλächenaktivmittel und aliphatische Amine mit entweder einer Carboxylgruppe oder eine Sulphonatgruppe umfasst.
Cholesterinsensor nach Anspruch 1, wobei die Reagensschicht ein Polykation umfasst.
Cholesterinsensor zum Ermitteln von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte, wobei der Cholesterinsensor aufweist: eine elektrisch isolierende Basisplatte; ein Elektrodensystem, das auf der Basisplatte angebracht ist und Zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält; eine Enzymschicht, die auf der Basisplatte mit dem Elektrodensystem gebildet ist; einen Filter, der vor der Enzymschicht in einem Probelösungszufuhrpfade zu dem Elektrodensystem angeordnet ist; und eine Reagensschicht, die entweder auf dem Filter getragen oder vor dem Filter in dem Probelösungszufuhrpfad angeordnet ist, wobei die Enzymschicht zumindest eine Oxireduktase und einen Elektronenvermittler umfasst, und wobei die Reagensschicht ein Reagens umfasst, das dazu dient, andere Lipoproteine als das Lipoprotein niedriger Dichte zu absorbieren oder miteinander zu verkleben.
Cholesterinsensor nach Anspruch 5, wobei die Reagensschicht Polyanion, ein divalentes Kation und entweder einen Antikörper gegen hochdichtes Lipoprotein oder Silica umfasst.
Verfahren zum Ermitteln von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) zur Reaktion bringen einer Probe mit einem Reagens oder einer Reagensgruppe, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (i), (ii), und (iii) besteht, wie nachfolgend spezifiziert: (i) α-Zyklodextrinsulfat, Dextransulfat, ein Magnesiumion, ein Polyoxiethylen und einen Polyoxiethylenpolyoxyprvpylenblockblockcopolyäther, (ii) ein Amphoteroberflächenaktivmittel und aliphatische Amine mit entweder einer Carboxylgruppe oder eine Sulphonatgruppe, und (iii) ein Polykation; (b) darauf folgendes zur Reaktion bringen der Probe mit einer Oxidoreduktase, die mit Cholesterin spezifisch reagiert, und mit einem Elektronenvermittler; und (c) elektrochemisches Oxidieren des Elektronenvermittlers, der in Schritt (b) reduziert wurde, um einen Oxidationsstromwert zu messen.
Verfahren zum Ermitteln von Cholesterin in Lipoprotein niedriger Dichte, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) zur Reaktion bringen einer Probe mit einem Polyaniom, einem divalenten Kation und entweder einem Antikörper gegen hochdzchtes Lipoprotein oder Silica; (b) darauf folgendes zur Reaktion bringen der Probe mit einer Oxidoreduktase, die mit Cholesterin spezifisch reagiert, und mit einem Elektronenvermittier: und (c) elektrochemisches Oxidieren des Elektronenvermittlers, der in Schritt (b) reduziert wurde, um einen Oxidationsstrom wert zu messen.