DE60011389T2

DE60011389T2 - Optisches kohärenzmikroskop und verfahren zur schnellen 3d-in-vivo -visualisierung biologischer funktionen

Info

Publication number: DE60011389T2
Application number: DE60011389T
Authority: DE
Inventors: June Iris Medford; Richard Campbell Haskell; Barbara Maria Hoeling; Daniel Carl Petersen; Ruye Wang; Mary Elizabeth Williams
Original assignee: Hoeling Barbara Maria San Dimas; Petersen Daniel Carl Claremont; Wang Ruye Claremont
Current assignee: Hoeling Barbara Maria San Dimas; Petersen Daniel Carl Claremont; Wang Ruye Claremont
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2020-01-29
Also published as: WO2000045153A9; ATE268901T1; ES2222183T3; EP1147398B1; EP1147398A1; WO2000045153A1; US6608717B1; AU3352900A; DE60011389D1; CA2361195A1; AU779717B2

Description

Allgemeiner Stand der Technik
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches Kohärenzmikroskopsystem (OCM) zur Studie von Problemen, die in der Entwicklungsbiologie und Biotechnologie auftreten. Insbesondere wird die Erfindung zur Abbildung von Zellen eingesetzt, die sich bis zu vier Millimeter oder mehr unter der Oberfläche von lebendem Gewebebe finden.
Beschreibung des Standes der Technik
Bei der optischen Kohärenzmikroskopie (OCM) handelt es sich um eine vor kurzem zur Abbildung von Objekten, die bis zu einer Tiefe von 1 bis 2 mm in einem undurchsichtigen Medium (z.B. Muskelfleisch) eingebettet sind, entwickelte Methode. Beruhend auf einem Prototyp, wurde sie erfolgreich in der Augenheilkunde (Swanson et al., 1993) und Dermatologie (Schmitt et al., 1995) zum Abbilden von Gewebestrukturen und Schnittstellen angewendet. Weiterhin wurde die OCM zum Messen der optischen Eigenschaften des Gewebes, und daher zum Bereitstellen von Informationen über die physiologische Kondition des Gewebes, eingesetzt. OCM wurde kürzlich zum Mittelpunkt des Interesses in der Studie der Entwicklungsbiologie.
Das Verständnis des Entwicklungsmechanismus stammt von Studien über Genexpressionsmuster, Gewebegeometrie, und/oder Zellenmorphologie, die alle am festen Gewebe durchgeführt werden. Aus dieser „Schnappschuss"-Sicht müssen Forscher auf die. Dynamik der zugrunde liegenden zellförmigen und molekularen Erscheinungen schließen. Vor kurzem wurden biologische Abbildungstechnologien eingeführt, die eine zerstörungsfreie Analyse von Zellmigration, Differenzierung, und neuronaler gegenseitiger Verbindung während der Entwicklung des Embryos zulassen. Zum Beispiel können fluoreszente oder absorbierende Verbindungen verwendet werden, um die Zellen zu kennzeichnen, die dann mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop, das mit einer Videokamera oder mit einem Konfokalmikroskop ausgerüstet ist, weiter verfolgt werden. Das Konfokalmikroskop vergrößert die Tiefenauflösung auf signifikante Weise, wodurch die Möglichkeit geboten wird, eine dreidimensionale Abbildung durch die Vereinigung von optischen Abschnitten durch die Tiefen des Embryos hindurch zu erhalten. Die Abbildungsformationssrate des Konfokalmikroskops ist ausreichend schnell, um die dynamischen Verhaltensweisen von migrierenden Zellen, oder von sich erweiternden Netzhautzellenfortsätzen zu verfolgen, aktiv abzutasten, und Projektionen zu den Zellen hin im Tectum zurückzuziehen (O'Rourke et al., 1994). Die Lichtstreuung im Embryogewebe reduziert jedoch das Signal-Rausch-Verhältnis eines Konfokalmikroskops, wodurch die erforschbare Tiefe der Probe auf etwa 200 μm beschränkt wird (Schmitt- et al., 1994b). Bei einer zweiten Abbildungstechnologie handelt es ich um die Magnetische Resonanzabbildung (MRI), die vor kurzem auf das mikroskopische Gebiet erweitert wurde, sodass sie nun eine Kubikzahl von 12 μm im lebenden Embryo auflösen kann (Jacobs and Fraser, 1994). Obwohl die MRI-Mikroskopie sich nicht von der optischen Undurchsichtigkeit unterscheidet, ist sie gleichermaßen teuer und langsam, und benötigt fast eine Stunde, um eine Abbildung von hoher Auflösung zu erzeugen.
Es sollte bemerkt werden, dass andere vor kurzem entwickelte Methoden ebenfalls eine Degradation der Abbildung bezüglich der Tiefe im Gewebe erfahren. So wurde z.B. das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) in der Pflanze Arabidopsis thaliana modifiziert und ausgepresst, wodurch sehr schöne Abbildungen der sich entwickelnden Wurzeln hervorgebracht wurden. Diese Abbildungen werden jedoch mit einem Konfokalmikroskop erhalten, und beschränken sich daher auf Tiefen von weniger als 100 μm in diesem Präparat. Die Entwicklung des primären Meristems im Embryo Saatgut findet mehrere Hundert Mikrometer innerhalb des Gewebes statt, was zu tief für die Konfokalmikroskopie ist. Ähnliche Beschränkungen gelten für die 2-Photonen-Mikroskopie (Potter et al., 1996) und den Fluroeszenzresonanz Energietransfer (Helm und Tsien, 1996).
Optische Kohärenzmikroskopie. Ein optisches Kohärenzmikroskop verwendet die Prinzipien der Konfokalmikroskopie mit einer zusätzlichen Kohärenzschranke, die von der unscharfen Ebene zurück gestreutes Licht ausgrenzt, was zu einem Signal-Rausch-Verhältnis führt, das durch 6 Größenordnungen erweitert wird (Izatt et al., 1994a,b). Eine Auflösung von 10 μm wurde in den seitlichen als auch den Tiefenrichtungen erreicht (Huang et al., 1991b). Üblicherweise werden optische Glasfasern und Festkörperquellen/Detektoren verwendet, sodass das Instrument eigenstabil ist. Das OCM bezwingt die Tiefenbeschränkungen der Konfokalmikroskopie und ist derzeit schneller, als MRI. Und bei geschätzten Kosten von unter US $10.000,00, ist das Instrument um zwei Größenordnungen günstiger im Preis, als das der MRI-Mikroskopie.
Die Kohärenzschranke in dem OCM wird durch ein Michelson Interferometer am Konfokalmikroskop erreicht. Das von der Probe zurück gestreute Licht beeinträchtigt an sich das Licht, das von einem Referenzarm zurück kommt nur dann, wenn die zwei optischen Wege dieselben sind. Die Amplitude der Interferenzstreifen (deren „Sichtbarkeit") wird zu einem Signal; dieses Signal ist nur für das von einem engen Bereich von Tiefen in der Probe zurück gestreute Licht abschätzbar. Der Tiefenbereich, über welchem die Interferenz stattfindet, steht in Bezug zu der Kohärenzlänge der Quelle. Zum Beispiel, der Tiefenbereich, der gleichzeitig die Tiefenauflösung ist, beträgt ungefähr 10 μm, wenn die Spektralbreite der Quelle 30 nm (λ = 830 nm, Swanson et al., 1992) beträgt. Bei einer bestimmten Tiefe kann eine seitliche Abbildung (optischer Abschnitt) durch die Translation des Strahls gebildet werden; die Punktgröße des fokussierten Strahls (leicht weniger als 10 μm) bestimmt die seitliche Auflösung.
Geschichte der Reflektometrie. Als optische Glasfasern in der Kommunikationsindustrie in den 1970ern eingeführt wurden, stieg sofort der Bedarf nach einem Verfahren zum Testen und Auffinden von Mängeln in Glasfaserkabeln an. Die ersten Reflektometer (Barnoski und Jensen, 1976), die in diesem Bereich angewendet wurden, maßen lediglich die Hin- und Rückflugzeit bis zu einem reflektierenden Glasfasermangel. Typische Pulsbreiten betrugen ein paar Nanosekunden, sodass die räumliche Auflösung etwa einen Meter betrug.
In den 1980ern erschienen Niedrigkohärenzreflektometer, die im Frequenzbereich funktionieren, (Danielson und Whittenburg, 1987; Takada et al., 1987; Youngquist et al., 1987). In diesem Verfahren wird eine spektralbreite (30 nm) Lichtquelle im nahen Infraroten (800 bis 1300 nm) in einem Michelson Interferometer eingesetzt, wobei ein Bein davon die Glasfaser in der Prüfung ist. Die Lichtquelle hat eine Eigenzeit von 70 Femtosekunden, eine erhebliche Verbesserung gegenüber den Zeitbereichspulsbreiten. Während die Referenzweglänge variiert, wird die Interferometerleistung auf Interferenzstreifen überwacht, die stattfinden, wenn Licht von einem Abstandspunkt entlang der geprüften Glasfaser auf die Referenzweglänge reflektiert oder zurück gestreut wird. Die räumliche Auflösung entlang der geprüften Glasfaser beträgt die Hälfte der Kohärenzlänge, weil die Glasfaser dieses Bein des Interferometers zweimal durchquert. (Die geometrische räumliche Auflösung ist tatsächlich noch kleiner um einen Faktor n, wobei n für die Brechzahl der Glasfaser steht.) Bei einer Spektralbreite von 30 nm beträgt die geometrische räumliche Auflösung einer Glasfaser 7 μm.
Kurz danach wurde dieses Niedrigkohärenzreflektometer von Augenärzten überarbeitet, um damit die Augenlänge zu messen (Fercher et al., 1988; Hitzenberger, 1991). Schließlich wurden seitliche Abtastungen hinzugefügt, und seitliche sowohl als auch Tiefendaten bezüglich der Abbildungen auf der Probe interpretiert, gewöhnlich in zweidimensionalen Abbildungen mit einer seitlichen und einer Tiefendimension (Huang et al., 1991 a,b). Die Abbildung stellt vermutlich die räumliche Variation der optischen Eigenschaften einer Probe dar, hauptsächlich den Streuungskoeffizienten.
Ein Beispiel eines Niedrigkohärenz-Reflectomersystems, das optische Weglängenvariationen und Frequenzhübe durch die Anwendung einer streuenden oder reflektierenden Oberfläche einführt, die einer Translationsphase unterworfen sind, wird in der internationalen Anmeldung WO 95-33970 diskutiert. Dieses System verwendet eine optische Streukurve in seinem Referenzarm. Der Radius der Streukurve variiert, und hat eine schrittweise Transition in die periphere Fläche der Streukurve zum Einsetzen einer Doppler-induzierten Frequenzvariation.
Polarisationseffekte. Eine Interferenz tritt an der Ausgabe am OCM nur zwischen den gleichen Polarisationskomponenten der elektrischen Felder auf, die vom Referenzspiegel bzw. von der Probe zurückkommen. Doppelbrechungseffekte in den Glasfasern oder in der Probe können das Ausmaß und die Phase der von der Quelle abgestrahlten zwei Polarisierungskomponenten verändern und daher die Amplitude der Interferenzstreifen am Photodetektor reduzieren. Um diese Probleme in den Glasfasern zu beseitigen, haben einige Arbeiter polarisationserhaltende Glasfasern und geradlinig polarisiertes Licht angewendet, um Polarisations-Dispergierungseffekte zu beseitigen, die zu verschiedenen optischen Weglängen der verschiedenen Polarisationszuständen führen (Cilvaz et al., 1992). Kobayashi et al. (1991) bauten ein Polarisationsunempfindliches Reflektometer durch die Trennung der zwei Polarisationszustände an der Ausgabe am Interferometer und maßen deren Interferenzstreifen mit zwei unabhängigen Detektoren. Die Summe der Detektorausgaben ist unabhängig von den Doppelbrechungseffekten in den Glasfasern oder in der Probe. Demgegenüber entwickelten Wang et al. (1994) ein einfaches, kostengünstiges Mittel, um die Doppelbrechungseffekte zu umgehen. Verständigerweise verdrehen sie die Referenzglasfasern, wodurch die Stressdoppelbrechung eingeführt wird, bis die Polarisationszustände der Referenz- und Probenfelder übereinstimmen und die Amplitude der Interferenzstreifen auf ein Maximum gebracht werden. Anstatt für die Doppelbrechungseffekte zu kompensieren und diese zu beseitigen, haben Hoe et al. (1992) ein Niedrigkohärenz-Reflektometer gebaut, um die Polarisationsveränderungen in der Probe auszunutzen. Mit diesem Gerät waren sie in der Lage, Die Eigenschaften der Doppelbrechung in der Koronararterie eines Kalbs zu messen.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein optisches Kohärenzmikroskopsystem mit hoher Auflösung für das Sichtbarmachen von Strukturen unter einer Oberfläche einer biologischen Probe bereit. Das System enthält eine Lichtquelle, die Licht in einer Wellenlänge von zwischen 700 und 1500 nm abstrahlt, wobei das Licht entlang eines Probenwegs und eines Referenzwegs gelenkt wird. Die Länge von mindestens einem der Wege ist ein modulierter Weg mit einer ausgewählten Modulationsamplitude, die gleich oder kleiner als etwa 3 Streifen der Wellenlänge ist. Die Modulation kann bei einer Frequenz von mindestens etwa 50 KHz, 100 KHz, 300 KHz oder einer höheren Frequenz stattfinden. Das entlang des Probenwegs gelenkte Licht kann die biologische Probe abtasten, wobei die Abtastung zu einer Abbildung eines Teils der biologischen Probe führt; und der Teil zwischen etwa 100 μm und etwa 4000 μm unter der Oberfläche der Probe liegen kann.
Die Abbildung kann eine oder mehrere Schichten enthalten. Jede Schicht kann von mehrfachen Voxel abgeleitet sein, die alle im wesentlichen der Probentiefe unter der Oberfläche der Probe entsprechen. Die Abbildung kann mindestens etwa 50 verschiedene Schichten enthalten, wobei jede der Schichten von einer verschiedenen Gruppe an Voxel abgeleitet ist, wobei alle Voxel für eine jede bestimmte Schicht im wesentlichen einer gleichen bestimmten Tiefe unter der Oberfläche der Probe entsprechen. Die Abbildung kann gleichermaßen vermischte Voxel aus mehreren Schichten enthalten, sodass die Abbildung eine dreidimensionale Wiedergabe des Teiles der biologischen Probe ist. Das OCM-System gemäß der Erfindung kann weiterhin ein Kohärenzvolumen über eine Ebene enthalten, bei der die Länge der Probe gleich mit der Länge des Referenzweges ist, sodass das Kohärenzvolumen unter der Oberfläche der biologischen Probe besteht.
Das Licht aus dem Probenweg kann in die Probe eintreten und sich am Strahltaillendurchmesser von nicht größer als 20 μm innerhalb der Probe verjüngen. Die Strahltaille stimmt mit dem Kohärenzvolumen überein, sodass die Auflösung der Strukturen innerhalb der Probe um einen Abstand kleiner ist, als der Durchmesser der Strahltaille, oder gleich groß ist wie derselbe.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Sichtbarmachen einer Struktur unter einer Oberfläche einer biologischen Probe bereit, wobei das hierin beschriebene OCM-System eingesetzt wird. Das OCM-System ermöglicht ebenfalls ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Funktion, die auf dem Sichtbarmachen von in vivo Strukturveränderungen unter einer Oberfläche der biologischen Probe beruht. Die analysierende Funktion kann z.B. aus Genregulierung, Entwicklung, Messenger-Antwort und Stress bestehen.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Sichtbarmachen einer Struktur unter einer Oberfläche einer biologischen Probe bereit. Das Verfahren kann die folgenden Schritte enthalten: Das Bereitstellen von Licht mit einer Wellenlänge von zwischen 700 und 1500 nm; wobei das Licht in einen Probenlichtweg und einen Referenzlichtweg geteilt wird; die Länge von mindestens einem der Lichtwege bei einer Amplitude von nicht mehr als etwa 3 Streifen der Wellenlängen moduliert wird, das Licht vom Probenweg in die biologische Probe gelenkt wird, sodass sich das Licht zu einer Strahltaille in einer ausgewählten Tiefe unter der Oberfläche der Probe verjüngt, und sodass die Strahltaille mit einem Kohärenzvolumen auf einer Ebene von gleicher Weglänge des Probenweges und des Referenzweges übereinstimmt; und wobei eine Abbildung in der ausgewählten Tiefe unter der Oberfläche der Probe zum Sichtbarmachen der Struktur nachgewiesen wird.
Gemäß diesem Verfahren wird der Lenkungsschritt mindestens 100-mal wiederholt, und nach jedem Lenkungsschritt kann das Verfahren den zusätzlichen Schritt der Translokation des Probenlichtweges in eine andere Position in der biologischen Probe umfassen. So sichtbar gemacht, kann die Abbildung auf einen Unterschied zwischen einer mutierenden biologischen Probe und einer nicht mutierenden biologischen Probe hinweisen. Die Abbildung kann ein Muster an Lichtstreuung einschließen, wobei das Muster mit einer kennzeichnenden Eigenschaft der biologischen Probe in Korrelation steht, wie z.B. Gentätigkeit, Differenzierung, Zellstreckung, Zellruhe, Stressantwort und Pathogenantwort.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt das optische Schema eines optischen Glasfaser-Kohärenzmikroskops (OCM) dar.
2 stellt eine Abbildung einer Ronchi Anordnung dar, die durch 1,2 mm einer hoch streuenden Lösung aus Polystyrol-Latexkugeln sichtbar gemacht wird.
3 ist ein typischer Ausdruck eines Kurvenschreibers der OCM-Streifenamplitude gegenüber der Tiefe, gemittelt über horizontale Schnitte in einem Pflanzenpräparat.
4 ist ein typischer Ausdruck eines Kurvenschreibers der OCM-Streifenamplitude gegenüber der Tiefe, gemittelt über horizontale Schnitte in einem Froschpräparat.
5 stellt das Verhältnis zwischen dem Rauschen im Referenzstrahl gegenüber der Referenzstrahlleistung dar.
6 zeigt die Impedanz von montierten und nicht montierten Piezovorrichtungen als eine Funktion der Treiberspannungsfrequenz.
7 zeigt die Verschiebung der Piezovorrichtung pro angewendeter Voltzahl bei jeder der Resonanzfrequenzen.
8 stellt die Phasenabhängigkeit des Ausgabestreifensignals dar.
9 zeigt die experimentellen Werte der Leistungen des Interferometer-Ausgangssignals in den ersten zwei Harmonischen als eine Funktion der Piezotreiberspannung.
10 ist ein optisches Schema eines modifizierten OCM.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung offenbart ein optisches Kohärenzmikroskop, das in der Lage ist, grundlegende Probleme in der Entwicklungsbiologie anzusprechen. Resultate für zwei beispielhafte Entwicklungssysteme, der Frosch Xenopus laevis und die Pflanze Arabidopsis thaliana werden hierin dargelegt. Die Erfindung ist gleichermaßen geeignet für Anwendungen in zahlreichen anderen Klassifizierungen, einschließlich z.B. Drosophila, dem Zebrafisch, und nahezu jeder landwirtschaftlich oder wissenschaftlich wichtigen Pflanze. Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls im weiten Sinne auf andere biologische Systeme anwendbar, in welchen die sichtbar zu machenden Erscheinungen, Strukturen, Zellen, und/oder Verfahren der Lichtmikroskopie nicht zugänglich sind. Die Erfindung ist insbesondere für Entwicklungsbiologiestudien von Strukturen und Erscheinungen innerhalb von 4 mm geeignet, vorzugsweise innerhalb 3 mm, besonders bevorzugt innerhalb von 2 mm, und ganz besonders bevorzugt innerhalb von 1 mm einer Gewebeoberfläche. Gleichermaßen zieht die Erfindung die Anwendung des offenbarten OCM für andere Zwecke in Erwägung, wie z.B. für die Diagnostik und die Genfunktionalanalyse. In Anlehnung an das hier offenbarte Verfahren können durch das Stapeln von aufeinander folgenden seitlichen Abbildungen von den verschiedenen Tiefen gebildeten Daten für eine dreidimensionale Abbildung in weniger als einer Minute erhalten werden. Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung besonders gut für die Genfunktionalanalyse mit hoher Durchsatzleistung geeignet, wobei jedes OCM die Fähigkeit besitzt, Entwicklung und andere genregulierte Erscheinungen in vielen Pflanzen pro Tag aufzuspüren. In diesem Aspekt der Erfindung können 25, 50, 100, 250, 500 oder mehr Pflanzen pro Tag je nach Art der Prüfung überprüft werden.
Entwicklungsbiologie - Xenopus laevis. Durch seine Auflösung ist das OCM ideal zur Verfolgung der Entwicklung innerhalb von amphibischen Embryos geeignet, wo die Einzelzellgröße normalerweise größer als 10 μm ist und kritische Entwicklungserscheinungen innerhalb der ersten paar Hundert Mikrometer stattfinden. Die eher konventionelle Mikroskopie (Konfokalmikroskopie, Videomikroskopie) ist zur Verfolgung vieler der embryonalen Entwicklungen wegen der hoch streuenden Natur des Zellplasmas des Froschembryos und der optischen Anomalien, die mit der konfokalen Abbildung tief im Gewebe (Schmitt et al., 1994b) einhergehen, nicht geeignet. Vor kurzem waren Jacobs und Fraser (1994) mit der Anwendung eines MRI-Mikroskops in der Lage, Erscheinungen im Inneren eines Froschembryos während der Gastrulation und Neurulation zu verfolgen. Zu ihrer Überraschung beobachteten sie, dass sich die tieferen Zellen (Mesoderm) und die Oberflächenzellen (Ektoderm) zu verschiedenen Raten ausdehnen. Vorherige an explantierten Fragmenten von Embryogewebe durchgeführte Analysen hatten darauf hingewiesen, dass sich die ektodermischen und mesodermischen Gewebe die embryonische Achse grob geschätzt übereinstimmend ausdehnen (Keller, 1986). Es ist wünschenswert, die genauen Verhältnisse zwischen diesen Geweben zu untersuchen, da größtenteils angenommen wird, dass die vom Mesoderm zum Ektoderm fließenden Signale eine Hauptrolle in der Einrichtung und der Musterung des embryonischen Nervensystems spielen.
Entwicklungsbiologie – Arabidopsis thaliana. Der Pflanzenkörper wird überwiegend nach der Embryonalperiode durch die Tätigkeit von speziellem Gewebe, genannt Meristems (Steeves und Sussex, 1989), gebildet. Das gegenwärtige Verständnis über Molekularmechanismen, die die Funktion und Bildung von Meristems regeln, ist sehr beschränkt. Vor kurzem haben sich jedoch im Verständnis über die Meristembildung einige Fortschritte durch die genetische Analyse des kleinen Kreuzblütlers Arabidopsis thaliana (Mayer et al., 1991; Barton und Peothig, 1993) abgezeichnet. Im Arabidopsis werden zwei Meristems, nämlich das Hauptwurzel- und das Austriebsscheitel-Meristem embryonal gebildet, während die sekundären (seitlichen) Wurzel- und Austriebsmeristems erst nach der Embryonalperiode erscheinen. Molekulare und genetische Ansätze wurden eingesetzt, um die für die Bildung des Wurzelmeristems erforderlichen Gene zu identifizieren (Williams und Sussex, 1995; Laskowski et al., 1995). Demzufolge ist es nun möglich, den sich entwickelnden seitlichen Wurzelmeristems Phasen zuzuordnen, die auf deren morphologischen Eigenschaften beruhen.
Das Austriebsscheitel-Meristem von Arabidopsis liegt unter der Oberfläche, und ein Embryo von Arabidopsis liegt innerhalb einer Schicht von Pigmentzellen. Dementsprechend konnte das Sichtbarmachen der Entwicklung der Hauptwurzel- und Austriebsscheitel-Meristems im Embryo bisher nur durch Fixieren und das in Abschnitte Teilen, oder die Sektion des Embryos vom mütterlichen Gewebe stattfinden. Diese Verfahren verhindern offesichtlicherweise eine kontinuierliche Observation der Entwicklung innerhalb desselben Meristems.
Nach der Embryonalphase bildet das Austriebsscheitel-Meristem den größten Teil des Gewebes und der Organe in einer Pflanze (z.B. in den Blättern). Blätter werden direkt an den Flanken des Austriebsscheitel-Meristems durch eine asymmetrische Erweiterung des Meristems angeregt, was zu einer Auswölbung führt, die sich nach weiterer gleichlaufender Ausdehnung zu einer deutlich abgegrenzten Organanlage des Blattes bildet (Steeves und Sussex, 1989). Chirurgische Experimente haben demonstriert, dass zuvor angeregte Blattorgananlagen einen hemmenden Effekt auf die Lage der nachfolgenden Organanlage haben, wodurch diese sich an einem Punkt bildet, der am weitesten entfernt von den zwei vorher angeregten Blättern liegt (Snow und Snow, 1962). Ob dieser hemmende Effekt auf chemische oder physikalische Faktoren zurückzuführen ist, bleibt noch ungeklärt (Smith und Hake, 1992; Hernandez und Green, 1993; Green, 1994). Herkömmliche Ansätze zur Studie der Blattstellung (dem Muster der Blattanregung) haben eine Art von Sektion zum Entfernen von Deckgewebe erfordert, um das Austriebsscheitel-Meristem sehen zu können. Die Anwendung des OCM zum nichtinvasiven Verfolgen von Mustern der Blattanregung in Arabidopsis vermeidet die Veränderung der biochemischen und physikalischen Umgebung der Pflanze. Es ist möglich die Verfahren im Scheitelmeristem, in der Austriebsspitze und anderen tief verdeckten Geweben und Organen zu betrachten. Zum Beispiel ermöglicht das OCM den Nachweis der Organanregung, Dorsoventralität sowie andere Verfahren, die tief in 1 bis 2 Millimetern des Gewebes bei einer Auflösung von mindestens 10 μm verdeckt sind. Diese Abmessungen fallen innerhalb eines optimalen Bereiches des OCM und sind nicht für die Analyse durch andere Methoden geeignet. Als ein Beispiel ermöglicht das OCM die Observation von veränderten Mustern der Blattstellung, die durch die genetische Mutation oder exogene Anwendung von Hormonen entstehen. Weiterhin stimmt ein hoher Betrag an zurück gestreutem, in den Zellen und dem Gewebe erkanntem Licht durch das OCM stark mit den Zellen und dem Gewebe überein, die dafür bekannt sind, in der Transkription und Differenzierung aktiv mitzuwirken. Daher bietet das OCM ein Werkzeug zur Verfolgung von jeweils aktiven Verfahren, seien es natürliche oder durch in vivo hervorgerufene. Die vorliegende Erfindung zieht daher ausdrücklich die Verwendung von OCM-Ausführungsformen der Erfindung in verschiedenen Ansätzen zum Verfolgen von aktiven biologischen Verfahren in Erwägung, einschließlich, z.B. Genfunktionalanalyse, Entwicklungsstudien, Nachvollziehung der Antworten auf biologische Signale, wie z.B. Hormone und pathogene Auslöser und ähnliches.
Optisches Kohärenzmikroskop. Das Mikroskop gemäß der Erfindung ist in der Lage Zellen abzubilden, die sich unter der Oberfläche von lebendem Gewebe befinden, obwohl es durch die Lichtstreuung in der Probe in einem herkömmlichen oder einem Konfokallichtmikroskop als undurchsichtig wiedergegeben werden würde. Die Eindringtiefe wird durch die Verwendung einer nahen Infrarot superlumineszierende Diodenleuchtquelle mit einer Kohärenzlänge von 20 μm zusammen mit einer Kohärenzschranke basierend auf einem Michelson Interferometer erreicht. Diese Kombination schließt aus, dass Licht von unscharfen Ebenen zurückgestreut wird, wobei eine Tiefenauflösung von 10 μm gegeben wird. Die seitliche Auflösung von 10 μm oder höher wird durch das Fokussieren des Leuchtstrahls nach unten auf einen kleinen Punkt erreicht. Das zweidimensionale seitliche Abtasten des Strahlpunkts erzeugt einen optischen Abschnitt bei einer festgesetzten Tiefe in der Probe. Eine dreidimensionale Abbildung wird durch das Stapeln von aufeinander folgenden optischen Abschnitten bei verschiedenen Tiefen erhalten. Solche dreidimensionalen Abtastungen benötigen normalerweise weniger als eine Minute.
1 stellt ein optisches Schema eines optischen Glasfaser-OCM dar. Die superlumineszierende Diode (SLD) ist eine Laserdiode mit Endfacetten, die mit einer antireflektierenden Schicht überzogen worden sind, sodass keine Lasertätigkeit stattfindet und daher die volle Spektralbreite der Transition in der Ausgabe erscheint. Die mittlere Wellenlänge liegt im nahen Infrarot (d.h. 850 nm), wo der Absorptionskoeffizient des biologischen Gewebes sich nahe des Minimums aufhält. Bei der Annahme eines Gaußschen Spektralprofils, ergibt eine Spektralbreite des SLD von 30 nm Halbwertsbreite eine endgültige Tiefenauflösung (Halbwertsbreite der Gaußschen Sichtbarkeitsfunktion) von 11 μm/n, wobei die Brechzahl n des Gewebes nahezu 1,40 beträgt (Bolin et al., 1989). Der Helium-Neon Laserstrahl (633 nm) dient lediglich dem Sichtbarmachen des fokussierten Punkts, und beide Strahlen werden zu Einmodenglasfasern vereint. Die zwei Glasfasern werden in einer Schmelzregion vereint, die sich "2 × 1 Koppler" nennt.
Jeder Quellstrahl wird gespalten und entlang der beiden Wege auf dem Michelson Interferometer durch den 2 × 2 Koppler verschickt, einer ähnlichen Schmelzregion aus zwei Fasern, die deren räumlichen Moden vermischt. Die Probenweg-Glasfaser wird mit einer asphärischen Einstelllinse begrenzt, und der Strahl wird dann durch eine Dupletlinse auf einen Punktdurchmesser von 9 μm fokussiert. Die Probenglasfaser/der Fokussierungslinsenbausatz wird an der dreidimensionalen Abtastphase, bestehend aus einer eindimensionalen Translationsphase, die durch einen Gleichstrommotor angetrieben wird, und einem Paar Galvoscanner, die mit einer x–y Befestigung montiert sind. Die Regelkreis-Galvoscanner tasten die horizontale Ebene nach dem Rasterverfahren ab, während der Regelkreis-Gleichstrommotor entlang der Tiefenabmessung läuft, sodass die Taille des fokussierten Strahls ein Probenvolumen bemustert und eine OCM-Abbildung gebildet wird. Die Referenzweg-Glasfaser wird ebenfalls mit einer asphärischen Einstelllinse begrenzt und an einen Referenzspiegel (Retroreflektor) geleitet, der an einer anderen Translationsphase montiert ist, die von einem Regelkreis Gleichstrommotor angetrieben wird. Während die Probenglasfaser/der Fokussierlinsenbausatz entlang der Tiefenabmessung läuft, wird der Referenzspiegel einer Translation unterzogen, um die Strahltaille übereinstimmend mit dem Kohärenzvolumen (Position der gleichen Weglängen im Interferometer) zu halten. Dieser letzte Punkt ist wichtig, weil der Rayleigh-Bereich des fokussierten Strahls etwa 60 μm beträgt, sodass sich der Strahl rasch erweitert und sich die seitliche Auflösung degradiert, während das Kohärenzvolumen von der Strahltaille abweicht.
In einer Ausführungsform kann das Instrument ebenfalls passende piezoelektrische Zylinder aufweisen, um welche die Referenzweg-Glasfaser und die Probenweg-Glasfaser gewickelt sind. In Antwort auf eine angewandte Spannung verändert sich der Umfang jedes Zylinders leicht, was zu einer Veränderung der optischen Weglänge der Glasfasern führt. Falls die piezoelektrischen Zylinder durch ein Dreieckspannungssignal (180 ° gegenphasig) bei einer Frequenz von z.B. 8,3 KHz, modulieren die daraus resultierenden Veränderungen in den Glasfaserlängen die optische Weglängendifferenz zwischen den zwei Armen des Interferometers. Falls die Amplitude der Piezoantriebsspannung so gewählt wird, dass die optische Weglängenvarianz ± 1,5 λ beträgt, wird das Interferenzmuster an der Interferometerausgabe bei 100 KHz moduliert, einer Frequenz, die sich leicht durch einen elektrischen Bandpassfilter zum Vergrößern des Signal-Rausch-Verhältnisses isolieren lässt. Alternative Ausführungsformen können einen piezoelektrischen Stapel mit einem daran montierten Spiegel als einen Weg einsetzen, um Hochfrequenz-Längenveränderungen in einem Lichtweg zu erreichen. Diese Ausführungsform wird im nachstehenden Beispiel 1 näher erläutert.
Abtastverfahren. Zwei verschiedene, allgemeine Verfahren können zum Abtasten einer Probe und Erzeugen einer OCM-Abbildung verwendet werden. Zum einen kann ein zweidimensionales seitliches Abtasten bei einer festgelegten Tiefe, die Tiefe dann schrittweise, dann eine weiteres seitliches Abtasten, etc. durchgeführt werden. Eine dreidimensionale Abbildung eines Probenvolumens wird dann durch das erfolgreiche Stapeln von zweidimensionalen optischen Abschnitten erstellt, die sich parallel zur Oberfläche der Probe befinden. Im Gegensatz dazu führen die meisten Forscher. (siehe z.B. Huang et al., 1991 a) ein Längsabtasten (Tiefe) an einem festgelegten quer verlaufenden Punkt durch, unterziehen den Strahl einer seitlichen Translation in einer Einzelrichtung, und wiederholen das Längsabtasten, etc. üblicherweise wird dann ein zweidimensionaler optischer Abschnitt gebildet, der senkrecht zur Probenoberfläche verläuft, wobei er eine Tiefenabmessung und eine seitliche Abmessung hat. Jedes Längsabtasten wird durch die Translation des Referenzspiegels bei Geschwindigkeiten von bis zu 160 mm/s ausgeführt (Hee et al., 1994). Das vom sich bewegenden Referenzspiegel reflektierte Licht wird dann um bis zu 380 KHz vom Doppler versetzt, und der elektrische Bandpassfilter kann auf dieser Frequenz eingestellt werden. In diesem Fall ist die Modulation des durch die piezoelektrischen Kristalle in 1 bereitgestellten Interferenzmusters nicht notwendig. Bei dieser Doppler-Versetzungsmethode ist es jedoch schwierig, die Strahltaille übereinstimmend mit dem Kohärenzvolumen zu halten, was zu einer degradierten seitlichen Auflösung führt. Für die Abbildung von Embryos wird vorgezogen, in beiden seitlichen Richtungen abzutasten, um einen optischen Abschnitt bei beliebiger Tiefe zu erzeugen.
Fokussieren des Strahls. Die seitliche Auflösung einer OCM-Abbildung wird durch die Größe des fokussierten Strahls bestimmt. Für eine gute Auflösung ist es daher von Vorteil, einen fokussierten Punkt mit einem Durchmesser zu verwenden, der kleiner als 10 μm ist. In einer Ausführungsform des OCM (siehe 1) wird die Probenglasfaser mit einer asphärischen Einstelllinse (f = 6,2 mm, OZ Optik) begrenzt, sodass der hervorkommende Strahl einen l/e² Durchmesser von 1,4 mm und einen Divergenzhalbwinkel von 0,4 mrad hat. Die daraus folgende Dupletfokussierungslinse (f = 10 mm, Metles Griot, 06LAl001) ist ausgelegt, um sphärische Anomalien bei 803 nm auf ein Minimum zu bringen, und ergibt eine nahezu beugungsbegrenzte Punktgröße mit einem l/e² Durchmesser von 8 μm.
Eine ausgewählte Fokussierungsanordnung kann durch die Abbildung einer Ronchi Anordnung durch 1,2 mm einer hoch streuenden Lösung aus Polystyrol-Latexkugeln getestet werden. Die Ronchi Anordnung besteht aus 10 μm breiten Streifen aus Chrom, das auf einer Glasplatte abgelegt wird. Die Chromstreifen werden durch 10 μm starke Streifen aus klarem Glas getrennt. Die hoch streuende Lösung dient als Gewebserscheinung und besteht aus Polystyrol-Latexkugeln mit einem Durchmesser von 0,523 μm. Die Lösung hat einen Streuungskoeffizienten μ von 40/cm und einen reduzierten Streuungskoeffizienten μ = (1 g)μ von 10/cm, wobei der Asymmetrieparameter g gleich dem Mittelwert des Kosinus des Streuungswinkels ist. Die Sphärenlösung stellt nahezu 5 optische Tiefen dar, und erscheint dem. nicht unterstützten Auge, oder durch ein herkömmliches Mikroskop, als undurchsichtig. Aus einer detaillierten Analyse von Abbildungen, wie 2, wurde der l/e² Durchmesser der Strahltaille mit 8,8 ± 0,2 μm festgestellt, gerade etwas größer, als die beugungsbegrenzte Punktgröße von 8 μm.
Abbildungserfassungszeit. Bei dem Entwerfen und der Ausführung eines OCM zur Abbildung in der Entwicklungsbiologie und Biotechnologie ist die zum Erfassen einer Abbildung benötigte Zeit ein kritischer Faktor. Sicherlich sollte diese Zeit im Vergleich zur mittleren Zeit zwischen den Zellteilungen sein, und es wäre hilfreich, wenn die Erfassungszeit kurz genug wäre, die großen Bewegungen des Embryos zu eliminieren. Das grundlegende physikalische Phänomen, das ein Mindestmaß an Erfassungszeit setzt, ist das Photonenrauschen. Um z.B. 3 Präzision im erfassten Signal bei jedem Voxel in einer dreidimensionalen Abbildung eines Embryos unter Annahme der Poisson-Statistik zu erhalten, müssen sich für einen durchschnittlichen Voxel etwa 10³ Photonen im erfassten Signal befinden. Um daher eine Kubikzahl von 500 μm bei einer Auflösung von 10 μm in jeder Richtung, und einen Abstastschritt von 5 μm in jeder Richtung abzubilden, müssen Daten von 100 × 100 × 100 = 10⁶ Voxel erfasst werden. Die Gesamtzahl der benötigten Photonen ist deshalb 10³ × 10³ = 10⁹ Photonen.
Das erfasste Signal ist proportional zur Amplitude der Interferenzstreifen an der Ausgabe des Interferometers. Die Interferenzdauer ist proportional zum elektrischen Feld, das von einem Voxel zurück gestreut wird, sodass das erfasste Signal proportional zur Quadratwurzel der zurück gestreuten Leistung (Izatt et al., 1994a) ist. Wenn P₀ für die Leistung steht, die auf das Interferometer einfällt, und P_(Z) für die Leistung steht, die von einem Voxel bei einer Tiefe z zurück kommt, dann ist: Signal = Po Quadratwurzel (P(z))P0) (1)
Interpretation der OCM-Abbildungen. Obwohl einige OCM-Abbildungen von lebendem organischem Gewebe bereits in der Literatur angegeben worden sind (Swanson et al., 1993; Hee et al., 1994; Schmitt et al., 1994c,d, Bouma et al., 1995), muss noch eine Menge getan werden, um die exakten optischen Eigenschaften der Probe zu identifizieren, die zu Merkmalen in der OCM-Abbildung führen. Schmitt et al. (1993, 1994a) haben gezeigt, dass in schwach gestreuten Medien die Leistung, die vom selben Probenvolumen bei einer Tiefe z in einem OCM zurück kommt, durch P(z) = Po exp(·2μtz)·μ back/coh/2 (2)gegeben wird, wobei P₀ für die Leistung steht, die auf ein Interferometer einfällt, μ_t = μ_s + μ_a für den Gesamtschwächungskoeffizienten gleich der Summer der Streuungs- und Absorptionskoeffizienten des Mediums (Einheiten von 1/m)steht, μback für den zurück streuenden Koeffizienten (1/m) steht, und /_coh für die Kohärenzlänge der Quelle steht. In der Gleichung (2) steht P₀exp (–μ_tz) für die Leistung, die eine Tiefe z in der Probe ohne gestreut oder absorbiert zu werden erreicht, μ_back/coh/2 für die Fraktion der Leistung steht, die zurück gestreut wird und an der Ausgabe des Interferometers kohärent störend wirken kann, und exp(–μ_tz) für die Fraktion des zurück gestreuten Lichts steht, das die Oberfläche des Mediums erreicht, ohne gestreut oder absorbiert zu werden. Wie Schmitt et al. (1993) hingewiesen haben, können OCM-Daten in Verbindung mit Gleichung (1) und (2) verwendet werden, um die Werte für μ_t und μ_back im Gewebe abzuleiten. In der Tat haben Clivaz et al. (1992) OCM eingesetzt, um die Streuungseigenschaften, Brechzahl und Dicke von Arterienwänden zu messen.
Schmitt et al. (1994a) haben Monte Carlo Simulationen verwendet um aufzuzeigen, dass das einfachstreuende Modell der Gleichung (2) in einem Medium von bis zu 4 oder 5 optischen Tiefen (4 oder 5/μ_t)
Gültigkeit hat. Mit dem OCM maßen Schmitt et al. (1993) μl mit etwa 5/mm (und mit etwa 1,5/mm) in der Haut des menschlichen Fingers oder Unterarms. Bei optischen Tiefen von mehr als 4 bis 5 beginnt die mehrfache Streuung wichtig zu werden, und die Auflösung kann degradiert sein. Dementsprechend zeigen Iyatt et al. (1994a), dass das OCM die größten Vorteile gegenüber der Konfokalmikroskopie zwischen 5 und 15 optischen Tiefen hat.
Schmitt et al. (1994c) studierte die Wände von frisch exzidierten Koronararterien von Ratten mit dem OCM. Unter Verwendung des fokussierten Strahlpunktes mit Durchmessern im Bereich von 8 bis 17 μm, maßen Sie höhere Gesamtschwächungskoeffizienten mit größeren Strahlpunkten.
Sie kamen zu dem Schluss, dass die Steigung im gemessenen μ₁ dem Ergebnis der Degradation der räumlichen Kohärenz über dem Strahl mit steigendem Strahldurchmesser zuzuschreiben war. Sie spekulierten, dass diese Degradation in den räumlichen Schwankungen der Bruchzahl in den Arterienwänden zu suchen war, und deuteten auf ein theoretisches Rahmenwerk basierend auf der gegenseitigen Kohärenzfunktion des Strahls hin, der eventuell den beobachteten Verlust an räumlicher Kohärenz quantitativ zu beschreiben vermag.
Eine gründliche Interpretation von OCM-Abbildungen von biologischem Gewebe erfordert die Erläuterung des Ursprungs der Streuung und Absorption im Gewebe. Zum Beispiel können sich zwei Arten von Streuung von einem Zellhaufen so vorgestellt werden: (1) Die Streuung von Zellorganellen, die zu einer Streuung über alle gestreuten Winkel führen sollte, vielleicht leicht zu den vorderen Winkeln gewichtet, und (2) Fresnel Reflektionen von Bruchzahl-Fehlanpassungen, wie sie z.B. an der extrazellulären/intrazellulären Schnittstelle vorkommen. Die letztere Streuung sollte stark gerichtet sein, und wird als „spiegelnde" Reflektion bezeichnet. Natürlich ergeben sich beide Arten (1) und (2) aus den Inhomogenitäten in der Bruchzahl, die winkelförmige Abhängigkeit ist jedoch ziemlich eindeutig. Darüber hinaus gibt es eine Phasenveränderung von 180 ° in der Streuung nach Art (2), wenn die Reflektion von einem Medium mit einer höheren Bruchzahl stammt.
Kalibrierung des OCM. Es ist wünschenswert, zahlreiche Kalibrierungsverfahren für das OCM zu entwickeln. Ein wichtiges Kalibrierungsverfahren ist, das OCM dafür zu verwende, die Gewebephantome mit sorgfältig ausgelegten optischen Eigenschaften und physikalischen Abmessungen zu untersuchen. Zum Beispiel kann das Längsabtasten eines OCM durch die Prüfung von Phantomen getestet werden, die aus homogenen Schichten aus hoch gestreuten Lösungen mit Tiefen bestehen, die exakt durch die Glasplatten des Mikroskops definiert werden. Die Lösungen können aus Polystyrol-Latexkugeln oder Intralipid hergestellt werden, einer Fettemulsion, die für die intravenöse Ernährung in Krankenhäusern verwendet wird. Die Kugeln sind in exakten Durchmessern erhältlich; die Mie-Theorie kann zum Kalkulieren des Streuungskoeffizienten von Sphärenlösungen sowohl als auch von dem Asymmetrieparameter g, dem mittleren Kosinus des Streuungswinkels, verwendet werden. Intralipid enthält ein breites Kontinuum an Partikelgrößen, seine optischen Eigenschaften sind jedoch erschöpfend untersucht worden, weil es weniger teuer ist, als die Latexkugeln (Driver et al., 1989; Flock et al., 1987, 1992; van Staveren et al., 1991). Die Werte für μl für Lösungen von Kugeln und Intralipid können mithilfe eines Spektralphotometers unter Anwendung von aufeinander folgenden Verdünnungsverfahren gemessen werden.
Seitliche und Tiefenauflösungen können überprüft werden, indem ein Auflösungsziel oder eine
Kalibrierungszielmarke des Mikroskops an eine Schnittstelle zwischen den, Schichten in einem Gewebephantom gelegt wird. (Siehe die Abbildung der Ronchi Anordnung in 2.) Richtungskoeffizienten, Abschnitte und Unstetigkeiten in den von einer Längsabtastung erhaltenen Daten können verwendet werden, um μ_t und μ_back für die verschiedenen Schichten in einem Phantom abzuleiten (Schmitt et al., 1993). Längsabtastungen einer Lösung aus Polystyrolkugeln (auch in 2 angewendet) zeigten, dass das gemessene Streifensichtbarmachen exponentiell bei der in der Gleichung (2) vorausberechneten Tiefe abfällt, und einem Wert für μ_t von 38,4 ± 0,2/cm. Eine Reihe von Spektralphotometer-Messungen resultierten in μ_t von 40,0 ± 0,1/cm. Die Diskrepanz ist wahrscheinlich im geringen Beitrag der mehrfach gestreuten Photonen zu suchen.
Abbildungen eines OCM. Die Abbildungserfassung kann durch ein Computersystem gesteuert werden, das eine Sichtbarmachungs-Software verwendet, wie z.B. LabView (von National Instruments). Zum Beispiel kann eine Abbildung aus 500.000 Voxel bestehen, und ein Volumen von 1 mm × 1 mm × 1 mm abdecken. Natürlich kann die Erfindung ebenfalls zur Abbildung einer beliebigen Anzahl von Voxel eingesetzt werden, gleich ob weniger als 500.000 Voxel oder mehr als Millionen von Voxel. Die erwünschte Anzahl von Voxel wird basierend auf dem abzubildenden Volumen und der gewünschten Auflösung ausgewählt. Horizontale Schnitte von Abbildungen können während der Datenerfassung betrachtet werden, und nach der Sammlung kann eine dreidimensionale Abbildung schnell als Zeitserie von horizontalen Schnitten betrachtet werden, die auf einem Computerbildschirm dargestellt werden. Ausführlichere Untersuchungen einer dreidimensionalen Abbildung können durch die Übertragung der Abbildung auf ein Unix-Arbeitsplatzsystem erreicht werden, welches ein fortgeschrittenes Softwarepaket verwendet, wie z.B. AVS 5.0 (Advanced Visualization Systems). Eine besonders hilfreiche Art, Informationen von einer Abbildung zu beziehen, ist eine Volumenwiedergabe der Abbildung zu drehen, wobei die Einstellung der strukturellen Merkmale notiert wird. In einer im Volumen dargestellten Abbildung wird der Beitrag eines Voxel an der Rückseite des Abbildungsvolumens mit Beiträgen aller Voxel entlang der nach vorne zur endgültigen Pixel in der zweidimensionalen Abbildung ragenden Linie „vermischt". Bei mehreren der hier beigefügten Figuren handelt es sich um einfache, im Volumen wiedergegebenen Abbildungen aus einer Einfachperspektive, die dann auf einem Farblaserdrucker ausgedruckt werden. Der Informationsgehalt dieser Laserdruckerabbildungen ist erheblich niedriger als die sich drehende, im Volumen wiedergegeben Abbildung auf dem Computerbildschirm.
Optische Eigenschaften von Frosch- und Pflanzengewebe. Von den von Frosch- und Pflanzengewebe gesammelten Abbildung wurden durchschnittliche Werte für den Gesamtschwächungskoeffizienten μ_total = μ_s + μ_a abgeleitet, wobei μ_s und μ_a für die Streuungs- und Absorptionskoeffizienten stehen. Während der 850 nm Strahl in die Probe eintritt, wird die einfallende Leistung aufgrund der Streuung und Absorption mit der Tiefe abgeschwächt. 3 und 4 zeigen typische Diagramme einer OCM Streifenamplitude gegenüber der Tiefe, gemittelt über horizontale Schnitte in jeweils Pflanzen- und Froschpräparaten. Die Streifenamplitude ist proportional zur Quadratwurzel der von der Probe zurück gestreuten Leistung, sie sollte also exponentiell bei einer Tiefe gemäß exp(–μ_total · Tiefe) zerfallen. Festgesetzte werte für μ_total sind 15 und 10/mm für Pflanzen- und Froschgewebe, in Übereinstimmung der optischen Tiefen (l/e Schwächungslängen) von 70μm, bzw. 100μm.
Ausgestaltung des modifizierten OCM. Das modifizierte OCM ist schneller als das ursprüngliche Instrument, weil die x–y Abtastungen durch Galvo-Abtastspiegel anstelle von Gleichstromübersetzern durchgeführt wird. Ferner erzeugt ein piezomontierter Referenzspiegel Ausgabestreifen bei 125 KHz anstelle der 2 KHz Frequenz durch das Umwickeln der optischen Glasfaser um einen Piezozylinder.
Andere Modifikationen am OCM sind gemäß der Erfindung vorgesehen. Zum Beispiel kann eine niedrigere Antwort zeit für die elfektrischen Filter, die wahlweise durch die ersten zwei Harmonischen der Streifenfrequenz passieren, durch das Erweitern des Bandpasses dieser Filter erreicht werden. Zusätzlich kann der effektiv-integrierte Schaltkreis verwendet werden, um die Amplitude des Streifensignals zu messen, das einen inhärent niedrigen Dynamikbereich hat. Die digitale Signalverarbeitung (DSP) ist daher eine erwünschte Alternative zu analogen Schaltkreisen. Eine DSP Lösung kann Modifizierungen an den Filtereigenschaften in der Software zulassen, wobei die Antwortzeit durch die Ganzzahl der abgetasteten Streifenperioden bestimmt wird. Der Dynamikbereich kann deshalb über den analogen Effektivwert-Chip verbessert werden, weil Multiplizierungen digital durchgeführt werden.
Ferner beträgt das Photodetektorrauschen bei 100 KHz 25 pW/Quadratwurzel(Hz), ein Faktor von 8 Mal mehr als in den vom Hersteller angegebenen technischen Daten (New Focus, Modell 1801). Durch das Ersetzen von ähnlichen digitalen und analogen Photodioden/Verstärkern aus Silikon der Firma Advanced Photonix (Modell SD 100-41-21-23 1) wurde ein Rauschpegel von 1 pW/Quadratwurzel(Hz) erreicht. Der Verstärker in dem Photodetektor von Advanced Photonix hat eine Bandbreite von 400 KHz im Vergleich zu 125 MHz des New Focus Detektors. Die fortgeschrittene Photodiode von Advanced Photonix funktioniert ebenfalls mit einer Sperrvorspannung von 15 Volt, während die New Focus Diode über keine Vorspannung verfügt. Diese Rauschreduzierung am Photodetektor hat Rauschpegel insgesamt auf den Grundbereich, von Photonenrauschen reduziert. 5 zeigt, dass die typische OCM Interferometer Ausgabe von 25 μW von einem Photonenrauschen begleitet wird, das hauptsächlich Bose-Einstein ist. Dies bedeutet letztlich, dass das OCM sein Maximum an Signal-Rausch-Verhältnis erreicht, wenn der Referenzstrahl auf 3 μW geschnitten wird.
Die niedrigen Modulierungen der Amplitudenweglänge gemäß der Erfindung sind wichtig, um eine gute axiale Auflösung der Abbildung zu erhalten, die konsistent mit der Kohärenzlänge der Lichtquelle ist. Wünschenswerte Amplituden in Weglängen sind am besten als eine Funktion der Streifen der Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle ausgedrückt, wo ein Streifen als ½ λ definiert wird. Eine Amplitude von etwa 3 Streifen wird bevorzugt, eine Amplitude von etwa 2 Streifen wird besonders bevorzugt, und eine Amplitude von etwa 1 Streifen oder weniger wird ganz besonders bevorzugt. Zum Beispiel bei einer Wellenlänge von 850 nm, 3 Streifen = 1276 nm, 2 Streifen = 850 nm, und 1 Streifen – 425 nm.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Modifizierungen am OCM-System
A. Erhalt einer Hochfrequenz-Modulation der Weglänge durch das Montieren eines leichten Referenzspiegels am piezoelektrischen Stapel.
1. Schnellphasenmodulation
Die Schnellphasenmodulation wird in dem Michelson Interferometer eines OCM-Systems durch das Montieren eines leichten Referenzspiegels am piezoelektrischen Stapel und dem Antrieb des Stapels bei einer Resonanzfrequenz von etwa 125 KHz erreicht. Das elektrische Verhalten des Piezostapels und die mechanischen Eigenschaften der Piezospiegelanordnung wurden untersucht. Eine Verschiebungsamplitude bei einer Resonanz von etwa 400 nm wurde durch die Verwendung eines gewöhnlichen Funktionsgenerators erreicht: Langsame Drifts in der Weglängendifferenz der zwei Interferometerarme führten zu Variationen in der gemessenen Effektivwertintensität des an Wechselstrom gekoppelten Ausgabestreifensignals. Durch den Antrieb des Piezostapels an einer optimalen Amplitude (eine Verschiebung um 0,42 λ, oder etwas weniger als 1 Streifen) und dem Aufsummieren der Leistungen in den ersten beiden Harmonischen der piezotreibenen Frequenz, wurden Driftsensible Messungen des Ausgabestreifensignals erreicht.
Piezoelektrische Kristalle werden in einer Vielfalt von formen für die Phasenmodulation in der Interferometrie eingesetzt. Der Spiegel im Referenzarm eines Michelson Interferometers wird oft an einem Piezostapel montiert, der bei Frequenzen von bis zu 10 KHz angetrieben ist, was deutlich unter seiner Resonanzfrequenz liegt. Mit Antriebsamplituden von einigen zehn bis Einhundert Volt, können Weglängenmodulationen in einer Größenordnung von ein paar μm erreicht werden. Bei Glasfaser-Interferometern kann die Glasfaser in einer großen Anzahl von Wicklungen um einen hohlen piezoelektrischen Zylinder gewickelt werden. Das Antreiben des Zylinders auf Frequenzen von ein paar KHz veranlasst ihn, sich radial zu erweitern und zusammenzuziehen, wobei sich die Glasfaser entsprechend streckt und erschlafft und dadurch die Modulation der optischen Weglänge bereitgestellt wird. Dieses Verfahren erfordert normalerweise jedoch einige Dutzende Meter an Glasfaser, wodurch das Interferometer sensibel auf thermische Variationen reagiert, die zu einer Phasenwanderung des Ausgabesteifensignals führt. Andere Probleme mit diesem Ansatz können zu einer Unausgeglichenheit der statischen Polarisation und der Modulation der dynamischen Doppelbrechung umfassen, wofür ein Faradayscher Rotator zum Ausgleich erforderlich ist. Mit piezoelektrischem Überzug beschichtete Glasfasern sind ebenfalls eingesetzt worden. Wird eine Spannung auf den Piezomantel aufgetragen, wird die Glasfaser radial zusammengedrückt, und streckt sich dadurch in die Länge. Auf diese Weise können Schnellphasenmodulationen erreicht werden, die Modulationsamplitude ist jedoch typischerweise gering. Um eine Veränderung der optischen Weglänge von 1 μm bei 100 KHz zu erzeugen, würde eine Glasfaser, die über eine Länge von 20 cm beschichtet ist, über 100 V an Antriebsamplitude erfordern.
Um die zum Erfassen einer OCM-Abbildung benötigte Zeit zu reduzieren, war es wünschenswert, ein Verfahren der Phasenmodulation mit einer Frequenz, die höher als 100 KHz liegt, und mit einer Verschiebungsamplitude der Größenordnung 1 μm zu entwickeln. Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines piezoelektrischen Stapels, der bei einer Resonanzfrequenz von 125 KHz angetrieben wird, um eine Verschiebungsamplitude von 400 nm mit einer Spitzenantriebsspannung von nur 6,7 V zu erzeugen.
2. Tests des elektrischen Verhaltens eines piezoelektrischen Stapels
Von der Firma NEC Corporation in Japan hergestellte piezoelektrische Stapel (erhältlich von Thorlabs Inc., Newton, NJ, U.S.A., Typ AE0203-D04) wurden auf die mögliche Verwendung im Michelson Interferometer des OCM der Erfindung untersucht. Die Abmessungen dieser Piezovorrichtungen betragen 2,5 mm × 5 mm × 5 mm, und die technischen Daten des Herstellers deuten auf eine Verschiebung von etwa 3 μm bei 100 V DC hin. Da sich die Impedanz der Piezovorrichtung anfänglich bei einer steigenden Frequenz (Z = 1/ωC, wobei C = 100 nF) erhöht, könnten die höheren Stromstärken, die zur Beibehaltung dieser angewendeten Spannung erforderlich sind, zu einer Überhitzung des Stapels bei höheren Frequenzen führen. In jedem Fall wäre ein Hochleistungs-Funktionsgenerator für den Betrieb bei höheren Frequenzen erforderlich. Der Antrieb der Piezovorrichtungen bei deren Resonanzfrequenz hat sich jedoch als ein Verfahren herausgestellt, das diese Probleme umgeht.
Das piezoelektrische Verhalten der nicht montierten Piezovorrichtung wurde durch das Messen seiner Impedanz als eine Funktion der Frequenz getestet (siehe 6). Bei Frequenzen, die deutlich unter der Resonanz liegen, verhält sich der Piezovorrichtung wie ein Kondensator, wobei die Impedanz umgekehrt proportional zur Frequenz ist, und die Spannung um ungefähr 90 Grad hinter der Stromstärke her zögert. Bei 255 KHz erfährt das nicht montierte Piezovorrichtung ein Minimum an Impedanz, und Spannung und Stromstärke sind phasengleich. Diese Frequenz wird üblicherweise als die elektrische Resonanzfrequenz der Piezovorrichtung bezeichnet. Bei 330 KHz tritt ein Maximum an Impedanz ein, und die Spannung und Stromstärke sind wieder gleichphasig – die elektrische Antiresonanzfrequenz der Piezovorrichtung. Die Impedanz steigt zwischen Resonanz und Antiresonanz mit der Frequenz, während die Spannung die Stromstärke um etwa 90 Grad leitet. Bei höheren Frequenzen als der Antiresonanz zeigt die Piezovorrichtung wieder ein Kondensator-ähnliches Verhalten.
Mehrere nicht montierte Piezovorrichtungen desselben Models wurden getestet, und deren elektrischen Eigenschaften als innerhalb von ein paar Prozent übereinstimmend befunden. Diese Messungen wurden mit einer anderen Piezostapelmarke mit etwas größeren Abmessungen (3,5 mm × 3,5 mm × 9 mm von der Firma Piezomechanik, München) wiederholt. Dieselbe Art von Verhalten wurde beobachtet, wobei das Minimum und Maximum der Impedanz bei 183 KHz, bzw. 191 KHz stattfand, also bei niedrigeren Frequenzen als bei den kleineren NEC Piezovorrichtungen.
Um den Piezostapel für die Phasenmodulation einsetzen zu können, wurde ein kleiner, leichter Spiegel (1,5 mm × 1,5 mm × 0,1 mm von der Firma Edmund Scientific Co., Barrington, NJ, U.S.A.) an seiner Fläche mit Cyanacrylat („Superkleber") montiert. Der Piezostapel mit dem montierten Spiegel wurde entweder direkt auf eine standardmäßige, verstellbare Spiegelbefestigung oder auf eine Aluminiumscheibe von 8 mm Dicke mit einem Durchmesser von 25 mm geklebt, die dann durch eine Spiegelbefestigung gehalten wurde. Obwohl das Festkleben des leichten Spiegels am Piezovorrichtung sein elektrisches Verhalten nicht änderte, so wurden jedoch die elektrischen Resonanzeigenschaften der Piezovorrichtung durch das Montieren des Stapels an einer Aluminiumscheibe oder an der Spiegelbefestigung erheblich verändert. Anstatt einer elektrischen Einfach-Antiresonanz der nicht montierten Piezovorrichtung, erschienen mehrere Antiresonanzen bei Frequenzen, die jeweils niedriger und höher als die ursprünglichen lagen. 6 zeigt auch die Impedanz der montierten Piezovorrichtung als eine Funktion der Antriebsspannungsfrequenz. Diese Piezovorrichtung wurde mit einem Epoxydharz auf eine für Glasfaseranschlüsse (F 120 von der Firma Thorlabs Inc., Newton, NJ, U.S.A.) vorgesehene Aluminiumscheibe geklebt.
3. Mechanisches Verhalten des Piezospiegels in einem Michelson Interferometer
Das mechanische Verhalten des Piezospiegels wurde in einem Arm des Michelson Interferometers mit einem Helium-Neonlaser (633 nm) als Lichtquelle getestet. Bei den Messungen mit der montierten Piezovorrichtung wurde beobachtet, dass die Frequenzen der maximalen Piezoverschiebung denen der maximalen Impedanz entsprechen. Die mechanische Resonanz der Piezovorrichtung stimmt daher mit seiner elektrischen Antiresonanz überein. Nachfolgend werden diese Frequenzen als Resonanzen bezeichnet, bei welchen die Piezovorrichtung ein Maximum an Verschiebung erfährt. 7 zeigt die Verschiebung der Piezovorrichtung per angewandter Voltzahl bei jeder der Resonanzfrequenzen. Es wurde beobachtet, dass die Piezoverschiebung sich mit steigender Antriebsspannungsamplitude linear für eine bestimmte Resonanzfrequenz erhöhte. Die Verschiebung pro Volt variiert jedoch bei den verschiedenen Resonanzen derselben Piezovorrichtung, und fällt bei höheren Frequenzen ab. Obwohl die Verschiebung pro Volt höher als die 56 KHz Resonanz um nahezu einen Faktor von drei liegt, wurde die Piezovorrichtung im Michelson Interferometer anstatt dessen bei der 125 KHz Resonanz aufgrund ihrer höheren Frequenz angetrieben (siehe Abschnitt 5).
Beide Positionen der Resonanz und der entsprechenden Verschiebungsamplituden hingen von den Details der Piezomontage in einer Weise ab, die zumindest als qualitativ zu verstehen war. Die Montage des Stapels mit Superkleber führte zu niedrigeren Resonanzfrequenzen und größeren Verschiebungsamplituden als im dem Fall, in dem das weichere Epoxydharz verwendet wurde. Dieses Ergebnis wird als Bedeutung interpretiert, dass die sehr dünne Superkleberschicht zwischen der Piezovorrichtung und dem Montagesubstrat das Piezovorrichtung dazu zwingt, sich nur in der freien Richtung auszudehnen. Dies führt zu einer größeren Verschiebung des Spiegels, als dies mit einer dickeren Schicht des elastischeren Epoxydharzes der Fall ist, wahrscheinhich weil der Epoxydharz durch den sich erweiternden Piezovorrichtung gedrückt werden kann. Wenn die Piezovorrichtung mit Superkleber montiert wird, dehnt sie sich ebenfalls hauptsächlich in der freien Richtung aus, wobei ihr Schwerpunkt einer Translation unterzogen wird im Gegensatz zu der Piezovorrichtung mit Epoxydharz, die sich in ihrem Schwerpunkt erweitern und erschlaffen kann. Die mit Superkleber montierte Piezovorrichtung verfügt dann über einen größeren Effektivschwerpunkt während sie mitschwingt, wodurch niedrigere Resonanzfrequenzen erhalten werden.
Auf ähnliche Weise kann die Scheibe, auf der die Piezovorrichtung montiert ist, eine wichtige Rolle in der Feststellung der Positionen der Resonanzfrequenzen spielen. Der Unterschied zwischen mit Epoxydharz auf 5 und 10 mm dicken Aluminiumscheiben, beide mit 25 mm Durchmesser, geklebten NEC Piezovorrichtungen wurde untersucht. Sie wiesen im wesentliche dieselben Resonanzfrequenzen zwischen 100 und 360 KHz auf, die niedrigste Resonanz, die ebenfalls die größte Verschiebungsamplitude aufwies, wurde jedoch von 56,7 KHz bei der dünneren, auf 85,6 KHz bei der dickeren Scheibe verschoben. Die Beschichtungstheorie rechnet voraus, dass die Resonanzfrequenz des niedrigsten (Zylinderkopf) Modus für eine 5 mm dicke Aluminiumscheibe mit einen Durchmesser von 25 mm ungefähr 80 KHz und für die 10 mm dicke Scheibe einen um zwei höheren Faktor betragen sollte. Die dafür verwendet Formel hat in der Annahme Gültigkeit, dass die Scheibe unnachgiebig um ihren Umfang herum festgehalten wird, und dass die Dicke der Scheibe im Vergleich zu ihrem Durchmesser klein ist. Keine dieser Annahmen wird im vorliegenden Fall gut erfüllt. Weitere Untersuchungen unter Verwendung eines Finke Elementanalyse-Softwarepaket (SAP 2000 Nonlinear V6.15) ergaben, dass die Resonanzfrequenzen sehr sensibel auf die exakten Befestigungskonditionen reagierten, wobei die beobachteten Frequenzen grob konsistent mit dem drei-Punk-Befestigungsverfahren waren, das in diesen Tests angewendet wurde. Messungen mit zwei drei-Punkt-Spiegelbefestigungen von verschiedenen Massen ergaben dieselben mechanischen Resonanzen und Piezoamplituden. Diese Messungen und Kalkulationen unterstützen die Schlussfolgerung, dass die niedrigste Frequenzresonanz für das Stapel-Epoxidharz-Scheibensystem wahrscheinlich eine fundamentale Vibration der Scheibe ist, während die höheren Frequenzresonanzen dem „Piezovorrichtung auf Epoxydharz" Teil des Systems zugeschrieben werden können.
Die Ergebnisse für Resonanzfrequenzen und Verschiebungsamplituden derselben Marke von Piezovorrichtungen und desselben Montageverfahrens für die Piezovorrichtung ergab einen Unterschied von nur ein paar Prozent. Der stundenlange Betrieb des Piezospiegelsystems im OCM Michelson Interferometer über ein Jahr hinweg hat zu keinerlei Verschiebungen in der Resonanzfrequenz oder Veränderung in der Piezoverschiebung geführt. Sogar nach Stunden von kontinuierlichem Betrieb erhitzt sich der Stapel nicht beachtlich, und das System behält einen hohen Grad an Stabilität bei. Bei einer Antriebsspitzenspannung von 6,7 V stellt das beschriebene NEC Piezovorrichtung mit durch Superkleber montiertem Spiegel, mit Epoxydharz auf einer 5 mm dicken Aluminiumscheibe montiert eine Verschiebung von ungefähr 400 nm bei einer Resonanzfrequenz von etwa 125 KHz bereit, wodurch es bestens für die Phasenmodulation in dem OCM gemäß der Erfindung geeignet ist.
4. Kalkulationen, die die optimale Modulationsamplitude festlegen
Die superlumineszierende Diodenlichtquelle (SLD) im geprüften OCM hat eine Wellenlänge von 850 nm. Deshalb erzeugt eine Piezoverschiebung von 400 nm eine Gesamtdifferenz der Weglänge zwischen der Probe und den Referenzarme in dem OCM von weniger als einer Weglänge (λ), d.h. die Modulation beträgt, weniger als einen Streifen. Für solch kleine Weglängenmodulationen nimmt das Interferometer-Ausgabestreifensignal je nach dem anfänglichen Phasenverhältnis der Probe und den Referenzstrahlen deutlich verschiedene Formen an.
8 stellt diesen Punkt für eine Modulation eines halben Streifens (Piezoverschiebung von 0,25 λ) dar. Graphik (a) in 8 zeigt die Piezoverschiebung, die einfach aus der Form d_osinωt besteht, wobei die Spitzenverschiebung 2-D₀ als 0,25 λ zu verstehen ist. Theoretisch wird die Interferenzdauer in der entsprechenden Interferometer-Ausgabeintensität durch folgendes gegeben: /out = /0cos (αsinωt + Φ), wobei α mit der Piezoverschiebungsamplitude um α = 4πd₀/λ, und /_o gleich 2 Quadratwurzeln ) /_ref/_sample) ist, wobei /_ref und/_sample für die Intensitäten stehen, die von dem Referenzweg und dem Probenweg zurück kommen. Graphik (b) in 8 zeichnet /_out für eine anfängliche Phasendifferenz zwischen dem Probenstrahl und dem Referenzstrahl von Φ = O auf; Graphik (c) ist eine ähnliche Aufzeichnung für Φ = x/2. Die beiden Signale sind in der Form deutlich verschieden, und haben verschiedene Fourier-Komponenten, einschließlich verschiedener DC-Komponenten. In Graphik (b) ist die stärkste Komponente die von 2ω, die zweite Harmonische der Modulationsfrequenz. In Graphik (c) ist die dominante Fourier-Komponente des Signals die von ω, die Fundamentale der Antriebsfrequenz. Durch die Untersuchung der Graphiken wird ebenfalls deutlich, dass die Effektivwerte der AC-gekoppelten Signale verschieden sind. (Die Interferometerausgabe muss im OCM AC-gekoppelt sein, um die sehr große DC-Komponente /_ref zu eliminieren.) Deshalb führen randomisierte Phasendrifte zwischen dem Probenstrahl und dem Referenzstrahl zu Driften im Effektivwert der AC-gekoppelten Interferometerausgabe.
Das Kalkulieren der Fourier-Komponenten des Signals (1), die Leistung P₁, in der Grundfrequenz ω und die Leistung P₂ in der zweiten Harmonischen 2ω können wie folgt ausgedrückt werden: P1 = 2lo 2 J1 2 (α) sin2Φ (2) P2 = 2l/o 2J2 2(α)cos2Φ (3)
Die Summe der Leistungsstärken in den ersten zwei Harmonischen P₁ + P₂ ist daher nur für diese Piezoamplituden von Φ unabhängig, wobei J₁ ² (α) =J₂ ² (α). Der niedrigste Wert von α = 2,63, was zu einer Piezoverschiebung 2-D_o von 0,419λ führt. An dieser bestimmten Modulationsamplitude ist die Summe P₁ + P₂ unabhängig von Driften im Weglängenunterschied zwischen den zwei Armen und ist deshalb ein hilfreiches Maß der AC-gekoppelten Interferometer-Ausgangsstreifenintensität.
9 zeigt die experimentellen Werte der Leistungsstärken des Interferometer-Ausgangsstreifensignals in den ersten zwei Harmonischen als eine Funktion der Piezoantriebsspannung. Für jede Einstellung der Antriebsspannung wurden Leistungsstärken von 112 KHz und von 244 KHz mit einem Spektralanalysiergerät beobachtet, wie sie mit der Driftphase variierten, und deren Maximalwerte wurden aufgezeichnet. Die durchgezogenen und gestrichelten Linien deuten die besten Passungen an die Gleichungen P₁=k₁J₁ ² (r₁x) und P₂=k₂J₂ ² (r₂x) an, wobei k₁, k₂, r₁ und r₂ passende Parameter sind. Wie erwartet, waren die Passwerte von k₁ und k₂ dieselben bis innerhalb von 1 %, und die Werte von r₁x und r₂x bei einer Piezospannung von x=5,95 Volt Spitzenspannung waren innerhalb von 1 % von 2,63. An diesem Punkt war die Summe der Leistungsstärken P₁ + P₂ unabhängig vom Phasendrift.
5. Diskussion
Eine hohe Streifenfrequenz wurde durch den Antrieb einer Piezovorrichtung bei dieser selben Frequenz und durch die Verwendung einer Piezoresonanz erreicht, um eine Modulationsamplitude von etwa einem Streifen zu erhalten. Es ist ebenfalls möglich, hohe Streifenfrequenzen durch den Antrieb einer Piezovorrichtung bei niedrigen Frequenzen zu erreichen, jedoch mit größeren Verschiebungsamplituden. Durch das Wickeln von 100 m an Glasfaser um eine Piezoröhre, erreichten Cruz et al. Streifenfrequenzen von 1 GHz bei einer Spitzenweglängendifferenz von 14 mm. In diesem Fall stellt die Phasendrift wegen dem langen Zug an Streifen vor dem mit der Piezoumkehr verbundenen Phasenbruch kein Problem mehr dar. Die mit diesem Ansatz verbundenen großen
Interferometer-Wegdifferenzen sind jedoch mit dem Betrieb des OCM gemäß der Erfindung inkompatibel.
Das OCM gemäß der Erfindung sammelt dreidimensionale Abbildungen durch die Durchführung einer Reihe von schnellen zweidimensionalen Abtastungen in Ebenen, die senkrecht zum einfallenden Strahl stehen, und bei regelmäßigen Tiefenintervallen in der Probe. Diese zweidimensionalen „en face" Abtastungen werden bei Tiefen durchgeführt, die durch die gleiche Interferometer-Weglängenposition in der Probe bestimmt wird. Weil das typische Tiefenintervall für das OCM etwa 5 μm beträgt, muss die Modulation in der Weglängendifferenz auf etwa 1 μm während einer der en face Abtastungen beschränkt sein.
Größere Modulationen würden die Tiefenauflösung des OCM degradieren. Daher hat ein bei seiner Resonanzfrequenz angetriebener. Piezostapel sowohl eine hohe Streifenfrequenz für schnelle OCM Abbildungserfassung als auch eine kleine Modulationsamplitude für eine gute Tiefenauflösung bereitgestellt.
6. Schlussfolgerung
Wenn an eine Aluminiumscheibe geklebt, zeigt ein piezoelektrischer Stapel eine Anzahl von mechanischen Resonanzen zwischen 50 und 350 KHz auf. Das Piezovorrichtung wird bei seiner 125 KHz Resonanz für eine schnelle Phasenmodulation in einem Michelson Interferometer angetrieben. Bei einer Antriebs-Spitzenspannungsamplitude von 8 Volt wird eine Piezoverschiebung von etwa 350 nm (0,42 λ) erreicht. Die Langzeitleistung der Piezovorrichtung unter diesen Konditionen ist zuverlässig; insbesondere wurde keine Erhitzung oder anderer Schaden am Stapel beobachtet. Der gemessene Effektivwert der AC-gekoppelten Interferometerausgabe erfährt große Variationen wegen der Phasenwanderung zwischen dem Referenzarm und dem Probenarm des Interferometers. Für eine Piezoverschiebung von 0,42 λ stellt die Summe der Leistungsstärken der ersten zwei Harmonischen der Antriebsfrequenz jedoch ein Maß der Interferometerausgabe bereit, das unabhängig von Phasendriften ist.
B. Modifikationen am OCM Grunddesign zur Verbesserung der Geschwindigkeit der Abbildungserfassung.
Ein modifiziertes OCM wurde so konstruiert, dass es in der Lage ist eine Abbildung von einer Million Voxel in weniger als einer Minute zu erfassen. Ein optisches Schema des Instrumentes ist in 10 dargestellt. Die Hauptveränderungen in der Ausführung gegenüber des ursprünglichen OCM beinhalten den Einsatz eines Galvoscannerspiegels für die Röntgenabtastungen, und die Verwendung eines Piezo-montierten Spiegels zum Erzeugen der Interferometerstreifen.
1. Galvoscannerspiegel. Ein Paar rechtwinklige Galvoscanner (Modell 6800-XY, Firma Cambridge Technology Inc.) lenkt den von der Glasfaserprobe hervortretenden ausgeblendeten Strahl ab und variiert seinen Einfallswinkel auf der Fokussierlinse, wodurch die fokussierte Strahltaille über die x–y Ebene in der Probe abgetastet wird. Die Galvoscanner können bei bis zu 1 KHz betrieben werden. Der Strahl verbleibt etwa 20 Mikrosekunden auf einem Voxel, sodass eine lineare Abtastung entlang der x-Achse von 100 Voxel 2 Millisekunden benötigt. Der schnelle x-Achsen-Galvoscanner wird bei etwas unter 500 Hz betrieben. Eine Abbildung von einer Million Voxel könnte deshalb in 20 Sekunden aufgenommen werden, obwohl die Ablaufzeit der Verarbeitung jeder x–y Abtastung, und die Bewegung der Bedienteile des DC-Motors entlang der z-Achse die Erfassungszeit auf 40 bis 60 Sekunden erhöhen. Die Galvoscanner wurden durch die Abbildung einer Ronchi-Anordnung mit, einer Periode von 20 μm kalibriert.
2. Erzeugen schneller Interferometerstreifen. Die Helligkeit eines Voxel in einer OCM-Abbildung verhält sich proportional zur Amplitude des OCM-Interferometerstreifens. Die Amplitude der Streifen muss an jedem Voxel festgestellt werden. Das modifizierte OCM verbleibt nur 20 Mikrosekunden an einem Voxel, sodass die Frequenz der Streifen mindestens 50 KHz betragen muss. Um diese Frequenz zu erreichen, wurde ein kleiner Referenzspiegel (1,5 mm × 1,5 mm × 0,1 mm, Firma Edmund Scientific Co.) an einen piezoelektrischen Stapel (AED203-D04, Firma Thorlabs) mit einer Resonanzfrequenz von 250 KHz geklebt. Als der Spiegel und der Stapel mit Epoxydharz an eine Aluminiumscheibe (Durchmesser = 25 mm, Dicke = 5 mm) geklebt wurde, spaltete sich die Resonanzfrequenz in eine Anzahl von Resonanzen, wobei eine starke davon 120 KHz betrug. Bei dieser Resonanz reicht eine Antriebsspitzenspannung von 6 Volt aus um den Spiegel um 0,42 × 750 nm = 357 nm (Spitze) zu verschieben. Diese Modifikation wird im obigen Beispiel 1A näher betrachtet.
Der Spiegel/piezoelektrische Stapel bildet das rückwärtige Ende des Retroreflektors im Referenzarm des OCM Interferometers. Während der Spiegel piezoelektrisch bei 120 KHz oszilliert, variiert die Weglängendifferenz in dem Interferometer, und 120 KHz Streifen erscheinen an der Ausgabe. Die Streifen werden mit einem elektrischen Niedrigbandweitenfilter isoliert, und die Ausgabe wird dann an einen Effektivschaltkreis weitergeleitet. Ein handelsüblicher integrierter Schaltkreis ist der AD63 7 (Analog Devices), der die Amplitude der Streifen um besser als 10 % in ungefähr zwei Perioden des Streifensignals misst. Zwei Perioden bei 120 KHz kommen auf 17 Mikrosekunden; sodass der Strahl 20 Mikrosekunden lang an jedem Voxel verbleibt.
3. Eliminierung des Phasenrauschens des Interferometers. Wie alle Michelson Interferometer, treten bei der Weglängendifferenz zwischen dem Probenarm und dem Referenzarm des OCM langsame Drifts um etwa eine Hälfte der Wellenlänge (ein Streifen) aufgrund von Luftströmungen, Temperatureffekten, etc. auf. Diese Phasendrift verursacht, dass das Streifensignal Strom von der piezoelektrischen Grundantriebsfrequenz (120 KHz) auf höhere Harmonische und auf einen Gleichstromversatz verschiebt. Als Ergebnis kann die Ausgabe des Effektivschaltkreises um 30 bis 50 variieren, und zwar auch dann, wenn die Streuungsleistung des Voxel konstant bleibt. Dieses Problem wird dadurch gelöst, dass ein elektrischer Filter so gebaut wird, dass er die Grundfrequenz und die erste Harmonische Frequenz umgeht. Weiterhin wird die Bewegungsamplitude des Referenzspiegels unter Verwendung einer sinusförmigen Antriebsspannung für den Piezostapel auf 0,42 × 850 nm = 357 nm (Spitze) eingestellt. Bei dieser Amplitude ist die Ausgabe des Effektivschaltkreises unabhängig von der Phasendrift im OCM Interferometer. Dies ist ein sachdienliches Ergebnis zur Rauschreduzierung in einer OCM-Abbildung.
4. Eliminieren von Doppelbrechungsdriften. Die Ausführung des modifizierten OCM hat einen weiteren nennenswerten Vorteil gegenüber dem ursprünglichen OCM. Im ursprünglichen OCM wurde etwa 10 m an optischer Glasfaser unter Spannung um einen piezoelektrischen Zylinder gewickelt. Eine Antriebsspannung wurde auf den Zylinder angewendet, wodurch sich die Glasfaser streckte und wieder erschlaffte, und wodurch die optische Weglänge der Glasfaser zum Oszillieren gebracht wurde. Ein Faser-/Zylindersystem wurde in jede der Proben und Referenzarme des OCM Interferometers eingesetzt. Diese zwei piezoelektrischen Zylinder wurden 180 ° gegenphasig angetrieben, um Streifen an der Ausgabe des OCM Interferometers zu erzeugen. Das Strecken dieser langen Längen an Glasfaser führte zu beachtlichen Stressdoppelbrechungen, und „Schaufeln" wurden eingearbeitet, um die Glasfaser systematisch zu verdrehen, bis die optische Weglängen für die zwei Polarisierungszustände des Strahls gleichwertig waren. Die Einstellung der Schaufeln unterlag einer Drift, was zu verzerrten Sichtbarkeitskurven der Interferometerstreifen führte.
In dem modifizierten OCM betragen die Längen der optischen Glasfaser in dem Probenarm und dem Referenzarm nur 1 Meter. Ein Strecken der Glasfaser findet nicht statt, und es wurde auch keine Verzerrung der Gaußschen Sichtbarkeitskurve im Zeitablauf festgestellt.
Beispiel II – Software zum Betrachten von dreidimensionalen OCM-Abbildungen
Dreidimensionale OCM-Abbildungen können durch die Überarbeitung von erhältlicher Sichtbarmachungs-Software erzeugt werden, wie z.B. AVS (Advanced Visual Systems) Version 5.0, um dreidimensionale OCM-Abbildungen auf Unix-Arbeitsplatzsystemen anzuzeigen. Für eine noch größere Verbraucherfreundlichkeit benötigt VISUALIYATION EXPRESS, ebenfalls von AVS erhältlich, kein Unix-Arbeitsplatzsystem. VISUALIYATION EXPRESS ist in der OpenGL-Sprache verfasst, die es ermöglicht, Grafikanwendungen an viele Software-/Hardware-Plattformen anzuschließen. Diese Software wurde überarbeitet, um eine kundenspezifische grafische Benutzeroberfläche, genannt „Intuitive Network" innerhalb von Visualization Express zu generieren, und erreichte erhöhte Flexibilität und Leistung. Im Nachfolgenden werden die Grundsätze dieses Abbildungen anzeigenden Softwarepakets kurz beschrieben.
Grundsätze der Volumenwiedergabe. Während der Abbildungserfassung teilt das OCM jedem der im Probenvolumen abgetasteten, etwa einer Million Voxel eine einzelne Nummer zu. Zur ersten Approximation stellt diese Nummer ein Maß der Lichtstreuungsleistung des entsprechend zugeteilten Voxel dar. Zum Sichtbarmachen eines dieser dreidimensionalen Datenvolumen müssen alle Voxel auf einen zweidimensionalen Computerbildschirm zum Betrachten projiziert werden. Das Verfahren zum Projizieren von Voxel, einschließlich der Zuteilung der relativen Gewichte der Voxeltiefe innerhalb des Volumens gegenüber dem nahe der Oberfläche des Volumens, wird Volumenwiedergabe genannt.
Der grundlegende Algorithmus der Volumenwiedergabe ist die Lichtstrahlverfolgung. Jeder Pixel in, der zweidimensionalen Abbildung, die auf dem Computerbildschirm erzeugt werden soll, legt einen Lichtstrahl fest, der aus dem Pixel auf dem zweidimensionalen Bildschirm durch das dreidimensionale Datenvolumen gezogen wird. Eine „parallele Projektion" wird eingesetzt, in welcher die projizierten Lichtstrahlen parallel zu einander angeordnet sind. Alle Voxel im Volumen entlang eines Lichtstrahls tragen zum Wert des entsprechenden Pixels auf dem zweidimensionalen Computerbildschirm bei. Weil der Lichtstrahl nicht immer durch die Mitten der Voxel, die es durchkreuzt, hindurch geht, gibt es verschiedene Wege die Mitwirkung der Voxel entlang des Lichtstrahls zu berechnen (oder „vermischen"). Zum Beispiel können alle Voxel in der Nähe des Lichtstrahls in Erwägung gezogen, und die Summe deren Voxelgehaltes, der umgekehrt durch deren Abstände zum Lichtstrahl bewertet wird, ausgerechnet werden. Als Alternative zur Vereinfachung und daher reduzierten Rechenkosten können nur die Voxel verwendet werden, die durch den Lichtstrahl durchdrungen werden, und deren Voxelgehalt ausgerechnet werden (unbewertet).
Ein weiteres an der Vermischung von Voxel entlang eines Lichtstreifens beteiligtes Merkmal ist der „Undurchsichtigkeitsfaktor". Der Gehalt jedes Voxel wird mit dem Undurchsichtigkeitsfaktor multipliziert, während die Summe entlang eines festgelegten Lichtstrahls gebildet wird. Falls der Undurchsichtigkeitsfaktor für alle Voxel Null ist, beteiligt sich kein Voxel and einem Pixel, und der Pixel ist schwarz. Falls der Undurchsichtigkeitsfaktor für alle Voxel eins ist, wird der Voxelgehalt entlang des Lichtstrahls aufsummiert, und das daraus resultierende Pixel kann eine große Zahl enthalten, vielleicht eine Zahl, die eine Sättigung darstellt. Kleine Werte für den Undurchsichtigkeitsfaktor neigen dazu, eine Sättigung zu vermeiden und ermöglichen den Voxel tief im Abbildungsvolumen so, sich sinnvoll an dem entsprechenden Pixel zu beteiligen. Das heißt, dass kleine Werte des Undurchsichtigkeitsfaktors dazu neigen, dem Abbildungsvolumen eine eher „transparente" Erscheinung zu verleihen.
Verwendung der Falschfarbendarstellung. Das OCM gemäß der Erfindung teilt einem Voxel basierend auf seiner gemessenen Lichtstreuungsleistung eine grobe Nummer (Grauzone) zu. VISUALIYATION EXPRESS von AVS verwendet die Falschfarbendarstellung dazu, bei der Unterscheidung von verschiedenen Grauzonen im groben Voxelgehalt behilflich zu sein. Zwei verschiedene Weisen wurden zur Implementierung der Falschfarbendarstellung in den im AVS Express zur Verfügung stehenden Volumenwiedergabealgorithmen verwendet. Die einfachere Weise, genannt „SFP", besteht darin, den Lichtstrahlverfolgungsalgorithmus zur Volumenwiedergabe (oben beschrieben) auf den groben Grauzonengehalt der Voxel anzuwenden. Die resultierenden zweidimensionalen Grauzonenpixel werden dann farbcodiert, d.h. schwache Pixel werden der Farbe blau zugeordnet, und starke Pixel werden rot codiert. In diesem Verfahren kann sich jedoch die Farbe einer bestimmten Region des dreidimensionalen Volumens drastisch verändern während das Volumen aus verschiedenen Blinkwinkeln betrachtet wird. Zum Beispiel können zwei grüne Voxel entlang einer bestimmten Sichtlinie so überlagert werden, dass sich ein roter Pixel ergibt.
Ein zweites Verfahren der Im Implementierung von Falschfarbendarstellung im AVS-Programm Express wird eher bevorzugt. Im Volumenwiedergabeverfahren genannt "DC", wird der grobe Voxelgehalt farbcodiert, z.B. Werte für rot, grün und blau werden jedem Voxel basierend auf der groben Grauzone des Voxel zugeordnet. Dann wird der Lichtstrahl-Verfolgungsalgorithmus für die Volumenwiedergabe separat für alle drei Farben ausgeführt, um eine farbliche zweidimensionale Abbildung auf dem Computerbildschirm zu erzeugen. Dieses DC-Verfahren überlagert in der Tat zwei grüne Voxel, um einen starken grünen Pixel zu ergeben. Auf diese Weise behält eine Region des Abbildungsvolumens mit einer bestimmten Lichtstreuungsstärke ihre Farbe bei, zumindest annähernd während das Volumen auf dem Bildschirm gedreht wird.
Die Software ermöglicht die Untersuchung von anatomischen, morphologischen und historischen Aspekten von Pflanzen, Fröschen und anderen Organismen. Nachfolgend einige Beispiele der AVS-Softwareeinstellungen:

Lichtstrahl-Verfolgungsalgorithmus: Direktzusammensetzung
Interpolation: Dreilinear
Kontrollpunkte Position von Kontrollpunkt 1: 2 Position von Kontrollpunkt 2: 25
Einstellungsbereich 1: Transparenz links = 1,0 Farbton = 0 Sättigung = 0 Wert = 0 Transparenz rechts = 1,0 Farbton = 0,66 Sättigung = 1,0 Wert = 1,0
Einstellungsbereich 2: Transparenz links = 0,91 Farbton = 0,66 Sättigung = 1,0 Wert = 1,0 Transparenz rechts = 0,95 Farbton = 0 Sättigung = 1,0 Wert = 1,0
Einstellungsbereich 3: Transparenz links = 0,69 Farbton = 0 Sättigung = 1,0 Wert = 1,0 Transparenz rechts = 1,0 Farbton = 0 Sättigung = 1,0 Wert = 1,0

Beispiel III Entwicklungsbiologie der Pflanze Arabidopsis thaliana.
A. Um die Meristembildung in einem sich entwickelnden Embryo zu studieren, wurden Pflanzen in mit Erde gefüllten Töpfen mit 10 cm Durchmesser in einer Gewächskammer unter 16-Stunden Tageszeitlängen gezogen, um den Übergang zum Reproduktivwachstum zu beschleunigen. Während der Blütenbildung dehnen sich die Sproßabschnitte der Arabidopsis weitgehend aus. Dadurch konnte eine einzelne Schote mit ihren sich entwickelnden Embryos im Inneren leicht zwischen zwei Glasobjektträgern gelegt werden, ohne die restliche Pflanze zu stören, oder die Schote von der Pflanze zu entfernen. Die Schote wurde kurz nach der Befruchtung montiert, um die Entwicklung der Embryos über die nächsten Tage hinweg zu verfolgen (von einem kugelförmigen, Embryo zu einem voll ausgedehnten Embryo). Die OCM-Abbildungen ermöglichten eine exakte Observation der Entwicklung eines einzelnen Embryos im Zeitablauf. Das Muster der Entwicklung in Wildtyp-Embryos wurde mit denen von mutierenden Embryos verglichen, um eine bessere Einsicht in die veränderten embryogenen Muster zu gewinnen.
B. Das OCM wurde ebenfalls verwendet, um die zeitlichen Veränderungen im Austriebsscheitel-Meristem und der Austriebspitze während der aufeinander folgenden Blattanregungen zu studieren. Zum Zweck dieser Observationen, wurden die Pflanzen in mit Erde gefüllten Töpfen mit einem Durchmesser von 10 cm unter 8-Stunden Tageszeitlängen gezogen, um den Übergang von der Vegetativ- zur Reproduktivwachstumsentwicklung zu hemmen. Diese Wachstumskonditionen erlauben die Observation der Meristemtätigkeit über viele fortlaufende Blattanregungsabläufe hinweg. Während es den Anschein hatte, dass Variationen in der Feuchtigkeit einen erheblichen Einfluss auf die Pflanzenwachstumsraten haben, sollten die Pflanzen vorzugsweise in einer feuchtigkeitsregulierten Gewächskammer behalten werden. Zusätzlich zu der ermöglichten exakten Regulierung der Umgebung, in der die Pflanzen wachsen, ermöglicht eine Gewächskammer gleichzeitig das Wachstum von Pflanzenkulturen unter langen Tagesbedingungen (für die Studien über Embryobildung) und kurzen Tagesbedingungen (für die Studien über Blattstellung).
In diesem Verfahren wurden das Volumen und die Form des Austriebsscheitel-Meristems und der Austriebspitze über mehrere Tage hinweg beobachtet. Das Meristem und die Austriebspitze wurden von oben untersucht um sicherzustellen, dass jedes Blatt, wo immer es auch angeregt wurde, bei gleicher Genauigkeit abgebildet wurde. Durch diesen Ansatz wurden Einsichten in die Veränderungen in der Austriebspitze und im Austriebsscheitel-Meristem gewonnen, während diese entwicklungsbedingten Veränderungen durchmachen, wie z.B. die Bildung von aufeinander folgenden Blättern, und die Verfahren der Mutationen können im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen gekennzeichnet werden.
C. Studien der Pflanzen-Abbildungen. Eine Abbildung eines Pflanzenaustriebs (Arabidopsis thaliana) wurde durch die Anwendung des OCM gemäß der Erfindung erhalten. Das Volumen der Abbildung beträgt 600 μm × 600 μm × 400 μm (Breite × Breite × Tiefe) mit einer Voxelgröße von (10 μm)³. In einer Ansicht von oben gerade nach unten entlang dem Strahl und entlang der Austriebsachse, wuchsen die Blattstiele der Keimblätter und Blätter 1 und 2 sichtbar von der Mitte des Pflanzenaustriebs heraus. Das Austriebsscheitel-Meristem wurde ersichtlich, als die Abbildung als eine hoch gestreute Region am Blattstamm gestutzt wurde. Die gl-1 (unbehaarte) Mutation der Arabidopsis thaliana wurde verwendet, um eine hohe Lichtstreuung vom Pflanzenhaar zu vermeiden.
Eine gedrehte Abbildung des Blattes und der Meristemregion wurde mit einem Volumen von (200 μm × 200 μm 120 μm) (Breite × Breite × Tiefe) mit einer Voxelgröße von (2 μm)³ sichtbar gemacht. Als Seitenansicht, wobei der Strahl von der Oberseite der Abbildung einfällt, konnte beobachtet werden, wie die Blätter von der Mitte des Austriebs heraus wachsen. Das Meristem und die Austriebspitze waren am Stamm der Blätter ersichtlich.
Mehrere Abbildungen wurden hintereinander für jede der zehn Arabidopsis Keimlinge während dem 5. bis 12. Tag der Entwicklung angefertigt, als sich Blattursprünge bildeten, und ein spiralförmiges Muster der Blätter hervorhob. In diesen Abbildungen war es möglich, das Austriebsscheitel-Meristem und/oder die zugehörigen Blattursprünge zu identifizieren, was die Schlussfolgerung unterstützt, dass das OCM die morphologische Entwicklung einer einzelnen Pflanze auf nichtinvasive Weise verfolgen kann. Die Abbildungen können darauf hin deuten, dass die Regionen der höchsten Lichtstreuung mit den Bereichen der höchsten Zellaktivität übereinstimmen. Blattursprünge und das vermutete Austriebsscheitel-Meristem streuen in hohem Ausmaß, und sind Orte der raschen Zellteilung. Dementsprechend kann eine hohe Zellaktivität für das OCM als eine spezifische Probe dienen.
In einer OCM-Abbildung einer 5 Tage alten Arabidopsis Pflanze wurde der „Undurchsichtigkeitsparameter" (siehe Beispiel III der Abbildung darstellenden Software) so eingestellt, dass die Undurchsichtigkeit hoch war. Bei dieser Einstellung deckten die schwach streuenden Gewebe (blau), welche die stark streuenden Gewebe (rot/gelb) umgeben, die stark streuenden Regionen von der Sicht ab. Der Gesamteffekt war der, dass das „Äußere" der Pflanze wie in einer Rasterelektronenmikroskopaufnahme sichtbar war. Durch das Stutzen oder Einschneiden in die Abbildungsebene des stark streuenden Gewebes wurde rot/gelb dargelegt.
In einer weiteren OCM-Abbildung derselben 5 Tage alten Pflanze wurde der Undurchsichtigkeitsparameter niedrig eingestellt, sodass Voxel tief im Gewebe gesehen werden konnten. Unter Anwendung dieser Verfahren war es möglich, viele der größeren (> 30 μm) Organe an der Austriebspitze eindeutig zu identifizieren. Das Identifizieren der kleineren Blattursprünge ging schwieriger vonstatten. Um die kleineren Organe eindeutig identifizieren zu können, wurden häufige Observationen angestellt, d.h. alle ein bis zwei Stunden, um deren Größenanstieg während der Entwicklung zu beobachten. Alle Abbildungen wurden mit dem ursprünglichen OCM erhalten, das 3 Stunden für Abbildungen von einer Million Voxel benötigt. Deshalb bildet eine einzige Abbildung den Mittelwert aus dem wesentlichen Wachstum, und dieser Mittelwert bildet in der Auflösung der Abbildung wahrscheinlich einen Faktor. Das modifizierte OCM hat eine Abbildungserfassungszeit von 5 Minuten oder weniger für ähnliche Abbildungen. Die Verwendung des modifizierten OCM erzeugte eine Reihe von Abbildungen mit zeitlich dichteren Abständen, und ermöglichte die Identifikation von Blattursprüngen, während sie vom Meristem hervorkamen.
In einem nebeneinander liegenden Vergleich einer OCM-Abbildung einer lebenden Pflanze mit einem histologischen Abschnitt einer anderen Pflanze, beinhaltete die OCM-Abbildung Blätter und, eine kleine stark streuende Region, die mit dem Blattursprung übereinstimmte. Der histologische Abschnitt einer vergleichbaren Pflanze unterstützte diese Interpretation. Die OCM-Abbildung wurde von oben gestutzt, und was eine Abbildung von „außen" (hohe Undurchsichtigkeit), sodass das Meristem unten nicht sichtbar war. Beim Verfolgen der Entwicklung einer individuellen Pflanze ist es hilfreich, einen hervorkommenden Blattursprung so früh wie möglich zu sehen. Obwohl die Auflösung des histologischen Objektträgers eindeutig besser war, waren lediglich die OCM-Abbildungen in der Lage, die darauf folgenden Entwicklungen des hervorkommenden Blattursprungs zu verfolgen.
In direktem Vergleich des OCM zu herkömmlichen Abschnitten, wurden Pflanzen mit dem OCM abgebildet, und für die herkömmliche Analyse fixiert. Die OCM-Abbildung zeigte den Blattursprung und Keimblattstiele. Der Betrag an Lichtstreuung war proportional zu der Farbe. Ein einfaches Spektrum wurde eingerichtet, sodass rot den höchsten Betrag and Lichtstreuung, orange-gelb den etwas niedrigeren, grün den noch etwas niedrigeren, und blau-schwarz den niedrigsten Betrag darstellt. Zellen und Gewebe, die aktiv waren (d.h. Transkription und Differenzierung) erzeugten den größten Betrag an Lichtstreuung.
In optischen Abschnitten und traditionellen plastischen Abschnitten tiefer in der Pflanze wurde eine OCM-Abbildung von tief gelegenem Gewebe sichtbar gemacht. Die Blattursprünge, und auch ein kürzlich gebildetes Nebenblatt konnten gesehen werden. Nebenblätter, die bekanntlich in der Transkription sehr aktiv sind, erzeugten einen großen Betrag an zurück gestreutem Licht im OCM, und erschienen daher als rot auf der OCM-Abbildung.
Im OCM und dem traditionellen Abschnitt von sich entwickelnden Organen und dem Scheitelmeristem wurde ein Blattursprung gesehen, der gerade eine dorsoventrale Symmetrie annahm, wohingegen ein weniger entwickelter Blattursprung als nicht dorsoventral beobachtet wurde, der seine mittigen Eigenschaften noch bewahrte. Auf diese Weise kann das OCM drei Unterschiede erfassen. Der eher fortgeschrittene Blattursprung erschien als eine rote, rechtwinklig Form, und der weniger fortgeschrittene Blattursprung erschien als eine rote, runde Form. Das Meristem, in einem plastischen Abschnitt in einer anderen Brennebene erfassbar, erschien ebenfalls als ein rotes, rechtwinklig geformtes Objekt. Auf diese Weise kann das OCM in zerstörungsfreier Weise entwicklungsbedingte Veränderungen, die tief innerhalb des Gewebes in vivo stattfinden, verfolgen und vorhersagen.
Ein Vergleich eines Arabidopsis Mutanten ohne Austriebsmeristem, wurde zwischen dem OCM und der Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt. Bekannterweise fehlt dem Mutanten ohne Austriebsmeristem ein Austriebsscheitel-Meristem (Barton und Peothig, 1993). In Wildtyppflanzen erscheint das Scheitelmeristem als rote, hoch Licht streuende Struktur. Wie vorhergesehen, gab es keine solche Struktur in dem Mutanten ohne Austriebsmeristem. Anstatt dessen wurde eine Lücke nachgewiesen, die auf ein Fehlen eines Austriebsscheitel-Meristems hinwies.
Auf diese Weise kann das OCM nicht nur zum Sichtbarmachen von Strukturen in einer biologischen Probe, sondern auch zum Sichtbarmachen von Entwicklungsphasen, Verfahren und Erscheinungen verwendet werden, um Mutanten den Nicht-Mutanten gegenüberzustellen, oder um Mutanten- oder Allelreihen zu bewerten, u.ä. Der Einfluss einer Vielzahl von Faktoren auf die Lichtstreuung kann ebenfalls verwendet werden, um biologische Proben in Bezug auf solche Faktoren zu kennzeichnen, einschließlich z.B. die Gentätigkeit, Differenzierung, Zellsteckung, Zellruhe, Stressantwort, Pathogenantwort, u.ä. Die Verwendung von Licht streuenden Vergleichen, die das OCM gemäß der Erfindung einsetzen, werden den mit solchen Vergleichen Beschäftigten in der Übereinstimmung der Lichtstreuung oder anderen OCM-Abbildungseigenschaften mit einer Vielzahl von Konditionen, Strukturen und Erscheinungsbelangen ersichtlich sein.
Beispiel IV – Entwicklungsbiologie des Frosches Xenopus laevis
A. Xenopus Embryos werden in einem kleinen, dreieckigen Brunnen montiert, der in eine Schicht am Boden der Petrischale eingeschnitten worden ist, die mit Silikonkautschuk beschichtet ist. Eine 100 μm dicke Schicht Agarosegel wird über die Oberseite des Embryos gegeben, und an Ort und Stelle mit dünnen Kaktusstacheln montiert, die in den Silikonkautschuk gestochen werden. Dieses Verfahren zur Stabilisierung des Embryos hält den Embryo in einer festgelegten Position und Orientierung fest ohne die Gefahr der Verformung der zu untersuchenden Zellbewegungen. Während der Gastrulation wird ein Satz von dreidimensionalen Abbildungen durch die Dicke des Fleischschaftes des Embryos angefertigt. Diese dreidimensionalen Datensätze werden verarbeitet und in einem Zeitrafferfilm dargestellt. Da die Auflösung des OCM kleiner ist, als die Einzelzellen, sind diese Abbildungen ausreichend zur Verfolgung der Gewebebewegungen der Gastrulation. Als Alternative können zweidimensionale Abbildungen in der Winkelhalbierenden des Embryos entlang der Mittellinie angefertigt werden. Dies ermöglicht eine rasche Bildfolge, und daher bessere Details über die Zellbewegungen innerhalb dieses reduzierten Sichtfelds.
B. Zusätzlich wird das OCM-System zur Untersuchung der morphologischen Musterung des Mesoderms angewendet. Dieses Verfahren ist wichtig für die resultierenden Strukturen, wie z.B. die Chorda dorsalis und die Somiten, sowohl als auch für das Nervensystem. Wechselwirkungen zwischen der Chorda dorsalis und dem Rückenmark haben einen Einfluss auf die dorsoventrale Musterung des Nervensystems, und Wechselwirkungen mit den Somiten führen zu einer Zellteilung des Sinnesnervensystems und den Vorderwurzelns der durch das Rückenmark gebildeten Motorneuronaxonen. Die oben beschriebene experimentelle Anordnung wird verwendet, um die Embryos zu stabilisieren, und das OCM wird eingesetzt, um Abbildungen zu erfassen, die für zwei- und dreidimensionale Zeitrafferfilme benötigt werden.
C. Studien von Froschembryoabbildungen. Eine Abbildung wurde von einem Froschembryo erstellt, das leicht fixiert wurde (2 % Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C in Phase 41 der Entwicklung). Die abgebildete Kopfregion betrug (1,6 mm × 1,6 mm × 1,3 mm) (Breite × Breite × Tiefe). Die Voxelgröße betrug (20 μm)³. In der Figur befand sich der Embryo (Kaulquappe) auf seiner rechten Seite und wurde entlang einer Körperachse vom Schwanz bis zum Kopf betrachtet, sodass die ventral-dorsale Achse von links nach rechts verlief. Der Strahl fiel von der Oberseite der Abbildung ein. Die Wölbung des linken Auges war at der Oberseite der Abbildung deutlich sichtbar. Rote und gelbe Bereiche deuteten hoch streuende Regionen an, und blaue und schwarze deuteten eher transparente Regionen an.
Eine weitere Abbildung desselben Froschembryos wurde angefertigt, jedoch mit einer etwas höheren Vergrößerung. Das dargestellte Volumen betrug (600 μm × 600 μm × 420 μm) (Breite × Breite × Tiefe), und die Voxelgröße betrug (6 μm)³. Der Strahl fiel immer noch auf die linke Seite des Embryos von der Oberseite der Abbildung ein. Die Sicht war wieder entlang der Körperachse, jedoch mit Sicht zum Schwanz hin, sodass sich die dorsale Seite links, und die ventrale Seite rechts befanden. Der 600 μm lange Abschnitt, der abgebildet wurde, befand sich weiter unten am Körper vom Kopf aus gesehen. Die 420 μm Tiefe wurde in der Figur von oben nach unten orientiert, und die 600 μm dorsalventrale Breite verlief von links nach rechts. Die dreidimensionale Abbildung wurde vorsichtig gedreht, sodass die Sicht gerade nach unten entlang der Achse des Rückenmarks verlief – eine Drehung von nur einem Grad um die Strahlachse (Achse von oben nach unten) hätte die Struktur verdeckt, die bei dem gewählten Sichtwinkel ersichtlich war.
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Claims

Optisches Kohärenzmikroskopsystem mit hoher Auflösung für das Sichtbarmachen von Strukturen unterhalb einer Oberfläche einer biologischen Probe, wobei das System umfasst – eine Lichtquelle; – einen Referenzspiegel; – eine fokussierende Linse für das Fokussieren von Licht auf die biologische Probe; – einen Photodetektor; – eine piezoelektrische Vorrichtung; – einen optischen Weg der Probe zum Empfangen von Licht von der Lichtquelle und zum Lenken des Lichtes auf die fokussierende Linse, wobei der besagte Weg der Probe eine Weglänge der Probe darstellt, in welcher das entlang dem Weg der Probe gelenkte Licht in die biologische Probe eintritt und sich innerhalb der Probe bis zu dem Durchmesser der Strahltaille verjüngt; – einen optischen Referenzweg zum Empfangen von Licht aus der Lichtquelle und zum Lenken des Lichtes auf den Referenzspiegel, wobei der besagte Referenzweg eine Referenzweglänge aufweist; – wobei die Länge von mindestens einem der optischen Wege durch die piezoelektrische Vorrichtung moduliert wird und wobei ein Lichtstrahl von dem optischen Weg der Probe, welcher von der biologischen Probe zurückgestreut wird, mit einem Lichtstrahl von dem Referenzweg vereinigt wird, welcher von dem Referenzspiegel zurückgeworfen wird, wobei die Vereinigung der Lichtstrahlen ein Signal eines Interferenzstreifens auf dem Photodetektor erzeugt, wenn die Weglänge der Probe und die Referenzweglänge im wesentlichen dieselben innerhalb der Kohärenzlänge der Lichtquelle sind, wobei eine Amplitudenmodulation gleich oder kleiner als 1,5 der Wellenlänge ist; und – einen Abtaster, der angeordnet ist, um die Strahltaille quer über eine erste Ebene, die im wesentlichen senkrecht zu der Richtung des einfallenden Lichtstrahles steht, abzutasten und um dann die Strahltaille tiefer in die Probe hinein zu bewegen und um eine andere Ebene abzutasten, während die Lage des Referenzspiegels einer Translation unterzogen wird, um die gleichen Weglängen der Probenwege und der Referenzwege übereinstimmend mit der Strahltaille zu halten, wobei die Streifenamplitude an einem jeden Volumenelement, Voxel, während des Abtastens der Probe aufgezeichnet wird, was zu einem dreidimensionalen Datensatz führt, welcher mit seinem Volumen wiedergegeben wird, um eine dreidimensionale Sichtbarmachung der Probe zu liefern.
System gemäß Anspruch 1, wobei die Leistungen in einem Streifensignal bei einer Grundfrequenz f und bei einer zweiten Harmonischen der Fundamentalfrequenz 2f aufsummiert werden, um ein Maß für die Amplitude der Streifen zu liefern.
System gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Modulation bei einer Frequenz von mindestens etwa 50 kHz stattfindet.
System gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Modulation bei einer Frequenz von mindestens etwa 100 kHz stattfindet.
System gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Modulation bei einer Frequenz von mindestens etwa 300 kHz stattfindet.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das entlang dem Weg der Probe gelenkte Licht die biologische Probe abtastet und wobei das Abtasten zu einer Abbildung eines Teiles der biologischen Probe führt, wobei dieser Teil zwischen etwa 100 μm und etwa 4000 μm unter der Oberfläche der Probe liegt.
System gemäß Anspruch 6, wobei die Abbildung eine erste Schicht umfasst, wobei die erste Schicht aus einer ersten Vielzahl von Voxeln abgeleitet ist, welche alle im wesentlichen einer gleichen ersten Tiefe unter der Oberfläche der Probe entsprechen.
System gemäß Anspruch 7, wobei die Abbildung weiterhin eine zweite Schicht umfasst, wobei die zweite Schicht aus einer zweiten Vielzahl von Voxeln abgeleitet ist, welche alle im wesentlichen einer gleichen zweiten Tiefe unter der Oberfläche der Probe entsprechen.
System gemäß Anspruch 8, wobei die Abbildung mindestens etwa 50 verschiedene Schichten umfasst, einschließlich der besagten ersten und zweiten Schichten, wobei jede der Schichten aus einer bestimmten Vielzahl von Voxeln abgeleitet ist, und wobei alle Voxel für eine jede bestimmte Schicht im wesentlichen einer gleichen bestimmten Tiefe unter der Oberfläche der Probe entsprechen.
System gemäß Anspruch 8, wobei die Abbildung vermischte Voxel aus einer Vielzahl von Schichten umfasst, einschließlich der besagten ersten und zweiten Schichten, und wobei die Abbildung eine dreidimensionale Wiedergabe des Teiles der biologischen Probe ist.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, welches weiter ein Kohärenzvolumen um eine Ebene herum umfasst, bei welcher die Länge der Probe die gleiche ist wie die Länge des Referenzweges, wobei das Kohärenzvolumen unter der Oberfläche der biologischen Probe vorhanden ist.
System gemäß Anspruch 11, wobei das Licht von dem Weg der Proben in die Probe eintritt und sich bis zu dem besagten Durchmesser der Strahltaille verjüngt, wobei der Durchmesser der Strahltaille nicht mehr als 20 μm innerhalb der Probe beträgt, und wobei die Strahltaille mit dem Kohärenzvolumen übereinstimmt, so dass die seitliche Auflösung von Strukturen innerhalb der Probe einen Abstand kleiner ist als der Durchmesser der Strahltaille oder gleich groß ist wie derselbe.
System gemäß irgendeinem der Anspräche 1 bis 12, wobei der entlang dem Weg der Probe gelenkte Lichtstrahl die biologische Probe abtastet und wobei das Abtasten zu einer Abbildung eines Teiles der biologischen Probe führt, wobei dieser Teil zwischen etwa 100 Mikrometer und etwa 4000 Mikrometer unter der Oberfläche der Probe liegt.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Amplitude der Modulation die gleiche ist wie etwa 0,42 der Wellenlänge.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Kohärenzlänge der Lichtquelle die Tiefe der Auflösung des Mikroskopsystems bestimmt.
System gemäß irgenäeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die piezoelektrische Vorrichtung ein piezoelektrischer Stapel ist, auf welchem der Referenzspiegel montiert ist.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Licht eine Wellenlänge zwischen 700 und 1500 nm aufweist.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Modulation der Weglänge bei einer Frequenz von mindestens 50 kHz stattfindet.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Amplitude der Modulation der Weglänge kleiner als 0,50 der Wellenlänge beträgt.
System gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Amplitude der Modulation der Weglänge gleich oder kleiner als 1,0 der Wellenlänge ist.
Verfahren zur Sichtbarmachung einer Struktur unter einer Oberfläche einer Pflanzenprobe unter Anwendung des Systems gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20.
Verfahren zur Analyse einer biologischen Funktion, das auf der Sichtbarmachung von in vivo Strukturveränderungen unter einer Oberfläche einer Pflanzenprobe beruht, dies unter Anwendung des Systems gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Funktion aus der Gruppe bestehend aus Genregulierung, Entwicklung, Messenger-Antwort und Stress ausgewählt wird.
Verfahren zur Sichtbarmachung einer Struktur unter einer Oberfläche einer Pflanzenprobe, welches die folgenden Schritte umfasst: – ein Bereitstellen von Licht; – ein Teilen des Lichtes in einen Lichtweg für die Probe und in einen Lichtweg für die Referenz; – ein Modulieren der Länge von mindestens einem der Lichtwege mit einer piezoelektrischen Vorrichtung, wobei die Modulation der Weglänge bei einer Frequenz – stattfindet und wobei eine Amplitudenmodulation gleich oder kleiner als 1,5 der Wellenlänge ist; – ein Lenken des Lichtes von dem Weg der Probe in die Pflanzenprobe mit Hilfe einer fokussierenden Linse, wobei das Licht in die Pflanzenprobe eintritt und sich innerhalb der Pflanzenprobe bis zu einer Strahltaille verjüngt; – ein Abtasten der Strahltaille quer über eine erste Ebene im wesentlichen senkrecht zu der Richtung des einfallenden Lichtstrahles; – ein Vereinigen eines Lichtstrahles von dem von der Pflanzenprobe zurückgestreuten Lichtweg der Probe mit einem Lichtstrahl von dem von einem Referenzspiegel zurückgeworfenen Lichtweg der Referenz, wobei die Vereinigung der Lichtstrahlen ein Signal eines Interferenzstreifens auf einem Photodetektor erzeugt, wenn die Länge des Lichtweges der Probe und die Länge des Lichtweges der Referenz im wesentlichen dieselben innerhalb der Kohärenzlänge der Lichtquelle sind; – ein Bewegen der Strahltaille zu einer anderen Tiefe innerhalb der Pflanzenprobe und ein Abtasten einer anderen Ebene, während die Lage des Referenzspiegels einer Translation unterzogen wird, um die gleichen Weglängen bei den Lichtwegen der Probe und der Referenz übereinstimmend mit der Strahltaille zu halten; – ein Aufzeichnen der Streifenamplitude an einem jeden Volumenelement, Voxel, während des Abtastens der Pflanzenprobe, was zu einem dreidimensionalen Datensatz führt, welcher mit seinem Volumen wiedergegeben wird, um eine dreidimensionale Sichtbarmachung der Pflanzenprobe zu liefern.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Leistungen in einem Streifensignal bei einer Grundfrequenz f und bei einer zweiten Harmonischen der Fundamentalfrequenz 2f aufsummiert werden, um ein Maß für die Amplitude der Streifen zu liefern.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei der Lenkungsschritt mindestens 100-mal wiederholt wird und wobei nach jedem Lenkungsschritt das Verfahren den zusätzlichen Schritt der Translokation des Lichtweges der Probe in eine andere Position in der Pflanzenprobe umfasst.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Abbildung einen Hinweis auf einen Unterschied zwischen einer Pflanzenprobe eines Mutanten und einer Pflanzenprobe eines Nicht-Mutanten liefert.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Abbildung ein Muster einer Lichtstreuung umfasst, und wobei das Muster mit einer kennzeichnenden Eigenschaft der Pflanzenprobe in Korrelation steht.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die kennzeichnende Eigenschaft aus der Gruppe bestehend aus Gentätigkeit, Differenzierung, Zellstreckung, Zellruhe, Stressantwort und Pathogenantwort ausgewählt wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Amplitude der Modulation die gleiche ist wie etwa 0,42 der Wellenlänge.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 30, wobei das Licht eine Wellenlänge zwischen 700 und 1500 nm aufweist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 31, wobei die Modulation der Weglänge bei einer Frequenz von mindestens 50 kHz stattfindet.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 32, wobei die Amplitude der Modulation der Weglänge kleiner als 0,50 der Wellenlänge beträgt.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 24 bis 32, wobei die Amplitude der Modulation der Weglänge gleich oder kleiner als 1,0 der Wellenlänge ist.