-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen
das Gebiet von Nukleinsäure-Analoga
mit ungeladenen neutralen Rückgraten.
Insbesondere betrifft die Erfindung wässrige Gemische von polaren
aprotischen Lösungsmitteln,
die eine hochkonzentrierte Lösung
von Peptidnukleinsäuren
(PNA) ermöglichen.
-
REFERENZEN
-
- Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K.
und Watson, J. "Molecular
Biology of the Cell, Second Edition", Garland Publishing, Inc., New York,
1989.
- Andrus, A. "Chemical
methods for 5' non-isotopic
labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach,
Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54.
- Atkins, P. W. "Physical
Chemistry", W. H.
Freeman und Co., San Francisco, CA, 1978, Seiten 746 f.
- Beaucage, S. und Iyer, R. "Advances
in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311
(1992).
- Blackburn, G. und Gait, M. Hrsg. "DNA and RNA structure" in Nucleic Acids
in Chemistry and Biology, 2. Auflage, (1996) Oxford University Press,
Seiten 15–81.
- Blanchard, Alan P. "Solvent
for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and apparatus employing
inkjet pump for automated solid-phase synthesis of biopolymers", PCT-Anmeldung WO
9841531, internationales Veröffentlichungsdatum
24. September 1998.
- Buchardt, O., Egholm, M., Nielsen, P., und Berg, R. "Peptide Nucleic Acids", WO 92/20702, internationales
Veröffentlichungsdatum
26. November 1992.
- Caruthers, M. und Beaucage, S. "Phosphoramidite compounds and processes", US-PS 4,415,732,
erteilt am 15. November 1983.
- Caruthers, M. und Matteucci, M. "Process for preparing polynucleotides", US-PS 4,458,066 , erteilt am 3. Juli 1984.
- CRC Handbook of Chemistry and Physics, 63. Auflage, Weast, R.
C., Herausgeber, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, Seiten E-59–62.
- Dueholm, K., Egholm, M., Behrens, C., Christensen, L., Hansen,
H., Vulpius, T., Petersen, K., Berg, R., Nielsen, P. und Buchardt,
0. "Synthesis of
peptide nucleic acid monomers containing the four natural nucleobases: thymine,
cytosine, adenine, and guanine and their oligomerization", J. Org. Chem. 59:5767–73 (1994).
- Egholm, M., Buchardt, 0., Christensen, L., Behrens, C., Freier,
S., Driver, D., Berg, R. und Kim, S. "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides
obeying the Watson-Crick hydrogen bonding rules", Nature 365:566-68 (1993).
- Englisch, U. und Gauss, D. "Chemically
modified oligonucleotides as probes and inhibitors", Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 30:613-29 (1991).
- Gildea, B., Casey, S., MacNeill, J., Perry-O'Keefe, H., Sorensen, D. und Coull, J. "PNA solubility enhancers", Tetrahedron Letters
39:7255–58
(1998).
- Goodnow, R. und Tam, S. "Antisense
Oligomers", US-PS 5,780,607 , erteilt
am 14. Juli 1998.
- Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press,
San Diego, Seiten 40–55,
643–671.
- Kricka, L. in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992), Academic
Press, San Diego, Seiten 3-28.
- Kutyavin, I., Lukhtanov, E., Gamper, H. und Meyer, R. "Covalently linked
oligonucleotide minor groove binder conjugates", WO 96/32496, internationales Veröffentlichungsdatum
17. Oktober 1996.
- Lee, L., Spurgeon, S., Rosenblum, B. "Energy transfer dyes with enhanced fluorescence", US-PS 5,800,996 , erteilt am 1. September
1998.
- Livak, K., Flood, S. und Marmaro, J. "Method for Detecting Nucleic Acid Amplification
Using Self-Quenching Fluorescence Probe", US-PS
5,538,848 , erteilt am 23. Juli 1996.
- Livak, K., Flood, S., Marmaro, J. und Mullah, K. "Self-quenching fluorescence
probe", US-PS 5,723,591 , erteilt am
3. März
1998.
- McMurry, J. Organic Chemistry (1984) Brooks/Cole Publishing
Co., Monterey, CA, Seiten 313–15.
- Menchen, S., Lee, L., Connell, C., Hershey, N., Chakerian, V.,
Woo, S. und Fung, S. "4,7-Dichlorofluorescein dyes
as molecular probes", US-PS 5,188,934 , erteilt
am 23. Februar 1993.
- Meyer, R. "Incorporation
of modified bases in oligonucleotides" in Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Hrsg.
S. Agrawal (1994) Humana Press, Totowa, N.J., Seiten 73–2.
- Miller, P. und Ts'O,
P. "Synthesis of
oligo-2'-deoxyribonucleoside
methylphosphonates" in
Oligonucleotides and Analogues, Hrsg. F. Eckstein (1991) IRL Press,
Oxford.
- Nielsen, P., Egholm, M., Berg, R. und Buchardt, O. "Sequence-selective
recognition of DNA by strand displacement with a thymidine-substituted
polyamide", Science
254:1497–1500
(1991).
- Oliver, R., Hrsg. "HPLC
of Macromolecules, A Practical Approach, 2nd Edition", Oxford University
Press, Oxford, (1999).
- Reichardt, C. Solvents und Solvent Effects in Organic Chemistry,
2. Auflage, VCH mbH, Weinheim, Deutschland (1990), Seiten 407–411.
- Rickwood, D. und Hames, B. Hrsg. "Gel Electrophoresis of Nucleic Acids,
A Practical Approach, 2nd Edition", Oxford University Press, Oxford (1990).
- Schmidt, J., Nielsen, P., und Orgel, L. "Separation of "Uncharged" oligodeoxynucleotide analogs by anion-exchange
chromatography at high pH",
Analytical Biochemistry 235:239–41
(1996).
- Summerton, J. und Weller, D. "Uncharged morpholino-based polymers
having achiral intersubunit linkages", US-PS
5,034,506 , erteilt am 23. Juli 1991.
- Summerton, J. und Weller, D. "Sequence-specific binding polymers for
duplex nucleic acids", US-PS 5,405,938 , erteilt
am 11. April 1995.
- Tyagi, S. und Kramer, F. "Molecular
Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization", Nature Biotechnology, 14:303–08 (1996).
- Van der Laan, A., Brill, R., Kuimelis, R., Kuyl-Yeheskiely,
E., van Boom, J., Andrus, A. und Vinayak, R. "A convenient automated solid-phase synthesis
of PNA-(5')-DNA-(3')-PNλ chimera", Tetrahedron Lett.
38:2249–52 (1997).
- Vinayak, R., van der Laan, A., Brill, R., Otteson, K., Andrus,
A., Kuyl-Yeheskiely, E. und van Boom, J. "Automated chemical synthesis of PNA-DNA
chimera on a nucleic synthesizer",
Nucleosides & Nucleotides 16:1653–56 (1997).
- Walsh, W. und Waldrop, M. "Process
for making hot-melt adhesives using watersoluble substituted lactam/polymer
solutions as feedstocks", US-PS 5,852,083 .
-
HINTERGRUND
-
Nukleinsäure-Analoga, einschließlich Peptidnukleinsäuren (PNA),
Internukleotid-Analoga
und Nukleobasen-Analoga, werden oft durch analytische Tests und
Verfah ren bei wesentlich höheren
Konzentrationen als physiologischen Konzentrationen unter metabolischen
Bedingungen untersucht und charakterisiert (Alberts, 1989). Einige
Tests, Verfahren und Experimente, die hohe Konzentrationen an Nukleinsäure-Analoga benötigen können, sind
intrazelluläre
Antisense-Hemmung von Transkription und Translation von Sense-DNA und
-mRNA, Markierung von Nukleinsäure-Analogon-Reaktionen
und Anbringen von Nukleinsäure-Analoga auf
Oberflächen
von anderen heterogenen Medien. Analytische Verfahren, die hohe
Konzentrationen an Nukleinsäure-Analoga
benötigen
können,
sind Gelelektrophorese (Rickwood, 1990), Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) (Oliver, 1998), Primer-Verlängerungsreaktionen, Polymerase-Kettenreaktion
(PCR), Massenspektroskopie, kernmagnetische Resonanz (NMR) und Röntgenkristallisation.
-
Nukleinsäure-Analoga mit ungeladenen,
neutralen Rückgraten
wie Peptidnukleinsäuren
(PNA) (Buchardt, 1992), Morpholino-Carbamate (Summerton, 1991),
Methylphosphonat-Oligonukleotide (Miller, 1991) und andere (Goodnow,
1998) weisen den Vorteil einer Nuklease-Resistenz für eine verlängerte in
vivo-Stabilität
auf, aber sie sind offenkundig schwierig zu lösen und in wässriger
Lösung
zu halten, insbesondere bei einem neutralen pH-Wert. Solchen ungeladenen
Analoga fehlen die löslichkeitserleichternden
Phosphatanionen von DNA und RNA. PNA-Sequenzen mit einem N-(2-Aminoethyl)glycin-Polymer-Rückgrat und
einem hohen Purin-Nukleobasen-Gehalt können besonders schwierig zu
lösen sein
(Nielsen, 1991). Geeignete Konzentrationen von PNA-Sequenzen mit
benachbarten Thydmidin-Nukleobasen sind auch manchmal schwierig zu
erreichen. Typischerweise werden PNA in vorwiegend wässrigen
Lösungen
mit einem niedrigen pH-Wert gelöst
(siehe z.B. DE-A-197 12 530)). PNA-Nukleobasen sind basisch und werden
bei einem niedrigen pH-Wert protoniert und geladen, wodurch deren
Löslichkeit
unter sauren Bedingungen erhöht
wird. Größtenteils
sind Nukleinsäure-Analoga
wie PNA nicht nennenswert löslich
bei neutralen, wässrigen
Bedingungen. Wenn eine Lösung
bei neutralem pH-Wert durch erhöhte
Temperatur, Rühren
oder anderen Techniken erreicht wird, neigen Nukleinsäure-Analoga zur Präzipitation,
wenn sie bei oder unterhalb von Raumtemperatur stehen gelassen werden.
Ferner können
hohe Konzentrationen an PNA und anderen Nukleinsäure-Analogon-Molekülen aggregieren,
um unlösliche,
sekundäre
und tertiäre
Strukturen auszubilden, die aus der Lösung ausfallen. Diese Präzipitate
sind oft schwierig wieder zu lösen.
-
Eine Aggregation von PNA und anderen
Nukleinsäure-Analoga
stellt ein signifikantes Hindernis bei der Aufreinigung, Analyse,
Charakterisierung, Messung und Verwendung dieser Verbindungen dar
(Schmidt, 1996). Unlöslichkeit
und Präzipitation
machen die Nukleinsäure-Analogon-Konzentrationen
fraglich und die Probenbehandlung und -Lagerung unverlässlich.
Diese Begrenzungen sind nachteilig, da Lösungen von Nukleinsäure-Analoga,
z.B. purinreiche DNA, in hohen Konzentrationen sehr wünschenswert
sind.
-
Nukleinsäure-Analoga wie PNA werden
oft mit hydrophoben Markierungsreagenzien z.B. fluoreszierenden
Farbstoffen, Biotin, Digoxigenin, zur Detektion, Affinität oder anderen
Erkennungszwecken in Markierungsreaktionen kovalent markiert oder
konjugiert. Bevorzugte Markierungsreaktionsbedingungen umfassen wässrige neutrale
Lösungen
mit dem Nukleinsäure-Analogon
und den Markierungsreagenzien in hohen Konzentrationen. Verfahren
oder Zusammensetzungen, um hohe Konzentrationen von Nukleinsäure-Analoga
für Markierungsreaktionen
zu erhalten, sind wünschenswert.
-
Die markierten Nukleinsäure-Analougon-Konjugate,
die sich aus Markierungsreaktionen ergeben, sind oft in neutralen
wässrigen
Medien unlöslich.
Verfahren oder Zusammensetzungen, um hohe Konzentrationen von markierten
Nukleinsäure-Analogon-Konjugaten,
z.B. fluoreszierender Farbstoff-PNA, sind wünschenswert.
-
Nukleinsäure-Analogon-Gemische mit einer
Präzipitierungsneigung
oder diejenigen, die eine Unlöslichkeit
zeigen, benötigen
eine aufwendige Überwachung
ihrer Konzentrationen für
eine geeignete experimentelle Kontrolle. Manchmal kann ein Lösen von
Nukleinsäure-Analoga
mit basischen Gruppen, die protoniert werden, bei einem niedrigen
pH-Wert, z.B. 1–5,
erreicht werden. Jedoch sind nicht alle Tests, Verfahren, Experimente,
Anwendungen oder Verwendungen von Nukleinsäure-Analoga bei einem sauren
pH-Wert durchführbar.
Zum Beispiel können
Nukleinsäuren
nicht spezifisch und affin bei saurem pH-Wert hybridisieren. Zusätzlich gibt
es etliche zellbiologische und molekulare Anwendungen, bei denen
ein neutraler pH-Wert benötigt wird
oder bevorzugt ist (Alberts, 1989).
-
Bestimmte Markierungen und Linker
wurden kovalent an Nukleinsäure-Analoga
gebunden, um deren Löslichkeit
in dem Versuch zu erhöhen,
hohe Konzentrationen für
verschiedene Zwecke zu erreichen. Zum Beispiel wurden hydrophile
Gruppen wie Polyoxyethylengruppen an PNA konjugiert, um ihre Löslichkeit
zu verbessern (Gildea, 1998). Ein Anbinden solcher solubilisierender
Gruppen benötigt
spezielle Reagenzien und zusätzlichen
Aufwand, um hochkonzentrierte Nukleinsäure-Analogon-Lösungen zu
erhalten. Ein zusätzlicher Nachteil
besteht in der nachteiligen Beeinflussung auf die Gesamt-Syntheseeffizienz,
wenn solubilisierende Gruppen angebunden werden. Ferner können solche
Gruppen die Form, Ladung, Hydrophobizität und andere Eigenschaften
eines Nukleinsäure-Analogons ändern. Angebundene
Gruppen können
die biologische Verwendbarkeit der Nukleinsäure-Analogon-Funktion, z.B.
Hybridisierungsspezifität
oder -affinität,
Antikörper/Antigen-Erkennung
und enzymatische Aktivität,
unterbrechen, verhindern oder beeinträchtigen.
-
Löslichkeitseigenschaften
von Nukleinsäure-Analoga
sind schwierig vorherzusagen und sind typ- und sequenzabhängig. Folglich
ist es wünschenswert,
Lösungsmittel
und Lösungsmittelgemische
bereitzustellen, die fähig
sind, Nukleinsäure-Analoga
bei hohen Konzentrationen löslich
zu machen. Bedingungen, die eine Langzeitlagerung, d.h. eine Woche
oder mehr, von Nukleinsäure-Analoga
wie PNA bei μM
(10-6 molar) bis 10 mM (10-2 molar)
Konzentrationen und neutralem pH-Wert, wobei die PNA in Lösung bleibt,
erlauben, sind besonders wünschenswert.
-
ZUSAMMENFASSUNG
-
Diese und andere Nachteile des Standes
der Technik werden durch die Erfindung überwunden, die Verfahren und
neue Zusammensetzungen bereitstellt, die hohe Konzentrationen von
in Lösungen
gelösten
Nukleinsäure-Analoga
betreffen, umfassend polare aprotische Lösungsmittel bei etwa neutralem
pH-Wert.
-
In einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt
umfasst eine wässrige
Zusammensetzung ein Nukleinsäure-Analogon
mit einem ungeladenen neutralen Rückgrat und etwa 10 bis etwa
60% (v/v) eines polaren aprotischen Lösungsmittels, wobei die Konzentration
des Nukleinsäure-Analogons
von etwa 1 μM
bis etwa 10 mM reicht und die Zusammensetzung einen pH-Wert von
etwa 5 bis etwa 9 aufweist. Vorzugsweise weist die Zusammensetzung
einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 auf.
-
Das Nukleinsäure-Analogon hat ein ungeladenes
neutrales Rückgrat.
Vorzugsweise ist das Nukleinsäure-Analogon
eine PNA.
-
Das polare aprotische Lösungsmittel
wird ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
worin
X eine O-, NH- oder NR
2-Gruppe ist, R
1 eine Alkyldiylgruppe ist und jede R
2 Gruppe unabhängig eine Methyl-, Cycloalkyl-,
Alkyl- oder Arylgruppe ist.
-
Bevorzugte polare aprotische Lösungsmittel
weisen eine Lactam-, Carbamat-, Harnstoff- und Carbonat-Funktionalität auf (Blanchard,
1998). Ein bevorzugtes polares aprotisches Lösungsmittel ist NMP (Walsh, 1998).
Vorzugsweise beträgt
die NMP-Konzentration 40 bis 60% (v/v) der Zusammensetzung.
-
Die Nukleinsäure-Analogon-Lösung kann
gegebenenfalls Salze, typischerweise bei Konzentrationen von, bis
zu und einschließlich
1 M enthalten, um die Löslichkeit
zu fördern
und/oder sich metabolischen, physiologischen oder anderen experimentellen
Bedingungen zu nähern.
Praktisch jegliches Salz kann verwendet werden, solange es in der
Zusammensetzung bei der gewünschten
Konzentration löslich
ist. Folglich kann das Salz ein anorganisches Salz wie ein Alkali-
oder Erdalkalihalogenid (z.B. NaCl, KCl, MgCl2,
usw.) sein oder es kann ein organisches Salz wie Guanidiniumchlorid,
Guanidiniumthiocyanat, Natriumacetat, Natriumformiat, Ammoniumformiat,
Tetrabutylammoniumformiat, Triethylammoniumacetat und Triethylammoniumformiat
sein.
-
In einem zweiten Aspekt wird ein
Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure-Analogon-Lösung in hoher
Konzentration bereitgestellt, umfassend die Schritte: Lösen eines
Nukleinsäure-Analogons
mit einem ungeladenen, neutralen Rückgrat bis zu einer Endkonzentration
von etwa 1 μM
bis 10 mM in einem wässrigen Lösungsmittelsystem,umfassend
etwa 10–60%
(v/v) eines polaren aprotischen Lösungsmittels, ausgewählt aus
der vorstehend beschriebenen Gruppe bei einem pH-Wert von etwa 5 bis
etwa 9. Gegebenenfalls enthält die
Lösung
eine Säure
oder Base, z.B. Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), um den pH-Wert
einzustellen. Vorzugsweise ist das Nukleinsäure-Analogon eine PNA.
-
Die Erfindung kann die Entwicklung
von neuen molekularen und zellulären
Anwendungen für
Nukleinsäure-Analoga
und die Manipulierung und chemische Konjugation von PNA an andere
Gruppen unter Verwendung neutraler Reaktionsbedingungen ermöglichen.
Auch kann die Erfindung zu einer verbesserten Rufreinigung von PNA
und einer Erleichterung bei der Handhabbarkeit dieser Moleküle führen. Ferner
werden erfindungsgemäß Markierungsreaktionen
mit hoher Konzentration an Nukleinsäure-Analoga bei oder nahe neutralem pH-Wert
ermöglicht.
-
GENAUE BESCHREIBUNG DER
BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Es wird nun genauer auf die erfindungsgemäßen bevorzugten
Ausführungsformen
verwiesen. Während
die Erfindung im Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben wird, soll verstanden werden, dass sie nicht die Erfindung
auf diese Ausführungsformen
begrenzen sollen. Im Gegenteil soll die Erfindung Alternativen,
Modifikationen und Äquivalente
umfassen, die innerhalb der Erfindung, wie durch die angehängten Ansprüche definiert,
umfasst sein können.
-
I. Definitionen
-
Wenn nicht anders angegeben, sollen
die nachstehenden hierin verwendeten Begriffe und Ausdrücke die
nachstehenden Bedeutungen haben:
-
"Nukleosid" betrifft eine Verbindung,
die aus einer Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidin-Nukleobase besteht,
z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin
und dergleichen, die an eine Pentose an der 1'-Position gebunden ist.
-
"Nukleotid" betrifft einen Phosphatester
eines Nukleosids, z.B. einen Triphosphatester, wobei die üblichste
Stelle der Veresterung die Hydroxylgruppe ist, die an die C-5-Position der Pentose
gebunden ist.
-
Die Begriffe "Nukleinsäure" oder "Oligonukleotid" betreffen Polymere von Nukleotidmonomeren,
einschließlich
doppel- und einzelsträngiger
Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, α-anomerer Formen davon und dergleichen.
Das Oligonukleotid kann vollständig
aus Desoxyribonukleotiden, vollständig aus Ribonukleotiden oder
Gemischen davon bestehen. Monomere sind über Internukleotid-Phosphodiesterbindungen
und zugehöriger
Gegenionen, z.B. H+, NH4
+, Na+, verbunden.
Oligonukleotide weisen typischerweise eine Größe von wenigen Monomereinheiten,
z.B. 5–40,
bis einigen Tausend Monomereinheiten auf. Immer wenn ein Oligonukleotid
durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt wird, wie "ATGCCTG", soll verstanden
werden, dass die Nukleotide in der 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts angegeben
sind und dass "A" Desoxyadenosin bedeutet, "C" Desoxycytidin bedeutet, "G" Desoxyguanosin bedeutet und "T" Thymidin bedeutet, wenn nicht anders
angegeben.
-
Der Begriff "Nukleinsäure-Analoga" betrifft Analoga von Nukleinsäuren, die
eine oder mehrere Nukleotid-Analogon-Einheiten umfassen und einige
der mit Nukleinsäuren
verbundenen Beschaffenheiten und Eigenschaften aufweisen, z.B. Watson/Crick-,
Wobble- und Hoogsteen-Basenpaarung und andere Sequenzerkennungswirkungen.
Nukleinsäure-Analoga
können
modifizierte Nukleobasengruppen, modifizierte Zuckergruppen und/oder
modifizierte Internukleotid-Bindungen aufweisen (Englisch, 1991).
Modifikationen umfassen Markierungen. Eine bevorzugte Klasse von
Nukleinsäure-Analoga ist diejenige,
in der die Internukleotidgruppe zu einer neutralen und ungeladenen
Gruppe bei oder nahe neutralem pH-Wert modifiziert ist, wie Phosphoramidat-,
Phosphotriester- und Methylphosphonat-Oligonukleotide, worin eines
der nicht-verbrückenden
Sauerstoffatome durch einen neutralen Substituenten, z.B. -NR2, -OR, R ersetzt ist. Eine weitere bevorzugte
Klasse von Nukleinsäure-Analoga
ist diejenige, in der die Zucker- und Internukleotidgruppen mit
einem ungeladenen, neutralen Amid-Rückgrat
ersetzt wurden, wie Morpholino-Carbamat, und Peptid-Nukleinsäuren (PNA).
Eine bevorzugte Form von PNA ist ein N-(2-Aminoethyl)glycinamid-Rückgrat-Polymer (Nielsen,
1991). Immer wenn eine PNA-Sequenz dargestellt ist, soll verstanden
werden, dass der Amino-Terminus sich an der linken Seite befindet
und der Carboxy-Terminus sich an der rechten Seite befindet.
-
Der Begriff "Watson/Crick-Basenpaarung" betrifft ein Muster
von spezifischen Paaren von Nukleotiden und Analoga davon, die über sequenzspezifische
Wasserstoffbrücken
miteinander binden, z.B. A paart mit T und U und G paart mit C.
-
"Polares
aprotisches Lösungsmittel" betrifft ein organisches
Lösungsmittel,
das ein Dipol-Moment von etwa 2 Debye-Einheiten oder mehr (Atkins,
1978; CRC Handbook, 1982; Reichardt, 1990), eine Wasserlöslichkeit
von mindestens etwa 5% (Volumen) bei oder nahe bei Raumtemperatur,
d.h. etwa 20°C,
aufweist und das keinen Wasser stoffaustausch bei etwa neutralem
pH-Wert, d.h. im Bereich von 5 bis 9 und vorzugsweise im Bereich
von 6 bis 8 unterläuft.
-
"Bindungsstelle" betrifft eine Stelle,
an die kovalent ein Linker gebunden ist.
-
"Linker" betrifft ein oder
mehrere Atome, die ein Oligonukleotid oder ein Nukleinsäure-Analogon
mit einer Markierung oder einem Festträger über eine kovalente Bindung
verknüpfen.
-
"Chimär" betrifft ein Oligonukleotid
oder ein Nukleinsäure-Analogon,
das ein oder mehrere Nukleotid- und ein oder mehrere Nukleotid-Analogon-Einheiten
umfasst.
-
"Konjugat" betrifft eine Zusammensetzung
eines Nukleinsäure-Analogons
und einer Markierung, wobei die Markierung kovalent an das Nukleinsäure-Analogon über einen
Linker an einer Bindungsstelle an dem Nukleinsäure-Analogon gebunden ist.
-
"Alkylgruppe" betrifft einen gesättigten
oder ungesättigten,
verzweigten, geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest,
der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom
eines Ausgangs-Alkans, -Alkens oder -Alkins abgeleitet ist. Typische
Alkylgruppen umfassen in nichtbegrenzender Weise Methyl-, Ethyl-,
Propyl-, Butylgruppen und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen
bestehen die Alkylgruppen aus 1 bis 12 gesättigten und/oder ungesättigten
Kohlenstoffatomen.
-
"Cycloalkylgruppe" betrifft einen cyclischen
Alkylrest. Stickstoffatome mit Cycloalkylsubstituenten können Aziridinyl-,
Azetidinyl-, Pyrrolidinyl-, Piperidinyl-Ringe, größere Ringe
und substituierte Formen von Heterocyclen davon bilden.
-
"Alkyldiylgruppe" betrifft einen gesättigten
oder ungesättigten,
verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest
mit 2 monovalenten Radikalzentren, der durch die Entfernung eines
Wasserstoffatoms von jeweils zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen
eines Ausgangs-Alkans, -Alkens oder -Alkins abgeleitet ist. Typische
Alkyldiylreste umfassen in nicht-begrenzender Weise Ethyldiyl (-CH2CH2-)-, Propyldiyl (-CH2CH2CH2-)-,
Butyldiyl (-CH2CH2CH2CH2-)-Guruppen und
dergleichen.
-
"Arylgruppe" betrifft einen ungesättigten
cyclischen oder polycyclischen Kohlenwasserstoffrest mit einem konjugierten
Resonanzelektronensystem. Typische Arylgruppen umfassen in nicht-begrenzender
Weise Reste, die sich von Phenyl, substituiertem Phenyl, Naphthalen,
Anthracen, Biphenyl und dergleichen ableiten.
-
"Markierung" betrifft eine jegliche
kovalent an ein Oligonukleotid gebundene Gruppe, die eine gewünschte Funktionalität oder Eigenschaft
verleiht (Hermanson, 1996). Eine bevorzugte Klasse von Markierungen
stellt ein Signal zur Detektion bereit, z.B. Fluoreszenz, Chemilumineszenz
und elektrochemische Lumineszenz (Kricka, 1992). Detektionsmarkierungen
umfassen in nicht-begrenzender Weise Fluoreszenzfarbstoffe (Menchen,
1993) wie Fluorescein- und Rhodamin-Derivate und Resonanz-Energie-Transfer-Paare (Livak, 1998;
Livak, 1996; Tyagi, 1996), Cyaninfarbstoffe, chemilumineszierende
Farbstoffe und Energie-Transfer-Farbstoffe (Lee, 1998). Eine weitere
bevorzugte Klasse von Markierungen dient dazu, die Hybridisierung und
Basenpaarungs-Wechselwirkungen zu erhöhen, zu stabilisieren oder
zu beeinflussen, z.B. Interkalatoren, Verbindungen, die an die kleine
Furche binden (Kutyavin, 1996), und Gruppen mit vernetzender Funktion (Blackburn,
1996). Eine noch weitere bevorzugte Klasse von Markierungen dient
dazu, die Trennung oder Immobilisierung eines markierten Nukleinsäure-Analogons
durch spezifische oder nicht-spezifische Abfangmittel, z.B. Biotin,
2,4-Dinitrophenyl (DNP) und Digoxigenin, zu bewirken (Andrus, 1995).
-
II. Polare aprotische
Lösungsmittel
-
Polare aprotische Lösungsmittel
sind zum Lösen
von Nukleinsäure-Analoga
verwendbar. Homogene, stabile Lösungen
mit einem etwa neutralen pH-Wert von Nukleinsäure-Analoga bei hoher Konzentration
können
mit wässrigen
Zusammensetzungen erreicht werden, die polare aprotische Lösungsmittel
umfassen. Polare aprotische Lösungsmittel
verbessern die Löslichkeit
von PNA bei etwa neutralem pH-Wert. Die Löslichkeit von PNA korreliert
im Allgemeinen mit steigender Konzentration von polarem aprotischem
Lösungsmittel,
z.B. 10% bis 60% des Gesamtvolumens der Zusammensetzung. Bevorzugte
Konzentrationen von polaren aprotischen Lösungsmitteln betragen etwa
50% (v/v).
-
Das polare aprotische Lösungsmittel
ist ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
worin
X eine O-, NH- oder NR
2-Gruppe ist, R
1 eine Alkyldiylgruppe ist und jede R
2-Gruppe
unabhängig
eine Methyl-, Cycloalkyl-, Alkyl- oder Arylgruppe ist.
-
Bevorzugte polare aprotische Lösungsmittel
umfassen NMP, andere N-Alkylpyrrolidinone, 2-Pyrrolidon, Ethylencarbonat,
Propylencarbonat, Dimethylacetamid (DMA), N-Methyl-2-piperidon, 2-Piperidon, andere
N-Aulkylpiperidone, Caprolactam, Dimethylbenzamid, Diethylbenzamid,
andere Dialkylacetamide und Kombinationen davon. Solche Verbindungen
werden durch ihre relativ hohen Dielektrizitätskonstanten, hohen Dipol-Momente
(Reichardt, 1990) und Löslichkeit
in Wasser (McMurry, 1984) abgegrenzt.
-
Ein bevorzugtes polares aprotisches
Lösungsmittel
ist N-Methylpyrrolidinon (NMP), dargestellt durch die Struktur:
-
III. Salze
-
Die Salze können beim Lösen und Aufrechterhalten der
Löslichkeit
und Stabilität
des Nukleinsäure-Analogons
in der Lösung
helfen. Salzverbindungen sind typischerweise Alkalimetall- oder
Alkylammoniumkationen und Halogenide oder andere Anionen. Bevorzugte
Salze umfassen Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Guanidiniumchlorid,
Guanidiniumthiocyanat, Natriumacetat, Natriumformiat, Ammoniumformiat, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid
(Tris-HCl), Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Tetrabutylammoniumformiat, Triethylammoniumacetat,
Triethylammoniumformiat und Kombinationen davon. Bevorzugte Salze
umfassen Tris-HCl und Natriumchlorid. Das Salz kann in der Zusammensetzung
in einer Konzentration von bis zu 1 M vorhanden sein. Vorzugsweise
ist das Salz in einer Konzentration von 0 bis 0,1 M vorhanden.
-
IV. Nukleinusäure-Analoga
-
Die erfindungsgemäßen wässrigen Zusammensetzungen sind
zum Solubilisieren von nahezu jeglichem Nukleinsäure-Analogon bei hohen Konzentrationen
geeignet. Folglich können
die Nukleinsäure-Analogy Modifikationen
an den Nukleobasen-, Zuckerund/oder Internukleotidgruppen tragen.
-
Bevorzugte Nukleobasen-Analogon-Modifikationen
umfassen in nicht-begrenzender Weise C-S-Alkylpyrimidine, 2-Thiopyrimidin,
2,6-Diaminopurin, C-S-Propinpyrimidin, Phenoxazin (Flanagan, 1999),
7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, 4(3H)-Pyrimidon,
Hypoxanthin, 8-Oxopurine und Universalbase (Meyer, 1994).
-
Bevorzugte Zucker-Analogon-Modifikationen
in einem oder mehreren der Nukleoside umfassen in nicht-begrenzender
Weise 2'- oder 3'-Modifikationen,
wobei die 2'- oder
3'-Position ein
Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Allyloxy-, Isopropoxy-,
Butoxy-, Isobutoxy-, Methoxyethyl-, Alkoxy-, Phenoxy-, Azido-, Amino-,
Alkyl-aminogruppe,
ein Fluor-, Chlor- und Bromatom sein kann.
-
Andere bevorzugte Zucker-Analogon-Modifikationen
umfassen 4'-α-anomerische
Nukleotide, 1'-α-anomerische
Nukleotide, 2'-verzweigende
Gruppe-Ribonukleotide und 2'-O-verzweigende
Gruppe-Ribonukleotide.
-
Bevorzugte modifizierte Internukleotid-Bindungen,
die neutrale, ungeladene Rückgrate
bilden, umfassen in nicht-begrenzender Weise ein Austauschen eines
nichtverbrückenden
Sauerstoffatoms in der Internukleotid-Phosphodiester-Bindung mit
substituierten Schwefel-, Sauerstoff-, Kohlenstoff- und Stickstoffatomen, um
Alkylphosphorothioat, Alkylphosphotriester, Alkylphosphonat bzw.
Phosphoramidat zu bilden. Andere bevorzugte Internukleotid-Analogy
umfassen N-(2-Aminoethyl)glycin-PNA, Morpholino-Carbamat (Summerton, 1991)
und andere ungeladene neutrale Rückgrate.
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind
für ein
Lösen von
PNA bei hohen Konzentrationen besonders geeignet. Sogar PNA, das
aus mehr als 50% Purin-Nukleobasen besteht und von dem gezeigt wurde,
dass es unter Standardtest- und/oder analytischen Bedingungen extrem
unlöslich
ist, kann in Konzentrationen im 1 μMbis 10 mM-Bereich gelöst werden.
-
Eine besonders bevorzugte Form von
PNA, die in hoher Konzentration erfindungsgemäß gelöst werden kann, weist ein ungeladenes
Rückgrat
von N-(2-Aminoethyl)glycin, eine Peptid-artige Einheit, auf (Egholm,
1993; Nielsen, 1991). PNA/DNA-Chimäre und markierte PNA sind bevorzugte
Varianten von PNA bei der Durchführung
der Erfindung. PNA-Oligomere sind zur Basenpaarung mit komplementären Sequenzen über Watson/Crick-Basenpaarung
mit hoher Affinität
und Spezifität
fähig.
PNA und PNA/DNA-Chimäre
können unter
Verwendung herkömmlicher
Verfahren in käuflich
erhältlichen
automatischen Synthesegeräten
mit käuflich
erhältlichen
Reagenzien hergestellt werden (Dueholm, 1994; Vinayak, 1997; Van
der Laan, 1997). PNA mit einem N-(2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat weist
die Struktur:
auf, worin B eine Nukleobase
oder ein Nukleobasen-Analogon ist.
-
Ein anderes Amid-verknüpftes, ungeladenes
Nukleinsäure-Analogon,
das erfindungsgemäß in hoher Konzentration
gelöst
werden kann, weist Morpholino-Carbamat-Rückgrat-Einheiten:
auf, worin B eine Nukleobase
oder ein Nukleobasen-Analogon ist (Summerton, 1995; Summerton, 1991).
-
Eine bevorzugte Nukleinsäure-Analogon-Lösung wird
dadurch hergestellt, dass eine bekannte Menge eines oder mehrerer
Nukleinsäure-Analoga
mit bekannten Volumina und Mengen eines oder mehrerer polarer aprotischer
Lösungsmittel
und Wasser gemischt wird. Die Volumenmenge in der Lösung des
polaren aprotischen Lösungsmittels
beträgt
10 bis 60% (v/v) polares aprotisches Lösungsmittel und vorzugsweise
40 bis 60% (v/v) polares aprotisches Lösungsmittel. Salz kann auch
als ein Feststoff oder vorgelöst
in Wasser zu der Lösung
gegeben werden. Die Endkonzentration des Salzes in der Lösung kann
0 bis 1 molar betragen. Das Gefäß kann vortexiert
oder anderweitig geschüttelt
und/oder auf etwa 50°C
für etwa
1 bis 15 Minuten erhitzt werden, um ein Lösen zu unterstützen. Säure oder
Base, die ausreicht, um den pH-Wert auf einen Bereich von 5 bis
9 einzustellen, wird hinzugefügt,
vor oder nachdem ein Lösen
erreicht ist. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 6 bis 8 und der am
meisten bevorzugte pH-Wert ist etwa pH 7. Zum Beispiel kann 2 M
Tris bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,1 mM zugegeben werden,
um einen pH-Wert von 8 zu erreichen. Die Endkonzentration des (der)
Nukleinsäure-Analogons
(Analoga) kann etwa 1 μM
bis etwa 10 mM betragen. Vorzugsweise wird eine hohe Konzentration
des Nukleinsäure-Analogons,
1 mM oder mehr, erreicht. Ein Gemisch von Nukleinsäure-Analoga
kann in der Lösung
vorhanden sein. Lösungen
können
bei Raumtemperatur oder darunter gelagert werden.
-
PNA kann in dem 2 μmol-Maßstab unter
Verwendung von Fmoc/Bhoc-, tBoc/Z- oder MMT-Schutzgruppen-Monomeren
auf einem Expedite Synthesizer (PE Biosystems) auf einem XAL- oder
PAL-Träger,
auf dem Modell 433A-Synthesegerät
(PE Biosystems) auf einem MBHA-Träger oder auf anderen automatischen Synthesegeräten hergestellt
werden. Nach Abschluss der Synthese wird die Roh-PNA von dem Träger z.B. mit
Trifluoressigsäure
abgespalten, und sodann mit Diethylether ausgefällt und zweimal in Diethylether
gewaschen. PNA wird durch HPLC mit reverser Phase aufgereinigt,
durch Massenspektroskopie analysiert und durch Korrelation von Absorption
bei 260 nm mit der Masse quantifiziert. PNA/DNA-Chimäre (Van
der Laan, 1997; Vinayak, 1997) können
mit MMT-Schutzgruppen-PNA-Monomeren und Phosphoramidit-Nukleosid-Monomeren
hergestellt werden (Beaucage, 1992).
-
V. Beispiele
-
Die Erfindung wird unter Berücksichtigung
der nachstehenden Beispiele weiter verdeutlicht, die nur beispielhaft
für die
Erfindung sein sollen und in keiner Weise ihren Umfang begrenzen
sollen.
-
Beispiel 1
-
Eine PNA-Sequenz (SEQ ID NO:1) mit
hohem Puringehalt (73%) und 15 N-(2-Aminoethyl)glycin-Monomereinheiten
wurde mit zwei löslichkeitserhöhenden Gruppen
O (2-[2-(2-Aminoethoxy)]essigsäure),
die an dem Amino-Terminus gebunden sind, hergestellt:
wurde hergestellt, gespalten
und aufgereinigt. Zwei Proben, die jeweils 59 nmol SEQ ID NO:1 enthielten,
wurden in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei vermindertem Druck
getrocknet. Zur Probe 1 wurden 29,5 μl NMP und 29,5 μl 0,1 M Tris-HCl
mit einem pH-Wert von 8 gegeben. Zur Probe 2 wurden 59 μl 0,05 M
Tris-HCl mit einem
pH-Wert von 8 gegeben. Die maximale angestrebte Konzentration jedes
Röhrchens
betrug somit 1,0 mmol. Die Röhrchen
wurden etwa 1 Minute vortexiert. Probe 1 ergab eine klare Lösung. Probe 2
ergab eine trübe
Lösung.
-
Um die Konzentrationen zu messen,
wurden die Proben bei etwa 14 000 g in einer Mikrozentrifuge für etwa 10
Minuten zentrifugiert, um jegliches ungelöstes Nukleinsäure-Analogon
oder andere Verunreinigungen zu sedimentieren. Eine kleine Menge
der Lösung
wurde entnommen und mit einem bekannten Volumen Wasser verdünnt. Die
Absorption wurde bei 260 nm gemessen und auf die Masse korreliert.
Probe 1 mit 50% NMP ergab eine Konzentration von PNA von 0,69 mM,
was eine 69%ige Lösung
anzeigte. Probe 2 ohne NMP ergab eine Konzentration von PNA von
0,13 mM, was eine 13%ige Lösung
anzeigte.
-
Beispiel 2
-
Eine Homopurinsequenz-PNA (SEQ ID
NO:2) mit 12 N-(2-Aminoethyl)glycin-Monomereinheiten wurde mit löslichkeitsverbessernden
Gruppen O (2-[2-(2-Aminoethoxy)]essigsäure), die an den Amino- und
Carboxy-Termini gebunden waren, hergestellt:
-
SEQ ID NO:2 war vollständig unlöslich in
Wasser bei einem neutralen pH-Wert. Zugabe von 10% oder 50% NMP
brachte die PNA sofort in Lösung
bei 1 mM. Beide Lösungen
verblieben homogen ohne Präzipitation über 2 Monate
bei Raumtemperatur. Zwei zusätzliche
Biotin-markierte PNA-Sequenzen, SEQ ID NO:3 und 4, sind auch bei
1,0 mM in 50% NMP löslich.
-
Beispiel 3
-
Eine Gruppe von 4 N-(2-Aminoethyl)glycin-PNA-Proben
wurde in Zusammensetzungen ohne (0%) NMP und mit (50%) NMP gelöst. Die
Zielkonzentration ist die maximale Konzentration, bei der die gesamte Probe
gelöst
wäre. Die
tatsächlichen
gelösten
Konzentrationen (mM) wurden durch Absorption wie in Beispiel 1 gemessen.
Sequenzprotokoll
