DE4343842C1 - Reaktionsgefäß zur immunologischn Analytik von Aerosolen - Google Patents

Reaktionsgefäß zur immunologischn Analytik von Aerosolen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Reaktionsgefäß zur schnellen qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von sog. Luftschadstoffaerosolen mit Hilfe einer immunchemischen Reaktion, bei der spezifische Antikörper zur selektiven Bindung der Luftschadstoffaerosole und eine Markierung bzw. System zur Anzeige oder Kenntlichmachung dieser Bindung eingesetzt werden.
Natürliche, trockene Luft ist chemisch gesehen ein Gasgemisch. Luftverunreinigungen durch eine Vielzahl von Substanzen verändern die Zusammensetzung dieses "Gases" teilweise erheblich. Besondere Bedeutung in diesem Zusammenhang haben chemische Verbindungen, entweder in solider Form oder an/auf Grob- bzw. Feinstäuben sorptiv gebunden, die der normalen Luft entweder durch natürliche Prozesse (z. B. Vulkantätigkeit) zugeführt werden oder durch die Tätigkeit des Menschen in die Luft gelangen. Diese sog. "Umweltchemikalien" kann man aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften grob in Gase und Aerosole einteilen. Von großer Bedeutung dabei sind diejenigen Umweltchemikalien (d. h. Umweltnoxen, z. B. Allergene, Pestizide, usw.), die als "Schadstoffbelastung" der Außen- und Innenraumluft von Mensch und Tier in zunehmendem Maße vorkommen. Die Belastung der Luft durch Grob- und Feinstäube ist dabei in Großstädten und Industriegebieten besonders zu spüren. Stäube mit Teilchen unter 5 Mikrometer sind lungengängig, d. h. sie gelangen in die Lungenbläschen. Sie können sich dort ansammeln oder ins Blut übergehen, dringen in die Körperzellen ein und schädigen deren Stoffwechselenzyme, lösen Allergien aus u. a. Kommen mehrere Umweltnoxen gleichzeitig in der Luft vor, so sind synergistische Wirkungen möglich.
Aerosole sind definitionsgemäß Zweiphasensysteme, bei denen feste oder flüssige Partikel/Stoffe in einer Gasphase fein dispergiert schweben, d. h. in denen Luft als Träger- und Verteilungsmedium für diese Partikel/Stoffe dient. Werden z. B. biologische Materialien wie Sporen, Viren oder Bakterien in Luft dispergiert, spricht man von "biologischen Aerosolen" bzw. "Bioaerosolen"; sog. "solide Aerosole" sind diejenigen, die feste Stoffe dispers enthalten. Die Größenverteilung von in Aerosolen enthaltenen Partikeln überdecken ein Spektrum von Teilchen, deren Durchmesser von 10-3 Mikrometer bis ca. 10² Mikrometer reicht. Diese große Spannweite erklärt sich aus der Vielfalt der Möglichkeiten der Entstehung und unterschiedlichen physikochemischen Zusammensetzung luftverunreinigender Partikel. Die Partikelgröße hängt unmittelbar zusammen mit den für die biologische Wirkung bestimmenden Parametern: Verweildauer in der Luft, chemische Aktivität und Lungendeposition. Die Deposition von Partikeln beim Menschen betrifft einen Größenbereich von 0,03 bis 20 Mikrometer Partikeldurchmesser. Der Feinstaubanteil (< 10 Mikrometer) macht im sog. "Hausstaub" nur ca. 20% der Gesamtstaubmasse aus, kann aber bis zu 90% der allergen bzw. toxisch wirkenden Stoffe beinhalten. Dadurch stellen Aerosole, d. h. in diesem Zusammenhang "luftgetragene Gefahrstoffe", z. B. in Innenräumen, Wohn- und Arbeitsräumen, Verkehrsmitteln, Hotels usw. ein nicht zu unterschätzendes gesundheitliches Risiko dar. Um Gesundheitsgefahren beispielsweise am Arbeitsplatz auszuschließen, sind bestimmte Grenzwerte in Verbindung mit einer entsprechenden Gesetzgebung (Chemikaliengesetz: ChemG) erlassen worden. Ist das Auftreten eines gefährlichen Stoffes (Aerosoles) in der Luft am Arbeitsplatz nicht sicher auszuschließen, so ist der Arbeitsplatz auf die Unterschreitung der Grenzwerte (Maximale Arbeitsplatzkonzentration: MAK; Technische Richtkonzentration: TRK, Biologischer Arbeitsplatztoleranzwert: BAT) zu überwachen. Eine solche Überwachung kann durch Vornahme von Messungen erfolgen.
Heutzutage gibt es ein umfangreiches Sortiment von Prüfröhrchen zur quantitativen Schnellanalyse von Gasen, Dämpfen und Aerosolen im Bereich der MAK-Werte. Für den Meßeinsatz werden dem Prüfröhrchen die Spitzen abgebrochen, das Prüfröhrchen in die entsprechende Gasspürpumpe eingeführt und mit dieser das vorgeschriebene Gas- bzw. Luftvolumen durch die Reaktionsschicht gesaugt. Die meisten Prüfröhrchen sind sog. Skalenröhrchen, bei denen sich die Anzeigeschicht in einer von der Analytkonzentration abhängigen Länge verfärbt. Ferner sind Prüfröhrchen mit einer Farbvergleichsschicht bekannt, über die ein Farbvergleich nach der Reaktion stattfindet. Die Grundlage der meisten Prüfröhrchen sind rein chemische Reaktionen der zu messenden Gase bzw. Aerosole mit den Chemikalien der Röhrchenfüllschicht/en. (Dräger-Röhrchen Handbuch, (1991): Boden-, Wasser- und Luftuntersuchung sowie technische Gasanalyse, 8. Auflage, Drägerwerk AG, Lübeck, DE).
Es gibt Einweg-Reaktionsgefäße bzw. Prüfröhrchen, bei denen der Nachweis gasförmiger Schadstoffe mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion erfolgt (DE-A 38 42 607 und DE-A 39 14 801).
Allerdings gibt es eine Reihe von Schadstoffen, die enzymatisch nicht bzw. mit den üblichen physikalisch-chemischen Methoden nur mittels aufwendiger Anreicherungs- und Analyseverfahren meßbar sind. Immunchemische Verfahren (Immunoassays), wie sie in der Klinischen- oder Lebensmittel-Analytik zum Nachweis verschiedener Substanzen routinemäßig eingesetzt werden, sind in jüngster Zeit auch zur Bestimmung von "Umweltchemikalien" in Boden und Wasserproben eingesetzt worden und exemplarisch von Van Emon und Mumma (1990) beschrieben (Van Emon, J.M. & Mumma, R.O. Hrsg., (1990): Immunochemical Methods for Environmental Analysis, ACS Symposium series 442, ACS Washington, USA).
Bei Immunoassays unter Verwendung der sog. "Affinitätschromatographie" als wichtigen Verfahrensschritt wurden bisher im wesentlichen Mehrzweckreaktionsgefäße bzw. wiederverwendbare Säulen, die mit Antikörpern oder Antigen (Analyt), gebunden an einem festen Träger, gepackt sind, verwendet.
In der DE 41 26 436 A1 wird ein Einwegreaktionsgefäß für die Festphasenimmunanalytik in Form einer Einwegsäule beschrieben, das die Durchführung eines Immunoassays ermöglicht und das zum sofortigen Gebrauch ohne vorherige Kalibirier- oder Regeneriermaßnahmen geeignet ist. Es handelt sich dabei um ein oben und unten offenes Einwegreaktionsgefäß für die Festphasenimmunanalytik mit zwei darin befindlichen, für Flüssigkeiten durchlässigen porösen Trenneinrichtungen, zwischen denen sich mindestens eine auf einem Trägermaterial aufgebrachte immunologische Reaktivkomponente befindet. Die Durchflußgeschwindigkeit der Flüssigkeiten wird dabei durch die Durchlässigkeit der oberen und/oder unteren Trenneinrichtung bestimmt. Ferner bewirkt die hohe Beladungsdichte des Trägermaterials mit den Reaktivkomponenten, daß die zu bestimmende Komponente innerhalb von ca. 1 min. nahezu quantitativ an die Reaktivkomponente bindet, bevor die durchfließende Flüssigkeit aus dem Trägerbettvolumen austritt. Verfahrensgemäß wird dabei die zu bestimmende Komponente aus der Probe von der immunologischen Reaktivkomponente im Einwegreaktionsgefäß zurückgehalten und beispielsweise über eine der zu bestimmenden Komponente konkurrierende markierte Verbindung bestimmt. Auch wenn das Einweggefäß und Nachweisverfahren der DE 41 26 436 A1 im Vergleich zu bisherigen immunchromatographischen Verfahren sehr vereinfacht ist, kann es nicht direkt für den Nachweis luftgetragener Schadstoffaerosole eingesetzt werden. Ferner beinhaltet der immunchemische Nachweis zwischen Probenauftrag und Detektion zusätzliche Verfahrensschritte wie Waschen, Eluieren und Markierungs- (Fluoreszenz-)-Nachweis. Letzteres erfordert darüber hinaus eine besondere Apparateperipherie.
Aus der DE 41 21 493 A1 ist eine Analysevorrichtung zur quantitativen, immunologischen Bestimmung von Schadstoffen bekannt, welche aus einem Träger mit zwei Teilbereichen von Schichten besteht, von denen eine erste Schicht eine lichtundurchlässige Reaktionsschicht ist, in der verteilt sich ein Tracer/Antikörper-Komplex befindet und die zweite Schicht eine sich an die Reaktionsschicht anschließende lichtdurchlässige Nachweisschicht ist. Der Tracer ist hierbei ein mit einem Farbstoff markierter Analyt. Die nachzuweisenden Analyten diffundieren in die Reaktionsschicht, verdrängen die Tracer von ihren Bindungsplätzen an den Antikörpern und nehmen deren Plätze ein. Die verdrängten Tracer diffundieren dann in die lichtdurchlässige Nachweisschicht, in welcher sie als Farbreaktion sichtbar sind. Die Reaktionsschicht kann mit einer vorgeschalteten Sammelschicht versehen sein und zusammen mit der Nachweisschicht sandwichartig zwischen zwei plattenförmigen Deckeln als Gehäuse eingespannt sein, wobei der der Nachweisschicht zugewandte Deckel einen Einlaß und der der Reaktionsschicht zugewandte Deckel eine Auslaß aufweist.
Aus der DE 41 14 159 A1 ist ein faseroptischer Detektor bekannt, der aus einer mit Antikörpern überzogenen optischen Faser in einer Kammer besteht. An die aktiven Bereiche der Antikörper sind Tracer in Form von fluoreszenzmarkierten Antigenen gebunden. Die Fluoreszenz-Markierung der Antigene ist durch Licht von einer bestimmten Wellenlänge aktivierbar, welches über die Faser in den mit den Antikörpern beschichteten Bereich gelangt. Wenn nachzuweisende Moleküle in die Kammer eindringen, ersetzen diese die Antigene an den Antikörpern, was zu einer Abnahme der Fluoreszenz führt. Die relative Abnahme der Fluoreszenz ist ein Maß für die relative Menge der in die Kammer gelangten nachzuweisenden Moleküle.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, direkt anzeigendes und auswertbares Reaktionsgefäß für solche Umweltchemikalien, bevorzugt Aerosole, zu entwickeln, die enzymatisch nicht direkt bzw. mit den üblichen physikalisch-chemischen Methoden nur mittels aufwendiger Anreicherungs- und Analyseverfahren meßbar sind.
Die Aufgabe wird durch ein Reaktionsgefäß gemäß dem Hauptanspruch gelöst.
Vorteil des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes, im folgenden auch als Prüfröhrchen bezeichnet, ist, daß alle benötigten Reagenzien (Antikörper, Tracer, Substrate, Puffer, usw.) direkter Bestandteil des Prüfröhrchens sind. Die Luftprobe wird mittels einer Gasspürpumpe direkt in das Prüfröhrchen gesaugt und das Aerosol auf diese Weise gesammelt/angereichert. Zusätzliche Handhabungsschritte, wie das Aufbringen oder Dosieren der Probe und weiterer Lösungen mit üblichen Laborhilfsmitteln oder Pipettierautomaten, entfallen. Dadurch wird eine unmittelbare Messung/Überwachung, z. B. am Arbeitsplatz, Wohn- oder Innenraumbereich, möglich.
Den Ausgangspunkt der Erfindung bilden bereits bewährte Prüfröhrchen, wie sie im Dräger-Röhrchen Handbuch, 8. Auflage von 1991 beschrieben sind. Dabei sind Prüfröhrchen bekannt, die eine oder auch mehrere brechbare Ampullen mit flüssigen Reagenzien enthalten. Das Prüfröhrchen ist im Bereich der Ampulle brechbar und beispielsweise mit einem Schlauchüberzug versehen. Mit den Ampullen, in der vorliegenden Erfindung einzeln oder doppelt nebeneinander oder hintereinander angeordnet, ergibt sich die Möglichkeit, in dem Prüfröhrchen flüssige Reagenzien zu lagern, ohne daß sie während der Lagerzeit mit den anderen "Füllungen" (beschichtete Träger, lyopholisierte Reagenzien, Sammelschichten, usw.) in Berührung kommen. Beim Gebrauch des Prüfröhrchens wird es zu dem jeweils für die Reaktion richtigen Zeitpunkt an der brechbaren Stelle gebrochen, wobei dann auch die Ampulle zerbricht und deren Inhalt sich in das Innere des Prüfröhrchens ergießt. Ein besonders vorteilhaftes, konstruktives Merkmal ist in der DE-C 29 48 218 beschrieben. Dabei wird zur Auswertung der eingetretenen chemischen Reaktion, d. h. zur Aerosolmessung der Verfärbungsgrad einer zu sammelnden Flüssigkeit in einer zuvor leeren Prüfröhrchenkammer (Meßkammer) herangezogen. Dabei verhindert die aus hydrophobisiertem Vlies (Papier) bestehende Flüssigkeitssperre das Austreten von Reagenzflüssigkeit in die Ansaugpumpe (Gasspürpumpe) und damit deren Schädigung. In der vorliegenden Erfindung wird dieser Prüfröhrchenabschnitt analog zur DE 29 48 218 C2 für die Meßauswertung herangezogen. Die Auswertung kann dabei mit bloßem Auge durch Vergleich mit einem Farbstandard, oder maschinenunterstützt spektralphotometrisch durchgeführt werden. Darüber hinaus kann dieser Röhrchenbereich Reaktionsbereich sein, da in ihm beispielsweise in lyophilisierter Form Reagenzien bevorratet werden können, die erst nach Inkontaktbringen mit Flüssigkeit rehydratisiert und z. B. als Enzymsubstrat verwendet werden. Zusätzlich bzw. alternativ kann in diesem Bereich eine weitere Reagenzampulle integriert werden.
Das erfindungsgemäße Prüfröhrchen samt immunologischem Verfahren ist durch die Kombination der Nachweismethode auf Basis eines immunologischen Verdrängungstests (Displacementassays) mit der Prüfröhrchen-Technologie, die heute zur den klassischen Meßverfahren der Gas- und Luftanalytik gehört, geeignet, als einfach und schnell handhabbare, kostengünstige, direkt qualitativ und/oder quantitativ auswertbare Analyseeinheit eingesetzt zu werden. Eine schnelle Analyse von Luftproben wird weiterhin deshalb möglich, weil das Einwegreaktionsgefäß den sofortigen Gebrauch erlaubt, da die darin enthaltenen Reagenzien, Lösungen, Trägermaterialien usw. standardisiert sind und vor der unmittelbaren Verwendung nicht geeicht werden müssen. Dadurch wird erstmals eine direkte Messung/Überwachung, z. B. am Arbeitsplatz bzw. in Innen- und Wohnräumen von luftgetragenen Schadstoffaerosolen, die einer schnellen, verläßlichen, kostengünstigen und in der Handhabung einfachen Analytik vor Ort nicht zugänglich waren, möglich.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert und in den zugehörigen Figuren dargestellt. Für die Beispiele der immunchemischen Reaktion und beteiligten Reaktivkomponenten wird Dinitrophenyl-Lysin (DNP-L) als Analyt bzw. DNP-L-Konjugate als Tracer verwendet. Als spezifischer Antikörper wird der von Stanley et al. beschriebene monoklonale anti-Dinitrophenol-Antikörper verwendet (Stanley, C., Lew, A.M. & Steward, M.W. (1983): The measurement of antibody affinity; a comparison of five techniques utilizing a panel of monoclonal anti-DNP antibodies and the effect of high affinity antibody on the measurement of low affinity antibody., J. Imm. Methods 64, pp., 119-132). In den Beispielen wird der Einfachheit halber von Prüfröhrchen als Reaktionsgefäß gesprochen, auch wenn andere Ausführungsformen ebensogut einsetzbar sind.
Die Figuren zeigen
Fig. 1 bis 8 Längsschnittdarstellungen unterschiedlicher Ausführungsformen von Prüfröhrchen zum immunchemischen Nachweis von Aerosolen,
Fig. 9 Schematischer Aufbau der immunologischen Reaktionskomponente,
Fig. 10 Schematischer Reaktionsablauf an der immunologischen Reaktionskomponente.
In den Fig. 1 bis 8 ist ein aus Glas bestehendes Prüfröhrchen (1) gezeigt. Die Enden des Prüfröhrchens (1) sind jeweils als abbrechbare Spitzen (2, 3) ausgebildet. An erster Stelle in der Durchströmungsrichtung (5) gesehen ist eine erste Kammer (6) angeordnet, in der eine oder zwei brechbare Ampullen (7, 28, 29, 32, 33) untergebracht sind. In der Höhe der Ampullen (7, 28, 29, 32, 33) ist das Glasröhrchen (1) mit einem aufgeschrumpften Schlauch (8) überzogen. Auf die erste Kammer (6) folgend befindet sich eine Sammelschicht (9). Diese Sammelschicht (9) besteht aus inerten PTFE-Membranen definierter Porengröße (zwischen 0,45-5 Mikrometer), gefolgt von einer unterstützenden hydrophobierten Vliesschicht. Möglich ist ferner eine körnige, inerte Quarzschicht (in den Figuren nicht dargestellt) mit Körnungen von 0,5 bis 0,8 mm. In der darauf folgenden Reaktionskammer (10) ist eine immunchemisch reaktive Füllung (11) angeordnet, gefolgt von einer Meßkammer (12). Die einzelnen Füllungen (11) bzw. Kammern (6, 10, 12) des Prüfröhrchens (1) werden durch Halteelemente (13, 14, 15, 16, 17, 26) rüttelsicher gehalten. Ferner sind die einzelnen Röhrchenkammern (6, 10, 12) in Durchströmungsrichtung (5) mit den Flüssigkeitstransport behindernden Sperrschichten (18, 19, 24) aus hydrophobierten Filtermaterial abgeschlossen. Am Ende (3) des Prüfröhrchens (1) verhindert eine Flüssigkeitssperre (20) den Austritt von Flüssigkeit. In den Fig. 3 bis 8 befindet sich zwischen dem Halteelement (16) und der Meßkammer (12) eine Enzym-Reaktionskammer (25) mit dem Halteelement (26) und der Sperrschicht (24). Konfiguration und Konstitution der Bestandteile bzw. Reagenzien in der Enzym-Reaktionskammer (25) und der Meßkammer (12) können in trockener Form (27, 38), als imprägnierte körnige Reaktionsschicht (49) oder in einer Brechampulle (36, 39) bevorratet werden.
Beispiel 1: Aerosol-Prüfröhrchen Aufbau
Der immunchemische Nachweis luftgetragener Schadstoffaerosole mit den erfindungsgemäß beschriebenen Prüfröhrchen (Fig. 1) wird wie folgt durchgeführt:
An dem Glas-Prüfröhrchen (1) werden die Spitzen (2, 3) abgebrochen und anschließend das Prüfröhrchen in eine Gasspürpumpe eingesetzt. Anschließend werden beispielsweise 10 bis 100 l Prüfluft in Durchströmungsrichtung (5) hindurchgesaugt. Während dieser "Luftprobenahme" wird das in der Probenluft vorhandene Aerosol in der Kammer (6), bevorzugt aber auf der daran angrenzenden Sammelschicht (9), abgeschieden und gesammelt/angereichert. Danach wird die Brechampulle (7) an der Sollbruchstelle (21) zerbrochen. Dadurch gelangt die Ampullenlösung (22) in die Kammer (6) und durch Schütteln auf die Sammelschicht (9). Die Art der Lösung (22), mit der die Ampulle (7) gefüllt wird, ist vom zu untersuchenden Aerosol abhängig. Die Ampullenlösung (22) wird so gewählt, daß einerseits eine gute Löslichkeit der auf den Aerosolpartikeln haftenden Schadstoffe erreicht wird, andererseits aber die nachfolgende immunchemische Reaktion nicht inhibiert wird. So ist zu erwarten, daß Bioaerosole, deren Schadstoffanteil sog. "Exine" (allergene Proteine bzw. Peptide) sind, in Bezug auf deren Löslichkeit andere Eigenschaften der Ampullenlösung (22) benötigen als beispielsweise Pestizide oder andere aerosolbildende chemische Verbindungen. In Abhängigkeit der Löslichkeit des zu untersuchenden Schadstoffs wird das Prüfröhrchen (1), nach dem Brechen der Ampulle (7) und dem Inkontaktbringen von Ampullenlösung (22) und abgeschiedenem Aerosol, einige (z. B. 5 bis 20) Minuten, z. B. bei Raumtemperatur belassen. Ein direkter Übergang der so entstandenen Schadstofflösung in die folgende Reaktionskammer (10) wird durch eine vorhandene Sperrschicht (18) verhindert bzw. verzögert. Für den vollständigen Übergang der Lösung (22) von der Kammer (6) und Sammelschicht (9) in die Reaktionskammer (10) muß das Röhrchen (1) senkrecht gehalten und mit der Gasspürpumpe die Schadstofflösung in die Reaktionskammer (10) gesogen werden. Während des Durchtritts der Schadstofflösung durch die Reaktionskammer (10) entlang der immunochemisch reaktiven Füllung (11) erfolgt die Immunreaktion (Fig. 10). Ein direkter Übergang der Schadstofflösung aus der Reaktionskammer (10) in die Meßkammer (12) wird durch eine vorhandene Sperrschicht (19) verhindert bzw. verzögert. Nach einer definierten Reaktionszeit, beispielsweise 5 bis 20 Minuten, wird die Schadstofflösung erneut mittels Gasspürpumpe aus der Reaktionskammer (10) in die Meßkammer (12) gesogen. Diese Meßkammer (12) dient der Meßauswertung beispielsweise anhand sichtbarer Verfärbung. Bei der erfindungsgemäßen Immunreaktion ist die Aerosol-Schadstoffkonzentration der farberzeugenden Markierungskonzentration direkt proportional, so daß die resultierende Farbintensität in der Meßkammer direkt proportional zur Schadstoffmenge ist. Die Auswertung der verschiedenen Markierungsintensitäten ist sowohl mit dem bloßen Auge als auch mit Hilfe optolelektrischer Abtastvorrichtungen möglich. Im Falle von Farbmarkierungen können die verschiedenen Farbintensitäten mit einem Farbstandard verglichen werden. In der vorliegenden Erfindung ist die Meßkammer (12) in den Fällen, in denen mit Enzymen als farbgebender Komponente gearbeitet wird, gleichzeitig Kammer für die Enzymreaktion. In ihr werden beispielsweise Reagenzien (Substrate, Salze oder Puffersubstanzen) in trockener lyophilisierter Form (23) oder als Lösung (40) in einer brechbaren Ampulle (39) (Fig. 2) bevorratet. Erst zum gewünschten Zeitpunkt, bei Übergang der Flüssigkeit aus der Reaktionskammer (10) in die Meßkammer (12), werden diese Reagenzien im Falle des Lyophilisates (23) rehydratisiert und als farbloses Enzymsubstrat durch die immunchemisch freigesetzten Enzymtracer in eine detektierbare Verfärbung umgesetzt. Die Inkubation und anschließende Auswertung erfolgt nach definierten Zeitvorgaben. Dabei verhindert die aus hydrophobiertem Papier bestehende Flüssigkeitssperre (20) das Austreten von Reagenzflüssigkeit in die Ansaugpumpe und damit deren Schädigung.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform (Fig. 3-8) ist in direktem Anschluß an die Reaktionskammer (10), versehen mit einer weiteren Sperrschicht (24) und Halteelement (26), eine Enzym-Reaktionskammer (25) angeordnet. Die Enzym-Reaktionskammer (25) enthält in trockener Form (38) (Fig. 7) bzw. als mit einem Enzym-Substrat (23) imprägnierte körnige Reaktionsschicht (49) (Fig. 3-6) oder in einer Brechampulle (39) (Fig. 8) spezifische farbgebenden Enzym-Substrate für die Enzym-Tracer. Nach der erfindungsgemäßen Immunreaktion in der Reaktionskammer (10), beispielsweise nach 5 bis 20 Minuten, wird die Lösung mittels Gasspürpumpe aus der Reaktionskammer (10) in die Enzym-Reaktionskammer (25) gesogen. Hier erfolgt die enzymatische Umwandlung der beispielsweise farblosen Substrate zu farbgebenden Produkten. Nach einer definierten Reaktionszeit wird erneut mittels Gasspürpumpe die nun mehr oder weniger farbige Flüssigkeit aus der Enzym-Reaktionskammer (25) in die Meßkammer (12) gesogen. Erfindungsgemäß befinden sich bei dieser Ausführungsform in der Meßkammer (12) Enzym-inhibierende Reagenzien (27) in lyophilisierter Form, die nach Rehydratisierung durch die hinzukommende Flüssigkeit die farbgebende Reaktion abstoppen und somit ein über längere Zeit stabilisiertes Meßsignal erzeugen. In der Ausführung nach Fig. 6 liegen die Enzym-inhibierenden Reagenzien als Lösung (37) in einer Brechampulle (36) vor.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform (Fig. 4), mit analoger Bestandteilzusammensetzung wie Fig. 3, wird die Ampulle (7) durch beispielsweise zwei nebeneinander angeordnete Brechampullen (28) und (29) mit den Ampullenfüllungen (30) und (31) ersetzt. Dieses ermöglicht die Bevorratung von Ampullenlösungen für die nachfolgende Aerosolreaktion, die z. B. im vermischten Zustand für längere Zeit chemisch inkompatibel, instabil, nicht lagerbar o. a. sind. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform (Fig. 5), mit analoger Bestandteilzusammensetzung wie Fig. 3, wird die Ampulle (7) durch zwei ineinander angeordnete Brechampullen (32) und (33) mit den Ampullenfüllungen (34) und (35) ersetzt. Diese Ausführungsform ermöglicht die gleichzeitige Bevorratung von Reagenzien in zwei unterschiedlichen Phasen, beispielsweise eine Reagenzlösung oder einen Puffer in flüssiger Form (34) und Reagenzien als Trockensubstanz (35). Wird die Doppelampulle (32, 33) zum gegebenen Zeitpunkt an der Sollbruchstelle (21) zerbrochen, wird die trockene Reagenzsubstanz (35) durch den Puffer (34) gelöst und kann anschließend als gebrauchsfertiges Ampullenreagenz für den Aerosolnachweis wie beschrieben eingesetzt werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform (Fig. 6), mit analoger Bestandteilzusammensetzung wie Fig. 1 bzw. Fig. 3, wird das als Trockensubstanz in der Meßkammer (12) bevorratete Reagenz (23) bzw. enzyminhibierende Reagenz (27) durch eine Brechampulle (36) mit der Ampullenlösung (37) ersetzt. Diese Anordnung ermöglicht im Bereich der Meßkammer (12) die Bevorratung von flüssigen Reagenzien. In den weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen (Fig. 7 und 8), mit analoger Bestandteilzusammensetzung wie Fig. 3, wird die Füllung der Enzym-Reaktionskammer (25) variiert. Enthält die Enzym-Reaktionskammer (25) in Fig. 3 einen trockenen, körnigen mit spezifischen farbgebenden Enzymsubstraten (23) imprägnierten Träger (49), so werden in Fig. 7 die spezifischen farbgebenden Enzymsubstrate als reines Reagenz-Lyophilisat beispielsweise in Pulver- oder als Pillen-Form (38), in Fig. 8 als Ampullenflüssigkeit (40) in einer zusätzlichen Brechampulle (39) bevorratet.
Welche der oben beschriebenen beispielhaften Ausführungsformen zur Anwendung kommt, wird maßgeblich von physiko-chemischen Eigenschaften des nachzuweisenden Aerosols und weiteren Reaktionsbestandteilen, der Qualität der Antikörper sowie der Stabilität und Lagerbarkeit der verwendeten Reagenzien beeinflußt.
In den beschriebenen Ausführungsbeispielen ist der immunchemisch nicht reaktive Anteil der Füllung (11) in der Reaktionskammer (10) auf einer Kugel (41) als Träger (Fig. 9) dargestellt. Kunststoffkugeln, beispielsweise aus Polystyrol als sog. Festphase, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunanalytik bekannt sind, mit geeignetem Durchmesser für die Reaktionskammer (10) für das erfindungsgemäße Einwegreaktionsgefäß sind im Vergleich zu Glasgrieß oder Silicagel besonders gut geeignet. Der Durchmesser bzw. die Gestalt der Kugel (41) wird dabei so gewählt, daß stets ein Luft- und Flüssigkeitsdurchtritt durch das Prüfröhrchen gewährleistet wird, und daß beim Einsatz dieser Kugel (41) in die Reaktionskammer nicht auf eine bestimmte Orientierung geachtet werden muß. Beispielhafte Gestaltungsformen der Kugeln (41), die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind in der DE 34 48 006 C2 beschrieben. So kann beispielsweise beim Einsatz von Kugeln mit radial herausragenden Vorsprüngen eine koaxiale Anordnung der Kugeln in dem erfindungsgemäßen zylindrischen Prüfröhrchen erreicht werden. Hat die Kugel ebenfalls axiale und stirnseitige Vorsprünge, so können diese dafür sorgen, daß bei Verwendung eines Prüfröhrchens mit ebenem Boden bzw. erfindungsgemäßer, ebener Halteelemente (15) und/oder Sperrschichten (19), die Kugel in Abstand zu diesen gehalten wird und dadurch den freien Flüssigkeitszugang zu einer möglichst großen, die Immunreaktionszeit verringernden Kontaktfläche der Füllung (11) aufrecht erhalten wird.
Beispiel 2: Herstellung der immunchemischen Füllung (11)
Der Träger (41) der immunchemischen Füllung (11) besteht aus Polystyrolkugeln (Fa. Spherotech, Durchmesser = 4,76 mm). Diese Kugeln werden in einem ersten Schritt (Fig. 9, A) mit anti-Antikörpern (42), in diesem Beispiel anti-Maus-Immunglobulinen (Fa. DAKO, Art.-Nr.: Z 109), beschichtet:
  • - je Kugel wird 0,1 Mikroliter der anti-Maus-Antikörperlösung eingesetzt, d. h.:
    0,12 Mikrogramm Protein/Kugel,
  • - zusätzlich werden je Kugel + Proteinlösung, 150 Mikroliter 0,05 M PBS-Puffer dazugegeben,
  • - Kugeln und Protein-Pufferlösung werden über Nacht bei 37°C inkubiert,
  • - anschließend wird der Überstand abgesaugt bzw. dekantiert; danach werden die Kugeln dreimal mit Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) gewaschen.
Im zweiten Verfahrensschritt (Fig. 9, B) wird die Kugel mit dem für das zu analysierende Aerosol spezifischen monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörper (43), in diesem Beispiel mit monoklonalen anti-DNP-Antikörper #51 beschichtet:
  • - je Kugel wird 1 Mikroliter der anti-DNP-Antikörper #51-Lösung eingesetzt, d. h.: 1 Mikrogramm Protein/Kugel,
  • - zusätzlich werden je Kugel + Proteinlösung, 150 Mikroliter 25 mM Na-Acetatpuffer eingesetzt,
  • - Kugeln und Protein-Pufferlösung werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Mögliche freigebliebene Bindungsstellen werden anschließend mit Mausserum (Fa. Sigma, Art.-Nr.: M5905) abgesättigt:
  • - je Kugel werden 1,5 Mikroliter des Mäuseserums eingesetzt,
  • - Kugeln und Mäuseserum werden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert,
  • - anschließend wird der Überstand abgesaugt bzw. dekantiert; danach werden die Kugeln dreimal mit Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) gewaschen.
Ab diesem Verfahrensschritt können die vorbereiteten, jetzt immunchemisch reaktiven Kugeln bis zur weiteren Verwendung in beispielsweise 0,05 M PBS-Puffer mit 0,1% (w/v) Na-Azid (Fa. Merck, Art.-Nr.: 882 335) bei 4°C, bzw. in Anwesenheit der dem Fachmann bekannten Stabilisatoren, trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.
Im dritten Verfahrensschritt (Fig. 9, C) werden die spezifischen Antikörperbindungsstellen mit den während der eigentlichen Aerosolmessung zu verdrängenden Tracermolekülen (48) abgesättigt. Die beispielhaft gewählten Tracer (48) bestehen aus Dinitrophenyl-Lysin (DNP-L) (44), Biotin (45) und Streptavidin-beta-Galactosidase (46). Zur Kopplung von DNP-L mit Biotin werden:
  • - 3,2 mg NE-2,4-DNP-L-Lysin Hydrochlorid (Fa. Sigma, Art.-Nr.: D-0380) und 4,5 mg Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester (Fa. Sigma, Art-Nr.: B-2643) in 500 Mikroliter Wasser- und Amin-freiem DMF gelöst, und
  • - 25 Mikroliter Pyridin (Fa. Aldrich, Art.-Nr.: 27,097-0, 99%ig) zugefügt,
  • - die Lösung mindestens 18 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert,
  • - mit 500 Mikroliter Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) die Reaktion gestoppt,
  • - die Reaktionsprodukte und Bestandteile mittels Chromatographie über Tris-Acryl GF05 Säulenmaterial (Fa. LKB, Art.-Nr.: 300-2500/810-2204) getrennt, Laufpuffer: 0,05 M PBS-Puffer, pH = 8,0,
  • - der Chromatographieverlauf mittels Photometer verfolgt, das Säuleneluat fraktioniert aufgefangen und anschließend auf die dem Fachmann bekannte Weise spektralphotometrisch und immunchemisch analysiert.
Von dem auf diese Weise hergestellten DNP-L-Biotin-Konjugat (44, 45) werden im nachfolgenden Schritt:
  • - 200 Mikroliter einer 1 : 1000 Verdünnung der immunchemisch aktiven, zusammengefaßten Chromatographiefraktionen, je Kugel, in 0,05 M PBS-Puffer eingesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert,
  • - der verbleibende DNP-L-Biotin-Überschuß danach gründlich durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt,
  • - anschließend erfolgt die Bindung zwischen Antikörper gebundenem "biotiniliertem" Analytderivat (DNP-L-Biotin) und dem Streptavidin-Enzym-Konjugat:
  • - es werden 200 Mikroliter einer 1 : 1000 Verdünnung des Streptavidin-beta-Galactosidase-Konjugats (Fa. Boehringer Mannheim, Art.-Nr.: 1112481, 500U), je Kugel, in 0,05 M PBS-Puffer eingesetzt und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert,
  • - der verbleibende Streptavidin-beta-Galactosidase- Konjugat-Überschuß wird danach gründlich durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt.
Der auf diese Weise aufgebaute Tracer (48) kann nun in der nachfolgenden immunologischen Verdrängungsreaktion aus seiner Bindung mit dem Antikörper (43) durch den spezifischen Analyten (47) verdrängt werden.
Beispiel 3: Immunchemische Reaktion mit Dinitrophenyl-Lysin als Analyt (47)
Die Immunreaktion zum erfindungsgemäßen Nachweis von Schadstoffaerosolen erfolgt nach dem sog. "Verdrängungsprinzip" (Kusterbeck, A.W., Wemhoff, G.A., Charles, P.T., Yeager, D.A., Bredehorst, R., Vogel, C.-W. & Ligler, F.S. (1990): A continuous flow immunoassay for rapid and sensitiv detection of small molecules. J. Imm. Methods 135, pp. 191-197.) Mit diesem Verdrängungs-Immunassay (Displacement-Immunoassay) entfällt ein Mischen der Proben mit dem Tracer (hierunter sollten Analyt oder Analytderivat verstanden werden, woran ein oder mehrere Markierungselemente gebunden sind), wie es bei kompetitiven Assays erforderlich ist, um die Konkurrenz-Reaktion für die begrenzten antigenen Bindeplätze am Träger zu starten. In einem solchen Displacementassay entfallen ebenfalls gesonderte Reagenzgefäße bzw. Reagenzschichten samt zugehöriger Reagenzien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Enzyme mit den entsprechenden Farbsubstraten bevorzugte Markierungselemente (Tracer) für den Schadstoff-Aerosol- Nachweis.
In Fig. 10 sind schematisch die drei wesentlichen Reaktionsschritte während der immunchemischen Reaktion zwischen Analyt (47) und den beteiligten Reagenzien der immunchemischen Füllung (11) in der Reaktionskammer (10) des erfindungsgemäßen Prüfröhrchens dargestellt. Der Ausgangszustand an der Füllung (11) während z. B. der Lagerung des Reaktionsgefäßes und auch noch während der Aerosol-Sammel- und Lösungsphase ist in Abschnitt D der Fig. 10 dargestellt. Dabei sind alle verfügbaren Bindeplätze der auf dem Träger (41) immobilisierten spezifischen Antikörper (43) mit einem Analytderivat in Form eines Enzym-markierten Tracers (48) abgesättigt. Während des Inkontaktbringens der Lösung aus Kammer (6) und/oder Sammelschicht (9) mit der Füllung (11) sowie während der anschließenden definierten Inkubationszeit wird dabei der Tracer (48) durch den Analyten (47) verdrängt (Fig. 10, E). Zur Meßwerterfassung werden die mit einer Markierung versehenen Tracer, die proportional zur Analytkonzentration während der immunchemischen Reaktion freigesetzt wurden, herangezogen (Fig. 10, F).
Im hier beschriebenen Beispiel werden die nach Beispiel 2 hergestellten Kugeln mit DNP-L-Standards, d. h. Lösungen unterschiedlich definierter Konzentrationen (Fa. Sigma, Art.-Nr.: D0380), inkubiert:
  • - 200 Mikroliter der DNP-L-Standardlösung werden je Kugel eingesetzt und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert,
  • - anschließend werden 150 Mikroliter der Reaktionslösung entnommen und in einem weiteren Reaktionsgefäß zusammen mit dem Enzymsubstrat (s. u.) inkubiert.
Auf die Ausführungsform des Einwegreaktionsgefäßes angewandt, bedeutet dies:
  • - die Lösung wird in die körnige Reaktionsschicht (49) des Enzym-Reaktionsbereichs (25) der Prüfröhrchen überführt. Diese Reaktionsschicht enthält als Enzymsubstrat:
    Chlorophenolrot-beta-D-galactopyranosid (CPRG, Fa. Boehringer Mannheim, Art.-Nr.: 884308),
  • - nach einer Inkubationszeit von beispielsweise 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von je 50 Mikrolitern Stopplösung/Kugel abgestoppt.
Für die Ausführungsform des Einwegreaktionsgefäßes als Röhrchen bedeutet dies:
  • - nach einer definierten Reaktionszeit wird z. B. mittels Gasspürpumpe, die mehr oder weniger farbige Flüssigkeit aus der Enzym-Reaktionsschicht (25) in die Meßkammer (12) gesogen. In der Meßkammer (12) befinden sich Enzym-inhibierende Reagenzien (27) beispielsweise in lyophilisierter Form, die nach Rehydratisierung durch die hinzukommende Flüssigkeit die farbgebende Reaktion abstoppen und somit ein für längere Zeit stabilisiertes Meßsignal erzeugen.
Die Auswertung der Messung kann durch Farbvergleich mit einem Farbstandard oder alternativ spektralphotometrisch bei 574 bzw. 578 nm erfolgen.
In Fig. 9 sind schematisch die drei Phasen (A, B und C) des Aufbaus der immunchemisch reaktiven Füllung (11) dargestellt. Als Träger bzw. Festphase (41) für die Immunreaktion werden Kunststoffkugeln beispielsweise aus Polystyrol verwendet, auf/an denen der vorgeformte Immunkomplex für die nachfolgende immunchemische Reaktion aufgebaut wird. Der Komplex besteht aus einem ersten immobilisierten spezifischen anti-Antikörper-Immunglobulin (42) (Fig. 9, A), das selektiv die anti-Analyt-Antikörper (43) bindet (Fig. 9, B). Daran werden anschließend Analytderivate beispielsweise in Form der hier verwendeten Enzym-Konjugat-Tracer selektiv gebunden (Fig. 9, C).
In Fig. 10 sind schematisch die drei erfindungsgemäßen Phasen (D, E, F) während des immunchemischen Nachweises dargestellt. Fig. 10, D stellt den Ausgangszustand dar, in dem ein Analytderivat Tracer (48) an den spezifischen Antikörper (43) gebunden ist. Bei gleich hoher Spezifität, aber unterschiedlicher Affinität von Analyt (47) und Tracer (48) gegenüber der Antikörperbindung, wird der Tracer (48) beim Hinzukommen von Analyt (47) durch diesen aus seiner Antikörperbindung verdrängt (Fig. 10, E) und freigesetzt (Fig. 10, F). Die mit einer Markierung bzw. farbgebenden oder farberzeugendem System verbundenen, freigesetzten Tracer (48) erlauben nun eine direkt proportionale Meßauswertung. Dabei ist das erzeugte Signal/Markierung direkt proportional zur Analytkonzentration in der untersuchten Probe.
Tabelle: Puffer und Reagenzlösungen
A) Enzymsubstratlösung (CPRG-Lösung): 3,29 mM CPRG in 100 m M HEPES (Fa. Biochrom, Art.-Nr.: L1613); 150 mM NaCl (Fa. Sigma, Art.-Nr. S9625); 10 mM MgCl₂ (Fa. Merck, Art.-Nr. 5832); 0,1% (w/v)Na-Azid (Fa. Merck, Art.-Nr. 882335); 1% (w/v) Rinderserumalbumin (Fa. Sigma, Art.-Nr.: A3294); pH = 7,0.
  • B) Abstopplösung: 1 M Galactose (Fa. Sigma, Art.-Nr.: G0750); 0,1 M EDTA (Fa. Merck, Art.-Nr.: 8418) in Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O).
  • C) PBS-Puffer (0,05 M): 87 g di-Kaliumhydrogenphosphat (Fa. Merck, Art.-Nr.: 5104) und 17 g Kalimu-di-hydrogenphosphat (Fa. Merck, Art.-Nr.: 4873) in 900 ml Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) lösen, pH-Wert auf 7,0 einstellen, ad 1000 ml mit Reinstwasser. Anschließend: 1 : 10 in 0,9%iger (w/v) NaCl-Lösung (Fa. Clintec, Art.-Nr.: 45 358) verdünnen.
  • D) Na-Acetat-Puffer (25 mM): 2,05 g Natriumacetat (Fa. Merck, Art.-Nr.: 6268) und 1,5 ml Essigsäure (Fa. Merck, Art.-Nr.: 818755) in 1 Liter Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) lösen.; pH-Wert auf 4,5 einstellen.

Claims (18)

1. Reaktionsgefäß zur Bestimmung von an Aerosolen anhaftenden Schadstoffen in Luftproben, welches in Durchströmungsrichtung angeordnet mindestens eine brechbare mit einer Reagenzlösung gefüllte Ampulle, eine Sammelschicht, eine Reaktionskammer, eine Meßkammer, in der der Schadstoff mittels einer Farbreaktion bestimmt wird, und eine Flüssigkeitssperre enthält, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Sammelschicht (9) und Reaktionskammer (10) sowie zwischen Reaktionskammer (10) und Meßkammer (12) eine den Flüssigkeitstransport behindernde Sperrschicht (18, 19) angeordnet ist, daß die Sammelschicht (9) dafür vorgesehen ist, das Aerosol aus der Prüfluft zurückzuhalten, und die Reagenzlösung (22) dafür vorgesehen ist, den Schadstoff von dem Aerosol zu lösen und in die Reaktionskammer (10) zu transportieren, daß die Reaktionskammer (10) eine an ein Trägermaterial (41) gebundene immunologische Reaktionskomponente (43, 48) als immunochemisch reaktive Füllung (11) enthält, die nach dem Prinzip der immunochemischen Verdrängung spezifisch mit dem als Analyt (47) wirkenden Schadstoff und der Reagenzlösung (22) zu einer Schadstofflösung umgesetzt wird, und daß ein farbgebendes System (46; 23, 38, 40) vorgesehen ist, welches die Schadstofflösung proportional zum Schadstoffgehalt der Luftprobe anfärbt.
2. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktionskomponente aus einem für den Analyten (47) spezifischen Antikörper (43) und einem daran gebundenen Tracer (48) gebildet wird und der Tracer (48) dafür vorgesehen ist, durch den Analyten (47) verdrängt zu werden.
3. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das farbgebende System aus einem ein Enzym (46) enthaltenden Tracer (48) und einem für das Enzym (46) spezifischen farbgebenden Enzym-Substrat (23, 38, 40) aufgebaut ist.
4. Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat in trockener lyophilisierter Form (23) oder als Lösung (40) innerhalb einer Brechampulle (39) in der Meßkammer (12) vorliegt.
5. Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat (23, 38, 40) in einer Enzym-Reaktionskammer (25) aufgenommen ist, die zwischen der Reaktionskammer (10) und der Meßkammer (12) angeordnet ist und zu beiden Kammern (10, 12) hin durch eine den Flüssigkeitstransport behindernde Sperrschicht (19, 24) begrenzt ist.
6. Reaktionsgefäß nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat in trockener Form (38) als Pulver oder Pille vorliegt.
7. Reaktionsgefäß nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat (23) in trockener Form an eine körnige Reaktionsschicht (49) gebunden vorliegt.
8. Reaktionsgefäß nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat als Lösung (40) innerhalb einer Brechampulle (39), die in der Enzym-Reaktionskammer (25) angeordnet ist, vorliegt.
9. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb der Meßkammer (12) Enzym-inhibierende Reagenzien in lyophilisierter Form (27) oder als in einer Brechampulle (36) aufgenommene Lösung (37) vorliegen.
10. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktionskomponente (43, 48) kovalent oder adsorptiv an das Trägermaterial (41) gebunden ist.
11. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an das Trägermaterial (41) ein anti-Antikörper (42) gebunden ist, der dafür vorgesehen ist, die immunologische Reaktionskomponente (43, 48) zu binden.
12. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 1, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial Kunststoffkugeln (41) verwendet werden.
13. Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer aufgebaut ist aus a) einem derivatisierten Analytmolekül (44) oder einer vom Analyt (47) abgeleiteten chemischen Verbindung (44), b) einem Enzym (46) und c) einem die beiden Komponenten (44, 46) verbindenden Biotin-Molekül (45).
14. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperrschichten (18, 19, 24) aus hydrophobiertem Material, bevorzugt Filtermaterial, gebildet sind.
15. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelschicht (9) aus inerten Membranen mit definiertem Porendurchmesser und/oder Quarzglasgewebe gebildet wird.
16. Reaktionsgefäß nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelschicht (9) körnigen Quarz enthält.
17. Reaktionsgefäß nach einer der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zum Abstoppen der Farbreaktion der Schadstofflösung mit dem farbgebenden System (46; 23, 38, 40) ein enzym-inhibierendes Reagenz verwendet wird.
18. Reaktionsgefäß nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das enzym-inhibierende Reagenz eine selektive Substrathemmung bewirkt.
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