DE4326473A1 - Rastermikroskop zur Beobachtung unter einem Winkel zur Beleuchtung - Google Patents

Rastermikroskop zur Beobachtung unter einem Winkel zur Beleuchtung

Info

Publication number
DE4326473A1
DE4326473A1 DE4326473A DE4326473A DE4326473A1 DE 4326473 A1 DE4326473 A1 DE 4326473A1 DE 4326473 A DE4326473 A DE 4326473A DE 4326473 A DE4326473 A DE 4326473A DE 4326473 A1 DE4326473 A1 DE 4326473A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
microscope according
light
lenses
interference
microscope
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE4326473A
Other languages
English (en)
Other versions
DE4326473C2 (de
Inventor
Ernst H K Dr Stelzer
Steffen Lindek
Rainer Pick
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Original Assignee
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL filed Critical Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority to DE9321413U priority Critical patent/DE9321413U1/de
Priority to DE4326473A priority patent/DE4326473C2/de
Publication of DE4326473A1 publication Critical patent/DE4326473A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE4326473C2 publication Critical patent/DE4326473C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements

Description

Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit mindestens einer Lichtquelle, mindestens einem Lichtdetektor und mindestens zwei Objektiven, die mindestens einen, vorzugsweise gemeinsa­ men, Objektpunkt, vorzugsweise gleichzeitig, beleuchten und/oder das von ihm ausgehende Licht sammeln, wobei mindestens zwei der Objektive nicht auf einer gemeinsamen Achse lie­ gen.
Für die genaue dreidimensionale Erfassung eines Punktobjektes oder eines Punktes eines Ob­ jekts mit einem Mikroskop ist die Auflösung entlang aller drei Raumachsen zu verbessern. Die­ ses kann mittels Vergrößerung der Apertur der Objektive oder/und mittels Verkleinerung der Wellenlängen des ein- und/oder ausgehenden Lichts erfolgen. Bisher wurde bei der Entwick­ lung von Mikroskopen besonderer Wert auf die Vergrößerung der Apertur der Objektive ge­ legt. Dadurch wird vor allem die Auflösung senkrecht zu der Beleuchtungsachse, die üblicher­ weise als optische Achse bezeichnet wird, erhöht. Aus der technisch-wissenschaftlichen Litera­ tur sind konfokale Rastermikroskope bekannt, die eine Auflösung entlang der optischen Achse (axiale Auflösung) aufweisen und Bilder mit einer deutlich verbesserten Schärfe erzeugen kön­ nen. Ein Problem ist, daß Objektive maximal 35% der um die optische Achse zentrierten Flä­ che erfassen. Das führt dazu, daß die axiale Auflösung bestenfalls dreimal so schlecht wie die axiale Auflösung ist. Im allgemeinen ist das Verhältnis größer.
Für die zusätzliche Erhöhung der Auflösung in axialer Richtung wurde in der DE-OS 40 40 441 ein doppelkonfokales Rastermikroskop vorgeschlagen, das durch die Verwendung eines zweiten Objektivs auf der anderen Seite der Objektebene gekennzeichnet ist, wobei beide Ob­ jektive einen gemeinsamen Objektpunkt gleichzeitig beleuchten und/oder das von ihm ausge­ hende Licht detektieren. Wird das Objekt über die beiden Objektive kohärent beleuchtet, so wird das Beobachtungsvolumen durch Interferenz längs der optischen Achse reduziert. Zwei Probleme dieser Methode sind: a) Die Phasendifferenz im gemeinsamen geometrischen Fokus der Objektive ist a priori nicht zu bestimmen, so daß die Lichtverteilung zunächst unbekannt ist. Vorteilhafterweise muß die Phasendifferenz ein ganzzahliges Vielfaches von 2π sein, so daß die Interferenz konstruktiv ist. b) Im vorteilhaften Fall der konstruktiven Interferenz im geometrischen Fokus treten neben dem schmalen Hauptmaximum weitere axiale Nebenmaxima auf, so daß außer dem abzubildenden Punkt im geometrischen Fokus noch andere Punkte er­ heblich zu dem Signal des doppelkonfokalen Rastermikroskops beitragen. Aus diesen Gründen führt das doppelkonfokale Rastermikroskop zunächst nicht zu Bildern mit einer höheren Auf­ lösung.
Diese bekannten Rastermikroskope definieren eine Objektebene und unterscheiden dadurch von dem erfindungsgemäßen Rastermikroskop. Sie sind nicht dazu geeignet, Licht, das senk­ recht zur Beleuchtungsrichtung von dem abzubildenden Objektpunkt ausgeht, zu detektieren. Des weiteren unterscheiden sie sich durch die Definition einer optischen Achse und besitzen (im Fall des doppelkonfokalen Rastermikroskops) vorzugsweise zwei Objektive, die gegenein­ ander gerichtet und zu dieser optischen Achse und zueinander zentriert sind.
Das doppelkonfokale Rastermikroskop dient im Gegensatz zu dem erfindungsgemäßen Ra­ stermikroskop zur Verbesserung der Auflösung allein mittels Interferenz. Die tatsächliche Ver­ besserung der Auflösung hängt dabei von der Lösung der beiden oben genannten Probleme ab.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Rastermikroskop vorzuschlagen, dessen Auflösung entlang aller drei Raumachsen in etwa gleich ist und das Be­ obachtungsvolumen kleiner als in den bekannten Rastermikroskopen ist. Die Aufgabe ist es, das Ziel auch zu erreichen, ohne daß die Phasendifferenz des Beleuchtungs- und des Detekti­ onslichts bekannt sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bei einem Rastermikroskop der ein­ gangs genannten Art mindestens zwei Objektive derart angeordnet sind, daß sie mindestens einen Objektpunkt gleichzeitig beleuchten und/oder das von ihm ausgehende Licht sammeln, wobei mindestens zwei der Objektive nicht auf einer gemeinsamen Achse liegen.
Zusätzlich können wie bei einem doppelkonfokalen Rasterlichtmikroskop Interferenzverände­ rungsmittel derart angeordnet sein, daß Licht, das ganz oder teilweise durch eines der Objek­ tive hindurchgegangen ist, mit Licht, das ganz oder teilweise durch eines der anderen Objektive hindurchgegangen ist, am Objekt und/oder an mindestens einem der Lichtdetektoren kohärent oder teilweise kohärent überlagert wird, so daß es interferiert und eine gezielte Beeinflussung der Interferenzmuster durch Interferenzveränderungsmittel möglich ist.
Vorzugsweise sind zwei Objektive so angeordnet, daß sie auf denselben Objektpunkt fokus­ siert sind und ihre Achsen senkrecht aufeinander stehen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind drei Objektive so angeordnet, daß sie auf denselben Objektpunkt fokussiert sind und die Achsen zweier Objektive senkrecht auf­ einander stehen, während die Achse des dritten Objektivs auf der Achse eines der beiden ande­ ren Objektive liegt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind drei Objektive so angeordnet, daß ihre Achsen paarweise senkrecht aufeinander stehen.
Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen sind vier, fünf oder sechs Objektive so auf einer Kugeloberfläche um den gemeinsamen geometrischen Fokus und/oder den abzubildenden Punkt angeordnet, daß ihre Achsen beliebige Winkel zueinander einnehmen.
Gemäß weiterer besonders bevorzugter Ausführungsformen sind vier, fünf oder sechs Objek­ tive senkrecht zu den Flächen eines Würfels angeordnet, in dessen Mitte der gemeinsame geo­ metrische Fokus und/oder der abzubildende Objektpunkt liegt.
Vorteilhafterweise haben die Objektive die gleiche numerische Apertur oder auch verschie­ dene.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich in mindestens einer der Ebenen, die zu den Fokalebenen der Objektive optisch konjugiert sind, mindestens eine Blende. Eine Blende wird insbesondere dann vorgesehen, wenn sich die optisch zur Fokalebene konju­ gierte Ebene vor einem Lichtdetektor befindet, der das durch die Blende gegangene Licht re­ gistriert, und/oder wenn diese Blende im Beleuchtungsstrahl zur Formung der Lichtquelle dient. Diese Blende ist üblicherweise eine Lochblende.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Interferenz bei der Überlagerung der Beleuchtungslichtstrahlen und/oder bei der Überlagerung der Detektionslichtstrahlen zur Verbesserung der Auflösung ausgenutzt. Dabei wird Licht, das ganz oder teilweise durch eines der Objektive hindurchgegangen ist, mit Licht, das ganz oder teilweise durch eines der anderen Objektive hindurchgegangen ist, am Objekt und/oder an mindestens einem der Lichtdetektoren kohärent oder teilweise kohärent überlagert, so daß es interferiert und eine gezielte Beeinflus­ sung der Interferenzmuster durch Interferenzveränderungsmittel möglich ist. Hierbei können die Objektive, durch die die interferierenden Lichtstrahlen gehen, auf der gleichen Achse liegen oder auf Achsen, die einen Winkel bilden, der kleiner als π ist, liegen. Der Begriff der Objekt­ ebene verliert in diesem Aufbau seine übliche Bedeutung.
Vorteilhafterweise verändern die Interferenzveränderungsmittel die Interferenzmuster schnell oder auch langsam. Insbesondere verändert eine Kompensationsvorrichtung die Phasendiffe­ renz zwischen den Lichtstrahlen, die durch eines der Objektive hindurchgehen, und den Licht­ strahlen, die durch ein anderes der Objektive hindurchgehen, schnell oder auch langsam.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Veränderung der In­ terferenzmuster periodisch durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Rastermikroskop kann ein Fluoreszenzmikroskop sein. Durch geeignete optisch aktive Elemente kann die Interferenz von Strahlen, die durch verschiedene Objektive fallen, bewirkt oder verhindert werden. Das erfindungsgemäße Rastermikroskop kann aber auch ein Mikroskop sein, das mit Streulicht arbeitet. Bei der Beobachtung von Streulicht kön­ nen geeignete Polarisationsfilter in die Strahlengänge eingeführt werden. Geeignete optische Elemente sind beispielsweise Polarisatoren, spektrale Filter und optisch aktive Elemente, die die Polarisationsrichtung des Lichtes verändern.
Als Lichtquellen sind alle Quellen geeignet, die eine ausreichende Intensität zur Verfügung stellen. Vorteilhafterweise handelt es sich um Punktlichtquellen bzw. Quellen, die sich auf ei­ nen Punkt fokussieren lassen. Vorteilhafterweise wird bei Fluoreszenzmikroskopie ein gepul­ ster oder auch nicht-gepulster Laser eingesetzt, der die Zwei- und/oder Mehrphotonenabsorp­ tion ermöglicht.
Die Umlenkung der Lichtstrahlen in dem Mikroskop findet über geeignete Umlenkelemente statt. Dies sind beispielsweise Spiegel, dichroitische Spiegel, Strahlteiler oder optische Fasern. Vorteilhafterweise entfällt in der Fluoreszenzmikroskopie bei der Detektion senkrecht zu der Beleuchtungsrichtung die Verwendung von dichroitischen Spiegeln im Detektionslichtpfad.
Als Lichtdetektoren sind Photomultiplier gut geeignet, aber auch Detektoren mit räumlicher Auflösung und auch andere Empfänger, die Lichtsignale in elektrische Signale bzw. in elek­ trisch auswertbare Signale umwandeln.
Die Erfindung wird nun anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Eine Darstellung des Prinzips der Beobachtung unter einem Winkel zur Beleuchtung.
Fig. 2 Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer besonders bevorzugten Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops.
Fig. 3 Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer weiteren besonders bevorzug­ ten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops.
Fig. 1a stellt die Anordnung der Objektive und die Beobachtungsvolumina für eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops dar, bei dem zwei Objektive 2 und 4, deren Achsen senkrecht aufeinander stehen, um den Objektpunkt 3 angeordnet sind.
Fig. 1b stellt die Anordnung der Objektive und die Beobachtungsvolumina für eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops dar, bei dem drei Objektive 2, 4 und 17, von denen zwei (2 und 4) senkrecht aufeinander stehen und das dritte Objektiv 17 auf einer gemeinsamen Achse mit einem der ersten beiden Objektive 2 liegt, um den Objektpunkt 3 angeordnet sind.
Links ist jeweils angegeben, wie die Objektive um den Objektpunkt 3 angeordnet sind. Die Pfeile deuten die Lichtwege 1 und 5 an. In Fig. 1b erfolgt demgemäß die Beleuchtung über zwei gegenüberstehende Objektive 2 und 17. Die beiden Teilbeleuchtungsstrahlen sind hierbei kohärent und die Phasendifferenz ist so eingestellt, daß sie im geometrischen Fokus konstruk­ tiv interferieren.
Die zweite Graphik gibt jeweils das Beleuchtungsvolumen 18 bzw. 22, das längs der Beleuch­ tungsachse ausgedehnt ist, und die dritte Graphik das Detektionsvolumen 19 bzw. 23, das längs der Detektionsachse ausgedehnt ist, wieder. Die vierte Graphik stellt jeweils die Überla­ gerung des Beleuchtungs- und des Detektionsvolumens 20 bzw. 24 dar. Rechts wird schließ­ lich jeweils das resultierende Beobachtungsvolumen 21 bzw. 25 der Ausführungsform des er­ findungsgemäßen Mikroskops dargestellt. Je kleiner das Volumen des Ellipsoids ist, desto bes­ ser ist die Auflösung des Mikroskops.
Wie in Fig. 2 dargestellt wird das Licht der Lichtquelle, die vorteilhafterweise ein Laser ist, koilimiert. Das Licht des Beleuchtungsstrahls 1 fällt auf das Objektiv 2, das es auf den abzubil­ denden Punkt im Objekt 3 fokussiert. Ein zweites Objektiv 4 ist so angeordnet, daß es vor­ zugsweise auf den gleichen Punkt 3 fokussiert ist, aber nicht auf einer gemeinsamen Achse mit dem Objektiv 2 liegt. Das Objektiv 4 erfaßt das von dem abzubildenden Punkt 3 ausgehende Licht. Dieses Licht 5 wird über die Linse 6 in die Lochblende 7 fokussiert. Der Lichtdetektor 8 mißt vorzugsweise die Intensität des durch die Lochblende 7 gelangten Lichts. In dem Licht­ weg können auch Spiegel und/oder andere Umlenkelemente angeordnet sein.
Das Beleuchtungslicht wird durch das Objektiv 2 fokussiert. Die Intensitätsverteilung im Fo­ kalbereich des Objektivs 2 wird durch die Beleuchtungs-Punktverschmierungsfunktion (B- PVF) |hbel(x,y,z)|² beschrieben. Die B-PVF ist die Punktverschmierungsfunktion (PVF) eines konventionellen und die B-PVF eines konfokalen Mikroskops. Die Wahrscheinlichkeit, mit der das von dem Fokalbereich ausgehende Licht durch das Objektiv 4 detektiert wird, beschreibt die Detektions-Punktverschmierungsfunktion (D-PVF) |hdet(x,y,z)|₂. Die PVF eines konfokalen Mikroskops und also auch des erfindungsgemäßen Mikroskops ergibt sich aus dem Produkt der B-PVF und der D-PVF. Die räumliche Begrenzung der PVF ist ein Maß für die Auflösung des Mikroskops. Durch die Drehung der D-PVF gegen die B-PVF um einen Winkel, der kleiner oder größer als π ist, wird die B-PVF mit einer D-PVF multipliziert, die eine wesentlich geringere Ausdehnung längs der Beleuchtungsachse hat. Die Beleuchtungs­ achse ist die Achse des Objektivs 2, das zur Beleuchtung verwendet wird. Dadurch wird die Ausdehnung der PVF längs dieser Achse deutlich geringer als bei den bisher bekannten konfo­ kalen Mikroskopen. Die Ausdehnung längs der Achse des Objektivs 4 nimmt nur wenig zu, so daß insgesamt das Volumen der PVF des Mikroskops abnimmt und auch insgesamt eine Auflö­ sungsverbesserung eintritt.
Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops besitzt die höchste Auflösung, die ein Fernfeld-Lichtmikroskop mit zwei Objektiven ohne die Benutzung von Interferenz haben kann. Durch die Unabhängigkeit von einem Interferenzmuster ist das erfindungsgemäße Mi­ kroskop nicht mit der Problematik der Phasendifferenz behaftet. Der Begriff der Objektebene verliert in diesem Aufbau seine herkömmliche Bedeutung.
Falls Objektrasterung durchgeführt wird, befindet sich das Objekt auf einem - hier nicht einge­ zeichneten - Tisch, der die vorteilhafterweise beliebige Translation und/oder Rotation des Ob­ jekts erlaubt. Falls Strahlrasterung vorgesehen ist, ist eine - hier nicht eingezeichnete - Raster­ einheit in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet, die den Beleuchtungspunkt durch das Objekt bewegt. Gleichzeitig muß auch der Detektionspunkt verändert werden, so daß Beleuch­ tungs- und Detektionspunkt im Objekt unter kontrollierten Bedingungen verändert werden.
In Fig. 3 ist die schematische Darstellung einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops dargestellt, das die Interferenz der Beleuchtungslicht­ strahlen im abzubildenden Objektpunkt zur Verbesserung der Auflösung ausnutzt.
Das Licht 1 wird von dem Strahlteiler 9 in zwei zueinander kohärente Lichtstrahlen aufgespal­ ten. Der nach oben abgespaltene Teil des Lichts wird mit Hilfe von Spiegeln 13 und 14 oder anderen Umlenkelementen auf das Objektiv 2 gelenkt. Der nach unten abgespaltene Teil des Lichts wird mit Hilfe von Spiegeln 10, 11 und 12 oder anderen Umlenkelementen auf das Ob­ jektiv 17 gelenkt. Das Objektiv 2 fokussiert das auf es treffende Licht auf den abzubildenden Punkt 3 in dem Objekt. Das zweite Objektiv 17 ist vorzugsweise so angeordnet, daß es auf derselben Achse liegt wie das erste Objektiv 2 und vorzugsweise auf den gleichen Punkt 3 fo­ kussiert ist. Ein drittes Objektiv 4 ist so angeordnet, daß es auf den gleichen Punkt 3 wie die beiden Objektive 2 und 17 fokussiert ist, aber nicht auf einer gemeinsamen Achse mit den bei­ den Objektiven liegt. Dieses Objektiv 4 sammelt das von dem abzubildenden Punkt 3 ausge­ hende Licht. Dieses Licht 5 wird über die Linse 6 in die Lochblende 7 gelenkt. Der Lichtdetek­ tor 8 mißt das Signal des durch die Lochblende 7 gelangten Lichts. In beiden Teilbeleuch­ tungsstrahlengängen sind Kompensationsvorrichtungen 15 und 16 angeordnet, die zur Verän­ derung der Phasendifferenz zwischen den oberen und unteren Teilstrahlen dienen und die Inter­ ferenz der Teilstrahlen im Objekt gewährleisten.
Die räumliche Kohärenz der Beleuchtung ist durch die geeignete Wahl der Lichtquelle gewähr­ leistet. Im Fokalbereich interferieren die Teilbeleuchtungsstrahlen zu einer B-PVF |h4Pi(x,y,z)|², die räumlich stärker begrenzt ist, als die B-PVF in einem herkömmlichen Mi­ kroskop. Ist die Phasendifferenz zwischen den beiden Beleuchtungsteilstrahlen im Objektpunkt 3 gleich null oder ein ganzzahliges Vielfaches von 2π, so ist die Interferenz konstruktiv und die B-PVF hat ein Maximum im Objektpunkt 3. Die B-PVF weist aber mehrere Nebenmaxima längs der Beleuchtungsachse auf, die die Auflösung herabsetzen. Das erste Intensitätsmaximum von | h4Pi(x,y,z)|² liegt etwa eine halbe Wellenlänge vom absoluten Intensitätsmaximum im Brennpunkt entfernt. Diese Nebenmaxima werden aber nun durch eine Detektion unter einem Winkel von vorteilhafterweise π/2 effektiv unterdrückt, da die Ausdehnung der D-PVF längs der Beleuchtungsachse sehr klein ist. Dadurch hat die PVF des erfindungsgemäßen Mi­ kroskops eine axiale Ausdehnung, die im wesentlichen durch die des Hauptmaximums der B- PVF |h4Pi(x,y,z)² bestimmt wird. Dies bedeutet, daß die Auflösung im erfindungsgemäßen Mikroskop substantiell verbessert wird.
Bezugszeichenliste
Zeichnung zur Zusammenfassung und Zeichnung 2
1 Beleuchtungsstrahl
2 Beleuchtungsobjektiv
3 Objektpunkt
4 Detektionsobjektiv
5 Detektionsstrahl
6 Linse
7 Blende
8 Lichtdetektor
Zeichnung 1
a) Ausführungsform mit zwei Objektiven
b) Ausführungsform mit drei Objektiven
Jeweils von links nach rechts:
Anordnung der Objektive; Beleuchtungsvolumen; Detektionsvolumen; Überlagerung von Beleuchtungs- und Detektionsvolumen; resultierendes Volumen
Zeichnung 3
1 Beleuchtungsstrahl
2 Beleuchtungsobjektiv
3 Objektpunkt
4 Detektionsobjektiv
5 Detektionsstrahl
6 Linse
7 Blende
8 Lichtdetektor
9 Strahlteiler
10-14 Spiegel
15, 16 Interferenzveränderungsmittel
17 Beleuchtungsobjektiv.

Claims (23)

1. Mikroskop mit mindestens einer Lichtquelle, mindestens einem Lichtdetektor und minde­ stens zwei Objektiven, die mindestens einen Objektpunkt beleuchten und/oder das von ihm ausgehende Licht sammeln, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der Objektive nicht auf einer gemeinsamen Achse liegen.
2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Objektive mindestens einen Objektpunkt gleichzeitig beleuchten und/oder das von ihm ausgehende Licht sammeln.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Objektive mindestens einen gemeinsamen Objektpunkt beleuchten und/oder das von ihm ausgehende Licht sammeln.
4. Mikroskop nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Interferenzveränderungsmittel derart angeordnet sind, daß Licht, das ganz oder teilweise durch eines der Objektive hindurchgegangen ist, mit Licht, das ganz oder teilweise durch ein anderes der Objektive hindurchgegangen ist, am Objekt und/oder an mindestens einem der Detektoren kohärent oder teilweise kohärent überlagert wird, so daß es interferiert und eine gezielte Beeinflussung der Interferenzen möglich ist.
5. Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß an dem abzubildenden Objekt­ punkt und/oder an mindestens einem der Lichtdetektoren zumindest zeitweise konstruktive Interferenz auftritt.
6. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Objektive so angeordnet sind, daß sie auf denselben Objektpunkt fokussiert sind und ihre Achsen senkrecht aufeinander stehen.
7. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der mindestens drei Objektive eine gemeinsame Achse haben.
8. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß drei Objektive so angeordnet sind, daß ihre Achsen paarweise senkrecht aufeinander stehen.
9. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß drei, vier, fünf oder sechs Objektive so auf einer Kugeloberfläche um den gemeinsamen geo­ metrischen Fokus und/oder den abzubildenden Punkt angeordnet sind, daß ihre Achsen belie­ bige Winkel zueinander einnehmen.
10. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vier, fünf oder sechs Objektive senkrecht zu den Flächen eines Würfels angeordnet sind, in dessen Mitte der gemeinsame geometrische Fokus und/oder der abzubildende Objektpunkt liegt.
11. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Objektive die gleiche numerische Apertur oder auch verschiedene numerische Apertu­ ren haben.
12. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich in mindestens einer Ebene, die zu einer der Fokalebenen der Objektive optisch konju­ giert ist, mindestens eine Blende befindet.
13. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferenzveränderungsmittel an dem abzubildendem Objektpunkt und/oder an min­ destens einem der Detektoren eine Überlagerung kohärenter oder teilweise kohärenter Licht­ strahlen ermöglicht, die jeweils durch verschiedene Objektive getreten sind.
14. Mikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kompensationsvorrich­ tung an dem abzubildendem Objektpunkt und/oder an mindestens einem der Detektoren zu­ mindest zeitweise konstruktive Interferenz der Lichtstrahlen hervorruft.
15. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der Interferenzen durch die Interferenzveränderungsmittel schnell oder auch langsam durchgeführt wird.
16. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der Interferenzen periodisch durchgeführt wird.
17. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalauswertung zumindest teilweise mit einem Computer erfolgt.
18. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Anordnung von optischen Elementen zur Veränderung der Amplitude und/oder der Polarisation und/oder des Frequenzbereichs und/oder anderer Eigenschaften des Lichts in den Beleuchtungs- und/oder den Detektionsstrahlengängen vorgesehen sind.
19. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fluoreszenzmikroskop oder als Mikroskop zur Beobachtung von Streu- oder Refle­ xionslichts verwendet wird.
20. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtquelle eingesetzt wird, die Mehrphotonenabsorption ermöglicht, insbesondere ein Laser, der Zweiphotonenabsorption ermöglicht.
21. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu einer der Fokalebenen konjugierten Blenden entfernt und/oder ausgetauscht und/oder in ihrer Öffnung variiert und/oder parallel und/oder senkrecht zu dem Lichtweg ver­ schoben werden können.
22. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungs- und/oder Detektionslicht durch optische Fasern gelenkt wird.
23. Mikroskop nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich optische Elemente mit mindestens einem Lichtdetektor angeordnet sind, insbe­ sondere um zusätzliche Bilder, beispielsweise mit doppelkonfokaler oder herkömmlich konfo­ kaler oder konventioneller Auflösung zu erhalten.
DE4326473A 1993-08-06 1993-08-06 Konfokales Mikroskop Expired - Lifetime DE4326473C2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE9321413U DE9321413U1 (de) 1993-08-06 1993-08-06 Mikroskop
DE4326473A DE4326473C2 (de) 1993-08-06 1993-08-06 Konfokales Mikroskop

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4326473A DE4326473C2 (de) 1993-08-06 1993-08-06 Konfokales Mikroskop

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE4326473A1 true DE4326473A1 (de) 1995-02-09
DE4326473C2 DE4326473C2 (de) 1997-05-15

Family

ID=6494624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4326473A Expired - Lifetime DE4326473C2 (de) 1993-08-06 1993-08-06 Konfokales Mikroskop

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE4326473C2 (de)

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998003892A1 (de) * 1996-07-23 1998-01-29 Carl Zeiss Jena Gmbh Konfokales mikroskop mit einem doppelobjektiv-system
DE19632040A1 (de) * 1996-08-08 1998-02-19 Europ Lab Molekularbiolog Strahlumlenkeinheit zur mehrachsigen Untersuchung in einem Mikroskop, insbesondere Rasterlichtmikroskop
WO2000052512A1 (de) * 1999-03-02 2000-09-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenscaften E.V. Verfahren und vorrichtung zur objektabbildung
EP1130439A2 (de) * 2000-03-03 2001-09-05 Leica Microsystems Heidelberg GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung eines transparenten Objekts
US6351325B1 (en) 2000-07-28 2002-02-26 Optical Biopsy Technologies, Inc. Fiber-coupled, angled-dual-axis confocal scanning microscopes for imaging in a scattering medium
US6414779B1 (en) 2000-11-30 2002-07-02 Opeical Biopsy Technologies, Inc. Integrated angled-dual-axis confocal scanning endoscopes
US6423956B1 (en) 2000-07-28 2002-07-23 Optical Biopsy Technologies Fiber-coupled, high-speed, integrated, angled-dual-axis confocal scanning microscopes employing vertical cross-section scanning
US6441356B1 (en) 2000-07-28 2002-08-27 Optical Biopsy Technologies Fiber-coupled, high-speed, angled-dual-axis optical coherence scanning microscopes
EP1777571A3 (de) * 2005-10-21 2007-05-23 Olympus Corporation Mikroskopuntersuchungsgerät und Mikroskopuntersuchungsverfahren
DE19830596B4 (de) * 1997-07-10 2008-08-21 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Wellenfeldmikroskop, Wellenfeldmikroskopieverfahren, auch zur DNA-Sequenzierung, und Kalibrierverfahren für die Wellenfeldmikroskopie
WO2008146226A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Koninklijke Philips Electronics N.V. Sample holder for an optical device
US7554725B2 (en) * 2002-12-09 2009-06-30 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie (Embl) Microscope with a viewing direction perpendicular to the illumination direction
EP2163935A1 (de) 2008-09-16 2010-03-17 Yokogawa Electric Corporation Mikroskopvorrichtung
US7790353B2 (en) * 2000-06-15 2010-09-07 3M Innovative Properties Company Multidirectional photoreactive absorption method
DE102010063412A1 (de) 2010-12-17 2012-06-21 Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover Technik zur tomographischen Bilderfassung
EP2801855A1 (de) * 2013-05-10 2014-11-12 European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Mikroskopmodul zur Abbildung einer Probe
WO2016156092A1 (de) * 2015-03-27 2016-10-06 Laser-Laboratorium Göttingen e.V. Verfahren zum lokalisieren wenigstens eines emitters mittels eines lokalisationsmikroskops

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19834279C2 (de) * 1998-07-30 2002-09-26 Europ Lab Molekularbiolog Kompaktes Einzelobjektiv Theta-Mikroskop
DE19851240C1 (de) * 1998-11-06 2000-03-02 Europ Lab Molekularbiolog Fluoreszenzmikroskop mit Mehrphotonenanregung
JP4786858B2 (ja) 2000-06-15 2011-10-05 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 封入光学素子を提供するための多光子硬化

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4350892A (en) * 1980-07-31 1982-09-21 Research Corporation X'-, Y'-, Z'- axis multidimensional slit-scan flow system
DE3417075A1 (de) * 1984-05-09 1985-11-14 Peter 3300 Braunschweig Stuht Mikroskop mit beleuchtungseinrichtung fuer auflichtuntersuchungen
DE3906555A1 (de) * 1989-03-02 1989-07-06 Zeiss Carl Fa Auflicht-objektbeleuchtungseinrichtung
JPH01277812A (ja) * 1988-04-30 1989-11-08 Laser Tec Kk 顕微鏡装置
DE4040441A1 (de) * 1990-12-18 1992-07-02 Hell Stefan Doppelkonfokales rastermikroskop
JPH05164970A (ja) * 1991-12-18 1993-06-29 Res Dev Corp Of Japan 高分解能顕微鏡

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4350892A (en) * 1980-07-31 1982-09-21 Research Corporation X'-, Y'-, Z'- axis multidimensional slit-scan flow system
DE3417075A1 (de) * 1984-05-09 1985-11-14 Peter 3300 Braunschweig Stuht Mikroskop mit beleuchtungseinrichtung fuer auflichtuntersuchungen
JPH01277812A (ja) * 1988-04-30 1989-11-08 Laser Tec Kk 顕微鏡装置
DE3906555A1 (de) * 1989-03-02 1989-07-06 Zeiss Carl Fa Auflicht-objektbeleuchtungseinrichtung
DE4040441A1 (de) * 1990-12-18 1992-07-02 Hell Stefan Doppelkonfokales rastermikroskop
JPH05164970A (ja) * 1991-12-18 1993-06-29 Res Dev Corp Of Japan 高分解能顕微鏡

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JP 1-277812 A. In: Patents Abstracts of Japan, P-997, Jan. 29, 1990, Vol. 14, No. 48 *

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19629725C2 (de) * 1996-07-23 1998-09-17 Europ Lab Molekularbiolog Doppelobjektiv-System für ein Mikroskop, insbesondere Rastermikroskop
DE19629725A1 (de) * 1996-07-23 1998-02-05 Europ Lab Molekularbiolog Doppelobjektiv-System für ein Mikroskop, insbesondere Rastermikroskop
WO1998003892A1 (de) * 1996-07-23 1998-01-29 Carl Zeiss Jena Gmbh Konfokales mikroskop mit einem doppelobjektiv-system
US5969854A (en) * 1996-07-23 1999-10-19 Carl Zeiss Jena Gmbh Confocal microscope with double-objective system
DE19632040C2 (de) * 1996-08-08 1999-11-18 Europ Lab Molekularbiolog Konfokales Mikroskop
WO1998007059A1 (de) * 1996-08-08 1998-02-19 Carl Zeiss Jena Gmbh Strahlumlenkeinheit zur mehrachsigen untersuchung in einem mikroskop
US6064518A (en) * 1996-08-08 2000-05-16 Carl Zeiss Jena Gmbh Beam deflecting unit for multiple-axis examination in a microscope
DE19632040A1 (de) * 1996-08-08 1998-02-19 Europ Lab Molekularbiolog Strahlumlenkeinheit zur mehrachsigen Untersuchung in einem Mikroskop, insbesondere Rasterlichtmikroskop
DE19830596B4 (de) * 1997-07-10 2008-08-21 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Wellenfeldmikroskop, Wellenfeldmikroskopieverfahren, auch zur DNA-Sequenzierung, und Kalibrierverfahren für die Wellenfeldmikroskopie
WO2000052512A1 (de) * 1999-03-02 2000-09-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenscaften E.V. Verfahren und vorrichtung zur objektabbildung
US6909105B1 (en) 1999-03-02 2005-06-21 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Method and device for representing an object
EP1130439A3 (de) * 2000-03-03 2003-10-29 Leica Microsystems Heidelberg GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung eines transparenten Objekts
EP1130439A2 (de) * 2000-03-03 2001-09-05 Leica Microsystems Heidelberg GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung eines transparenten Objekts
US7790353B2 (en) * 2000-06-15 2010-09-07 3M Innovative Properties Company Multidirectional photoreactive absorption method
US6351325B1 (en) 2000-07-28 2002-02-26 Optical Biopsy Technologies, Inc. Fiber-coupled, angled-dual-axis confocal scanning microscopes for imaging in a scattering medium
US6423956B1 (en) 2000-07-28 2002-07-23 Optical Biopsy Technologies Fiber-coupled, high-speed, integrated, angled-dual-axis confocal scanning microscopes employing vertical cross-section scanning
US6710316B2 (en) 2000-07-28 2004-03-23 Optical Biopsy Technologies, Inc. Fiber-coupled, high-speed, angled-dual-axis optical coherence scanning microscopes
US6713742B2 (en) 2000-07-28 2004-03-30 Optical Biopsy Technologies, Inc. Fiber-coupled, high-speed, integrated, angled-dual-axis confocal scanning microscopes employing vertical cross-section scanning
US6441356B1 (en) 2000-07-28 2002-08-27 Optical Biopsy Technologies Fiber-coupled, high-speed, angled-dual-axis optical coherence scanning microscopes
US6414779B1 (en) 2000-11-30 2002-07-02 Opeical Biopsy Technologies, Inc. Integrated angled-dual-axis confocal scanning endoscopes
US6522444B2 (en) 2000-11-30 2003-02-18 Optical Biopsy Technologies, Inc. Integrated angled-dual-axis confocal scanning endoscopes
US7554725B2 (en) * 2002-12-09 2009-06-30 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie (Embl) Microscope with a viewing direction perpendicular to the illumination direction
EP2273300A2 (de) 2002-12-09 2011-01-12 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Mikroskop mit Beobachtungsrichtung senkrecht zur Beleuchtungsrichtung
US11042015B2 (en) 2002-12-09 2021-06-22 European Molecular Biology Laboratory Single plane illumination microscope
US9857577B2 (en) 2002-12-09 2018-01-02 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Microscope with a viewing direction perpendicular to the illumination direction
US9823455B2 (en) 2002-12-09 2017-11-21 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie (Embl) Single plane illumination microscope
EP1777571A3 (de) * 2005-10-21 2007-05-23 Olympus Corporation Mikroskopuntersuchungsgerät und Mikroskopuntersuchungsverfahren
WO2008146226A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Koninklijke Philips Electronics N.V. Sample holder for an optical device
EP2163935A1 (de) 2008-09-16 2010-03-17 Yokogawa Electric Corporation Mikroskopvorrichtung
US9116353B2 (en) 2008-09-16 2015-08-25 Yokogawa Electric Corporation Microscope device
WO2012080478A1 (de) 2010-12-17 2012-06-21 Laser Zentrum Hannover E.V. Technik zur tomographischen bilderfassung
US9250061B2 (en) 2010-12-17 2016-02-02 Laser Zentrum Hannover E.V. Technique for tomographic image recording
DE102010063412B4 (de) * 2010-12-17 2013-06-06 Laser Zentrum Hannover E.V. Technik zur tomographischen Bilderfassung
DE102010063412A1 (de) 2010-12-17 2012-06-21 Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover Technik zur tomographischen Bilderfassung
WO2014180884A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 European Molecular Biology Laboratory A microscope module for imaging a sample
EP2801855A1 (de) * 2013-05-10 2014-11-12 European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Mikroskopmodul zur Abbildung einer Probe
US9946057B2 (en) 2013-05-10 2018-04-17 European Molecular Biology Laboratory Microscope module for a microscope arrangement for imaging a sample
EP3605183A1 (de) * 2013-05-10 2020-02-05 European Molecular Biology Laboratory Mikroskop für die spim mikroskopie
US10656404B2 (en) 2013-05-10 2020-05-19 European Molecular Biology Laboratory Microscope module for a microscope arrangement for imaging a sample
WO2016156092A1 (de) * 2015-03-27 2016-10-06 Laser-Laboratorium Göttingen e.V. Verfahren zum lokalisieren wenigstens eines emitters mittels eines lokalisationsmikroskops

Also Published As

Publication number Publication date
DE4326473C2 (de) 1997-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE4326473A1 (de) Rastermikroskop zur Beobachtung unter einem Winkel zur Beleuchtung
DE10004191B4 (de) Fluoreszenz-Scanmikroskop
DE102013001238B4 (de) Lichtmikroskop und Mikroskopieverfahren
EP0866993B1 (de) Konfokales mikroskop mit einem doppelobjektiv-system
DE102011055294B4 (de) Mikroskopische Einrichtung und Verfahren zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten in einer Probe
DE60320369T2 (de) Abbildungsvorrichtung für mikroscopie und bilderzeugungsverfahren
WO1998028775A2 (de) Rastermikroskop, bei dem eine probe in mehreren probenpunkten gleichzeitig optisch angeregt wird
DE4040441A1 (de) Doppelkonfokales rastermikroskop
DE10257237A1 (de) Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/oder rückgestreuter Lichtstrahlung
EP2350618A2 (de) Fluoreszenzmikroskop mit phasenmaske
EP1359452B1 (de) Konfokales Mikroskop mit zwei Mikrolinsenarrays und einem Lochblendenarray
DE2852203B2 (de) Lichtleiteinrichtung für eine mit Auflicht betriebene Abbildungsvorrichtung
EP3948392B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum erfassen von verlagerungen einer probe gegenüber einem objektiv
DE19632040C2 (de) Konfokales Mikroskop
EP1128200A2 (de) Mikroskop-Aufbau
DE102012007045A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Mikroskopie
DE10118463A1 (de) Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe
DE19511937C2 (de) Konfokales Auflichtmikroskop
WO2017174792A1 (de) Verfahren und mikroskop zum untersuchen einer probe
DE19851240C1 (de) Fluoreszenzmikroskop mit Mehrphotonenanregung
WO2020127647A1 (de) Fluoreszenzlichtmikroskopie mit erhöhter axialer auflösung
DE102012101344A1 (de) Optisches Rastermikroskop mit zwei Scaneinheiten
DD279962A1 (de) Konfokales laserrastermikroskop
DE102022128898A1 (de) Interferenzreflexionsmikroskop und Verfahren zum Analysieren einer Probe
DE10338556A1 (de) Verfahren sowie Anordnung zur Herstellung eines Hologramms

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
R071 Expiry of right
R071 Expiry of right