DE4315211A1

DE4315211A1 - Specific molecule detector using near-infrared surface plasmon resonance - has small cover plate of glass, silicon, metal or plastic having same size as precious metal layer carrying specific receptor mols.

Info

Publication number: DE4315211A1
Application number: DE4315211A
Authority: DE
Inventors: Erich Prof Dr Rer Nat Sackmann; Gunnar Brink
Original assignee: BRINK GUNNAR 81825 MUENCHEN DE
Current assignee: BRINK GUNNAR 81825 MUENCHEN DE
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1993-05-07
Publication date: 1994-02-03

Abstract

The mol. detector directs radiation having a wavelength in the 1200-2500 nm band through a glass prism into one or more measurement chambers formed by a Silicon wafer (5) with a hydrophobic coating (6). A pref. Aluminium layer (8) on the base (7) carries a layer (9) of specific receptor mols. between hydrophilically treated recesses (11). The chamber is covered with a plate (10) pref. bonded to the base and dimensioned so as not to obstruct movement of samples into and out of the recesses. USE/ADVANTAGE - For fully automated recognition of enzyme-substrate complexes e.g. in toxicology or biological weapon detection, both sample prepn. and exclusion of unspecific absorption phenomena are simplified.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis der spezifischen Adsorption von Molekülen mittels Nahinfrarot- Oberflächenplasmonenresonanz.The invention relates to a device and a method for detection the specific adsorption of molecules using near infrared Surface plasmon resonance.

Der selektive Nachweis von Enzym-Substrat-Komplexen mit vollautomatischen und sehr kompakten Nachweisgeräten (Biosensoren) ist für alle verfahrenstechnischen Schritte der Biotechnologie, der Medizin (Nachweis von Krankheitserregern, Toxinen, von physiologischen Reaktionen des Körpers auf Schädigungen), der Umwelttechnik (Erkennen von komplexen Molekülen in der Umwelt) und der militärischen Technologie (Erkennen von biologischen Waffen) von Bedeutung. Eine Reihe von Untersuchungsmethoden werden in Labors durchgeführt, z. B. Western Blotting und ELISA. Häufig erfolgt der Nachweis komplexer Moleküle auch durch spektroskopische Verfahren. Neuartige Biosensoren beruhen auf der Hälterung und Vermessung von intakten Zellen, auf elektrochemischen Verfahren oder auf Oberflächenplasmonenresonanz. Die Oberflächenplasmonenresonanz gestattet die Vermessung mittlerer Belegungsdichten von dünnen Adsorbaten auf Metalloberflächen unter Realbedingungen (in physiologischen Lösungen, Normaltemperatur, Normaldruck).The selective detection of enzyme-substrate complexes with fully automatic and very compact detection devices (biosensors) for all procedural steps in biotechnology and medicine (Detection of pathogens, toxins, physiological Reactions of the body to damage), environmental technology (detection of complex molecules in the environment) and the military Technology (detection of biological weapons) important. A A number of test methods are carried out in laboratories, e.g. B. Western blotting and ELISA. The detection is often more complex Molecules also by spectroscopic methods. Novel biosensors are based on the maintenance and measurement of intact cells electrochemical processes or on surface plasmon resonance. The surface plasmon resonance allows the measurement of medium ones Occupancy densities of thin adsorbates on metal surfaces below Real conditions (in physiological solutions, normal temperature, Normal pressure).

Oberflächenplasmonen sind elektromagnetische Oberflächenwellen, deren elektrische Felddichte in der Oberfläche maximal ist und senkrecht dazu exponentiell abfällt. Sie treten an der Oberfläche elektrisch leitfähiger Materialien, an Metallen und hochdotierten Halbleitern auf. Die Anregung von Oberflächenplasmonen kann unter anderem mit Licht erfolgen. Eine Anregung der Oberflächenplasmonen erfolgt dabei nur bei einem Einfallswinkel des Anregungslichts. Dünne Oberflächenbelegungen mit organischen Molekülen verschieben den Resonanzwinkel. Der Nachweis der spezifischen Adsorption von Molekülen mittels Oberflächenplasmonenresonanz beruht darauf, daß durch die spezifische Adsorption der nachzuweisenden Moleküle an die Rezeptoren die Schichtdicke auf der Metalloberfläche erhöht wird und dadurch der Resonanzwinkel bei Bestrahlung der Edelmetallschicht auf spezifische Art und Weise verschoben wird. Technisch praktikabel ist die sogenannte Kretschmann Konfiguration, bei durch ein Prisma Licht auf eine dünne, direkt aufgebrachte leitfähige Schicht fällt, wobei eine Adsorption der nachzuweisenden Moleküle auf der freien Gegenseite der leitfähigen Schicht erfolgt. Surface plasmons are surface electromagnetic waves whose electric field density is maximum in the surface and perpendicular to it declines exponentially. They appear more electrically conductive on the surface Materials, metals and highly doped semiconductors. The suggestion Surface plasmon can be done with light, among other things. A The excitation of the surface plasmon occurs only in one Angle of incidence of the excitation light. Thin surface coverings with organic molecules shift the resonance angle. The proof the specific adsorption of molecules by means of Surface plasmon resonance is based on the fact that the specific Adsorption of the molecules to be detected on the receptors Layer thickness is increased on the metal surface and thereby the Resonance angle when irradiating the precious metal layer in a specific way and way is shifted. The so-called is technically practical Kretschmann configuration, with light through a prism on a thin, directly applied conductive layer falls, an adsorption of the Molecules to be detected on the free opposite side of the conductive Layer takes place.

In der WO-A 90/05305 wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von spezifischen Adsortionsphänomenen mittels Oberflächenplasmonresonanz beschrieben, bei der ein Träger, als Beispiel wird ein Glasträger angegeben, mit einer Edelmetallschicht beschichtet wird und darauf eine spezifische Rezeptoroberfläche mit Funktionalitäten aufgetragen wird, die zur Bindung mit Biomolekülen befähigt sind. Die zu untersuchende Probe wird bei diesem Verfahren mit einer nicht näher definierten "unit for liquid handling" aufgetragen und der Resonanzwinkel mit einem nicht näher definierten Detektor ermittelt. Die Konfiguration (Glasträger) deutet daraufhin, daß die Messung in diesem Verfahren mit sichtbarem Licht durchgeführt wird. Die Auftragung der Meßflüssigkeit ist in der Patentschrift nicht beschrieben. In der Praxis ("bia-CORE") wird von den Anmeldern ein verhältnismäßig aufwendiger Apparat zur Beschickung des Biosensors mit Probeflüssigkeit eingesetzt.WO-A 90/05305 describes a method and an apparatus for Detection of specific adsorption phenomena using Surface plasmon resonance described using a carrier as an example a glass support is specified, coated with a noble metal layer and then a specific receptor surface with functionalities is applied, which are capable of binding with biomolecules. The too In this method, the sample to be examined is not specified with a defined "unit for liquid handling" and the resonance angle determined with an unspecified detector. The configuration (Glass carrier) indicates that the measurement in this method with visible light is performed. The application of the measuring liquid is not described in the patent. In practice ("bia-CORE") is used by the applicants a relatively complex apparatus for Feeding the biosensor with sample liquid used.

Der Nachteil der bislang verwendeten Oberflächenplasmonenresonanz in der technisch praktikablen Kretschmann-Konfiguration ist, daß nur durchsichtige Medien (Glas, Quarz) als Träger der Metallschicht eingesetzt werden können. Die Verwendung von Glas oder Quarz als Trägermaterial schränkt jedoch die Erzeugung von Mikrostrukturen und definierten Oberflächen stark ein. Die Verwendung von Silicium als Trägermaterial würde die Nutzung der Siliciumtechnologie zur Erzeugung von Mikrostrukturen (Mikromechanik bzw. Mikrosystemtechnik) erlauben. Mikrosystemtechnik ist die Voraussetzung zur Konstruktion von Biosensoren mit biochemischen Kaskadenreaktionen, Clearance- und Regenerationsfunktion Silicium konnte jedoch in der Kretschmann- Konfiguration bislang nicht eingesetzt werden, da bei den verwendeten sichtbaren Wellenlängen oberhalb der Bandlücke von Silicium, Silicium keine Transmission zeigt.The disadvantage of the previously used surface plasmon resonance in the technically practicable Kretschmann configuration is that only transparent media (glass, quartz) are used to support the metal layer can be. The use of glass or quartz as a carrier material however, limits the creation of microstructures and defined Surfaces strongly. The use of silicon as a carrier material would use silicon technology to generate Allow microstructures (micromechanics or microsystem technology). Microsystem technology is the prerequisite for the construction of Biosensors with biochemical cascade reactions, clearance and However, the silicon regeneration function could Configuration have not been used so far because the used visible wavelengths above the band gap of silicon, silicon shows no transmission.

Aus der WO-A 91/06855 ist ein Biosensor bekannt, mittels dessen Antigen/Antikörper-Bindungen mittels Oberflächenplasmonenresonanz bestimmt werden. Bei der dort beschriebenen Verfahrensweise wird die zu untersuchende Probe auf einen mit Aluminiumspiegeln beschichteten Siliciumträger aufgetragen, dessen Al-Spiegel mit immobilisierten Teilantigenen beschichtet sind. Linear polarisiertes Licht einer Wellenlänge von 1150 nm wird über ein Prisma auf die Al-Spiegel geleitet und das Minimum der Lichtreflexion durch Biegung des Si- Plättchens, mittels eines beheizten Thermoelements, mit einem Detektor festgestellt. Die unspezifische Bindung wird durch Erzeugung von Ultraschall eliminiert. Die optische Anbindung des bewegten Siliziumplättchens an das starre Prisma ist nicht beschrieben. Der größte Nachteil dieses Sensors liegt in dem Einsatz von Aluminium als Träger der Oberflächenplasmonen, da aufgrund der optischen Konstanten von Aluminium die Plasmonenresonanzkurve zu breit ist, um geringe Verschiebungen des Resonanzwinkels messen zu können. Des weiteren ist kaum erklärlich, wie die optische Anbindung des bewegten Siliziumplättchens an das starre Prisma durchgeführt werden kann.From WO-A 91/06855 a biosensor is known, by means of which Antigen / antibody binding using surface plasmon resonance be determined. In the procedure described there, the Sample to be examined on a coated with aluminum mirrors Silicon carrier applied, the Al mirror with immobilized Partial antigens are coated. Linearly polarized light Wavelength of 1150 nm is transmitted through a prism to the Al mirror guided and the minimum of light reflection by bending the Si Plate, by means of a heated thermocouple, with a detector detected. The nonspecific binding is generated by Ultrasound eliminated. The optical connection of the moving Silicon plate on the rigid prism is not described. The biggest The disadvantage of this sensor is the use of aluminum as the carrier Surface plasmons because of the optical constants of Aluminum the plasmon resonance curve is too wide to be low To be able to measure shifts in the resonance angle. Furthermore is hardly explainable how the optical connection of the moving Silicon plate can be performed on the rigid prism.

Die bei Edelmetallen im nahen Infrarot wesentlich schärfere Oberflächenplasmonenresonanz gegenüber der gebräuchlichen Resonanz im sichtbaren Licht ist hingegen für die unten beschriebene Meßgenauigkeit der vorliegenden Erfindung von grundlegender Bedeutung.Which is much sharper with precious metals in the near infrared Surface plasmon resonance compared to the usual resonance in visible light, however, is for that described below Accuracy of measurement of the present invention is fundamental Importance.

Zudem besteht in biologischer und medizinischer Forschung häufig das Interesse, die Adsorption und Bildung von Plaques an Oberflächen zu untersuchen, z. B. zur Untersuchung von Biokompatibilität von Materialien bei der Bildung von Ablagerungen in Adern, z. B. bei Arteriosklerose und von anderen Ablagerungen aus wäßrigen Flüssigkeiten an synthetische und natürliche Oberflächen.In addition, this is often the case in biological and medical research Interest, the adsorption and formation of plaques on surfaces too examine, e.g. B. to investigate the biocompatibility of materials in the formation of deposits in veins, e.g. B. in arteriosclerosis and from other deposits from aqueous liquids to synthetic and natural surfaces.

Vor diesem Hintergrund des Stands der Technik lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu entwickeln, mit der spezifische Adsorption von Molekülen mittels Oberflächenplasmonenresonanz vermessen werden können, wobei die Auftragung der Proben sowie die Ausschaltung unspezifischer Adsorptionsphänomene auf möglichst einfache, unkomplizierte Art und Weise durchführbar sein sollte. Weiter sollte das Verfahren dergestalt sein, daß die Messungen mit einer kompakten Meßanordnung (Mikromeßkammer) durchführbar sind. Die Meßgenauigkeit sollte deutlich besser sein, als mit der gebräuchlichen Oberflächenplasmonenresonanz im sichtbaren Licht möglich.Against this background of the prior art, the invention Task based on a method and an apparatus for performing to develop the process with the specific adsorption of Molecules can be measured using surface plasmon resonance can, the application of the samples as well as the switching off unspecific adsorption phenomena in the simplest possible should be straightforward. That should go on The method must be such that the measurements are carried out with a compact Measuring arrangement (micro measuring chamber) can be carried out. The Measuring accuracy should be significantly better than with the usual Surface plasmon resonance possible in visible light.

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum spezifischen Nachweis von Molekülen mittels Nahinfrarot-Oberflächenplasmonenresonanz, welche mit einer Lichtquelle (1), die Licht einer Wellenlänge von 1100 bis 2500 nm freisetzt, einem Glaskörper (2), welcher eine oder mehrere aus Silicium gefertigte Meßkammern (3) trägt und einem Detektor (4) zur Messung der Intensität des Lichtes ausgerüstet ist, wobei die Meßkammer aus einer Siliciumscheibe (5) besteht, die mit einer hydrophoben Schicht (6) überzogen ist und auf zwei gegenüberliegenden Seiten mit Sockeln (7) begrenzt wird, dazwischen mit einer Edelmetallschicht (8) beschichtet ist, welche eine Schicht (9) aus spezifischen Rezeptormolekülen trägt an deren Seiten links und rechts, paarweise, jeweils gegenüberliegende hydrophilisierte Stellen (11) angebracht sind, wobei die Meßkammer mit einem auf den Sockeln (7) aufliegendem Deckplättchen (10) abgedeckt ist.The invention relates to a device for the specific detection of molecules by means of near infrared surface plasmon resonance, which uses a light source ( 1 ) that releases light with a wavelength of 1100 to 2500 nm, a vitreous body ( 2 ) which has one or more measuring chambers made of silicon ( 3 ) carries and a detector ( 4 ) is equipped for measuring the intensity of the light, the measuring chamber consisting of a silicon wafer ( 5 ) which is coated with a hydrophobic layer ( 6 ) and delimited on two opposite sides with bases ( 7 ) is coated in between with a noble metal layer ( 8 ) which carries a layer ( 9 ) of specific receptor molecules on the left and right sides, in pairs, of opposite hydrophilized points ( 11 ), the measuring chamber with a on the base ( 7 ) overlying cover plate ( 10 ) is covered.

In Fig. 1 ist der Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung skizziert. In Fig. 1, the structure of the device according to the invention is outlined.

Auf einem Goniometer mit zwei verstellbaren Armen (12, 13) ist auf einem Arm (12) die Lichtquelle (1) angeordnet. Es ist zweckmäßig, die Goniometerarme mittels Motoren durch ein Steuerprogramm bewegbar zu gestalten. Als Lichtquelle geeignet ist eine Lichtquelle mit fester Lichtwellenlänge, beispielsweise ein Diodenlaser mit fester Lichtwellenlänge. Vorteilhaft wird ein Diodenlaser mit einer Lichtwellenlänge von etwa 1300 nm oder mit etwa 1500 nm Wellenlänge eingesetzt, da diese aufgrund der Glasfasertechnologie günstig verfügbar sind. Geeignet ist auch eine Lichtquelle mit variabler Wellenlänge. Vorteilhaft wird eine Halogenglühlampe, welche Licht in einem Wellenlängenbereich von 1100 nm bis 2500 nm abstrahlt, zusammen mit einem Monochromator und einem Polarisator (17) verwendet.The light source ( 1 ) is arranged on an arm ( 12 ) on a goniometer with two adjustable arms ( 12 , 13 ). It is expedient to make the goniometer arms movable by means of motors using a control program. A light source with a fixed light wavelength is suitable as the light source, for example a diode laser with a fixed light wavelength. A diode laser with a light wavelength of approximately 1300 nm or with a wavelength of approximately 1500 nm is advantageously used, since these are cheaply available due to the glass fiber technology. A light source with a variable wavelength is also suitable. A halogen incandescent lamp, which emits light in a wavelength range from 1100 nm to 2500 nm, is advantageously used together with a monochromator and a polarizer ( 17 ).

Als Lichtquelle geeignet sind weitere Lasertypen mit fester oder variabler Lichtwellenlänge. Bei ungenügender Polarisation des Laserlichts bei Verwendung einer Laserlichtquelle ist ebenfalls ein Polarisator (17) vorzusehen.Other types of lasers with fixed or variable light wavelength are suitable as light sources. If the laser light is insufficiently polarized when using a laser light source, a polarizer ( 17 ) must also be provided.

Oberflächenplasmonenresonanz zur Detektion biochemischer Veränderungen und der Abscheidung geringster Molekülmengen an der Oberfläche von Silicium-Metall-Schichtsystemen in wäßrigen Systemen wird durch die Bandlücke von Silicium einerseits und durch Lichtadsorption von Wasser andererseits begrenzt. Nutzbar ist also der Bereich von 1100 nm bis 2500 nm.Surface plasmon resonance for the detection of biochemical Changes and the separation of the smallest amounts of molecules on the Surface of silicon-metal layer systems in aqueous systems is due to the band gap of silicon on the one hand and by On the other hand, light adsorption by water is limited. So is usable Range from 1100 nm to 2500 nm.

Der andere Goniometerarm (13) trägt einen Detektor (4). Vorteilhaft wird ein Halbleiterdetektor, z. B. eine Indium-Galliumarsenid-Diode eingesetzt. Vorzugsweise wird zur Fokussierung des Lichts auf den Detektor (4) noch eine Zylinderlinse (14) vorgeschaltet. Das Goniometer ist weiter mit einem Proben- und Schichtsystemhalter (15) ausgerüstet, der einen optischen Körper (2) trägt. Dieser optische Körper (2) an dem ein- und abgestrahltes Licht so gebrochen werden, daß Totalreflexion an einer Seite erfolgen kann, kann vorzugsweise ein Glasprisma oder eine Halbzylinderlinse aus Glas oder Silicium sein. An dieser Seite trägt der optische Körper eine über eine optische Anpassung (16), angebrachten Meßkammer (3). Die Anbringung der Meßkammer an den optischen Körper wird nachfolgend noch näher erläutert.The other goniometer arm ( 13 ) carries a detector ( 4 ). A semiconductor detector, z. B. an indium gallium arsenide diode is used. A cylindrical lens ( 14 ) is preferably connected upstream to focus the light on the detector ( 4 ). The goniometer is further equipped with a sample and layer system holder ( 15 ) which carries an optical body ( 2 ). This optical body ( 2 ), at which the incident and emitted light are refracted so that total reflection can take place on one side, can preferably be a glass prism or a half-cylinder lens made of glass or silicon. On this side, the optical body carries a measuring chamber ( 3 ) which is attached via an optical adjustment ( 16 ). The attachment of the measuring chamber to the optical body is explained in more detail below.

Geeignet ist auch eine andere Anordnung von Lichtquelle (1), Detektor (4) und Probenhalter (15), beispielsweise die Montage des Glaskörpers auf einem der beiden Goniometerarme, des Detektors auf dem zweiten und eine ortsfeste Befestigung der Lichtquelle (1). Vorteilhaft ist die in Fig. 1 abgebildete Anordnung mit ortsfest liegender Probenkammer (3).Another arrangement of light source ( 1 ), detector ( 4 ) and sample holder ( 15 ) is also suitable, for example the assembly of the glass body on one of the two goniometer arms, the detector on the second and a fixed attachment of the light source ( 1 ). The arrangement shown in FIG. 1 with a stationary sample chamber ( 3 ) is advantageous.

Während der Messung gelangt das nahinfrarote Licht von der Lichtquelle durch das Glasprisma (2), an dessen Außenseite es gebrochen wird, auf die Edelmetallschicht der Siliciummeßkammer, wobei das Licht von der Oberfläche der Edelmetallschicht reflektiert wird und auf den Detektor trifft, wo die Intensität des Lichts gemessen wird. Im Strahlengang können zur Verbesserung der Strahlführung weitere Blenden und Linsen vorgesehen werden. Fig. 2a bzw. 2b zeigen den Aufbau der erfindungsgemäßen Meßkammer, wobei in Fig. 2a ein Längsschnitt und in Fig. 2b eine Draufsicht auf die Meßkammer gezeigt wird. Die Meßkammer ist mit einer Siliciumscheibe (5) ausgerüstet die mit einer wasserabstoßenden, vorzugsweise monomolekularen, Schicht (6) überzogen ist. Damit soll verhindert werden, daß während des Meßvorgangs wäßrige Probeflüssigkeiten zwischen Meßkammer und Glasprisma gelangen; darüberhinaus wird durch die Hydrophobisierung die Haftung der Edelmetallschicht (8) auf dem Silicium verbessert. Als hydrophobe Materialien eignen sich hierzu Alkyle oder Alkylverbindungen. Vorzugsweise ist die Siliciumoberfläche mit Siloxan, das aus polymerisierten Alkylchloroverbindungen hergestellt wird, überzogen. Die Siliciumscheibe kann beliebige Formgestalt haben. Vorzugsweise ist die Siliciumscheibe rechteckig mit einer Kantenlänge von 5 bis 20 mm und einer Dicke von 0.2 bis 1 mm.During the measurement, the near-infrared light from the light source passes through the glass prism ( 2 ), on the outside of which it is refracted, onto the noble metal layer of the silicon measuring chamber, the light being reflected from the surface of the noble metal layer and striking the detector, where the intensity of the Light is measured. Further diaphragms and lenses can be provided in the beam path to improve the beam guidance. Fig. 2a and 2b show the construction of the measuring chamber according to the invention, wherein a top view is shown on the measuring chamber in Fig. 2a is a longitudinal section and in Fig. 2b. The measuring chamber is equipped with a silicon wafer ( 5 ) which is coated with a water-repellent, preferably monomolecular, layer ( 6 ). This is to prevent aqueous sample liquids from getting between the measuring chamber and the glass prism during the measuring process; moreover, the hydrophobization improves the adhesion of the noble metal layer ( 8 ) to the silicon. Suitable hydrophobic materials for this purpose are alkyls or alkyl compounds. Preferably, the silicon surface is coated with siloxane made from polymerized alkyl chloro compounds. The silicon wafer can have any shape. The silicon wafer is preferably rectangular with an edge length of 5 to 20 mm and a thickness of 0.2 to 1 mm.

Seitlich der Edelmetallschicht (8) ist die Siliciumscheibe mit jeweils einer oder mehreren, jeweils paarweise gegenüberliegenden hydrophilierten Vertiefungen (11) versehen. Vorzugsweise sind zwei gegenüberliegende Vertiefungen vorhanden, mit einem Durchmesser von vorzugsweise 0.2 bis 0.5 mm. Diese Vertiefungen können beispielsweise durch Entfernung der hydrophoben Schicht mittels UV-Bestrahlung geschaffen werden. Im Bereich zwischen den jeweils gegenüberliegenden Vertiefungen (11) ist die hydrophobierte Siliciumscheibe mit einer Edelmetallschicht (8) überzogen. Dazu geeignete Edelmetalle sind Gold oder Silber, vorzugsweise wird Gold verwendet. Möglich ist auch die Anbringung hydrophiler Stellen auf der funktionalisierten Edelmetallschicht um das spätere Aufbringen von Probeflüssigkeit zu ermöglichen. Möglich ist es, die Hydrophilierung nicht durch Vertiefung in hydrophobe Schichten sondern durch lokale chemische Modifikation der Oberfläche zu erreichen. Vorzugsweise werden hydrophile Vertiefungen in der hydrophobierten Siliziumscheibe verwendet. Die Dicke der Edelmetallschicht beträgt zwischen 100 und 1000 nm. Um ein Abfließen der wäßrigen Probe während des Meßvorgangs zu verhindern, wird die Edelmetallschicht (8) an den in Längsrichtung dieser Schicht gegenüberliegenden Kanten der Siliciumscheibe durch die Sockel (7) begrenzt. Vorzugsweise beträgt die Höhe der Sockel von 0,0005 bis 0.2 mm. Die Sockel können aus Silicium gearbeitet sein. Denkbar sind auch Selbstklebebänder, die beidseitig mit einer Klebeschicht, beispielsweise auf Acrylamidbasis, beschichtet sind. Zum spezifischen Nachweis von Molekülen in der zu analysierenden Probe ist die Edelmetallschicht (8) schließlich mit einer Schicht (9) überzogen, die die biosensorisch oder chemosensorisch aktiven Rezeptormoleküle enthält. Die spezifische Anlagerung von Molekülen aus der Probe an den entsprechenden Rezeptoren, und die dadurch bedingte Anreicherung der nachzuweisenden Substanz an der Grenzfläche von Metall und wäßriger Probe, kann über die Verschiebung des Reflexionswinkels aufgrund der Oberflächenplasmonen-resonanz qualitativ und quantitativ erfaßt werden. Vorzugsweise ist die funktionalisierte Edelmetallschicht quadratisch oder rechteckig.To the side of the noble metal layer ( 8 ), the silicon wafer is provided with one or more hydrophilized depressions ( 11 ), each in pairs opposite one another. There are preferably two opposite depressions, with a diameter of preferably 0.2 to 0.5 mm. These depressions can be created, for example, by removing the hydrophobic layer by means of UV radiation. The hydrophobicized silicon wafer is coated with a noble metal layer ( 8 ) in the area between the respectively opposite recesses ( 11 ). Suitable noble metals are gold or silver, gold is preferably used. It is also possible to apply hydrophilic spots on the functionalized precious metal layer in order to enable the later application of sample liquid. It is possible to achieve the hydrophilization not by deepening in hydrophobic layers but by local chemical modification of the surface. Hydrophilic depressions are preferably used in the hydrophobicized silicon wafer. The thickness of the noble metal layer is between 100 and 1000 nm. In order to prevent the aqueous sample from flowing off during the measurement process, the noble metal layer ( 8 ) is delimited by the base ( 7 ) at the edges of the silicon wafer opposite this layer in the longitudinal direction. The height of the base is preferably from 0.0005 to 0.2 mm. The bases can be made of silicon. Self-adhesive tapes that are coated on both sides with an adhesive layer, for example based on acrylamide, are also conceivable. For the specific detection of molecules in the sample to be analyzed, the noble metal layer ( 8 ) is finally coated with a layer ( 9 ) which contains the biosensor or chemosensorically active receptor molecules. The specific attachment of molecules from the sample to the corresponding receptors, and the consequent accumulation of the substance to be detected at the interface between the metal and the aqueous sample, can be detected qualitatively and quantitatively via the shift in the angle of reflection due to the surface plasmon resonance. The functionalized noble metal layer is preferably square or rectangular.

Die Meßkammer wird mit einem Plättchen (10) nach oben abgeschlossen. Vorzugsweise ist das Deckplättchen auf den Sockeln aufgeklebt. Die Abmessungen des Deckplättchens sind dabei so zu bemessen, daß die Probenzufuhr und -absaugung über die Vertiefungen (11) nicht behindert wird, vorzugsweise entspricht die Ausdehnung des Deckplättchens in Breite und Länge der Edelmetallschicht. Geeignete Materialien zur Ausführung des Deckplättchens sind beispielsweise Glas, Silicium, Metall oder Kunststoff.The measuring chamber is closed at the top with a small plate ( 10 ). The cover plate is preferably glued to the bases. The dimensions of the cover plate are to be dimensioned such that the supply and suction of samples through the depressions ( 11 ) are not hindered, preferably the expansion of the cover plate corresponds to the width and length of the noble metal layer. Suitable materials for executing the cover plate are, for example, glass, silicon, metal or plastic.

Fig. 3 zeigt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Meßkammer in der die Edelmetallschicht (8) zwischen den Vertiefungen (11) auf ganzer Länge durch einen Spalt in 2 Hälften geteilt ist. In dieser Ausführungsform werden die biosensorisch oder chemosensorisch aktiven Rezeptormoleküle der Schicht (9) auf einer Hälfte (9a) durch Wärme in der Edelmetallschicht (beispielsweise erzeugt durch Leitung elektrischen Stroms durch die Edelmetallschicht oder Behandlung mit Oberflächenplasmonen) unter thermischer Zersetzung oder unter Einsatz von Enzymen oder unter chemischer Behandlung zerstört, auf der anderen Hälfte (9b) bleibt die Rezeptorschicht aktiv. Beim Einsatz von Enzymen kühlt man vorteilhaft die gesamte Meßkammer unter die Arbeitstemperatur der Enzyme, gibt diese hinzu und erwärmt nur einen Teil der funktionalisierten Schicht. Ebenso kann man in gleichem Verfahren eine noch nicht funktionalisierte Oberfläche durch lokale Anwendung von Wärme nur teilweise mit den Rezeptormolekülen versehen. Fig. 3 shows a particularly preferred embodiment of the measuring chamber in which the noble metal layer ( 8 ) between the depressions ( 11 ) is divided over its entire length by a gap in two halves. In this embodiment, the biosensory or chemosensory active receptor molecules of the layer ( 9 ) on one half ( 9 a) by heat in the noble metal layer (for example, generated by conduction of electrical current through the noble metal layer or treatment with surface plasmon) with thermal decomposition or using enzymes or destroyed under chemical treatment, on the other half ( 9 b) the receptor layer remains active. When using enzymes, it is advantageous to cool the entire measuring chamber below the working temperature of the enzymes, add it and only heat part of the functionalized layer. Likewise, a surface that has not yet been functionalized can only be partially provided with the receptor molecules by local application of heat in the same process.

Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß unspezifische und spezifische Adsorption an die Rezeptormoleküle getrennt gemessen werden können.The advantage of this embodiment is that non-specific and specific adsorption to the receptor molecules measured separately can be.

Die Auswahl der selektiv bindenden Rezeptormoleküle erfolgt nach dem nachzuweisenden Stoff: Zum Beispiel zum Nachweis von Proteinen und Haptenen verwendet man zweckmäßig Antikörper oder Antikörperfragmente, zum Nachweis von Antikörpern verwendet man zweckmäßig Epitope als Rezeptormoleküle, zum Nachweis von Coenzymen verwendet man zweckmäßig passende Apoenzyme oder deren Fragmente, zum Nachweis von Enzymsubstraten verwendet man zweckmäßig die passenden Enzyme oder deren Fragmente, zum Nachweis von Metallionen verwendet man zweckmäßig Chelate und Komplexbildner als Rezeptormoleküle.The selection of the selectively binding receptor molecules takes place after the Substance to be detected: For example for the detection of proteins and Antibodies or expediently haptens are used Antibody fragments are used to detect antibodies expediently epitopes as receptor molecules, for the detection of coenzymes appropriate apoenzymes or their fragments are used, for the detection of enzyme substrates it is expedient to use the suitable enzymes or their fragments, for the detection of metal ions expediently use chelates and complexing agents as Receptor molecules.

Die Rezeptormoleküle auf der Edelmetallschicht können durch chemische Bindung an der Metalloberfläche oder durch physikalische Adsorption oder durch hydrophobe Wechselwirkung fixiert werden. Vorteilhaft sieht man ein universell vorbereitetes Substrat vor, auf dem Rezeptormoleküle durch den Anwender aufgetragen werden können. Vorteilhaft überzieht man dazu die Metalloberfläche mit Alkylthiolen. Auf der so erzeugten hydrophoben Oberfläche kann der Anwender mittels Langmuir-Blodgett- oder davon abgeleiteter Methoden Rezeptormoleküle aufbringen. Dabei können die Rezeptormoleküle mit anderen Substanzen verbunden sein, die eine leichte Aufbringung der Rezeptormoleküle auf die Edelmetalloberfläche vermitteln. Dazu können amphiphile Moleküle wie Tenside oder Lipide verwendet werden oder es können Polymere verwendet werden, die in Beschichtungströgen nach Langmuir-Blodgett- oder einer davon abgeleiteten Methode auf die Edelmetalloberfläche übertragen werden können. Die Polymere könne aus verschiedenen Monomeren bestehen, die teilweise hydrophil und teilweise hydrophob sind oder die Polymere können hydrophobe Seitenketten enthalten, die die Beschichtung in Langmuir-Blodgett oder Langmuir-Schäfer-Methode ermöglichen. Es können Gele wie Polyacrylamidgele oder Dextrangele oder Agarosegele oder Silikatgele oder andere Polymergele auf die Edelmetalloberfläche fixiert werden an der Rezeptormoleküle angekoppelt werden. Weiterhin können Rezeptormoleküle durch chemische Bindung an auf der Edelmetalloberfläche fixierte Thiolverbindungen fixiert werden.The receptor molecules on the precious metal layer can by chemical Binding to the metal surface or by physical adsorption or be fixed by hydrophobic interaction. Looks advantageous one prepares a universally prepared substrate on which receptor molecules can be applied by the user. Advantageously covers the metal surface with alkylthiols. On the so generated The user can use hydrophobic surfaces using Langmuir-Blodgett or methods derived therefrom apply receptor molecules. Here the receptor molecules can be linked to other substances, which is an easy application of the receptor molecules to the Convey precious metal surface. To do this, amphiphilic molecules like Surfactants or lipids can be used or polymers can be used used in Langmuir-Blodgett- or a method derived from it on the precious metal surface can be transferred. The polymers can be made from different Monomers exist that are partially hydrophilic and partially hydrophobic or the polymers can contain hydrophobic side chains that coating using the Langmuir-Blodgett or Langmuir-Schäfer method enable. Gels such as polyacrylamide gels or dextran gels or Agarose gels or silicate gels or other polymer gels on the Precious metal surface fixed are coupled to the receptor molecules become. Furthermore, receptor molecules can be bound by chemical bonding fixed thiol compounds on the precious metal surface.

Vorteilhaft wird die Edelmetalloberfläche mit Alkylthiolen hydrophobisiert, gleichzeitig eine Lipidmischung, die teilweise mit Rezeptormolekülen modifizierte Lipide enthält, auf einer Wasseroberfläche monomolekular ausgebreitet wobei unter der Wasseroberfläche ein vorbereitetes Deckplättchen (10) der Meßkammer nach Fig. 2a angebracht ist. Anschließend wird eine vorbereitete Meßkammer ohne Deckplättchen (10) mit nach oben freiliegenden und klebrigen Sockeln (7) so durch die Lipidmischung auf der Wasseroberfläche gedrückt, so daß die Alkylthiolfläche mit den Lipiden beschichtet wird, und anschließend werden die Sockel unter der Wasseroberfläche an das Deckplättchen (10) angeklebt, so daß die Meßkammer zu einem an zwei Seiten offenen Gehäuse verbunden wird und dann so aus dem Trog entfernt werden kann. Dabei ist das Verbleiben der mit Rezeptoren funktionalisierten Lipide an der Alkylthioloberfläche durch hydrophobe Wechselwirkung gesichert. The noble metal surface is advantageously hydrophobized with alkylthiols, and at the same time a lipid mixture, which partially contains lipids modified with receptor molecules, is spread monomolecularly on a water surface, with a prepared cover plate ( 10 ) of the measuring chamber according to FIG. 2a being attached below the water surface. Subsequently, a prepared measuring chamber without cover plate ( 10 ) with sticky bases ( 7 ) exposed upward is pressed through the lipid mixture on the water surface so that the alkyl thiol surface is coated with the lipids, and then the bases are placed under the water surface on the cover plate ( 10 ) glued so that the measuring chamber is connected to a housing open on two sides and can then be removed from the trough. The lipids functionalized with receptors remain on the surface of the alkylthiol through hydrophobic interaction.

Die Anbringung der Meßkammer(n) (3) an das Glasprisma (2) zeigt Fig. 4 im Längsschnitt. Vorzugsweise wird die Oberseite des Glasprismas (2) mit einer Kunststoff-Folie (19) ausgerüstet, die eine oder mehrere Ausstanzungen (20) in Größe der erfindungsgemäßen Meßkammer enthält. Die Befestigung der Meßkammern erfolgt über ein Fluid (21) oder eine Kunststoffmasse mit einem Brechungsindex der dem des Glasprismas entspricht. Beispiele hierfür sind Immersionsöle oder die in der Mineralogie verwendeten indexanpassenden Fluide. Dazu wird das Fluid (21) in die Aussparungen (20) eingebracht und danach werden die Meßkammern eingesetzt.The attachment of the measuring chamber (s) ( 3 ) to the glass prism ( 2 ) is shown in Fig. 4 in longitudinal section. The top of the glass prism ( 2 ) is preferably equipped with a plastic film ( 19 ) which contains one or more punched-outs ( 20 ) the size of the measuring chamber according to the invention. The measuring chambers are attached using a fluid ( 21 ) or a plastic compound with a refractive index that corresponds to that of the glass prism. Examples of this are immersion oils or the index-matching fluids used in mineralogy. For this purpose, the fluid ( 21 ) is introduced into the recesses ( 20 ) and the measuring chambers are then inserted.

Es ist möglich, feldeffektabhängige Meßverfahren auf dem Siliciumplättchen oder dem Deckplättchen der Meßkammer zu integrieren um derartige Verfahren zum Zwecke besserer Spezifität des Sensors mit der Nahinfrarot-Oberflächen-plasmonenresonanz zu kombinieren. Auch Verwendung von Sensoren auf Basis mechanischer Oberflächenwellen ("surface acoustic wave sensors") oder anderer Sensoren in Kombination zum beschriebenen Nahinfrarot-Oberflächen-plasmonenresonanz-Sensor durch Ankleben an die Mikromeßkammer ist möglich.It is possible to use field effect-dependent measurement methods on the Integrate silicon plate or the cover plate of the measuring chamber to use such methods for the purpose of better specificity of the sensor to combine the near infrared surface plasmon resonance. Also Use of sensors based on surface mechanical waves ("surface acoustic wave sensors") or other sensors in combination to the described near infrared surface plasmon resonance sensor by sticking to the micro measuring chamber is possible.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der spezifischen Adsorption von Molekülen mittels Nahinfrarot- Oberflächenplasmonenresonanz mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Probenflüssigkeit in eine der hydrophilierten Vertiefungen (11) zugetropft wird, an der gegenüberliegenden Vertiefung abgesaugt wird und gegebenenfalls nach anschließendem Auftragen und Absaugen von einer Standardspüllösung die spezifische Veränderung des Resonanzwinkels, durch Variation des Reflexionswinkels mittels Bewegung von Detektor und/oder Lichtquelle oder durch Variation der anregenden Lichtwellenlänge, bestimmt wird.The invention further relates to a method for the detection of the specific adsorption of molecules by means of near infrared surface plasmon resonance by means of the device according to the invention, the sample liquid being dripped into one of the hydrophilized depressions ( 11 ), suctioned off at the opposite depression and optionally after subsequent application and suction of In a standard flushing solution, the specific change in the resonance angle is determined by varying the reflection angle by means of movement of the detector and / or light source or by varying the exciting light wavelength.

Die erfindungsgemäßen Meßkammern können nach jeder Messung ausgewechselt werden. Eine Regeneration der Kammern durch Spülung mit geeigneten Flüssigkeiten ist je nach verwendeter Art der Rezeptormoleküle denkbar.The measuring chambers according to the invention can be used after each measurement be replaced. Regeneration of the chambers by flushing with suitable liquids depending on the type used Receptor molecules conceivable.

Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit wird vorteilhaft nach der Anwendung der Probeflüssigkeit mit einer wäßrigen Standard-Lösung überschüssige Probeflüssigkeit und locker adsorbierte Substanz aus der Kammer gespült.To improve the measuring accuracy is advantageous after the Use the sample liquid with an aqueous standard solution excess sample liquid and loosely adsorbed substance from the Chamber rinsed.

Wird Variation des Reflexionswinkels zur Vermessung der Verschiebung der Oberflächenplasmonresonanz verwendet, werden bei der Messung z. B. über Schrittmotoren die Goniometerarme bewegt und abhängig vom Reflexionswinkel die Intensität des reflektierten Lichts im Detektor bestimmt. Mit einer Winkelauflösung des Goniometers von 1 Tausendstel Winkelgraden kann ohne weiteres eine Veränderung der mittleren Belegungsdicke der funktionalisierten Oberfläche um 1 Ångström gemessen werden. Entsprechend der Affinitäten der Rezeptormoleküle und der Größe der nachzuweisenden Moleküle ergibt sich daraus die Nachweisgrenze des Sensors.Is variation of the reflection angle to measure the displacement the surface plasmon resonance used in the measurement z. B. The goniometer arms are moved via stepper motors and depending on the Reflection angle the intensity of the reflected light in the detector certainly. With an angular resolution of the goniometer of 1 thousandth Angle degrees can easily change the mean Coverage thickness of the functionalized surface by 1 Ångström be measured. According to the affinities of the receptor molecules and the size of the molecules to be detected results in the Detection limit of the sensor.

Fig. 5a zeigt die mit der erfindungsgemäßen Apparatur bestimmte Abhängigkeit der reflektierten Intensität in Abhängigkeit des Reflexionswinkels in der Nähe der Nah-Infrarot- Oberflächenplasmonenresonanz bei einer Lichtwellenlänge von 1300 nm. Jede Messung besteht aus der zeitlich aufeinanderfolgenden Vermessung von Teilstücken einzelner Kurven wie in Fig. 5a und der Bestimmung des Resonanzminimums. Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit erfolgt die Bestimung des Minimums vorteilhaft durch numerische Berechnung. Die Schichtdickenänderung zwischen zwei Einzelmessungen steht in direkter Beziehung zu der Veränderung des Resonanzminimums. FIG. 5a, the specific with the inventive apparatus as a function displays the reflected intensity as a function of the reflection angle in the vicinity of the near-infrared surface plasmon resonance at a light wavelength of 1300 nm. Each measurement is made of the time-sequential measurements of sections of individual curves in Fig. 5a and the determination of the resonance minimum. To improve the measuring accuracy, the minimum is advantageously determined by numerical calculation. The change in layer thickness between two individual measurements is directly related to the change in the resonance minimum.

Fig. 5b zeigt die Messung eines Adsorptionsvorgangs in der erfindungsgemäßen Apparatur einer organischen Schicht von 0,2 nm mittlerer Schichtdicke aus der wäßrigen Phase an eine beschichtete Goldoberfläche. Das vorliegende Meßbeispiel zeigt einen besonders allgemeinen Anwendungsfall, die Vermessung der unspezifischen Adsorption von negativ geladenen Lipidmolekülen (Dimyristoyl- Phosphatidylglycerol) aus einer Vesikelsuspension in wäßriger Lösung an eine durch Carboxylgruppen negativ funktionalisierte Alkylmerkaptooberfläche auf einer Goldoberfläche nach Zugabe von Calcium-Ionen in einer erfindungsgemäßen Meßkammer jedoch ohne die beschriebene Trennung spezifischer (9b) und unspezifischer Adsorption (9a). Fig. 5b shows the measurement of an adsorption process in the inventive apparatus, an organic layer of 0.2 nm in average film thickness from the aqueous phase to a coated gold surface. The present measurement example shows a particularly general application, but the measurement of the non-specific adsorption of negatively charged lipid molecules (dimyristoyl-phosphatidylglycerol) from a vesicle suspension in aqueous solution to an alkyl mercapto surface negatively functionalized by carboxyl groups on a gold surface after addition of calcium ions in a measuring chamber according to the invention without the described separation of specific ( 9 b) and non-specific adsorption ( 9 a).

Statt oder neben der Variation des Reflexionswinkel kann die Resonanz und deren Verschiebung auch durch eine Veränderung des Anregungslichtes oder durch eine wellenlängenauflösende Messung des Lichts im Detektor bei gegebenem Reflexionswinkel die Resonanzenergie des anregenden Lichts bestimmt werden und dessen Verschiebung zur Vermessung der Veränderung der Schichtdicke durch Adsorption herangezogen werden.Instead of or next to the variation of the angle of reflection, the resonance and their displacement also by changing the Excitation light or by a wavelength-resolving measurement of the Light in the detector at a given reflection angle the resonance energy of the stimulating light can be determined and its shift to Measurement of the change in layer thickness through adsorption be used.

Claims

1. Device for the specific detection of molecules by means of near infrared surface plasmon resonance, which with a light source ( 1 ) releases the light of a wavelength of 1200 to 2500 nm, an optical body ( 2 ) which has one or more measuring chambers ( 3 ) made of silicon carries and is equipped with a detector ( 4 ) for measuring the intensity of the light, the measuring chamber consisting of a silicon wafer ( 5 ) which is covered with a hydrophobic layer ( 6 ) and is delimited on two opposite sides by bases ( 7 ), in between is coated with a noble metal layer ( 8 ), which carries a layer ( 9 ) made of specific receptor molecules, on the left and right sides of which, in pairs, one or more hydrophilized depressions ( 11 ) are arranged, the measuring chamber with one on the bases ( 7 ) overlying cover plate ( 10 ) is covered.

2. Device according to claim 1, characterized in that the device is equipped with a Goiniometer with two adjustable arms (12, 13) which are movable by means of motors by a control program, wherein on the one arm (12) the light source (1 ), the detector ( 4 ) is arranged on the other arm ( 13 ) and the goniometer on the joint is equipped with a layer system holder ( 15 ) which carries the optical body ( 2 ).

3. Device according to claim 1, characterized in that the noble metal layer ( 8 ) between the recesses ( 11 ) is divided over its entire length by a gap in two halves.

4. Apparatus according to claim 1 or 3, characterized in that the Precious metal layer is partially covered with receptor molecules to be able to differentiate between specific and non-specific adsorption.

5. The device according to claim 4, characterized in that the selective coating with receptor molecules by using Heat is generated in the precious metal layer.

6. A method for the detection of the specific adsorption of molecules by means of near infrared surface plasmon resonance by means of a device according to claim 1, wherein the sample liquid is added dropwise into one of the hydrophilized wells ( 11 ), is sucked off at the opposite well and, if appropriate after subsequent application and suction of aqueous solution, the specific change in the resonance angle is determined by varying the angle of reflection by means of movement of the detector and / or light source or by varying the exciting light wavelength.