DE4311464A1 - Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels enzymatischer Oxidation mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase in Gegenwart eines Elektronenakzeptors aus der Gruppe der elektronenreichen aromatischen Nitrosoverbindungen und Bestimmung des redu­ zierten Elektronenakzeptors durch Farbbildung als Maß für die Menge des Analyten. Weiter betrifft die Erfindung ein Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten durch enzymatische Oxidation, enthaltend eine PQQ-abhängige De­ hydrogenase, eine elektronenreiche aromatische Nitrosover­ bindung sowie ein farbbildendes nichtoxidatives Nachweis­ reagenz für die aus der elektronenreichen, aromatischen Nitrosoverbindung bei Reduktion entstehende Iminoverbin­ dung. Weiter betrifft die Erfindung neue Nitrosoanilinver­ bindungen, deren Herstellung, sowie deren Verwendung zur kolorimetrischen enzymatischen Bestimmung eines Analyten.

Enzymatische Oxidationen ermöglichen in der Analytik den Nachweis und die Bestimmung von Substanzen in verschieden­ sten Probenmaterialien. Hierbei wirkt ein oxidierendes Enzym in Gegenwart eines die Elektronen der Oxidationsre­ aktion aufnehmenden Akzeptors auf ein entsprechendes Enzym­ substrat ein. Die Reduktion des Elektronenakzeptors zeigt die Anwesenheit des Enzymsubstrats an. Hierbei hat es sich bisher als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn der redu­ zierte Elektronenakzeptor durch Farbbildung nachgewiesen werden kann, da dies nicht notwendigerweise nur mittels teurer Meßapparaturen möglich ist, sondern gegebenenfalls auch visuell erfolgen kann.

Bekannte Methoden zur kolorimetrischen Bestimmung von Sub­ stanzen mittels oxidierend wirkender Enzyme verwenden Oxi­ dasen oder Dehydrogenasen. Beide Enzymgruppen gehören zur Hauptgruppe der Oxidoreduktasen (Römpps Chemielexikon, Francksche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart, 8. Auflage, 1985, Band 4, Seite 2952; Lexikon Biochemie, Herausgeber H. D. Jakubke, Verlag Chemie, Weinheim, 2. Auflage, 1981, Sei­ te 194), deren Mitglieder nach ihren natürlichen Elektro­ nenakzeptoren unterschieden werden können.

Natürlicher Elektronenakzeptor für Oxidasen ist molekularer Sauerstoff (Römpps Chemielexikon, Francksche Verlagsbuch­ handlung, Stuttgart, 8. Auflage, 1985, Band 4, Seite 2946). Bei Analytbestimungen wird dabei der Analyt durch eine Oxi­ dase und O₂ oxidiert. Das entstehende H₂O₂ wird mit Hilfe von Peroxidase zur Oxidation eines Leukofarbstoffes be­ nutzt. Stellvertretend für den Stand der Technik des Ein­ satzes von Oxidasen zur kolorimetrischen Bestimmung von Analyten sei A. Kunst et al. in "Methods in enzymatic analysis", Hrsg. H. U. Bergmeyer, Verlag Chemie, Weinheim, 3. Auflage, 1984, Band 6, Seite 178-185 zitiert. Glucose wird dort in Serum, Plasma oder in deproteinisiertem Blut durch Umsetzung mit Glucoseoxidase und Luftsauerstoff in wäßriger Lösung nachgewiesen, indem das bei dieser Re­ aktion durch Reduktion des Sauerstoffs gebildete Wasser­ stoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase reduziert wird und damit farbbildend auf ebenfalls in der Reaktionsmischung vorliegendes Phenol und 4-Aminophenazon wirkt. Das hohe Redoxpotential von H₂O₂ und die Unselektivität und Insta­ bilität von Peroxidase führen meist zu Einschränkungen sol­ cher Tests. Störend wirken zum Beispiel Übergangsmetall­ ionen oder Häm oder Hämproteine, wie sie leicht in von Blut abgeleiteten Proben auftreten können, weil sie Wasser­ stoffperoxid zersetzen. Probeninhaltsstoffe, zum Beispiel Bilirubin oder auch Medikamente wie zum Beispiel Methyl­ dopa, die durchaus in von Blut abgeleiteten Proben oder in Urin vorkommen, können mit Wasserstoffperoxid und Peroxi­ dase zu einer Farbbildung und somit zu falschen Resultaten führen; sie können aber auch schon gebildeten Farbstoff wieder reduzieren und damit entfärben.

Insbesondere bei Durchführung der vorgenannten Bestimmungs­ methode auf festen Trägern, in sogenannten Trockentests, hat sich der Sauerstoffbedarf der Oxidasen zusätzlich als nachteilig erwiesen. Vor allem dann, wenn viel Sauerstoff zur Oxidation hoher Konzentrationen an Enzymsubstrat ge­ braucht wird, kann die Diffusion von Sauerstoff aus der Luft in das Reaktionsmedium zum geschwindigkeitsbestimmen­ den Schritt werden und zu langen Reaktionszeiten oder ins­ besondere bei kinetischen Bestimmungsmethoden zu falschen Ergebnissen führen.

Dehydrogenasen können im allgemeinen in solche unterteilt werden, die für die Oxidation von Enzymsubstraten Nikotin­ amid-adenin-dinucleotid (NAD) oder Nikotinamid-adenin- dinucleotid-phosphat (NADP) als natürlichen unmittelbaren Elektronenakzeptor benötigen und in solche, die nicht-NAD oder -NADP-abhängig sind und die also andere Substanzen als natürliche, unmittelbare Elektronenakzeptoren bei enzyma­ tischen Oxidationsreaktionen verwenden. Unter die Gruppe der nicht-NAD- oder -NADP-abhängigen Dehydrogenasen fallen insbesondere die PQQ- und flavin-abhängigen Dehydrogenasen.

Der Einsatz von NAD-abhängigen Dehydrogenasen für kolori­ metrische Messungen ist zum Beispiel aus DE-A-21 47 466 be­ kannt. Dort wird beschrieben, daß Lactat unter Katalyse von Lactatdehydrogenase mit Nikotinamid-adeni-dinucleotid zu Pyruvat und reduziertem Nikotinamid-adenin-dinucleotid um­ gesetzt wird. Das gebildete NADH reagiert dann beispiels­ weise in Gegenwart des Enzyms Diaphorase mit Tetrazolium­ salzen unter Bildung von NAD und farbigen Formazanen, deren Konzentration photometrisch bestimmt werden kann. Anstatt Diaphorase ist auch N-Methylphenazinium-methosulfat als Reduktionskatalysator für die Übertragung der Elektronen von NADH auf das Tetrazoliumsalz genannt.

Nachteile dieses Verfahrens sind darin zu sehen, daß statt NADH auch andere eventuell in biologischen Proben, wie zum Beispiel Blut, Serum, Plasma oder Urin vorkommende, re­ duzierend wirkende Substanzen, wie Glutathion oder Medi­ kamente wie Methyldopa oder Dobesylat in Gegenwart von un­ spezifischen Reduktionskatalysatoren, wie Diaphorase oder N-Methylphenazinium-methosulfat Tetrazoliumsalze in ent­ sprechende Formazane überführen und so zu falsch-positiven Ergebnissen führen, obwohl sie in Abwesenheit von Reduk­ tionskatalysatoren nicht so schnell mit Tetrazoliumsalzen reagieren würden.

Aus EP-A-O 354 441 ist der oxidative, enzymatische Nachweis von Analyten mittels flavinabhängiger Oxidasen oder nicht- NAD-abhängiger Dehydrogenasen, wie PQQ-abhängigen Dehydro­ genasen, mit elektronenreichen aromatischen Nitrosoverbin­ dungen bekannt. Bei dieser Nachweismethode wird die aroma­ tische Nitrosoverbindung enzymatisch zu einem entsprechen­ den elektronenreichen, aromatischen Amin reduziert, das entweder mittels einer ausgefällten, schwer löslichen Heteropolysäure durch Heteropolyblaubildung nachgewiesen wird oder mit einem Kupplungsreagenz in Gegenwart eines Oxidationsmittels zu einem Farbstoff gekuppelt wird. Die blau-grauen Farbabstufungen der Heteropolyblaubildung sind für eine genaue visuelle Auswertung allerdings wenig ge­ eignet. Zum kolorimetrischen Nachweis der im allgemeinen nicht oder nur sehr schwach gefärbten aromatischen Amine mit einem farbgebenden Kupplungsreagenz ist nachteilig, daß zusätzlich ein Oxidationsmittel benötigt wird. Da ein sol­ ches Oxidationsmittel die enzymatische Reduktion der aroma­ tischen Nitrosoverbindung zum aromatischen Amin stören wür­ de, muß die Nachweisreaktion in zwei getrennten Stufen er­ folgen: in der ersten Stufe wird die aromatische Nitroso­ verbindung enzymatisch zum aromatischen Amin reduziert und in einer davon getrennten zweiten Stufe ein Oxidationsmit­ tel für die oxidative Kupplung des aromatischen Amins mit einem farbgebenden Kupplungsreagenz zugegeben.

Ein weiterer Nachteil dieses Nachweisverfahrens besteht darin, daß für die Reduktion jedes Äquivalentes einer aro­ matischen Nitrosoverbindung zu einem aromatischen Amin zwei Äquivalente des Analyten oxidiert werden müssen. Dies kann insbesondere bei geringen Analytkonzentrationen zu einer unbefriedigenden Empfindlichkeit eines solchen Nachweisver­ fahrens führen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, die vor­ genannten Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und ein einfacheres, weniger störanfälliges, empfindliche­ res und optisch besser auswertbares Verfahren und Mittel zum oxidativen Nachweis von Analyten zur Verfügung zu stel­ len, das insbesondere in einer Stufe durchgeführt werden kann und über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich visuell gut auswertbare Farben liefert.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Erfindung wie sie in den Ansprüchen charakterisiert ist.

Demgemäß wurde ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestim­ mung eines Analyten mittels enzymatischer Oxidation des Analyten mit einer Oxidoreduktase in Gegenwart eines di­ rekten Elektronenakzeptors aus der Gruppe der elektronen­ reichen aromatischen Nitrosoverbindungen gefunden, bei dem die Bestimmung des reduzierten Elektronenakzeptors durch Farbbildung als Maß für die Menge des Analyten erfolgt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die elektronenreiche aro­ matische Nitrosoverbindung unter Oxidation des Analyten in Anwesenheit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase zu einer Iminoverbindung reduziert wird und diese ohne enzymatische Weiterreduktion zum aromatischen Amin durch Farbbildung nachgewiesen wird.

Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer Oxido­ reduktase in Gegenwart eines direkten Elektronenakzeptors aus der Gruppe der elektronenreichen aromatischen Nitroso­ verbindungen, bei dem die Bestimmung des reduzierten Elek­ tronenakzeptors durch Farbbildung als Maß für die Menge des Analyten erfolgt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindung unter Oxida­ tion des Analyten in Anwesenheit einer PQQ-abhängigen De­ hydrogenase zu einer Iminoverbindung reduziert wird und diese statt einer enzymatischen Weiterreduktion zum aro­ matischen Amin durch Reaktion mit einem farbgebenden nicht­ oxidativen Nachweisreagenz kolorimetrisch bestimmt wird.

Außerdem wurde ein Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten durch enzymatische Oxidation des Analyten enthaltend eine PQQ-abhängige Dehydrogenase und einen di­ rekten Elektronenakzeptor aus der Gruppe der elektronen­ reichen, aromatischen Nitrosoverbindungen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es entweder eine elektro­ nenreiche aromatische Nitrosoverbindung enthält, die bei enzymatischer Reduktion eine farbige Iminoverbindung bildet oder daß es weiterhin ein farbgebendes nichtoxidatives Nachweisreagenz für die aus der elektronenreichen aroma­ tischen Nitrosoverbindung durch Reduktion entstehende Imi­ noverbindung enthält.

Erfindungsgemäß wird unter "Analyt" eine solche Substanz verstanden, die enzymatisch oxidiert wird. In vielen Fällen wird der Analyt diejenige Substanz sein, die in der zu untersuchenden Probe direkt nachgewiesen oder quantitativ bestimmt werden soll. Beispielsweise kann Glucose direkt mit PQQ-abhängiger Glucosedehydrogenase (Glucose-dye-oxi­ doreduktase) oxidiert und kolorimetrisch bestimmt werden. Es ist jedoch auch möglich, daß der Analyt erst durch eine oder mehrere vorgeschaltete Reaktionen aus einer anderen Substanz gebildet wird, so daß durch kolorimetrische Be­ stimmung des Analyten indirekt auf die Konzentration der Ausgangssubstanz geschlossen werden kann.

Der Analyt ist in der vorliegenden Erfindung diejenige Sub­ stanz, die als Substrat der eingesetzten PQQ-abhängigen De­ hydrogenase akzeptiert wird.

PQQ-abhängige Dehydrogenasen enthalten als Cofaktor Pyrrol­ chinolinchinon. Eine Übersicht über solche "Chinoproteine" gibt J. A. Jongejahn et al. in "PQQ and Quinoproteins", Kluver Academic Publ. Dordrecht, Niederlande 1989. Beispie­ le für erfindungsgemäß einsetzbare Enzyme sind PQQ-ab­ hängige Glucosedehydrogenase (Glucose-dye-oxidoreductase, E.C 1.1.1.50/1.1.1.91/1.1.1.97), Alkoholdehydrogenase oder Lactatdehydrogenase. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann insbesondere die PQQ-abhängige Glucosedehydrogenase vorteilhaft für die kolorimetrische Bestimmung von Glucose eingesetzt werden.

Als direkte Elektronenakzeptoren, die die Elektronen von dem Enzym/ Cofaktorsystem Dehydrogenase/PQQ übernehmen, wer­ den elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindungen einge­ setzt, wie sie als Elektronenakzeptoren für Oxidasen und nicht-NADH-abhängige Dehydrogenasen aus EP-A-0 354 441 und EP-A-0 441 222 bekannt sind und bei denen eine Nitroso­ gruppe unmittelbar an einen elektronenreichen aromatischen Kern gebunden ist. "Direkte" Elektronenakzeptoren heißt, daß die Elektronen enzymkatalysiert direkt, ohne die Not­ wendigkeit eines Reduktionskatalysators, vom Enzym/Cofak­ torsystem übernommen werden.

Im erfindungsgemäßen Sinne als reduzierbare elektronenrei­ che aromatische Nitrosoverbindungen einsetzbare Verbindun­ gen sind solche, die die Elektronen, die bei der Oxidation des der eingesetzten PQQ-abhängigen Dehydrogenase ent­ sprechenden Substrates anfallen, von dem Enzym übernehmen und dabei Iminoverbindungen bilden. Eine entsprechende Iminoverbindung enthält eine Iminogruppe = NH, die über ihre Doppelbindung an den vormals aromatischen Kern gebun­ den ist und mit dessen Doppelbindungselektronen in Konjuga­ tion steht. Elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindun­ gen enthalten einen oder mehrere elektronenliefernde Reste oder Gruppen am oder im aromatischen Kern, die die Bildung einer Iminoverbindung begünstigen, indem sie durch Elek­ tronenabgabe über den vormals aromatischen Kern mit der Iminogruppe in Konjugation treten.

Dies sind zum einen Substituenten, die einen +M-Effekt auf den aromatischen Kern ausüben.

Beispiele für an einen aromatischen Kern gebundene Reste R mit +M-Effekt sind substituenten wie Hydroxy-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Monoalkylamino-, Monoarylamino-, Dialkylamino- und Diarylaminoreste.

Im Fall von Nitrosobenzolderivaten zeigen diese Substitu­ enten beispielsweise dann besonders ihre Wirkung, wenn sie in ortho und/oder in para-Position zur Nitrosogruppe ste­ hen.

Gruppen mit elektronenliefernden und eine Iminstruktur be­ günstigenden Effekt können auch Bestandteil eines hetero­ aromatischen Ringsystems sein.

Beispiele sind heterocylische aromatische Nitrosoverbin­ dungen mit einem π-Elektronenüberschuß, in denen das aro­ matische Ringsystem so elektronenreich ist, daß ein exter­ ner +M-Substituent für die Ausbildung einer iaesomeriestabi­ lisierten Imingruppe nach der Reduktion entbehrlich ist. Der π-Elektronenüberschuß resultiert daraus, daß mehr aro­ matische π-Elektronen vorhanden sind als Ringatome, über die sich die π-Elektronen verteilen können. Derartige Heterocyklen sind dem Fachmann bekannt.

Beispiele für solche aromatischen Heterocyclen sind Anti­ pyrin, Pyrazolo-Heterocyclen und Pyrazole.

Der Elektronenreichtum der erfindungsgemäß eingesetzten elektronenreichen aromatischen Nitrosoverbindungen hat den zusätzlichen Effekt, daß diese Nitrosoverbindungen zu einem gewissen Teil über Keto-Enol-Tautomerie mit der äquivalen­ ten Oximgrenzstruktor im Gleichgewicht stehen.

R - Ar - N = O <-< R′ = Ar′ = N - OH

Beide Tautomeriegrenzstrukturen sollen im Rahmen der Er­ findung mit dem Begriff "aromatische Nitrosoverbindungen" als erfindungsgemäß einsetzbare Substanzen umfaßt sein.

Bei den vorstehend genannten +M-Substituenten sind Alkoxy-, Alkylthio-, Monoalkylamino- und Dialkylaminoreste Reste, in denen Alkyl einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlen­ stoffatomen darstellt, der seinerseits durch eine Hydroxy­ gruppe, eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituierte Aminogruppe, PO₃H₂, SO₃H oder CO₂H substituiert sein kann. Die Säure­ reste PO₃H₂, SO₃H und CO₂H können als solche oder in Salz­ form als Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze vorliegen.

Aryloxy- und Arylthioreste enthalten aromatische Reste mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei Phenoxy- und Phenylthio­ reste besonders bevorzugt sind.

Ammoniumsalze sind solche, die das Ammoniumion NH₄+ enthal­ ten oder solche, die ein- oder mehrfach durch Alkyl-, Aryl- oder Aralkylreste substituierte Ammoniumkationen enthal­ ten. Alkyl in Alkyl- und Aralkylresten bedeutet einen Koh­ lenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Aryl in Aryl- und Aralkylresten ist ein 6 bis 10 Kohlenstoffatome zählendes aromatisches Ringsystem, wobei Phenyl bevorzugt ist. Ein bevorzugter Aralkylrest ist Benzyl.

Alkalisalze sind vorzugsweise solche des Lithiums, Natriums oder Kaliums. Erdalkalisalze sind vorzugsweise solche des Magnesiums oder Calciums.

Die im vorstehenden angegebenen Beispiele für +M-Sub­ stituenten sollen nicht als vollständige Aufzählung ver­ standen werden. Der Fachmann wird im Einzelfall wissen, ob ein gegebener Rest R ein +M-Substituent ist und an welcher Stelle er an einem aromatischen System diese Wirkung aus­ übt, oder welche aromatische Heterozyklen im Ringsystem eine entsprechende Gruppierung enthalten und insofern sollen alle diese Reste mögliche Substituenten in aroma­ tischen Nitrosoverbindungen sein, die gemäß der vorliegen­ den Erfindung eingesetzt werden können.

Das aromatische Grundgerüst der einzusetzenden aromatischen Nitrosoverbindung stellt bevorzugt einen elektronenreichen aromatischen Ring von 5-7, besonders bevorzugt 5-6 Koh­ lenstoff- oder Heteroatomen dar, der mit einem oder zwei aromatischen oder/und alicyclischen Ringen anelliert sein kann. Für die aromatischen anellierten Ringe kommen dabei sowohl kohlenstoffaromatische Systeme als auch heteroaroma­ tische Systeme mit je 5-7 bevorzugt 5-6 Kohlenstoff- oder Heteroatomen in Frage.

Unter alicyclischen Ringen werden gesättigte oder unge­ sättigte Cycloaliphaten mit 5-7 Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen, vorzugsweise 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ver­ standen. Unter Heteroatomen wird Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel verstanden.

Bevorzugte, erfindungsgemäß einsetzbare Nitrosoverbindungen sind Nitrosobenzolderivate.

Unter Nitrosobenzolderivaten wird auch Nitrosobenzol ver­ standen, das mit einem oder mehreren aromatischen oder/und alicyclischen Ringen anelliert ist. Als aromatische Ringe kommen hierbei sowohl kohlenstoffaromatische Systeme als auch Heteroaromaten mit je 5-7, bevorzugt 5 oder 6 Ring­ atomen in Frage. Beispiele sind anellierte Benzol- oder Naphthalinringe oder ein anellierter Pyridinring.

Besonders bevorzugt sind Nitrosobenzolderivate der allge­ meinen Formel I

wobei R¹
Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy COOH, PO₃H₂, oder SO₃H, Alkoxy, Alkylthio, Aryloxy, Arylthio, Halogen, oder Amino, das gegebenenfalls ein oder mehrfach durch Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, PO₃H₂₁ Dialkylphosphinyl, SO₃H oder CO₂H, substituiert ist, bedeutet
und R²
eine Hydroxygruppe, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthiogruppe bedeutet, wobei der Alkyl­ rest gegebenenfalls seinerseits durch eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl substitutierte Aminogruppe, PO₃H₂, SO₃H oder CO₂H als solche oder in Salzform als Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze substituiert ist, oder eine Aminogruppe NR³R⁴ bedeutet,
in der R³ und R⁴ gleich oder verschieden sein können, und Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe, die ihrerseits durch eine Hydroxy-, Alkoxy-, Hydroxyalkoxy-, eine gege­ benenfalls hydroxysubstituierte Polyalkoxygruppe, PO₃ H₂, SO₃H, COOH als solche oder in Salzform oder durch eine gegebenenfalls ein oder mehrfach durch Alkyl substituierte Aminogruppe substituiert sein kann, bedeutet, oder in der R³ und R⁴ einen Alkylenrest darstellen können, der gegebenenfalls durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen ist, wobei Stickstoff durch einen Alkyl-, Hydroxyalkyl-, Hydroxyalkoxyalkyl-, Alkoxyhydroxyalkyl-, Alkoxycarbonylalkyl-, Dioxanylyl-alkyl- oder Polyalkoxyal­ kylrest substituiert ist, der seinerseits jeweils gegebe­ nenfalls im Alkylteil durch einen Hydroxyrest substituiert sein kann, oder
wenn R¹ in ortho-Stellung zu NR³R⁴ steht, R³ oder R⁴ auch zusammen mit R¹ einen Alkylenrest darstellen kann.

Hierbei bedeutet Halogen Fluor, Chlor, Brom oder Jod. Fluor und Chlor sind besonders bevorzugt.

Alkyl in Alkyl, Alkoxy oder Alkylthio bedeutet einen Koh­ lenwasserstoffrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, Reste mit 1-3 Kohlenstoffatomen sind besonders bevorzugt. Die für Alkyl vorstehend gegebene Definition trifft auch für den Alkylteil in Hydroxyalkyl-, Dialkylaminoalkyl-, Hydroxyal­ koxyalkyl-, Alkoxyalkyl-, Polyalkoxyalkyl-, Alkoxy-hydroxy­ alkyl- und Dioxanylyl-alkylresten zu. Ein Dioxanylyl-alkyl­ rest ist ein Rest, bei dem ein Dioxanringsystem an einen Alkylrest gebunden ist. Vorzugsweise handelt es sich um ein 1,4-Dioxanringsystem, d. h.

Ein Polyalkoxyalkylrest ist ein Rest -Alkyl- (Alkoxy) -Alkoxy
mit n = 1-10. Bevorzugt ist n = 1-4. Besonders bevor­ zugt ist n = 1-3. Ein Alkylenrest ist eine geradkettige oder verzweigte - vorzugsweise geradkettige -, gesättigte oder ungesättigte - vorzugsweise gesättigte -, Kohlenwasser­ stoffkette aus 2-5, vorzugsweise 2-4 C-Atomen, mit zwei freien Bindungsstellen.

Aryl in Aryl- und Aralkylresten ist ein 6 bis 10 Kohlen­ stoffatome zählendes aromatisches Ringsystem, wobei Phenyl bevorzugt ist.

Ammoniumsalze sind solche, die das Ammoniumion NH₄+ enthal­ ten oder solche, die ein- oder mehrfach durch Alkyl-, Aryl- oder Aralkylreste substituierte Ammoniumkationen enthalten.

Alkalisalze sind vorzugsweise solche des Lithium, Natriums oder Kaliums. Erdalkalisalze sind vorzugsweise solche des Magnesiums oder Calciums.

Bevorzugte Reste R¹ sind Wasserstoff und Alkyl, insbeson­ dere Wasserstoff.

Bevorzugte Reste R² sind Alkoxyreste und die Aminogruppe NR³R⁴.

In der Bedeutung eines von R¹ und R³ durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochenen Alkylenrestes ist der durch Einbeziehung des Stickstoffatomes der allgemeinen Formel I gebildete Morpholin- bzw. Thiomorpholin- bzw. Piperazinrest bevorzugt. Der Piperazinrest ist besonders bevorzugt.

In der Bedeutung eines von R¹ und R³ gebildeten Alkylen­ restes ist der durch Einbeziehung des aromatischen Ringes der allgemeinen Formel I gebildete Indolin- oder 1,2,3,4- Tetrahydrochinolinrest bevorzugt.

Als Salz eines erfindungsgemäßen Nitrosoanilinderivates der allgemeinen Formel I werden insbesondere solche starker Säuren, insbesondere Mineralsäuren, wie Salzsäure, Schwe­ felsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure bevorzugt. Ganz be­ sonders bevorzugt sind Hydrochloride, das sind Salze der Salzsäure.

Bevorzugte Nitrosoverbindungen der allgemeinen Formel I sind:
N,N′-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin
N,N′-Dimethyl-p-nitrosoanilin
N,N′-Diethyl-p-nitrosoanilin
N-Methyl-N′-(4-nitrosophenyl)-piperazin
N-(2-hydroxyethyl)-5-nitrosoindol in
2,4-Dimethoxy-nitrosobenzol
N,N′-Bis-(2-methoxyethyl)-4-nitrosoanilin
N-(4-Nitrosophenyl)-morpholin
N-(2,2-diethoxy-ethyl)-N′-(4-nitrosophenyl)-piperazin p-Nitrosophenol
3-Methoxy-4-nitrosophenol.

Unter den elektronenreichen heteroaromatischen Nitrosover­ bindungen, deren aromatisches Ringsystem so elektronenreich ist, daß ein externer +M-Substituent für die Nitroso-/Oxim- Tautomerie und für die Iminbildung entbehrlich ist, sind besonders mit einer Nitrosogruppe substituierte Pyrazolone, Pyrazole und insbesondere nitrososubstituierte Pyrazoloverbindungen, wie sie zum Beispiel in Ullmann′s Enzyclopedia of Industrial Chemistry 5th ed., Vol A 20, Seite 72 bis 74, beschrieben sind, im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Bevorzugt sind dabei die 3-Nitroso­ pyrazolo-Verbindungen der allgemeinen Formel II.

Bekannt sind diese Verbindungen zum großen Teil als Vor­ stufe zur präparativen Synthese der entsprechenden 3-Amino­ pyrazoloverbindungen aus der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 433 854. In der Formel II bedeutet:

X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶

R⁵ Wasserstoff, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, Dialkylphosphinyl
R⁶ Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aryl, Arylthio, Aralkyl, gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder
Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei gege­ benenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste sub­ stituiert ist wobei, wenn Amino durch 2 Alkylreste substituiert ist, diese Reste auch zu einem Ring ge­ schlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres Stickstoffatom unter­ brochen sein kann, oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Acylgruppen, Alkoxy- oder/und Aralkoxycarbonylgruppen, H₂N-CO, Alkyl-, Aralkyl- oder/und Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen, und
R⁷ Alkyl, Thioalkyl oder Aralkyl, gegebenenfalls substi­ tuiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ oder Amino, das gegebenenfalls durch eine oder zwei Alkyl­ gruppen substituiert ist, die wiederum durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, Dialkylphosphinyl oder PO₃H₂ substituiert sein können,
wobei mindestens R⁶ und/oder R⁷ eine Aminogruppe darstellt, und
R⁸ eine Alkyl oder Aralkylgruppe, die gegebenenfalls durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ substituiert sein kann
oder wobei
R⁷ und R⁸ zusammen eine gesättigte oder ungesättigte Kette mit 3 oder 4 Gliedern aus Stickstoffatomen oder aus Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Stickstoff- oder Schwefelatomen, wobei Kohlenstoffatome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkyl­ reste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Alkyl oder Aralkyl gegebenenfalls durch Hydroxy, SO₃H, PO₃H₂, Carboxy oder Dialkylphosphinyl substituiert, substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubstituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist
sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze

Hierbei bedeutet "Alkyl" - auch in Alkylthio-, Dialkyl-phosphinyl-, Alkylcarbamoyl- und Aralkyl­ resten - einen geradkettigen oder verzweigten Alkyl­ rest mit 1-6, vorzugsweise 1-4 C-Atomen. Beispiele sind die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, iso-Butyl- oder tert.-Butylgruppe.

Wenn eine Aminogruppe durch 2 Alkylreste substituiert ist, können diese Reste auch so zu einem Ring ge­ schlossen sein, daß sie insgesamt einen durch ein Stickstoffatom unterbrochenen Ring darstellen. Bevor­ zugt sind hierbei solche Aminogruppen, die einen ins­ gesamt 5- oder 6gliedrigen Ring darstellen und der seinerseits gegebenenfalls durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen ist. Besonders bevorzugt ist der Morpholinorest.

"Alkoxy" - auch in Alkoxy- und Aralkoxycarbonylresten - steht für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1-6, vorzugsweise 1-4 C-Atomen. Beispiele sind die Methoxy-, Ethoxy-, Propyloxy-, iso-Butyloxy- oder tert.-Butyloxygruppe.

"Aryl" - auch in Arylcarbamoylgruppen - bezeichnet einen Kohlenstoffaromaten- oder Heteroaromatenrest, vorzugsweise einen solchen mit 6-10 Ring-Atomen, insbesondere die Phenyl- und die Naphthylgruppe, die zusätzlich noch durch Alkyl, Alkoxy oder/und Halogen substituiert sein können. Besonders bevorzugt ist der Phenylrest.

Ein "Aralkyl"-Rest - auch in einer Aralkylcarbamoyl­ gruppe -bedeutet einen Rest, bei dem eine wie vorste­ hend definierte Alkylgruppe durch einen wie zuvor charakterisierten Arylrest substituiert ist. Bevor­ zugt ist die Benzylgruppe.

Ein "Aralkoxy"-Rest, beispielsweise in Aralkoxycarbo­ nylgruppen, bezeichnet einen Rest, bei dem eine wie vorstehend definierte Alkoxygruppe durch einen wie zuvor charakterisierten Arylrest substituiert ist. Bevorzugt ist die Benzyloxygruppe.

"Halogen" steht für die Reste Fluor, Chlor, Brom und Jod. Fluor und Chlor sind bevorzugt.

Eine Acrylgruppe bezeichnet einen Carbonsäurerest, der Alkyl-, Aralkyl- oder Arylreste enthalten kann. Be­ vorzugt sind Acetyl-, Phenylacetyl- oder Benzoyl­ reste.

Unter einer Alkylengruppe wird eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlen­ wasserstoffkette aus 3-5, vorzugsweise 3 oder 4 C- Atomen mit zwei freien Bindungsstellen verstanden.

Beispiele sind -CH₂-CH=CH-,

-(CH₂)₄- oder -CH=CH-CH=CH-.

Bevorzugt sind der Butadiendiylrest (-CH=CH-CH=CH-) und der Tetramethylenrest (-(CH₂)₄-).

Ein Alkenylrest ist ein geradkettiger oder verzweig­ ter Kohlenwasserstoffrest aus 2-5 C-Atomen mit mindes­ tens einer Doppelbindung. Bevorzugt ist beispiels­ weise der Vinylrest. Unter einer Dialkylphosphinyl­ gruppe wird der Rest

verstanden, wobei Alkyl die zuvor gegebene Bedeutung hat. Bevorzugt ist der Dimethylphosphinylrest.

Als Salze von SO₃H, PO₃H₂ und Carboxyresten können Alkali- oder Erdalkalisalze oder Ammoniumsalze ein­ gesetzt werden. Unter Alkalisalzen werden Lithium Natrium-, Kalium-, Rubidium- und Cäsiumsalze verstan­ den, wobei Lithium-, Natrium- und Kaliumsalze, vor allem aber Natrium- und Kaliumsalze bevorzugt sind. Erdalkalisalze sind solche des Berylliums, Magnesiums, Calciums, Strontiums oder Bariums. Bevor­ zugt sind Magnesium- und Calciumsalze, wobei Calcium­ salze besonders bevorzugt sind. Als Ammoniumsalze können solche des unsubstituierten Ammoniumions, NH₄+, Verwendung finden. Es ist aber auch möglich, solche Ammoniumsalze einzusetzen, bei denen das Ammoniumion durch 1-4 Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl­ reste substituiert ist. Für diese Reste gelten die zuvor gegebenen Definitionen, wobei als Alkylrest Methyl, Ethyl und n-Propyl, als Arylrest die Phenyl­ gruppe und als Aralkylrest die Benzylgruppe besonders bevorzugt sind.

Als Carboxamidorest wird der Rest CONH₂ verstanden, aber auch solche Reste, bei denen die Aminogruppe durch ein oder zwei gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist.

In den erfindungsgemäß eingesetzten Nitroso-Verbin­ dungen der allgemeinen Formel II sind solche Verbin­ dungen bevorzugt, in denen R⁷ und R⁸ eine gesättigte oder ungesättigte Kette wie oben beschrieben bildet. Besonders bevorzugt ist dabei, wenn diese Kette unge­ sättigt ist und Doppelbindungselektronen und freie Stickstoffelektronenpaare der ungesättigten Kette in Konjugation zu der Doppelbindung oder zu dem Brücken- N-Atom der allgemeinen Formel II stehen, so daß ein anellierter aromatischer Ring resultiert.

Gegebenenfalls sind für eine Substanz der allgemeinen Formel II auch tautomere Formen möglich. Diese sollen ebenfalls als von der allgemeinen Formel II umfaßt gelten.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind Nitrosoverbindungen der allgemeinen Formeln III bis XII.

sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

Hierbei hat X-Y die gleiche Bedeutung wie zuvor be­ schrieben. R⁹, R¹⁰, R¹¹ und R¹², die gleich oder ver­ schieden sind, für Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido, Cyano, Amino, das gege­ benenfalls durch ein oder zwei gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxy­ carbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist oder Halogen, wobei zwei benachbarte Reste gegebenen­ falls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits ge­ gebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist und R¹³ Alkyl oder Aralkyl darstellt, das gegebe­ nenfalls durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂ oder Dialkylphosphinyl substituiert sein kann. Die Definitionen der Reste entsprechen den für die Substanzen der allgemeinen Formel II gegebenen.

Besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Verwen­ dung sind Substanzen der allgemeinen Formeln III, IV, V, VII, VIII und IX, gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze. Ganz besonders be­ vorzugt sind solche Substanzen, in denen X-Y die Be­ deutung N=CR⁶ hat, wobei R⁶ die Bedeutung haben kann wie für die allgemeine Formel II angegeben.

Als hervorragend geeignet für die erfindungsgemäße Verwendung haben sich insbesondere die Verbindungen 3-Nitroso-2-methyl-pyrazolo-[1.5a]-pyridin, 3- Nitroso-pyrazolo-[1.5a]-pyridin und 3-Nitroso­ pyrazolo [3.2-c]-s-triazol und deren Salze, insbesondere das Hydrochlorid erwiesen.

Wie vorstehend ausgeführt, werden für das erfindungsgemäße Verfahren aromatische Nitrosoverbindungen mit der zu unter­ suchenden Probe und der PQQ-abhängigen Dehydrogenase in Kontakt gebracht. In EP-A-0 354 441 und EP-A-0 441 222 wird beschrieben, daß Oxidasen und nicht-NAD-abhängige Dehydro­ genasen aromatische Nitrosoverbindungen zu elektronenrei­ chen aromatischen Aminoverbindungen reduzieren, die wiede­ rum mit einem farbgebenden Kupplungsreagenz und einem Oxi­ dationsmittel durch oxidative Kupplung nachgewiesen wer­ den.

Überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß in An­ wesenheit eines nichtoxidativen farbbildenden Nachweis­ reagenzes für chinoide Iminoverbindungen und einer PQQ-ab­ hängigen Dehydrogenase, eine aromatische Nitrosoverbindung unter Analytoxidation nicht die vollständige, durch eine PQQ-abhängige Dehydrogenase katalysierte enzymatische Reduktion zum elektronenreichen aromatischen Amin durch­ läuft, sondern daß eine nach einer teilweisen enzymetischen Reduktion entstehende Iminozwischenstufe durch das nicht­ oxidative farbbildende Nachweisreagenz abgefangen und nach­ gewiesen werden kann.

Noch überraschender war, daß wenn bestimmte aromatische Nitrosoverbindungen gewählt werden, die schon einen chromo­ genen Rest tragen, diese aromatischen Nitrosoverbindungen in Gegenwart einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase zwar zur farbigen Iminoverbindung reduziert werden, die enzymatische Weiterreduktion zum aromatischen Amin im wesentlichen aber unterbleibt, so daß auch die farbige Iminoverbindung selbst ohne die Notwendigkeit der Reaktion mit einem farbgebenden Nachweisreagenz als Maß für die Menge des Analyten bestimmt werden kann. Beispiele für entsprechende erfindungsgemäß einsetzbare chromogene Nitrosoverbindungen werden unten ge­ geben.

Obwohl die Bandbreite der geeigneten elektronenreichen aro­ matischen Nitrosoverbindungen sehr groß ist, werden sie alle von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen als direkte Elek­ tronenakzeptoren akzeptiert. Essentiell scheint lediglich die Nitrosogruppe zu sein, die an einen elektronenreichen aromatischen Rest gebunden ist.

Es wird vermutet, daß die Reaktion nach folgendem Reak­ tionsschema am Beispiel des Nitrosoanilins dargestellt wer­ den kann:

Schema I

Die aromatische Nitrosoverbindung (1) wird unter Oxidation des Analyten zum aromatischen Hydroxylamin (2) reduziert, dieses spaltet spontan Wasser ab, wodurch eine chinoide Iminozwischenstufe (3) entsteht. Bevor diese weiter enzy­ matisch durch die PQQ-abhängige Dehydrogenase zum aroma­ tischen Amin reduziert wird, wie es aus EP-A-0 254 441 und EP-A-0 441 222 bekannt ist, kann sie beispielsweise durch ein Kupplungsreagenz (HR) abgefangen und als farbiges Kupp­ lungsprodukt (4) kolorimetrisch bestimmt werden oder sie enthält den chromogenen Rest des Kupplungsproduktes schon in der Ausgangsverbindung (5) und kann so nach enzymati­ scher Reduktion direkt als farbige Iminoverbindung (4) kolorimetrisch bestimmt werden.

Überraschend ist, daß spezifisch bei der Verwendung von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen die Iminozwischenstufe (3) erfindungsgemäß mit einem Nachweisreagenz abgefangen oder direkt nachgewiesen werden kann, ohne daß die weitere aus EP-A-0 354 441 bekannte enzymatische Reduktion zum Amin er­ folgt. Denn bei Verwendung von flavinabhängigen Oxidasen, die gemäß EP-A-0 354 441 ebenfalls aromatische Nitrosover­ bindungen reduzieren, gelingt ein Nachweis der Imino­ zwischenstufe nur zu einem geringen Teil, während der größ­ te Teil der Iminozwischenstufe unter Analytoxidation sehr schnell enzymatisch zum aromatischen Amin weiterreduziert wird.

Erfindungsgemäß kann der Nachweis der Iminoverbindung über ihre Eigenfarbe erfolgen.

Erfindungsgemäß kann der Nachweis der chinoiden Iminover­ bindung auch mit einem farbgebenden nicht-oxidativen Rea­ genz erfolgen. Farbgebend heißt, daß durch Reaktion des farbbildenden Reagenzes mit der Iminoverbindung eine far­ bige Substanz erhalten wird, deren Absorptionsmaximum ver­ schieden ist von dem der eingesetzten Nitrosoverbindung und des farbbildenden Reagenzes vor der Reaktion. Unter einem nicht-oxidativen farbgebenden Nachweisreagenz wird verstan­ den, daß das Nachweisreagenz mit einer nachzuweisenden Ver­ bindung unter Farbbildung reagiert, ohne daß das Nachweis­ reagenz auf die nachzuweisende Verbindung oxidierend wirkt, (z. B. durch ein im Nachweisreagenz enthaltendes zusätz­ liches Oxidationsmittel).

Der Nachweis der in dem erfindungsgemäßen Verfahren entste­ henden Iminoverbindung kann durch Reaktion eines farbbil­ denden Kupplungsreagenzes mit der Iminoverbindung erfolgen. Dabei wird eine farbige Substanz erhalten, die die Imino­ verbindung als Teilstruktur enthält. Der Nachweis kann aber auch so erfolgen, daß die Iminoverbindung ein Leukofarb­ stoffmolekül zu einem farbigen Molekül oxidiert.

Möglich ist auch die Kombination beider Nachweisprinzipien, indem ein Kupplungsreagenz mit einem Molekül der nachzuwei­ senden Iminoverbindung zu einem nicht-farbigen Leukofarb­ stoffmolekül kuppelt, das durch ein weiteres Molekül der Iminoverbindung zu einem Farbstoff oxidiert wird.

Solch farbgebende Nachweisreagenzien für Iminoverbindungen sind in großer Vielzahl bekannt. Prinzipiell kommen bei­ spielsweise alle Substanzen in Betracht, die mit oxidierten p-Phenylendiaminderivaten unter Farbbildung reagieren.

Beispiele für farbgebende Kupplungsnachweisreagenzien sind aromatische Verbindungen, vorzugsweise Phenol- und Naph­ tholverbindungen, die mit guten Abgangsgruppen, substi­ tuiert sind und damit diese Abgangsgruppen leicht und sehr schnell unter Farbbildung durch die nachzuweisende Imino­ verbindung substituieren können. Bevorzugte Beispiele sind 1-Naphthol-4-sulfonsäure, 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoe­ säure, 2,4-Dichlor-1-naphthol, Tatrazin oder Orange 1.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind zum Nachweis der Iminoverbindung auch Nachweisreagenzien einsetzbar, die nicht mit der Iminoverbindung kuppeln, sondern die unter Reduktion der Iminoverbindung zum Amin eine farbige Verbin­ dung bilden. Häufig geschieht dies unter Dimerisierung des Leukofarbstoffes. Geeignete Leukofarbstoffe sind dem Fach­ mann aus Nachweisverfahren für H₂O₂ oder Peroxidase be­ kannt. Beispiele für solche Leukofarbstoffe sind 1-Naph­ thylaminosulfonsäuren, Triarylimidazole (DE-OS 27 35 690) Diarylimidazole (US-P-4,919,890), Aminocarbazole (DE-OS 22 05 733, 23 38 932) Oxazole, Thiazole (EP-A-0 167 973) u. a.
Geeignet sind alle Leukofarbstoffe, die aufgrund ihres Redoxpotentials in der Lage sind, Iminoverbindungen zu re­ duzieren.

Schließlich lassen sich die Nachweisprinzipien der Kupplung mit einem Kupplungsreagenz und der Oxidation eines Leuko­ farbstoffes kombinieren, indem als Kupplungskomponente für Iminoverbindungen ein Reagenz eingesetzt wird, das mit der Iminoverbindung eine farblose Leukoverbindung bildet, die erst durch ein zweites Molekül der Iminoverbindung unter dessen Reaktion zum entsprechenden aromatischen Amin zum Farbstoff oxidiert wird. Die gebräuchlichsten, aus der Farbfotografie sehr gut bekannten sogenannten "Kuppler" sind Phenole, Naphthole, Aniline, Naphthylamine sowie deren Derivate und methylenaktive Verbindungen. Eine Übersicht über diese Art von Kupplern gibt T. H. James in "The Theory of the Photographic Process" 3rd ed., Mc Millan, New York, 1966, Chapter 17 auf den Seiten 385-390.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird so durchgeführt, daß die zu untersuchende Probe mit einer PQQ-abhängigen Dehy­ drogenase, einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen elektronenreichen aromatischen Nitrosoverbindungen und einem Nachweisreagenz für Iminoverbindungen gleichzeitig kontaktiert wird. Enthält die Probe einen Analyten, der von der PQQ-abhängigen Dehydrogenase oxidiert wird, reagiert die aromatische Nitrosoverbindung unter enzymatischer Re­ duktion zur entsprechenden Iminoverbindung. Diese reagiert mit dem farbbildenden Nachweisreagenz, so daß die entsteh­ ende Farbe mit der Konzentration des Analyten in der Probe korreliert werden kann. Die Farbmessung kann direkt visuell durch Vergleichsfarben oder photometrisch geschehen.

Ein besonders einfaches Verfahren zum oxidativen Nachweis von Analyten liegt dann vor, wenn die durch Reduktion der aromatischen Nitrosoverbindung entstehende Iminoverbindung selbst farbig ist und nicht erst durch Kupplung mit einem farbgebenden Nachweisreagenz oder durch Oxidation eines Leukofarbstoffes nachgewiesen werden muß. Farbige Iminover­ bindungen sind an sich wie oben beschrieben dem Fachmann aus der Farbfotographie und aus analytischen Nachweisver­ fahren bekannt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zum oxidativen Nachweis eines Analyten durch direkte Messung einer farbigen chino­ iden Iminoverbindung haben sich Nitrosoanilinverbindungen der Formel XIII als direkte chromogene Elektronenakzeptoren als besonders geeignet erwiesen, die zu einem farbigen Chinondiimin der Formel XIV reduziert werden.

R¹ in der allgemeinen Formel XIII bedeutet Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Alkoxy, Alkylthio, Aryloxy oder Arylthio, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, PO₃H₂ oder SO₃H, Amino gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert durch Alkyl, das wiederum gegebenenfalls durch Hydroxy, PO₃H₂, Dialkylphosphinyl, SO₃H oder Carboxy substituiert sein kann
X-Y bedeutet NR⁵-CO oder N=CR⁶ wobei R⁵ und R⁶ die gleiche Bedeutung hat wie in der allge­ meinen Formel II und
A bedeutet eine gesättigte oder ungesättigte Kette aus drei Gliedern mit einem Stickstoff oder Schwefelatom und zwei Kohlenstoffatomen oder zwei Stickstoffatomen und einem Kohlenstoffatom darstellt, wobei Kohlenstoffatome gegebe­ nenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbo­ nyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy-, oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Wasserstoff, Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch SO₃H₂ oder Dialkyl­ phosphinyl, oder durch Aralkyl substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubstituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist,
sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

Die Bedeutung der einzelnen Substituenten ist dabei die gleiche wie in den Verbindungen mit der allgemeinen Formel II.

Bevorzugte Reste für R₁ sind dabei Wasserstoff und Alkyl und für X-Y die Gruppe N=CR⁶.

Besonders bevorzugt bildet A mit dem benachbarten Heterocyclus einen Imidazol, Triazol- Benzimidazol-, Thiazol- oder Dihydroimidazol-Ring, dessen Kohlenstoffatome die in der allgemeinen Definition von A gegebenen Substituenten tragen können. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der Imidazolring.

Besonders bevorzugte Verbindungen sind:

• 1) (2,4-Dimethyl-pyrazolo-[1.5a]-imidazol-3-yl)-(4- nitrosophenyl)-amin
• 2) (4-Methyl-pyrazolo-[1.5a)-imidazol-3-yl)-(4-nitroso­ phenyl)-amin
• 3) (4-(Dimethylphosphinylmethyl)-2-methyl-pyrazolo-[1.5a]- imidazol-3-yl)-(4-nitrosophenylamin)
• 5) (5,6 Dihydro-4-dimethylphosphinylmethyl-2-methyl­ pyrazolo-[1.5a]imidazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)-amin
• 6) (4-(Dimethylphosphinylmethyl-2-methyl-pyrazolo-[1.5a] imidazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)-amin
• 7) (2,6-Dimethyl-4-dimethylphosphinylmethyl-pyrazolo-[3.2- c]-s-triazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)-amin.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, daß durch Reduktion der aromatischen Nitrosoverbindung direkt eine farbige Chinondiiminverbindung der Formel XVII ent­ steht, so wird die zu untersuchende Probe mit einer PQQ-ab­ hängigen Dehydrogenase und einer oder mehreren elektronen­ reichen aromatischen Nitrosoverbindungen der allgemeinen Formel XVI gleichzeitig kontaktiert. Enthält die Probe einen Analyten, der von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen oxi­ diert wird, reagiert die elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindung zum entsprechenden farbigen Chinondiimin. Der zusätzliche Elektronenreichtum des an den chromogenen elektronenreichen Pyrazolring ankondensierten Ringes A be­ wirkt, daß überraschenderweise die gebildete Chinondiimin­ verbindung nicht mehr weiter enzymatisch zum entsprechenden Amin reduziert wird, sondern daß die farbige Chinondiimin­ verbindung direkt in Form einer Lichtabsorptionsmessung ge­ messen und mit der Konzentration des Analyten in der Probe korreliert werden kann. Um eine schnelle enzymatische Re­ duktion der chromogenen aromatischen Nitrosoverbindungen zu erzielen, ist es besonders vorteilhaft, wenn diese aus­ reichend gut löslich sind. Besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren beim Einsatz von chromogenen Nitrosoaromaten der Formel XIII ist es, wenn deren Konzen­ tration in Lösung mindestens 10^-3 mol/l, bevorzugt, mindes­ tens 10^-2 mol/l, beträgt.

Eine gute Löslichkeit kann insbesondere dadurch erreicht werden, daß die chromogene Nitrosoverbindung mit hydro­ philen Gruppen versehen wird.

Entsprechend ausnehmend gut im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete chromogene Nitrosoverbindungen sind beispiels­ weise die vorstehend genannten Verbindungen 3, 4 und 7.

Das Verfahren kann in einem sogenannten Naßtest, zum Bei­ spiel einer Küvette oder als sogenannter Trockentest auf einem entsprechenden Reagenzträger durchgeführt werden, wo­ bei die notwendigen Testreagenzien auf einem Testträger insbesondere einem saugfähigen oder quellbaren Material vorliegen. Solche Testträger sind zum Beispiel aus DE-A-3 247 608, EP-A-0 262 445 oder EP-A-0 256 806 bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten durch enzyma­ tische Oxidation, wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet ist. Ein solches Mittel enthält neben der für enzymatische Oxidation des zu bestimmenden Analyten notwendigen PQQ-ab­ hängigen Dehydrogenase und neben mindestens einer aroma­ tischen Nitrosoverbindung als direktem Elektronenakzeptor, der die bei der enzymatischen Oxidation des Analyten frei­ werdenden Elektronen von dem PQQ/Dehydrogenase-System über­ nimmt, weiterhin zusätzlich ein farberzeugendes nichtoxida­ tives Nachweisreagenz für Iminoverbindungen.

Als PQQ-Dehydrogenasen, aromatische Nitrosoverbindungen und farbbildende Nachweisreagenzien für chinoide Iminoverbin­ dungen werden die vorstehend für das erfindungsgemäße Ver­ fahren beschriebenen Stoffe eingesetzt. Werden in den er­ findungsgemäßen Verfahren elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindungen der Formel XIII eingesetzt, die einen am Anilinstickstoff gebundenen chromogenen Rest schon ent­ halten, so enthält das Mittel vorteilhafterweise kein farberzeugendes Nachweisreagenz für Iminoverbindungen, da das bei Reduktion entstehende Chinondiimin der Formel XIV schon farbig ist.

Zur Einhaltung eines für die Durchführung des Verfahrens geeigneten pH-Wertes, der sich insbesondere nach den ein­ zusetzenden Enzymen und nach dem Nachweisreagenz für die Iminoverbindung richtet, enthält das erfindungsgemäße Mittel ein Puffersystem. Vorteilhafterweise enthält das Mittel ein Puffersystem, das in der Testlösung einen pH- Wert zwischen 4-9 einstellt. Insbesondere vorteilhaft ist ein leicht saurer pH-Wert zwischen 5 und 6,5.

Das erfindungsgemäße Mittel kann in Form einer Lösung oder auf einem saugfähigen oder quellbaren Träger aufgezogen vorliegen. In Form einer Lösung enthält das Mittel vorzugs­ weise sämtliche für das erfindungsgemäße Verfahren benötig­ te Reagenzien. Als Lösungsmittel kommen bevorzugt Wasser, aber auch Mischungen mit wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methanol, Ethanol, Aceton oder Dimethylformamid in Frage. Aus Haltbarkeitsgründen kann es vorteilhaft sein, die für den Test benötigten Reagenzien auf zwei oder mehreren Lösungen zu verteilen, die erst bei der eigentlichen Untersuchung vermischt wer­ den. Zweckmäßigerweise ist aber darauf zu achten, daß die aromatische Nitrosoverbindung und das Nachweisreagenz für Iminoverbindungen vor Testbeginn in einer Lösung vorliegen. Die Konzentration der eingesetzten aromatischen Nitrosover­ bindungen richtet sich nach der Konzentration des zu messenden Analyten.

Typische Konzentrationen für die im erfindungsgemäßen Ver­ fahren zu messenden Analyte sind 10^-6-10^-2 mol/l, insbe­ sondere 10^-5-10^-3 mol/l. Entsprechend sind typische Konzentrationen der eingesetzten Nitrosoverbindungen 10^-4- 10^-1 mol/l. Um eine ausreichend schnelle enzymatische Re­ duktion zu erzielen sind Konzentrationen der Nitrosover­ bindungen, insbesondere der chromogenen Nitrosoverbindungen der Formel XIV, von über 10^-3 mol/l besonders vorteilhaft. Die Konzentration der eingesetzten PQQ-abhängigen Dehydro­ genase richtet sich nach deren Aktivität und der Konzentra­ tion des Analyten. Typische Werte für Enzymkonzentrationen sind 1mU/ml-1U/ml bei Küvettentests.

Nachweisreagenzien für Iminoverbindungen werden mindestens im stöchiometrischen Verhältnis zu den eingesetzten Nitrosoverbindungen eingesetzt, bevorzugt in einem 1,5-2 fachen Überschuß.

Das erfindungsgemäße Mittel kann auch in Form eines Test­ streifens vorliegen. Solche Teststreifen sind in verschie­ densten Ausführungsarten bekannt, zum Beispiel aus EP-A-0 016 387, DE-A-32 47 608, EP-A-0 262 445 oder EP-A-0 256 806. In einem Teststreifen liegen die zur Durchführung des Be­ stimmungsverfahrens benötigten Reagenzien auf festen Trä­ gerschichten vor. Als Trägerschichten kommen insbesondere saugfähige und/oder quellbare Materialien in Frage, die von der zu untersuchenden Probenflüssigkeit benetzt werden. Beispiele sind Gelatine, Cellulose oder Kunstfaservliese. In oder auf diesen Trägermaterialien liegen die Reagenzien in fester Form vor. Bei Aufgabe der Probenflüssigkeit auf den Teststreifen oder Eintauchen des Teststreifens in die Probenflüssigkeit, bildet sich in den streifen ein flüssi­ ges Milieu aus, innerhalb dessen die Nachweisreaktion ab­ läuft. Die durch die Reaktion verursachte Farbbildung kann visuell oder photometrisch, zum Beispiel reflexionsphoto­ metrisch ausgewertet werden.

Die bevorzugten Konzentrationen der einzelnen Reagenzien auf Teststreifen betragen:
Analyt typischerweise 10^-4 bis 10^-1 M
Nitrosoverbindung 10^-3 bis 1M
nichtoxidatives Nachweisreagenz 10^-3 bis 1M
Enzym 0,1 bis 100 U pro Testfeld.

Die vorliegende Erfindung bietet den Vorteil, daß keine un­ spezifischen Reduktionskatalysatoren wie Diaphorase oder Methylphenazinium-methosulfat zur Reduktion eines Elektro­ nenakzeptors notwendig sind, sondern daß dessen Reduktion direkt über ein spezifisches Analyt/Enzymsystem erfolgt. störende Nebenreaktionen können so vermieden werden. Durch den Einsatz von Nitrosoverbindungen als Elektronenakzepto­ ren tritt keine Limitierung des Elektronenakzeptors bei­ spielsweise durch zu langsame Diffusion mehr auf, wie dies bei Sauerstoff als Elektronenakzeptor der Fall ist. Pro Äquivalent der nachzuweisenden Iminozwischenstufe wird nur ein Äquivalent des Analyten oxidiert. Dies bewirkt eine hohe Empfindlichkeit des Analytnachweises. Ferner werden keine Oxidationsmittel für die Reaktion mit einem farber­ zeugenden Reagenz benötigt. Deshalb kann auch die gesamte Nachweisreaktion ohne Störung in einer Stufe und in einer gemeinsamen Lösung durchgeführt werden. Die große Bandbrei­ te der einzusetzenden farbbildenden Nachweisreagenzien, unter anderem solche, die aus der Farbfotografie bekannt sind, erlaubt eine nahezu freie Auswahl der Wellenlänge bei der die Messung durchgeführt werden soll und des Extink­ tionskoeffizienten der die Empfindlichkeit der Messung be­ stimmt.

Ganz besonders einfach gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren, wenn direkt eine farbige Iminoverbindung gebil­ det und eine Reaktion mit einem farbgebenden Reagenz unnö­ tig wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind neue chromogene Nitrosoanilinverbindung der Formel XIII

wobei
R¹ Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Alkoxy oder Alkylthio, Aryloxy oder Arylthio, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, PO₃H₂ Alkyl, Dialkylphosphinyl oder SO₃H, Amino gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert durch Alkyl, das wiederum gegebenenfalls durch Hydroxy, PO₃H₂, SO₃H oder Carboxy substituiert sein kann, bedeutet,
und NR⁵ -CO oder N=CR⁶ bedeutet,
X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶ bedeutet, wobei
R⁵ Wasserstoff, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, Dialkylphosphinyl und
R⁶ Wasserstoff, Alkyl gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Dialkylphosphinyl, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder
Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei gegebenen­ falls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist, wobei, wenn Amino durch 2 Alkylreste substituiert ist, diese Reste auch zu einem Ring geschlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres stickstoffatom unterbrochen sein kann, oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Acylgruppen, Alkoxy- oder/und Aralkoxy­ carbonylgruppen, H₂N-CO, Alkyl-, Aralkyl- oder/und Aryl­ carbamoylgruppen substituiert ist; oder Wasserstoff, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen und A eine gesättigte oder ungesättigte Kette aus drei Gliedern mit einem Stickstoff oder Schwefelatom und zwei Kohlen­ stoffatomen oder zwei Stickstoffatomen und einem Kohlen­ stoffatom darstellt, wobei Kohlenstoffatome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy-, oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substi­ tuiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Wasserstoff, Alkyl, ge­ gebenenfalls substituiert durch Hydroxy, SO₃H, Carboxy, PO₃H₂ oder Dialkylphosphinyl, oder durch Aralkyl substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubstituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist,
sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

Die Bedeutung der einzelnen Substituenten ist dabei die gleiche wie in der Verbindung mit der allgemeinen Formel II.

Bevorzugte Reste R₁ sind Wasserstoff und unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl. X-Y bildet bevorzugt die Gruppe N=CR⁶ wobei R⁶ bevorzugt Wasserstoff oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl darstellt.

Bevorzugt bildet A mit dem benachbarten Heterocyclus einen Imidazol-, Triazol-, Benzimidazol-, Thiazol- oder Dihydro­ imidazol-Ring, in denen die Bedeutung der Ring-Substituen­ ten denen der allgemeinen Formel III entspricht.

Ganz besonders bevorzugt bildet A einen Imidazolring. Besonders bevorzugte Verbindungen sind:

• 1) (2,4-Dimethyl-pyrazolo-[1.5a]-imidazol-3-yl)-(4- nitrosophenyl)-amin
• 2) (4-Methyl-pyrazolo-[1.5a)-imidazol-3-yl)-(4- nitrosophenyl)-amin
• 3) (4-(Dimethylphosphinylmethyl)-2-methyl-pyrazolo-[1.5a]- imidazol-3yl)-(4-nitrosophenylamin)
• 5) (5,6 Dihydro-4-dimethylphosphinylmethyl-2 methylpyrazolo-[1.5a]-imidazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)- amin
• 6) (4-(Dimethylphosphinylmethyl-2-methyl-pyrazolo-[1.5a] imidazol-3-yl-(4-nitrosophenyl)-amin
• 7) (2,6 Dimethyl-4-dimethylphosphinylmethyl-pyrazolo-[3.2- c]-s-triazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)-amin.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel XIII erfolgt nach an sich bekannten Methoden, wie sie von J.T. Hays et al. im J. Org. Chem. 32, 158 (1967) beschrieben wurden. Dazu werden Ether, bevorzugt Methyl­ ether, von p-Nitrosophenolderivaten unter Protonenkatalyse mit entsprechenden 3-Amino-heterocyclen umgesetzt. Unter Substitution der Methoxygruppe entstehen sekundäre Amine der Formel XIII.

Die verwendeten Hetarylamine sind entweder in der Literatur beschrieben oder können analog den bekannten Verfahren her­ gestellt werden. Insbesondere sind Aminoverbindungen, die als Grundbaustein Pyrazolo-Heterocyclen enthalten, in EP-A-0 433 854 beschrieben.

Die als Zwischenprodukte benötigten Aminoverbindungen liegen in der Regel aus Haltbarkeitsgründen als Salze von starken Säuren, z. B. Mineralsäuren vor. Zur Umsetzung mit p-Nitrosoanisolen werden bevorzugt die freien Basen der Aminoverbindungen eingesetzt, die man nach üblichen Methoden z. B. durch Auflösen der Salze in Wasser, Zugabe von Base bis zu einem pH 8-10 und Extraktion der freien Base mit einem organischen Lösungsmittel beispielsweise Essigester oder Methylenchlorid erhält. Alternativ dazu kann man, insbesondere bei schwer extrahierbaren Aminover­ bindungen folgendermaßen vorgehen: Man löst die Aminover­ bindung in Methanol, gibt dann eine Base z. B. NaHCO₃- Lösung, Triethylamin usw. zu, bis der pH-Wert der Methanol­ lösung auf einem nassen pH Papier etwa den Wert 5-6 er­ reicht hat. Anschließend setzt man den zweiten Reaktions­ partner, das p-Nitrosoanisol, zu.

Beispiel 1

Glucose-Bestimmung mit PQQ-abhängiger Glucose-Dye-Oxido­ reductase und 1-Naphthol-Sulfonsäure als Kupplungsreagenz.
In einer Küvette wurden gemischt:
0,38 ml Citratpuffer/Pyrophosphatpuffer (50mM) pH 7,5
0,40 ml N,N- Bis (2-hydroxyethyl)-4-nitrosoanilin (5mM in Puffer)
0,20 ml 1-Naphthol-4-Sulfonsäure (10 mM in H₂O) als Kupplungsreagenz
0,01 ml Probelösung (0-40 mM Glucose)

Der Test wurde durch Zugabe von 0-01 ml Enzymlösung (Glucose-Dye-Oxidoreduktase, EC 1.1.99.17, 900 U/mg, 800 U/ml) gestartet und die Extinktionsänderung bei 606 nm ge­ messen. Konstante Extinktionswerte wurden nach maximal 5 Minuten erreicht (Fig. 1).

Beispiel 2

Glucosenachweis mit PQQ-abhängiger Glucose-Dye-Oxidoreduk­ tase und 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure als Nachweis­ reagenz.
Meßansatz (Endkonzentrationen)
100 mM Citratpuffer pH 5,8
 10 mM 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure   1 mM N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-4-nitrosoanilin
 10 U/ml Glucose-Dye-Oxidoreduktase
  0,1 M Natriumnitrat
100-500 mM Glucose

Mit zunehmender Glukosekonzentration wird eine zunehmende Bildung eines grünen Farbstoffes beobachtet (max.=700 nm, Fig. 2).

Beispiel 3

In gleicher Weise können die in Tabelle 1 aufgeführten weiteren Kupplungsreagenzien für Imine eingesetzt werden. Tabelle 1 gibt die nach der Kupplung des N,N-Bis(2- hydroxyethyl)-p-chinondiimins mit den aufgeführten Kupplern erhaltenen Absorptionsmaxima wieder.

Tabelle 1

Beispiel 4

Analog Beispiel 1 werden verschiedene in Tabelle 2 aufge­ führte elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindungen eingesetzt. Tabelle 2 gibt die nach Kupplung mit 1- Naphthol-2-Sulfonsäure oder 1-Naphthol-4-Sulfonsäure er­ haltenen Farben bzw. Absorptionsmaxima an.

Tabelle 2

Beispiel 5

Vergleich der Glukosebestimmung mittels Nachweis von Iminoverbindungen durch reduktive Kupplungen zwischen PQQ- abhängiger Glucose-Dye-Oxidoreduktase und Glucose-Oxidase.
In einer Küvette werden vorgelegt:
100 mM Phosphatpuffer pH 7,5
  1 mM N,N-Bis- (2 hydroxyethyl)-4-nitrosoanilin
 10 mM 1-Naphthol-4-Sulfonsäure
100 U/ml Glucose-Dye-Oxidoreductase

Durch Zugabe von Glucose (0-60 mM) erhält man entsprechende Mengen an Farbe (Fig. 3).

Wird die Glucose-Dye-Oxidoreductase durch die gleiche Menge Glucose-Oxidase ersetzt, erhält man hingegen nur eine um den Faktor 8 geringere Farbausbeute, da ein Großteil der gebildeten Chinondiimin-Zwischenstufe von Glucoseoxidase unter Verbrauch von Glucose zum Phenylendiamin weiterreduziert wird (Fig. 4).

Beispiel 6

Glucosebestimmung mit PQQ-abhängiger Glucose-Dye-Oxido­ reductase mittels reduktiver Bildung von farbigen Iminover­ bindungen.

Reaktionsgleichung

                (3)                                                    (3a)
                orange/gelb                                            blau

Die Spektren von (3) und (3a) zeigt Fig. 5.
Meßansatz (Endkonzentration)
200 mM Citratpuffer pH 6
  1 mM p-Nitrosoanilin (Nr. 3 aus Tabelle 3)
  1 mM CaCl₂ 20 U/ml Mutarotase
 10 U/ml Glucose-Dye-Oxidoreductase

Nach Zugabe verschiedener Glucosemengen zwischen 0 und 50 µM Endkonzentration wurden 5 min. später die Extinktionsänderungen gemessen (Fig. 6).

Analog werden die Verbindungen aus Tabelle 3 eingesetzt. Tabelle 3 gibt die Absorptionsmaxima der eingesetzten Nitrosoverbindungen und der entstehenden farbigen Chinon­ diime an.

Tabelle 3

Beispiel 7

Bestimmung der Enzymaktivität einer PQQ-abhängigen Glucose- Dye-Oxidoreductase mittels reduktiver Bildung einer farbi­ gen Iminoverbindung aus einer aromatischen Nitrosoverbin­ dung.

Die im Beispiel 6 beschriebene Reaktion kann auch zur Messung der Enzymaktivität einer PQQ-abhängigen Dehydro­ genase benutzt werden.
Meßansatz (Endkonzentration
200 mM Citratpuffer pH 5,8
  1 mM p-Nitrosoanilin (3) aus Beispiel 6
  1 mM CaCl₂
 30 mM Glucose

Die kinetische Messung wurde mit 0-1 mU Glucose-Dye-Oxido­ reduktase gestartet und die Farbänderung zeitlich gemessen (Fig. 7).

Beispiel 8 (4-(Dimethylphosphinylmethyl)-2-methyl-pyrazolo-[1.5a]- imidazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)-amin (3)

13.7 g 3-Amino-2-methyl-4-(dimethylphosphinylmethyl)- pyrazolo-[1.5a]-imidazol Dihydrochlorid werden in 350 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird auf ca. 5°C abgekühlt und mit konz. wäßriger Natriumbikarbonatlösung versetzt, bis auf einem nassen pH-Papier ein pH-Wert von ca. 6 angezeigt wird. Dazu tropft man innerhalb von 30 min eine Lösung von 7.8 g p-Nitrosoanisol in 35 ml Methanol zu. Man rührt die Mischung 4 Stunden bei Raumtemperatur und hält den pH-Wert durch Zugabe von weiterer NaHCO₃-Lösung auf 6.

Das Reaktionsgemisch wird filtriert, mit ca. 150 ml Kiesel­ gel vermischt und zur Trockene eingedampft. Das Kieselgel wird auf eine Kieselgelsäule gepackt und das Produkt durch Eluieren mit Toluol/Methanol 2 : 1 isoliert. Man erhält 10.3 g einer schwarzbraunen Masse, die erneut über Kiesel­ gel mit Methylenchlorid/Methanol 12 : 1 chromatographiert wird. Man erhält 4.9 g der Titelverbindung mit dem Fp. 204° (unter Zersetzung).
R_f (Kieselgel) Toluol/Methanol 2 : 1 = 0.3
CH₂Cl₂/Methanol 12 : 1 = 0.21.

Herstellung des Ausgangsproduktes a) 4-Dimethylphosphinylmethyl-2-methyl-pyrazolo-[1.5a]- imidazol

37 g 2-Methyl-pyrazolo-[1.5a]-imidazol (J. Het. Chem. 10, 441 (1973)) werden in 370 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und mit 54.2 g Chlormethyl­ dimethylphosphanoxid und 119 g Kaliumcarbonat versetzt. Die Mischung wird 10 Std. bei 115° (Badtemp.) gerührt. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat einge­ dampft. Der Rückstand wird an Kieselgel chromato­ graphiert (Laufmittel Essigester/Methanol 2 : 1). Man erhält insgesamt 36.6 g der Titelverbindung als Mischung von braunen Kristallen und einem braunen Öl. DC (Kieselgel, Essigester/Methanol 2 : 1) R_f=0.2

b) 3-Amino-4-dimethylphosphinylmethyl-2-methyl-pyrazolo- [1.5a]-imidazol × 2 HCl

18 g der oben erhaltenen Verbindung werden in 25 ml konz. Salzsäure und 50 ml Wasser gelöst. Dazu tropft man bei 0° eine Lösung von 6.2 g Natriumnitrit in 25 ml Wasser. Nach 30 min bei 0° macht man die Lösung durch Zugabe von Natriumbicarbonatlösung leicht alkalisch und gibt dann portionsweise 21.4 g Natrium­ dithionit zu. Man rührt das Gemisch noch 30 min und versetzt es mit einer Lösung von 17 g Di-tert. -butyldi­ carbonat in 100 ml Dioxan. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Dioxan ab­ destilliert und der Rückstand mehrfach mit n-Butanol/Essigester 3 : 1 extrahiert. Der nach dem Trocknen und Eindampfen der organischen Phase ver­ bleibende Rückstand wird in 320 ml mit HCI gesättigtem Methanol gelöst. Man rührt noch 2 Stunden, kühlt im Eisbad ab und filtriert die ausgefallenen Kristalle ab. Es ergeben sich insgesamt 18.1 g der Titelverbindung. DC (Kieselgel, Toluol/Methanol 3 : 1) R_f=0.1.

Beispiel 9 (4-Nitrosophenyl)-2-methyl-(4-sulfopropyl-pyrazolo-[1.5a]- imidazol-3-yl)-amin (4)

Analog Beispiel 7 setzt man 3-Amino-4-sulfopropyl-pyrazolo- [1.5a]-imidazol mit p-Nitrosoanisol in Methanol um. Die Reaktionsmischung wird filtriert und das Filtrat einge­ dampft. Der Rückstand wird über Kieselgel mit Toluol/Methanol 2 : 1 chromatographiert. Das Produkt wird dann zur weiteren Reinigung auf eine Säule mit dem Ad­ sorberharz HP 2055 (Fa. Mitsubishi) gegeben und mit einem Stufengradienten von Methanol/Wasser 1 : 9 bis 2 : 8 eluiert. Man vereinigt die produkthaltigen Fraktionen, engt ein, nimmt in wenig Ethanol auf und fällt das Produkt durch Zugabe von Ether aus. Man erhält das Titelprodukt in Form eines braunen Pulvers.
DC (Kieselgel, Ethanol: R_f = 0.6,
Isopropanol/Essigsäurebutylester/Wasser 5 : 3 : 2: R_f=0.48)

Herstellung des Ausgangsproduktes a) 2-Methyl-4-sulfopropyl-pyrazolo-[1.5a]-imidazol

2-Methyl-pyrazolo-[1.5a]-imidazol wird mit Phenyldia­ zoniumsalz, das man in üblicher Weise durch Diazotieren von Anilin erhält, bei pH 2-5 umgesetzt. Das erhaltene 2-Methyl-3-phenylazo-pyrazolo-[1.5a]-imidazol (5.6 g) wird in 60 ml Dimethylformamid gelöst, mit 3.4 g Propansulton und 7 g Kaliumcarbonat versetzt. Man rührt das Gemisch 6 Std. bei 110°, gibt erneut 5 g Propan­ sulton und 7 g Kaliumcarbonat hinzu und rührt weitere 8 Stunden bei 110°. Nach dem Abkühlen wird filtriert und der Rückstand zweimal gut mit Methanol gewaschen. Die Lösung wird eingeengt und der Rückstand chromato­ graphisch an Kieselgel getrennt (Laufmittel Essig­ ester/Methanol/Wasser 75 : 15 : 10).
Ausbeute: 5.3 g gelbbraune Kristalle
DC (Kieselgel, Essigester/Methanol/Wasser 75 : 15 : 10)
R_f = 0.3.

b) 3-Amino-2-methyl-4-sulfopropyl-pyrazolo-[1.5a]- imidazol

4.3 g der oben erhaltenen Azoverbindung werden in 40 ml Eisessig gelöst und innerhalb 1 Stunde portionsweise mit 4 g Zinkpulver versetzt. Man rührt das Gemisch noch 30 min, saugt ab und dampft ein. Der Rückstand wird mit 30 ml Essigester verrieben, abgesaugt und das Filtrat verworfen. Man erhält 10.2 g eines graubraunen Pulvers, das zur Weiterverarbeitung rein genug ist.
DC (Kieselgel, Essigester/Aceton/Eisessig/Wasser 5 : 2 : 2 : 1)
R_f = 0.14

Beispiel 10

Analog zu Beispiel 8 oder 9 wurden die Verbindungen aus Tabelle 4 hergestellt. Die Synthese der Amino- Ausgangsverbindungen erfolgt auffolgende Weise:

a) Herstellung der Ausgangsverbindung zu 5 in Tabelle 4: 3-Amino-5,6-dihydro-,4-dimethylphosphinylmethyl-2-methyl pyrazolo-[1.5a]-imidazol

3.9 g 2-Methyl-pyrazolo-[1.5a]-imidazolin, 2.7 g Natrium­ acetat und 7. 4 g p-Methoxybenzoldiazonium-tetrafluoroborat werden in 40 ml Eisessig gelöst und die Lösung 1 Stunde auf 40-50° erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft, der Rückstand in NaHCO₃-Lösung und Essigester aufgenommen. Man extrahiert mit Essigester, trocknet und dampft ein. Der Rückstand wird durch Chromatographie über Kieselgel ge­ reinigt (Laufmittel: Essigester/Ligroin 1 : 1-2 : 1; Essigester; Essigester/Methanol 95 : 5). Man erhält 4.12 g der entsprechenden 3-Azoverbindung (DC: Kieselgel, Essig­ ester/Methanol 95 : 5; R_f = 0.5), die mit Chlormethyl­ dimethylphosphanoxid am Stickstoff des Imidazolinringes alkyliert wird. Die Überführung in die 3-Aminoverbindung erfolgt durch Reduktion der Azogruppe analog Beispiel 8b.

Zur Isolierung und Reinigung wird die rohe Aminoverbindung in weni 02734 00070 552 001000280000000200012000285910262300040 0002004311464 00004 02615g Wasser gelöst, mit festem Natriumbicarbonat ver­ setzt und eine Lösung der dreifachen molaren Menge an Di­ ter.-butyldicarbonat in Dioxan zugegeben. Man rührt das Ge­ misch über Nacht, dampft ein, extrahiert zunächst mit Ether, um Nebenprodukte zu entfernen und dann 5mal mit Methylenchlorid, um das Produkt zu isolieren. Man erhält die kristalline t-Butoxycarbonylverbindung (DC: Essig­ ester/Aceton/Eisessig/Wasser 50 : 25 : 12 : 5 : 12 : 5, R_f = 0.5), die zur Abspaltung der tert. Butoxycarbonylgruppe in 50 ml methanolischer Salzsäure gelöst wird. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur engt man auf die Hälfte ein und fällt das Produkt mit Ether aus. Man erhält die Titelver­ bindung als Hydrochlorid.
DC: n-Butanol/Eisessig/Wasser 2 : 1 : 1
R_f = 0.3

b) Herstellung der Ausgangsverbindung zu 6 in Tabelle 4: 3-Amino-4-dimethylphosphinylmethyl-2-methyl-pyrazolo- [1.5a]-benzimidazol

Die Titelverbindung wird analog Beispiel 10 durch Umsetzung von 2-Methyl-pyrazolo-[1.5a]-benzimidazol (J. prakt. Chem. 326, 829 (1984)) mit Phenyldiazoniumsalz, N- Alkylierung mit Chlormethyl-dimethylphosphanoxid und Reduktion der Azogruppe mit Zink in Eisessig durchgeführt. Man erhält die Titelverbindung als Trihydrochlorid-Dihydrat vom Fp. 192 (Zersetzung).
DC: Kieselgel, Isopropanol/Essigsäurebutylester/Wasser 50 : 30 : 20)
R_f = 0.38

c) Herstellung der Ausgangsverbindung zu 7 in Tabelle 4: 3-Amino-2,6-dimethyl-4-dimethylphosphinyl-pyrazolo-[3.2c]- s-triazol

6 g 2,6-Dimethyl-pyrazolo-[3.2c]-s-triazol werden in 65 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 3.9 g Chlor­ methyl-dimethylphosphanoxid und 8 g Kaliumcarbonat ver­ setzt. Man rührt das Gemisch 2 Stunden bei 100°, saugt heiß ab und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel Essigester/Methanol 4 : 1). Zur Verseifung und Decarboxylierung wird das Produkt 7 Stunden in conc. Salzsäure unter Rückfluß er­ hitzt. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft. Man erhält ein hellbraunes Öl.
DC (Kieselgel Essigester/Methanol 2 : 1)
R_f = 0.37

Die Umwandlung des oben erhaltenen Produktes in die 3-Aminoverbindung erfolgt analog dem in Beispiel 8 für die entsprechende 3-Aminopyrazolo-[1.5a]-imidazol beschriebenen Verfahren (8b). Man erhält die Titelverbindung als Hydrochlorid vom Fp. 225° (Zersetzung).
DC (Kieselgel Essigester/Methanol 3 : 1)
R_f = 0.2

Tabelle 4

Claims (25)

1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Ana­ lyten mittels enzymatischer Oxidation des Analyten mit einer Oxidoreduktase in Gegenwart eines direkten Elek­ tronenakzeptors aus der Gruppe der elektronenreichen aromatischen Nitrosoverbindungen und Bestimmung des re­ duzierten Elektronenakzeptors durch Farbbildung als Maß für die Menge des Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß die elektronenreiche aromatische Nitrosoverbindung unter Oxidation des Analyten in Gegenwart einer PQQ- abhängigen Dehydrogenase zu einer iminoverbindung redu­ ziert wird und diese ohne enzymatische Weiterreduktion zum aromatischen Amin durch Farbbildung nachgewiesen wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminoverbindung durch Reaktion mit einem nichtoxi­ dativen farbgebenden Nachweisreagenz kolorimetrisch be­ stimmt wird.

3. Verfahren gemäß Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als aromatische Nitrosoverbindung eine Verbindung der Formel I eingesetzt wird.
Wobei R¹ Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl gegebenenfalls substi­ tuiert durch Hydroxy, COOH oder PO₃H₂ SO₃H, Alkoxy, Alkylthio, Aryloxy, Arylthio, Halogen, oder Amino, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, PO₃H₂ Dialkylphosphinyl, SO₃H oder CO₂H, substituiert ist, bedeutet und R₂
eine Hydroxygruppe, Alkoxy, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthiogruppe bedeutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls seinerseits durch eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl substituierte Amino­ gruppe, PO₃H₂, SO₃H oder CO₂H als solche oder in Salzform als Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze substituiert ist, oder eine Aminogruppe NR₃R₄ bedeutet,
in der R³ und R⁴ gleich oder verschieden sein können, und Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe, die ihrerseits durch eine Hydroxy-, Alkoxy-, Hydroxy­ alkoxy-, eine gegebenenfalls hydroxysubstituierte Polylalkoxygruppe, PO₃H₂, SO₃H, COOH als solche oder in Salzform oder durch eine gegebenenfalls ein oder mehrfach durch Alkyl substituierte Aminogruppe substituiert sein kann, bedeutet, oder
in der R³ und R⁴ einen Alkylenrest darstellen können, der gegebenenfalls durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen ist, wobei Stickstoff durch einen Alkyl-, Hydroxyalkyl-, Hydroxyalkoxyalkyl-, Alkoxyhydroxyalkyl-, Alkoxycarbonylalkyl-, Dioxanylylalkyl- oder Polyalkoxyalkylrest substi­ tuiert ist, der seinerseits jeweils gegebenenfalls im Alkylteil durch einen Hydroxyrest substituiert sein kann, oder
wenn R¹ in ortho-Stellung zu NR³R⁴ steht, R³ oder R⁴ auch zusammen mit R¹ einen Alkylenrest darstellen kann.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als aromatische Nitrosoverbindung eine Verbindung der Formel II eingesetzt wird,
in der X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶ bedeutet, wobei
R⁵ H, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, Dialkylphosphinyl
R⁶ H, Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aryl, Arylthio, Aralkyl, gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Dialkylphosphinyl, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder
Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei ge­ gebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste sub­ stituiert ist wobei, wenn Amino durch 2 Alkylreste substituiert ist, diese Reste auch zu einem Ring ge­ schlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres Stickstoffatom unter­ brochen sein kann, oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Alkylgruppen, Alkoxy- oder/und Aralkoxycarbonylgruppen, H₂N-CO, Alkyl-, Aralkyl­ oder/und Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Wasserstoff, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen ist und
R⁷ Alkyl, Thioalkyl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ oder
Amino, das gegebenenfalls durch eine oder zwei Alkylgruppen substituiert ist, die wiederum durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, Dialkylphosphinyl oder PO₃H₂ substituiert sein können bedeutet
wobei mindestens R⁶ und/oder R⁷ eine Aminogruppe darstellt
R⁸ eine Alkyl oder Aralkylgruppe darstellt, die gegeben­ enfalls durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ substituiert sein kann
oder wobei
R⁷ und R⁸ eine gesättigte oder eine ungesättigte Kette mit 3 oder 4 Gliedern aus Stickstoffatomen oder aus Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Stickstoff- oder Schwefelatomen darstellt, wobei Kohlenstoffatome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy- Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Arylreste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Alkyl oder Aralkyl, durch ein oder zwei Alkylgruppen, Alkoxy- oder/und Aralkoxycarbonylgruppen, H₂ N-CO, Alkyl-, Aralkyl- oder/und Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Wasserstoff, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen ist und
R⁷ Alkyl, Thioalkyl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ oder
Amino, das gegebenenfalls durch eine oder zwei Alkylgruppen substituiert ist, die wiederum durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, Dialkylphosphinyl oder PO₃H₂ substituiert sein können bedeutet
wobei mindestens R⁶ und/oder R⁷ eine Aminogruppe darstellt
R⁸ eine Alkyl oder Aralkylgruppe darstellt, die gegeben­ enfalls durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ substituiert sein kann
oder wobei
R⁷ und R⁸ eine gesättigte oder eine ungesättigte Kette mit 3 oder 4 Gliedern aus Stickstoffatomen oder aus Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Stickstoff- oder Schwefelatomen darstellt, wobei Kohlenstoffatome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy- Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Arylreste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Alkyl oder Aralkyl, gegebenenfalls durch Hydroxy, SO₃H, PO₃H₂, Carboxy oder Dialkylphosphinyl substituiert, substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubstituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist
sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als aromatische Nitrosoverbindung eine Verbindung ein­ gesetzt wird, in der R⁷ und R⁸ eine gesättigte oder ungesättigte Kette bilden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als aromatische Nitrosoverbindung eine Verbindung der Formel III-XII eingesetzt wird. wobei
R⁹, R¹⁰, R¹¹ und R¹², die gleich oder verschieden sind, für Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido, Cyano, Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist oder Halogen stehen, wobei zwei benachbarte Reste gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist und R¹³ Alkyl oder anelliert ist und R¹³ Alkyl oder Aralkyl darstellt, das gegebenenfalls durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂ oder Dialkylphosphinyl substituiert sein kann.

7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-oxidative farbgebende Nachweisreagenz ein Kupplungsreagenz für Iminoverbindungen ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsreagenz ein Phenol-, Naphthol-, Anilin- oder ein Naphthylamiderivat eingesetzt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsreagenz 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoe­ säure, 2,4-Dibrom-1-naphthol oder 1-Naphthol-4-sulfon säure eingesetzt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Iminoverbindung durch Oxidation eines Leukofarb­ stoffes zu einem Farbstoff nachgewiesen wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Leukofarbstoff Diarylimidazole, Triarylimida­ zole oder Naphthylamine verwendet werden.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine aromatische Nitrosoanilinverbindung der allge­ meinen Formel XIII. eingesetzt wird, in der
R¹ Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Alkoxy, Alkylthio, Aryloxy oder Arylthio, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, PO₃H₂, oder SO₃H, Amino gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert durch Alkyl, das wiederum gegebenenfalls durch Hydroxy, PO₃H₂ Dialkylphosphinyl, SO₃H oder Carboxy substituiert sein kann, bedeutet und
X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶ darstellt, wobei
R⁵ H, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, Dialkylphosphinyl und
R⁶ H, Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aryl, Arylthio, Aralkyl, gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder
Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei gege­ benenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy­ oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkxylreste substituiert ist, wobei wenn Amino durch 2 Alkylreste substituiert ist, diese Reste auch zu einem Ring ge­ schlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres Stickstoffatom unter­ brochen sein kann oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Acylgruppen, Alkoxy- oder/und Aralkoxycarbonylgruppen, H₂N-CO, Alkyl-, Aralkyl­ oder/und Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen ist und
A eine gesättige oder ungesättigte Kette aus drei Glie­ dern mit einem Stickstoff- oder Schwefelatom und zwei Kohlenstoffatomen oder zwei Stickstoffatomen und einem Kohlenstoffatom darstellt, wobei Kohlenstoffatome ge­ gebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carbox­ amido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy-, oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Wasserstoff, Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch SO₃H₂, PO₃H₂ Carboxy oder Dialkylphosphinyl, oder durch Aralkyl substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubsti­ tuenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist, sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze,
die enzymatisch zu einem farbigen Chinondiimin rea­ giert, das kolorimetrisch als Maß für die Menge des Analyten bestimmt wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß A mit dem benachbarten Heterocyclus einen Imidazol-, Triazol-, Benzimidazol-, Thiazol- oder Dihydroimidazol-Ring bildet.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die aromatische Nitrosoverbindung in einer Konzentration von höher als 10^-3 mol/l eingesetzt wird.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-14, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als PQQ-abhängige Dehydrogenase Glukose-dye-oxidoreduktase zur Bestimmung von Glukose eingesetzt wird.

16. Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten durch enzymatische Oxidation des Analyten enthaltend eine PQQ-abhängige Dehydrogenase und eine elektronen­ reiche aromatische Nitrosoverbindung, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es weiterhin ein farbbildendes nichtoxi­ datives Nachweisreagenz für Iminoverbindungen enthält.

17. Mittel gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nitrosoverbindung der allgemeinen Formel I ent­ hält,
wobei R¹ Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl gegebenenfalls substi­ tuiert durch Hydroxy COOH, PO₃H₂ oder SO₃H, Alkoxy, Alkylthio, Aryloxy, Arylthio, Halogen, oder Amino, das gegebenenfalls durch Hydroxy, PO₃H₂ Dialkylphos­ phinyl, SO₃H oder CO₂H, substituiert ist, bedeutet
und R²
eine Hydroxygruppe, Alkoxy, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthiogruppe bedeutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls seinerseits durch eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl substituierte Amino­ gruppe, PO₃H₂, SO₃H oder CO₂H als solche oder in Salzform als Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze substituiert ist, oder eine Aminogruppe NR³R⁴ bedeu­ tet,
in der R³ und R⁴ gleich oder verschieden sein können, und Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe, die ihrerseits durch eine Hydroxy-, Alkoxy-, Hydroxy­ alkoxy-, eine gegebenenfalls hydroxysubstituierte Polyalkoxygruppe PO₃H₂, SO₃H oder CO₂H als solche oder in Salzform oder durch eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl substituierte Amingruppe substituiert sein kann, bedeutet, oder
in der R³ und R⁴ einen Alkylenrest darstellen können, der gegebenenfalls durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen ist, wobei Stickstoff durch einen Alkyl-, Hydroxyalkyl-, Hydroxyalkoxyalkyl-, Alkoxyhydroxyalkyl-, Alkoxycarbonylalkyl-, Dioxanylyl-alkyl- oder Polyalkoxyalkylrest substi­ tuiert ist, der seinerseits jeweils gegebenenfalls im Alkylteil durch einen Hydroxyrest substituiert sein kann, oder
wenn R¹ in ortho-Stellung zu NR³R⁴ steht, R³ oder R⁴ auch zusammen mit R¹ einen einen Alkylenrest dar­ stellen kann.

18. Mittel gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nitrosoverbindung der allgemeinen Formel II enthält, in der X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶ bedeutet, wobei
R⁵ H, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃ H₂, Dialkylphosphinyl
R⁶ H, Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aryl, Aralkyl, gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Dialkylphosphinyl, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder
Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei gege­ benenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste sub­ stituiert ist, wobei, wenn Amino durch 2 Alkylreste substituiert ist, diese Reste auch zu einem Ring ge­ schlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres Stickstoffatom unter­ brochen sein kann oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Acylgruppen, Alkoxy-, oder/und Aralkyl- oder/und Alkoxycarbonylgruppen, H₂N-CO, Achyl-, Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Wasserstoff, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen ist und
R⁷ Alkyl, Thioalkyl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ oder
Amino, das gegebenenfalls durch eine oder zwei Alkyl­ gruppen substituiert ist, die wiederum durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H Dialkylphosphinyl oder PO₃H₂ substituiert sein können bedeutet,
wobei mindestens R⁶ und/oder R⁷ eine Aminogruppe darstellt
R⁸ eine Alkyl oder Aralkylgruppe darstellt, die gegeben­ enfalls durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H oder PO₃H₂ substituiert sein kann
oder wobei
R⁷ und R⁸ eine gesättigte oder eine ungesättigte Kette mit 3 oder 4 Gliedern aus Stickstoffatomen oder aus Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Stickstoff- oder Schwefelatomen darstellt, wobei Kohlenstoffatome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aral­ kyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy- Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkyl­ reste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Alkyl oder Aralkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, SO₃H, PO₃H₂, Carboxy oder Dialkylphosphinyl substituiert, substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubstituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist
sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

19. Mittel gemäß einem der Ansprüche 16-18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es als nichtoxidatives Nachweisreagenz für Aminoverbindungen ein chromogenes Kupplungsreagenz für Iminoverbindungen oder einen Leukofarbstoff ent­ hält.

20. Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten durch enzymatische Oxidation des Analyten enthaltend eine PQQ-abhängige Dehydrogenase und eine elektronen­ reiche aromatische Nitrosoverbindung, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die elektronenreiche aromatische Nitroso­ verbindung eine Nitrosoanilinverbindung der Formel XIII ist wobei
R¹ Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Alkoxy oder Alkylthio, Aryloxy, Arylthio, Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, PO₃H₂, oder SO₃H, Amino gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert durch Alkyl, das wiederum gegebenenfalls durch Hydroxy, PO₃H₂ Dialkylphosphinyl, SO₃H oder Carboxy substituiert sein kann, bedeutet und
X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶ darstellt, wobei
R⁵ H, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂ oder Dialkylphosphinyl
R⁶ H, Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aryl, Aralthio, Aralkyl, gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Dialkylphosphinyl, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder
Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, ge­ gebenenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy­ oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste sub­ stituiert ist wobei diese Reste auch zu einem Ring geschlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres Stickstoffatom unter­ brochen sein kann, oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Acylgruppen, Alkoxy- oder/und Alkoxycarbonylgruppen, H₂N-CO, Alkyl, Aralkyl oder/und Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen ist und
A eine gesättigte oder ungesättigte Kette aus drei Gliedern mit einem Stickstoff- oder Schwefelatom und zwei Kohlenstoffatomen oder zwei Stickstoffatomen und einem Kohlenstoffatom darstellt, wobei Kohlenstoff­ atome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenen­ falls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy-, oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Wasserstoff, Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch SO₃H, PO₃H₂ Carboxy oder Dialkylphosphinyl, oder durch Aralkyl substituiert sind oder zwei benachbarte Ketten­ substituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls eine Alkylen­ gruppe bilden, die ihrerseits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist, sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

21. Mittel gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß A mit dem benachbarten Heterocyklus einen Imidazol-, Triazol-, Benzimidazol-, Thiazol- oder Dihydroimidazol- Ring bildet.

22. Testträger enthaltend ein Mittel gemäß einem der An­ sprüche 16-21.

23. Nitrosoanilinverbindungen der Formel XIII, wobei
R¹ Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Alkoxy oder Arylthio, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy. PO₃H₂, Alkyl, Dialkylphosphinyl oder SO₃H, Amino gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert durch Alkyl, das wiederum gegebenenfalls durch Hydroxy, PO₃H₂, SO₃H oder Carboxy substituiert sein kann, bedeutet und
X-Y NR⁵-CO oder N=CR⁶ darstellt, wobei
R⁵ H, Alkyl gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂ oder Dialkylphosphinyl
R⁶ H, Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aryl, Aralkyl, gegebenenfalls jeweils substituiert durch Hydroxy, Carboxy, SO₃H, PO₃H₂, ein Salz eines dieser Säurereste oder/und Alkoxycarbonyl; oder Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei gege­ benenfalls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy- oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste sub­ stituiert ist, diese Reste auch zu einem Ring ge­ schlossen sein können, der außer durch das N-Atom der Aminogruppe gegebenenfalls auch durch Sauerstoff, Schwefel oder ein weiteres Stickstoffatom unter­ brochen sein kann, oder Amino, das gegebenenfalls durch ein oder zwei Acylgruppen, Alkoxy- oder/und Aralkoxycarbonylgruppen, H₂N-CO, Alkyl-, Aralkyl­ oder/und Arylcarbamoylgruppen substituiert ist; oder Wasserstoff, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carboxamido oder Halogen ist und
A eine gesättigte oder ungesättigte Kette aus drei Gliedern mit einem Stickstoff- oder Schwefelatom und zwei Kohlenstoffatomen oder zwei Stickstoffatomen und einem Kohlenstoffatom darstellt, wobei Kohlenstoff­ atome gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxy, Aralkyl, Aryl, Carboxy, Carboxamido, Alkoxycarbonyl, Cyano, Halogen, Amino, das gegebenenfalls durch einen oder zwei, gegebenen­ falls einen oder mehrere Hydroxy-, Carboxy-, oder/und Alkoxycarbonylreste tragende Alkylreste substituiert ist, und wobei Stickstoffatome, die nicht über eine Doppelbindung gebunden sind, durch Wasserstoff, Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch SO₃H, PO₃H₂, Carboxyl, Dialkylphosphinyl oder Aralkyl substituiert sind oder zwei benachbarte Kettensubstituenten gegebenenfalls eine Alkylengruppe bilden, die ihrer­ seits gegebenenfalls mit Aryl substituiert oder anelliert ist, sowie gegebenenfalls entsprechende tautomere Formen und deren Salze.

24. Nitrosoanilinverbindungen gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß A mit dem benachbarten Heterocyklus einen Imidazol-, Triazol-, Benzimidazol-, Thiazol- oder Dihydroimidazol-Ring bildet.

25. Verwendung der Nitrosoanilinverbindungen gemäß einem der Ansprüche 23 oder 24 zur kolorimetrischen enzymati­ schen Bestimmung eines Analyten.