DE4310142A1 - Immunologisch aktive Konjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Immunologisch aktive Konjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung

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    • Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier

Description

Gegenstand der Erfindung sind immunolgisch aktive Konju­ gate aus Haptenen, Proteinen und Polymeren, welche stabil gebunden vorliegen.
Für die Bindung von Proteinen, Haptenen und Polymeren aneinander sind eine Vielzahl von Verfahren beschrieben. Üblicherweise werden zwei derartige Substanzen über bifunktionelle Linker kovalent gekoppelt. Ein Überblick der Methoden ist zu finden in M. Brinkley, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 2-13 und Wong, Chemistry of protein conjugating and cross-linking, CRC press 1991. Besonders bevorzugt ist die Kopplung über die Bildung einer Thioetherbindung (NH-SH-Kopplung) aus einer Malein­ imidylgruppe und einer Thiolgruppe.
Die Bindung über derartige Linker ist jedoch häufig nicht stabil, und bei Lagerung in flüssigem und lyophilisiertem Zustand erfolgt ein langsamer Zerfall dieser Konjugate. Dies ist insbesondere bei der Verwendung der Konjugate in Immunoassays nachteilig, da hierdurch Empfindlichkeit, Genauigkeit und Richtigkeit des Meßergebnisses beeinflußt werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, stabile, immunologisch aktive Konjugate bereitzustellen, die eine wesentlich stabilere Bindung der zu konjugieren­ den Substanzen besitzen, als die aus dem Stand der Technik bekannten Linker.
Die Aufgabe wird gelöst durch Konjugate der allgemeinen Formel
A-L1-L2-B
in der A und B die zu koppelnden Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe der Haptene, Proteine (z. B. Antikörper, Enzyme, wie POD, β-Galactosidase oder alkalische Phosphatase) Polysaccharide (wie z. B. Dextran) lösliche Polystyrole (z. B. Latices) oder Peptide (z. B. ED, Untereinheit der β-Galactosidase), L1 und L2 trivalente Linker darstellen und L1 und L2 über zwei Thioetherbin­ dungen miteinander verbunden sind.
Die Linker L1 und L2 sind chemische Verbindungen, die aus drei, über ein C-Atom gekoppelten, Seitenarmen (Spacer) bestehen. Zwei dieser Seitenarme des Linkers L1 enthalten jeweils eine Maleinimidogruppe und zwei der Seitenarme des Linkers L2 enthalten jeweils eine Thiolfunktion. Zur Kopplung der Substanzen A und B über die Linker L1 und L2 werden die beiden Maleinimidogruppen und die Thiolfunk­ tion durch SH-Gruppen-Addition an Maleinimid zu zwei Thioetherbindungen verknüpft.
Die erfindungsgemäß verwendeten Linker enthalten außer den beiden Maleinimido- bzw. Thiolfunktionen eine weitere Funktion, die zur Bindung der Linker an die zu koppelnden Substanzen A und B (beispielsweise Haptene, Proteine, Polymere oder Peptide) geeignet sind. Derartige Gruppen sind beispielsweise esteraktivierte Gruppen, wie N-Hy­ droxyestergruppen, Imidazolide, Pyridazolide, Aminoalkylcarbonsäuren oder aktivierte Arylestergruppen (z. B. p-Nitrophenylester). Die bevorzugte Kopplungsgruppe ist hier N-Hydroxysuccin-imid.
Zur Kopplung der Substanzen A und B werden vorzugsweise zwei homobidentale trifunktionelle Linker verwendet, von denen der erste Linker zwei Maleinimidogruppen und eine Hydroxysuccinimid- oder Carbodiimidazolylfunktion trägt und der zweite Linker zwei Thiolgruppen bzw. über Acylgruppen geschützte Thiolgruppen sowie ebenfalls eine Hydroxysuccinimid- bzw. Carbodiimidazolyl-funktion trägt.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate werden die zu koppelnden Substanzen, vorzugsweise über Hydroxysuccinimid- bzw. Carbodiimidazolylfunktionen, jeweils an einen der beiden homobidentalen trifunktionel­ len Linker gekoppelt und in einem zweiten Schritt die Maleinimidofunktionen mit den Thiolfunktionen zu zwei Thioetherbindungen umgesetzt.
Die hierbei verwendeten Verfahren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und beispielsweise in S. Mitra, J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 3097-3110 beschrieben.
Die Aktivierung von Proteinen über die N- Hydroxysuccinimid-Funktion kann beispielsweise durch nucleophile Substitution an der E-Aminogruppe der Lysin­ seitenkette von Proteinen im leicht alkalischen Puffer erfolgen. Hierzu wird ein 1- bis 15facher Überschuß an Linker, bezogen auf die zu derivatisierenden Aminogruppen des Proteins, verwendet. Durch Dialyse oder Gelchromato graphie werden das bei der Reaktion gebildete N-Hydroxy­ succinimid und der überschüssige Linker abgetrennt.
Aminogruppenhaltige Haptene können entweder in organi­ schen Medien, wie Dioxan oder DMF, unter Zusatz von Triethylamin, oder in Puffergemischen, bevorzugt Kalium­ phosphatpuffer, pH 7,5, mit äquimolaren Mengen an erfin­ dungsgemäß verwendeten Linkern umgesetzt werden.
Unter den drei Seitengruppen (Spacer), die den Linker darstellen, sind chemische Gruppen zu verstehen, deren Aufgabe die geeignete räumliche Anordnung von A, B und den Thioethergruppen ist und die die Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen Konjugate gewährleisten.
Sonstige Zusammensetzung und Länge der Funktionen der homobidentalen trifunktionellen Linker sind unkritisch. Beispiele, wie derartige Linker aufgebaut sein können, sind in der EP-A 0 446 071 beschrieben, wobei die homobi­ dentalen trifunktionellen Linker gemäß der Erfindung nicht wie die Linker gemäß der EP-A 0 446 071 drei Maleinimidofunktionen tragen dürfen, sondern lediglich zwei Maleinimidofunktionen und beispielsweise eine Hydroxysuccinimidfunktion bzw. zwei Thiolfunktionen und eine Hydroxysuccinimidfunktion. Weitere geeignete Linker sind beispielsweise in der EP-A 0 310 361 beschrieben, ebenfalls mit der Maßgabe, daß die Kopplungsgruppen homobidental aufgebaut sein müssen.
Analoges gilt für die in dem US-Patent 5,082,930 beschriebenen Linker.
Ebenfalls geeignete Linker sind beschrieben in der deutschen Patentanmeldung P . . . der Boehringer Mannheim GmbH, die mit gleichem Zeitrang wie die vorliegende Patentanmeldung zum Patent angemeldet wurde. Der Gegen­ stand dieser Patentanmeldung ist Gegenstand der Offenba­ rung der vorliegenden Patentanmeldung.
Bevorzugt ist es, als Spacergruppen im Linker gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppen, die durch Imid-, Ether-, Carbonyl- oder Carboxygruppen unterbrochen sind, zu verwenden. Die Länge der drei Spacergruppen ist ebenfalls unkritisch und im wesentlichen dadurch bestimmt, daß keine sterischen Hinderungen zwischen A und B sowie bei der Bildung der Thioetherbindungen erfolgen soll. Zweck­ mäßigerweise enthalten die Spacergruppen zwischen 2 und 40 Atome.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate, welches darin besteht, daß in einem ersten Schritt eine erste zu koppelnde Substanz A mit einem homobidentalen trifunk­ tionellen Linker L1, der zwei Maleinimidogruppen enthält, gekoppelt wird, in einem zweiten Schritt eine zweite zu koppelnde Substanz B mit einem homobidentalen trifunktio­ nellen Linker L2, der zwei Thiolfunktionen enthält, gekoppelt wird und beide so aktivierten zu koppelnden Substanzen durch eine SH-Gruppen-Addition an Maleinimid über zwei Thioetherbindungen miteinander verknüpft werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate zur Bestimmung von immu­ nologisch aktiven Substanzen in immunologischen Tests.
Dabei können die erfindungsgemäßen Konjugate beispiels­ weise zur Vermittlung der Bindung des Analyten an eine Festphase oder zur Bindung des Analyten an eine Markie­ rung (z. B. Enzyme) verwendet werden.
Besonders bevorzugt werden verwendet Antikörper/Enzymkon­ jugate, Antikörper/Biotinkonjugate, Hapten/Biotinkonju­ gate, Antikörper/Antikörper-Konjugate, Avidin/Strepta­ vidin/Antikörperkonjugate, Avidin/Streptavidin-Hapten­ konjugate.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert:
Beispiel 1 S,S-Diacetyl-6,8-dimercaptooktanoyl-bisphosphonat (Biphosphonat-LIPOS)
102.1 mg (3 mmol) Bisphosphonat (Formel 1) werden in 7 ml Wasser gelöst und mit 155.8 mg (0.4 mmol) LIPOS (Beispiel 2) in 4 ml Dioxan versetzt. Der pH-Wert wird mit verdünn­ tem Ammoniak auf PH 6-7 gestellt und 24 h bei 20°C gerührt. Anschließend werden weitere 78 mg (2 mmol) Verbindung der Formel 2 in 2 ml Dioxan gelöst, nachdo­ siert; 24 h später gibt man nochmals 39 mg (0.1 mmol) Verbindung der Formel 2 zu. Nach insgesamt 4 Tagen wird das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum entfernt, der Rückstand zweimal mit je 15 ml THF digeriert und der Überstand abdekantiert. Das Rohprodukt wird in 0.5 ml Wasser gelöst, mit Methanol gefällt und im Exsiccator über CaCl2 getrocknet.
Ausbeute: 20 mg (12% d.Th.)
DC: Cellulose, n-Butanol/Eisessig/Wasser (v/v/v 3/1/1), Detektion mit Ninhydrin
Rf = 0.58
1H-NMR(D20/TMS-Na-Salz): d = 1.30-2.00 (m, 10H, 5 CH 2); 2.23 (t, 2H, J=6.6 Hz, CH 2CO); 2.35 (s, 6H, CH 3-CO); 2.77 (s, 3H, N-CH 3); 2.77-3.70 ppm (m, 9H).
Beispiel 2 S,S-Diacetyl-6,8-dimercaptooktansäure-N-hydroxysuccin­ imidester (LIPOS) 2.1 Dihydroliponsäure
1.03 g (5 mmol) Liponsäure werden in 20 ml Wasser und 5 ml Ethanol gelöst, mit 380 mg (10 mmol) Natriumborhydrid versetzt und bei 20°C gerührt. Nach 60 min werden nochmals 380 mg (10 mmol) Natriumborhydrid zugegeben und weitere 5 h bei 20°C gerührt. Anschließend wird mit 50 ml Wasser verdünnt, mit 1 M Salzsäure auf pH 1-2 gestellt und zweimal mit 50 ml Essigester extrahiert. Die verei­ nigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abdestilliert und der ölige Rückstand im Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 1.0 g (95% d.Th.)
Analytische HPLC:
Säule: Vydac C18, 4.6 × 250 mm, 5 µm, 300 Å
Laufmittel: A: Millipore-Wasser, 0.01% TFA B: Acetonitril, 0.01% TFA
Gradient: 0-65% B in 90 min
Fluß 1 ml/min
Detektor: UV-Detektion bei 226 nm
Retentionszeit: Dihydroliponsäure 46.7 min Liponsäure 44.2 min
DC: Kieselgel (Merck 60), Isopropylether/1% Eisessig, Detektion mit N-Bromsuccinimid/Fluorescein-Spray
Rf = 0.46 (Edukt Rf = 0.43)
N-Bromsuccinimid/Fluorescein-Spray:
Sprühlösung 1 : 0.2% N-Bromsuccinimid in Methylenchlorid
Sprühlösung 2 : 3 ml Fluorescein-Lösung (0.33% Fluorescein in 0.1 N Natronlauge) mit 97 ml Ethanol verdünnt
Detektion:
DC mit Lösung 1 besprühen, bei 20°C trocknen lassen, mit Lösung 2 nachsprühen.
Färbung:
Nach längerem Stehen werden Schwefelverbindungen durch rosa Flecken auf gelbem Hintergrund sichtbar.
2.2 S.S-Diacetyl-6,8-dimercaptooktansäure
1 g (4.75 mmol) Dihydroliponsäure (Beispiel 2.1) werden in 50 ml Acetylchlorid aufgenommen und 15 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Reaktionslösung vorsichtig auf 500 ml Eiswasser gegossen und zweimal mit je 200 ml Essigester extrahiert. Die vereinigten organi­ schen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abdestilliert und der Rückstand mittels offener Säulenchromatographie (Kiesel­ gel Merck 60, 3×40 cm, Eluent: Ether/Hexan (v/v 4/1)/1 % Eisessig) aufgereinigt.
Ausbeute: 860 mg.(62% d.Th.)
DC: Kieselgel (Merck 60), Isopropylether/1% Eisessig, Detektion mit N-Bromsuccinimid/Fluorescein-Spray
Rf = 0.45 (Edukt Rf = 0.43)
HPLC: Bedingungen siehe oben
Retentionszeit: 52.0 min (Di-Acetat) 49.8 min (Mono-Acetat)
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): d = 1.44 (m, 6H); 1.60 (m, 2H); 2.19 (t, 2H, J=6.8 Hz, CH 2CO); 2.31 (s, 6H, 2 CH 3CO); 2.85 (m, 2H, CH 2- S); 3.40 ppm (m, 1H, CH-S).
2.3 S,S-Diacetyl-6,8-dimercaptooktansäure-N- hydroxysuccinimidester (LIPOS)
860 mg (2.94 mmol) Verbindung nach Beispiel 2.2 werden in 50 ml absoluten THF gelöst, mit 372 mg (3.23 mmol) N-Hy­ droxysuccinimid und 666 mg (3.23 mmol) Dicyclohexycar­ bodiimid versetzt. Nach 3 stündigem Rühren bei 20°C werden nochmals 115 mg (1 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 206 mg (1 mmol) DCC zugegeben und weitere 24 h bei 20°C gerührt. Anschließend wird der ausgefallene Dicyclohexyl­ harnstoff abfiltriert, das Filtrat eingeengt und in 20 ml absoluten THF aufgenommen. Unlösliches wird abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 75 ml Essigester gelöst und zweimal mit je 40 ml Wasser extrahiert. Die Essigesterphase wird über Natrium­ sulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Wasserstrahl­ vakuum entfernt und das Rohprodukt durch Chromatographie an Kieselgel (Merck 60, 4×30 cm, Eluent: Essig­ ester/Hexan (v/v 3/2) aufgereinigt. Die gepoolten Frak­ tionen werden eingeengt und der Rückstand aus 20 ml Dioxan lyophilisiert.
Ausbeute: 820 mg (72% d.Th.)
DC: Kieselgel (Merck 60), Ether/1% Eisessig, Detektion mit N-Bromsuccinimid/Fluorescein-Spray.
Rf = 0.36
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): d = 1.30-1.89 (m, 8H); 2.31 (s, 6H, 2 CH 3CO); 2.59 (t, 2H, J=6.6 Hz, CH 2CO); 2.80 (s, 4H, 2 CH 2CO; 2.88 (m, 2H, CH 2-S); 3.40 ppm (m, 1H, CH-S).
Beispiel 3 3.1 N-α-Boc-ε-maleinimido-α-aminohexansäure (α-Boc-ε-Mal-Lys)
3.70 g (15 mmol) α-N-t-Butyloxycarbonyl-Lysin werden in 200 ml ges. Natrium-hydrogen-carbonat-Lösung aufgenommen, mit 2.54 g (15 mmol) N-Ethoxycarbonyl-maleinimid versetzt und 30 min bei 20°C gerührt. Anschließend wird die Reak­ tionslösung mit 200 ml Wasser verdünnt, mit 2 N Salzsäure auf pH 1.8 gestellt, zweimal mit je 200 ml Essigester extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abdestilliert. Das Rohprodukt wird mittels offener Säulenchromatographie (5 × 50 cm) über Kieselgel, Eluent Essigester/Methanol (v/v 4/1)/1% Essigsäure, aufgereinigt. Die Fraktionen, die Produkt enthalten, werden vereinigt, das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum entfernt und der Rückstand im Hoch­ vakuum über CaCl2 getrocknet.
Ausbeute: 3.8 g (11.58 mmol) 78% d.Th.
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 3/2 ) /1% Essigsäure, Detektion mit Kaliumpermanganat
Rf = 0.83
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): δ = 1.35 (m, 15H, tBu u. 3 CH 2); 3.35 (m, 2H, CH2-N); 3.66 (m, 1H, CH-N); 6.18 (d, br, 1H, NH, J=7.2 Hz); 6.98 ppm (s, 2H, CH=).
3.2 N-α-Boc-ε-maleinimido-α-aminohexanoyl-β-alanin (α-Boc-ε-Lys-β-Ala)
1.60 g (4.9 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3.1 in 200 ml THF werden mit 676 mg (5.92 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 1.21 g (5.92 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 1 h bei 20°C gerührt. 480 mg (5.4 mmol) β-Alanin werden in 200 ml 0.1 M KPO4-Puffer pH 8.5 gelöst und zum Reaktionsansatz getropft. Nach weiteren 16 h Rühren bei 20°C wird das organische Lösungsmittel im Wasserstrahl­ vakuum abdestilliert, die wässrige Phase mit 100 ml Wasser verdünnt, zweimal mit je 250 ml Essigester extra­ hiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Wasser­ strahlvakuum eingeengt. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule (5 × 30 cm), Eluent Essigester/Methanol (v/v 4/1)/1% Essigsäure aufgereinigt.
Ausbeute: 1.17 g (2.96 mmol) 61% d.Th.
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 4/1)/1 % Eisessig Detektion mit Kaliumpermanganat
Rf = 0.7
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): δ = 1.35 (m, 15 H, tBu u. 3 CH 2); 2.32 (t, 2H, CH2CO, J=6.9 Hz); 3.16-3.41 (m, 4H, CH-N); 3.88 (m, 1H, CH-N); 6.73 (d, 1H, NH- COO, J=7.7 Hz); 6.98 (s, 2H, CH=); 7.78 ppm (t, 1H, NH-CO, J=5.4 Hz).
3.3 ε-Maleinimido-α-aminohexanoyl-β-alanin (ε-Mal-Lys-β-Ala)
710 mg (1.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3.2 werden bei 0°C unter Rühren mit 15 ml Trifluoressigsäure versetzt, langsam auf 20°C erwärmt. Nach 30 min wird mit 15 ml Essigester verdünnt, weitere 15 min bei 20°C gerührt, das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abdestilliert und der Rückstand aus Dioxan/Wasser (v/v 1/1) lyophilisiert.
Ausbeute: 430 mg (1.5 mmol) 81% d.Th.
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 1/4)/ 1% Eisessig Detektion mit Ninhydrin
Rf = 0.33
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): δ = 1.15-1.64 (m, 6H, 3 CH 2); 2.41 (t, 2H, CH 2-CO, J=6.6 Hz); 3.37 (m, 4H, 2 CH 2-N); 3.68 (m, 1H, CH-N); 7.00 (s, 2H, CH=); 8.53 ppm (t, 1H, NH-CO, J=6.0 Hz).
3.4 N-α-(6-Maleinimidohexanoyl)-ε-maleinimido-α­ aminohexanoyl-β-alanin (α-MHS-e-Mal-Lys-β-Ala)
Zu einer Lösung aus 400 mg (1.35 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3.3 in 10 ml 0.1 M KPO4-Puffer pH 7.5 wird unter Rühren eine Lösung aus 462 mg (1.5 mmol) Maleinimidohexansäure-N-hydroxysuccinimidester (MHS) in 10 ml THF getropft. Der pH-Wert wird bis zur Konstanz mit 1 N Natronlauge auf pH 7.5 nachgestellt. Nach 16stündi­ gem Rühren bei 20°C wird das organische Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abdestilliert, der Rückstand mit 10 ml Wasser verdünnt und mit 1 N Salzsäure auf pH 3.0 gestellt und dreimal mit je 30 ml Essigester extrahiert - das Produkt geht in die organische Phase über. Diese wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und im Wasserstrahlvakuum eingeengt. Der Rückstand wird mittels offener Säulenchro­ matographie über Kieselgel, Eluent Essigester/Metha­ nol(v/v 2/1)/1% Essigsäure, gereinigt, die gepoolten Fraktionen eingedampft und aus 10 ml Essigester/THF (v/v 1/1) mit Diisopropylether ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und im Hochvakuum über CaCl2 getrock­ net.
Ausbeute: 230 mg (0.47 mmol) 35% d.Th.
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 2/1)/ 1% Eisessig Detektion mit Kaliumpermanganat
Rf = 0.63
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): δ = 1.14-1.50 (m, 12H, 6 CH 2); 2.09 (t, 2H, CH 2-CO, J=6.6 Hz); 2.22 (t, 2H, -CH 2-CO, J=7.5 Hz); 3.37 (m, 6H, CH 2-N); 4.07 (m, 1H, CH-N); 7.00 (s, 2H, CH=); 7.85 ppm (m, 2H, NH- CO).
3.5 N-α-(6-Maleinimidohexanoyl)-ε-maleinimido-α­ aminohexanoyl-β-alanyl-(N-hydroxysuccinimid) (α-MHS-ε-Mal-Lys-β-Ala-OSu) (MALOS)
180 mg (0.36 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3.4 werden in 10 ml absolutem DMF gelöst, mit 49 mg (0.43 mmol) N- Hydroxysuccinimid und 60 µl (0.43 mmol) Morpholinoethyl­ isocyanat (MEI) versetzt und 16 h bei 20°C gerührt, wobei nach jeweils 8 h noch zweimal 49 mg (0.43 mmol) N-Hydro­ xysuccinimid und 60 µl (0.43 mmol) MEI nachdosiert werden. Zur vollständigen Umsetzung wird noch weitere 6 h gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Hochvakuum entfernt, der Rückstand mit 25 ml Essigester digeriert, Unlösliches abfiltriert und das Filtrat auf ca. 10 ml eingeengt. Das in wenig Essigester gelöste Produkt wird zu 200 ml Diisopropylether getropft, der Niederschlag abgetrennt (zum Absaugen nur Hausvakuum verwenden!), mit Diisopropylether gewaschen und im Trockenschrank mit CaCl2 getrocknet.
Ausbeute: 115 mg (0.20 mmol) 56% d.Th.
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 2/1)/ 1% Eisessig Detektion mit Kaliumpermanganat
Rf = 0.83
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): δ 1.06-1.50 (m, 12 H, 6 CH 2); 2.08 (t, 2H, CH 2CO, J-6.7 Hz); 2.50 (t, 2H, CH 2COOSu); 2.81 (s, 4H, 2 CH 2COO); 3.31 (m, 6H, 3 CH 2N); 4.12 (m, 1H, CH-NH); 6.98 (s, 4H, CH=); 7.81 (d, 1H, NHCH, J=7.0 Hz); 8.03 ppm (t, br, 1H, NHCH2).
¹) Vorpolymerisierte POD (PODp) kann durch Reaktion von monomerer POD (PODmono
) mit Glutardialdehyd, wie bei Engvall und Perlmann (Immunochemistry 8 (1971) 871-874) beschrieben, hergestellt werden.
Beispiel 4 Aktivierung von PODp¹) mit MALOS
Die Aktivierung erfolgt in einem molaren Überschuß von MALOS (Herstellung nach Beispiel 3.5) zu POD von 25 : 1. PODp wird mit einer Konzentration von 25 mg/ml in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.5, 150 mM NaCl gelöst. Die entsprechende Menge MALOS wird in DMSO vorgelöst mit 100 mg/inl. Von dieser Lösung werden 92 µl/ml POD zur POD- Lösung gegeben. Der pH des Ansatzes wird nachkontrolliert und auf 7.0 gestellt. Anschließend wird der Ansatz unter Rühren 1 h/25°C inkubiert. Beendigung der Reaktion erfolgt durch pH-Änderung auf 6.1 und Abkühlung des Ansatzes im Eisbad. Anschließend wird das nicht gekoppel­ te MALOS durch fließende Dialyse gegen 10 mM Kaliumphos­ phatpuffer pH 6.1, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA abgetrennt. Der Einbau der MH-Gruppen wird bestimmt durch Reaktion mit einer definierten Menge an Cystein und Titration der Restmenge an Cystein mit Dithiodipyridin.
Beispiel 5 Konjugation von PODp-MALOS mit Bisphosphonat-LIPOS 1. Abspaltung der Acetylschutzgruppe im Bisphosphonat- LIPOS
1 mg Bisphosphonat-LIPOS wird in 1 ml 10 mM Kaliumphos­ phatpuffer pH 7.5, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA gelöst. Von einer 1 M Hydroxylamin-Stammlösung werden 0.07 ml zugege­ ben (Endkonzentration 70 mM), der Ansatz wird 1 h/25°C unter Rühren inkubiert.
2. Kopplung mit PODp-MALOS
3 mg PODp-MALOS werden in 3 ml 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.5, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA verdünnt. 0.044 ml des obigen Hydroxylaminolyse-Ansatzes werden zugegeben (entspricht einer Stöchiometrie von Bisphosphonat zu PODmono von 1 : 1); der Ansatz wird 90 min./25°C unter Rühren inkubiert. Anschließend wird die Reaktion durch sukzessive Inkubation mit Cystein (ad 2 mM) und N-Ethyl- Maleinimid (ad 5 mM) beendet. Die Abtrennung der niedermolekularen Bestandteile erfolgt anschließend durch fließende Dialyse gegen 25 mM HEPES pH 6.8, 150 mM NaCl.
Beispiel 6 Aktivierung von Biotin mit MALOS 6.1. N-a-Boc-e-Maleinimido-a-aminohexanoyl-DADOO-Biotin
Zu einer Lösung aus 1.00 g (3.06 mmol) der nach Beispiel 3.1 hergestellten Verbindung in 50 ml THF werden unter Rühren 422 mg (3.67 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 757 mg (3.67 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach 1 stündigem Rühren bei 20 °C tropft man eine Lösung aus 1.37 g (3.67 mmol) Biotin-DADOO in 50 ml 0.1 M KPO4- Puffer pH 8.5 zu. Der Ansatz wird nach weitere 2 h bei 20°C gerührt, anschließend das organische Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum entfernt und die wäßrige Phase lyophilisiert. Das Rohprodukt wird durch Kieselgelchroma­ tographie, Eluent Essigester/Methanol (v/v 2/1)/1% Essigsäure, aufgereinigt.
Ausbeute: 930 g (1.36 mmol) 44% d.Th.
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 2/1)/1 % Eisessig
Detektion mit Biotinspray und Kaliumpermanganat
Rf = 0.44
1H-NMR (D6-DMSO/TMS): δ = 1.10-1.90 (m, 15H, tBu u. 6 CH 2); 2.06 (t, 2H, CH 2CO, J=6.7 Hz); 2.60-2.90 (m, 3H, CHS u. CH 2S); 3.00-3.60 (m, 14H, 3 CH 2N u. 4 CH2O); 3.77 (m, 1H, CHNH-Lys); 4.14 (dd, 1H, CH-NH- Biotin); 4.30 (dd, 1H, CHNH- Biotin); 6.39 (m, 2H, NH- Biotin); 6.76 (d, 1H, NHCOO, J=7.1); 6.99 (s, 2H, CH=); 7.84 ppm (t, br, 2H, 2 NHCO).
6.2 e-Maleinimido-a-aminohexanoyl-DADOO-Biotin (e-Mal-Lys-DADOO-Biotin)
500 mg (0.7 mmol) der nach Beispiel 6.1 hergestellten Verbindung werden bei 0°C mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt und langsam auf 20°C erwärmt. Nach 30 min wird mit 10 ml Essigester verdünnt und weitere 15 min gerührt. Das Lösungsmittel wird im Wasserstrahlvakuum entfernt und der Rückstand aus Dioxan/Wasser (v/v 1/1) lyophilisiert.
Ausbeute: ca. 0.7 mmol
DC: Kieselgel (Merck 60) Essigester/Methanol (v/v 1/1)/1 % Eisessig
Detektion mit Biotinspray, Kaliumpermanganat und Ninhydrin
Rf = 0.08
6.3 N-a-Maleinimidohexanoyl-e-Maleinimido-a- aminohexanoyl-DADOO-Biotin (a-MHS-e-Mal-Lys-DADOO- Biotin)
0.7 mmol der nach Beispiel 6.2 hergestellten Verbindung (enthält noch TFA) werden in 10 ml 0.1 M KPO4-Puffer pH 7.5 gelöst und mit 260 mg (0.84 mmol) Maleinimido­ hexansäure-N-hydroxysuccinimid (MHS) in 10 ml THF versetzt. Der pH-Wert wird mit 1 N Natronlauge so lange auf pH 7.5 nachgestellt, bis keine pH-Wert-Änderung mehr zu beobachten ist. Nach 16 h Rühren bei 20°C wird das organische Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum entfernt und der Rückstand lyophilisiert. Die Aufreinigung des Rohprodukts an Kieselgel, Eluent Essigester/Methanol (v/v 1/1)/1% Essigsäure. Die gepoolten Fraktionen werden im Wasserstrahlvakuum eingeengt, der Rückstand in Dioxan aufgenommen, Ungelöstes abfiltriert und lyophilisiert.
Ausbeute: 500 mg (enthält noch Dioxan und Essigsäure)
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 1/1)/1 % Eisessig
Detektion mit Biotinspray und Kaliumpermanganat
Rf = 0.55
1H-NMR (D2O/TMS-Na-Salz): δ = 1.20-1.80 (m, 18 H, 9 CH 2); 2.22 (m, 4H, 2 CH 2CO); 2.71-2.90 (m, 3H, CHS u. CH 2S); 3.38-3.75 (m, 16 H, 4 CH 2N u. 4 CH 2O); 4.20 (m, 1H, CHNH-Lys); 4.44 (dd, 1H, CHNH-Biotin); 4.60 (dd, 1H, CHNH-Biotin); 6.88 ppm (s, 4H, CH=).

Claims (8)

1. Konjugate der allgemeinen Formel A-L1-L2-Bin denen A und B zu koppelnde Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe der Haptene, Proteine, Peptide, Polysaccharide und löslichen Polystyrole, L1 und L2 trivalente Linker darstellen und L1 und L2 über zwei Thioetherbindungen miteinander verbunden sind.
2. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu koppelnden Substanzen A und B über Hydroxysuccinimid oder Carbodiimidazolylfunktionen an L1 und L2 gebunden sind.
3. Konjugate nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß A und B ausgewählt sind aus der Gruppe der Antikörper, Antikörperfragmente, Enzyme, Haptene, Biotin, Streptavidin und Perioxidase.
4. Verwendung von Konjugaten nach den Ansprüchen 1-3 in einem immunologischen Test.
5. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt eine erste zu koppelnde Substanz A mit einem homobidentalen, trifunktionellen Linker L1, der zwei Maleinimidogruppen enthält, gekoppelt wird und in einem zweiten Schritt eine zweite zu koppelnde Substanz B mit einem homobidentalen, trifunktionellen Linker L2, der zwei Thiolfunktionen enthält, gekoppelt wird und beide so aktivierten Substanzen AL1 und BL2 durch eine 5H-Gruppen-Addition an Maleinimid über zwei Thioetherbindungen miteinan­ der verknüpft werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zu koppelnden Substanzen jeweils über eine Hydroxysuccinimid- oder Carbodiimidazolylfunktion an den homobidentalen, trifunktionellen Linker L1 bzw. L2 gekoppelt werden.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zu koppelnden Substanzen ausgewählt sind aus der Gruppe Antikörper, Antikör­ perfragment, Enzym, Hapten.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß die zu koppelnden Substanzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Biotin, Streptavidin und Peroxidase.
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