DE4212280A1

DE4212280A1 - Asymmetrisch poröse Membranen

Info

Publication number: DE4212280A1
Application number: DE4212280A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dipl Chem Dr Harttig; Hartmut Dr Rer Nat Merdes; Hans-Rudolf Lange; Manfred Zeiler
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-04-11
Filing date: 1992-04-11
Publication date: 1993-10-14
Also published as: DE59309881D1; EP0586789B1; ES2141739T3; ATE186982T1; EP0586789A2; JPH0772145A; EP0586789A3; JP2815773B2; US6287867B1

Description

Die Erfindung betrifft den Einsatz asymmetrisch poröser Mem branen in Analysenverfahren und Testträgern zur Durchführung solcher Verfahren.

Als Testträger werden solche festen Analysemittel, vor allem in Form flacher Streifen oder Plättchen bezeichnet, die für Untersuchungen, insbesondere von biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin etc., benötigte Reagenzien tra gen. Die Trägermaterialien selbst sind fest und enthalten in der Regel auch die Reagenzien in fester Form. Als Trägerma terialien sind beispielsweise faserige Gebilde, wie Papier, Vliese, Gewebe, Gewirke, Netze etc., in der zu untersuchenden Flüssigkeit quellbare oder lösliche Filme oder poröse Membra nen bekannt. Die für die Durchführung der Bestimmung von Ana lyten in Flüssigkeiten, wie z. B. Körperflüssigkeiten erfor derlichen Reagenzien, können auf die Trägermaterialien durch Imprägnierung entsprechender Lösungen oder Beschichtung mit tels entsprechender reagenzienhaltiger streichfähiger Massen und anschließende Trocknung hergestellt werden. Alternativ können natürlich auch die Trägermaterialien selbst bei ihrer Herstellung mit den erforderlichen Reagenzien versetzt wer den. Beispielsweise können Filme oder Membranen aus gießfähi gen Lösungen oder Suspensionen hergestellt werden, die be reits die für die Bestimmung eines Analyten notwendigen Rea genzien enthalten.

Bei Aufgabe einer zu untersuchenden Flüssigkeit auf einen solchen Testträger findet auf bzw. in dem Testträger eine Re aktion zwischen dem in der Probenflüssigkeit zu bestimmenden Analyt und den in dem Trägermaterial befindlichen Reagenzien statt. Die Reaktionsprodukte werden bestimmt und bilden ein Maß für die Menge des Analyten in der zu untersuchenden Pro benflüssigkeit.

US-Patent 3,607,093 beschreibt beispielsweise einen Testträ ger zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten, der eine flüssigkeitsdurchlässige Membran enthält, die zumindest in Teilen ein diagnostisches Reagenz in fester Form, d. h. als trockene Substanz enthält. Die Membran selbst sollte so be schaffen sein, daß zumindest ein Oberflächenteil für größere Partikel, wie beispielsweise Erythrozyten, undurchlässig ist. Wie dem experimentellen Teil zu entnehmen ist, wird die Mem bran mit einer Lösung des für die Untersuchung biologischer Flüssigkeiten benötigten Reagenzes imprägniert und getrock net. Bei Aufgabe der zu untersuchenden Flüssigkeit und gege benenfalls nach Abwischen überschüssiger Flüssigkeit, wird bei Anwesenheit des zu bestimmenden Analyten in der Proben flüssigkeit eine Farbänderung der Membran beobachtet.

EP-A-03 45 781 betrifft einen Testträger zur Untersuchung von Flüssigkeiten. Er enthält eine asymmetrisch-poröse Membran, die ein oder mehrere Reagenzien trägt, die in Gegenwart des zu bestimmenden Analyten eine nachweisbare Substanz erzeugen. Zur Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeit wird die Probenflüssigkeit auf die großporige Oberfläche der Membran aufgegeben, während die Vermessung von der feinporigen Ober fläche her erfolgt. Als besonders vorteilhaft wird die "BTS Asymmetric Membrane" von Filtrite (San Diego, Kalifornien, USA) beschrieben, da hier zelluläre Blutbestandteile abge trennt werden und die Reagenz/Analyt-Reaktion überall in der Membran abläuft. Zur Auswahl der Reagenzien, die bei Reaktion mit dem zu bestimmenden Analyt eine nachweisbare Substanz er zeugen, wird Wert auf für die Detektion wichtige Eigenschaf ten gelegt, beispielsweise Farbe, Chemilumineszenz etc., so lange das Reagenz in der Membran ausreichend stabil ist.

EP-A-04 07 800 ist auf einen Teststreifen zur Analyse von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten gerichtet. Er ent hält eine asymmetrisch poröse Membran, die vorteilhafterweise aus einer Polymerlösung hergestellt wird, die 1 bis 4 Gew.-% eines anionischen Tensids enthält. Die Membran trägt die für die Analytbestimmung notwendigen Reagenzien. Zur Durchführung der Analyse wird die zu untersuchende Flüssigkeit auf die großporige Seite aufgegeben. Die Vermessung der Reaktionspro dukte erfolgt von der feinporigen Seite der Membran aus.

Keine der Schriften des Standes der Technik beschreibt eine Anreicherung der nachweisbaren Substanz, sei sie farbig, che milumineszierend etc., auf einer der bezüglich ihrer Poren größe unterschiedlichen Oberflächen asymmetrisch poröser Mem branen. Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß eine Substanz auf der feinporigen Seite einer asymmetrisch porösen Membran gleichmäßig verteilt angereichert werden kann, wenn diese Substanz in Form einer Membran-benetzenden Lösung mit der Membran in Kontakt gebracht wird und wenn die Substanz nicht oder nicht wesentlich an der Membran adsorbiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung einer asymmetrisch porösen Membran zur gleichmäßig verteilten An reicherung einer Substanz, die nicht oder nicht wesentlich an der Membran adsorbiert wird, und die in Form einer membran benetzenden Lösung mit der Membran in Kontakt gebracht wird, auf der feinporigen Seite der Membran.

Weiter ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur gleich mäßig verteilten Anreicherung einer Substanz auf einer Seite einer Membran, dadurch gekennzeichnet, daß eine Membran-be netzende Lösung der Substanz mit einer asymmetrisch porösen Membran, an der die Substanz nicht oder nicht wesentlich ad sorbiert wird, kontaktiert wird.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer flüssigen Probe mittels Testträger, bei dem von einem wie vorstehend beschriebenen Verfahren Gebrauch gemacht wird und bei dem eine Lösung der zu bestimmenden Substanz mit einer asymmetrisch porösen Mem bran kontaktiert oder die zu bestimmende Substanz in der Pro be durch eine oder mehrere auf der Membran vorliegende Stoffe freigesetzt oder gebildet wird und auf der Membran von der feinporigen Seite her bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz nicht oder nicht wesentlich an der Membran adsorbiert wird.

Ein besonders vorteilhafter Gegenstand der Erfindung ist ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, welches dadurch ge kennzeichnet ist, daß die zu bestimmende Substanz Hämoglobin ist sowie ein hierfür geeigneter Testträger, enthaltend eine asymmetrisch poröse Membran, die Hämoglobin nicht oder nicht wesentlich adsorbiert und die eine hämolysierende Substanz trägt oder eine solche Substanz in einer weiteren, vorgela gerten Schicht enthält.

Der Begriff "asymmetrisch porös" ist dem Fachmann allgemein bekannt und gebräuchlich (vgl. beispielsweise EP-A-04 07 800 oder EP-A-03 45 781). In der Regel versteht man hierunter ei nen durchgehend porösen Polymerfilm mit zwei sich gegenüber liegenden Oberflächen, wobei die Poren einer Oberfläche grö ßer sind als die der gegenüberliegenden Oberfläche. Erfin dungsgemäß sind solche asymmetrisch porösen Membranen bevor zugt, die einen Asymmetriefaktor von mehr als 10, besonders bevorzugt mehr als 100 aufweisen. Der Asymmetriefaktor gibt hierbei das Verhältnis der Porengröße auf der großporigen Oberfläche zu der Porengröße auf der feinporigen Oberfläche an. Erfindungsgemäß sind solche asymmetrisch porösen Mem branen bevorzugt einsetzbar, bei denen die Porengröße auf der feinporigen Seite 0,003-3 µm beträgt.

Asymmetrisch poröse Membranen sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise aus US-Patent 4,774,039; US-Patent 4,629,563 oder auch aus EP-A-03 45 781. Gemäß diesem Stand der Technik können asymmetrisch poröse Membranen vom Fachmann selbst hergestellt werden. Asymmetrisch poröse Membranen sind auch käuflich erhältlich, beispielsweise hat sich die BTS 25- Membran der Firma Memtec Timonium, Maryland, USA, erfindungs gemäß als vorteilhaft erwiesen. Es handelt sich hierbei um eine poröse Polysulfonmembran. Für den Gegenstand der Erfin dung ebenfalls brauchbar haben sich mit Polyvinylpyrrolidon legierte Polyethersulfonmembranen, wie sie beispielsweise in EP-A-03 36 483 beschrieben sind, erwiesen. Solche Membranen werden beispielsweise unter der Bezeichnung PS 11 bzw. PS 21 von der Firma X-Flow B.V. (Enschede, Niederlande) vertrie ben.

Um erfindungsgemäß einsetzbar zu sein, muß die asymmetrisch poröse Membran von der Flüssigkeit, die die Substanz, die auf der feinporigen Seite angereichert werden soll, enthält, be netzbar sein. Im Falle von wäßrigen Flüssigkeiten, wie es Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin, etc. sind, muß die Membran deshalb ausreichend hydrophil sein. Wenn das Membranmaterial selbst nicht ausreichend hydrophil ist, können Polymermembranen auch hydrophiliert werden. Hier zu können Membranen beispielsweise mit solchen Substanzen be handelt werden, die in Wasser quellbar, aber unlöslich sind. Aus US-Patent 4,413,074 ist beispielsweise bekannt, daß Hy droxyalkylcellulose zur Hydrophilierung von Polymermembranen eingesetzt werden kann. Polyvinylpyrrolidon ist ebenfalls ein mögliches Hydrophilierungsmittel.

Grundsätzlich gilt, daß eine Membran als durch die Flüssig keit ausreichend benetzbar anzusehen ist, wenn ein Tropfen der Probenflüssigkeit mit einem Volumen von 20 µl bei Raum temperatur innerhalb von weniger als 20 sec. vollständig in ein Membranstück von 15 mal 15 mm oder größer aufgesaugt wird und in der Membran gehalten wird bzw. wenn eine Aufgabe eines Flüssigkeitstropfens auf die grobporige Seite einer asym metrisch porösen Membran zu einer Durchfeuchtung der Membran im Aufgabenbereich in ihrer gesamten Dicke führt.

Erfindungsgemäß einsetzbar sind alle benetzbaren Membranen, an die die Substanz, die auf der feinporigen Seite angerei chert werden soll, nicht adsorbiert. Ob ein bestimmtes Mem bran-Substanzpaar diese Bedingung erfüllt, kann einfach ge prüft werden. Hierzu wird die zu prüfende Substanz in dem Lö sungsmittel gelöst, mit dem auch der Anreicherungseffekt er zielt werden soll, beispielsweise im Fall wäßriger Lösungen in Wasser. Die Lösung wird durch eine oder mehrere Lagen der in Frage kommenden Membran geschickt und anschließend über prüft, ob die Konzentration der Substanzen in der Lösung vor und nach dem Durchtritt durch die Membran unterschiedlich ist. Für farbige Substanzen kann dies auf folgende Weise ge schehen: Eine asymmetrisch poröse Membran wird in 5 Lagen so in einen Membranfilterhalter (beispielsweise der Firma Sarto rius, Göttingen, Deutschland) ohne Glasfilter gespannt, und so auf eine Saugflasche gesetzt, daß die großporige Seite der Membran jeweils nach oben zeigt. Die zu untersuchende Sub stanzlösung wird auf die großporige Seite der Membran im Fil terhalter gegeben und unter Anlegen eines Unterdruckes durch die Membran gesaugt. Nach ihrem Durchtritt durch die Membran wird die Flüssigkeit photometrisch auf ihre optische Dichte hin geprüft und der Wert mit dem der ursprünglichen Lösung verglichen. Adsorption der gelösten Substanz an die Membran hat dann stattgefunden, wenn sich die optische Dichte der Lö sung vor und nach dem Durchtritt durch die Membran deutlich unterscheidet. Von einem deutlichen Unterschied kann dann ge redet werden, wenn die optische Dichte der Lösung nach dem Durchtritt durch die Membran mindestens etwa 15% geringer ist als die optische Dichte der ursprünglichen Lösung, wobei auf die Einhaltung folgender Randbedingungen geachtet werden sollte:
Konzentration der Substanz in der Lösung etwa 1-100 mg/l, Menge der durchzusaugenden Flüssigkeit etwa 10 ml, Anzahl der Membranscheiben 5 Stück, Durchmesser der Membranscheiben im Membranfilterhalter etwa 60 mm, Dicke der einzelnen Membran scheiben etwa 110 bis 150 µm und Schnelligkeit des Durchsaug vorgangs etwa 0,25 ml/Sekunde.

Substanzen, die nicht oder nicht wesentlich (weniger als 15% nach vorstehend beschriebenem Prüfmodell) an der asymmetrisch porösen Membran adsorbiert werden, werden deutlich auf der feinporigen Seite der asymmetrisch porösen Membran angerei chert. Ein entsprechendes Konzentrationsprofil ist Fig. 1, 2 und 3 zu entnehmen. Diese Figuren sind in Beispielen 2 und 3 näher erläutert.

Um eine Substanz gleichmäßig verteilt auf der feinporigen Seite einer asymmetrisch porösen Membran anzureichern, wird erfindungsgemäß eine Membran-benetzende Lösung der Substanz mit der asymmetrisch porösen Membran in Kontakt gebracht. Dies kann durch Eintauchen der Membran in die Lösung oder zweckmäßigerweise durch Aufgeben der Lösung auf die Membran erfolgen. Bei Aufgabe der Lösung auf die Membran ist es zur Erreichung des Anreicherungseffektes gleichgültig, ob die Lö sung auf die feinporige oder auf die grobporige Seite aufge geben wird.

Das vorstehend beschriebene Verfahren zur gleichmäßig ver teilten Anreicherung einer Substanz im wesentlichen auf einer Seite einer Membran kann für ein Verfahren zur trägergebun denen Bestimmung eines Analyten benutzt werden. Hierzu wird eine Lösung der zu bestimmenden Substanz mit einer asymme trisch porösen Membran, die durch die Lösung benetzbar ist, kontaktiert und auf der Membran von der feinporigen Seite her bestimmt. Wie bereits zuvor ausgeführt, ist es erfindungsge mäß notwendig, daß die zu bestimmende Substanz nicht oder nicht wesentlich an der Membran adsorbiert wird. In der Regel wird die Lösung der zu bestimmenden Substanz auf die großpo rige Seite der Membran aufgegeben. Die zu bestimmende Sub stanz kann aber auch durch in oder auf der Membran befindli che Reagenzien oder Stoffe, die in einer oder mehreren schichten über der Membran angeordnet sind, freigesetzt oder gebildet werden. Im Grunde genommen sind für solche trägerge bundenen Bestimmungsverfahren Testträgeraufbauten einsetzbar, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, wobei jedoch erfindungsgemäß die Schicht, die vermessen wird, sei es visu ell, optisch, reflexionsphotometrisch etc., eine asymmetrisch poröse Membran ist, wie sie vorstehend charakterisiert ist.

Erfindungsgemäß eignet sich das Bestimmungsverfahren beson ders gut für farbige Analyten. Falls die zu bestimmende Sub stanz selbst nicht farbig ist, kann sie durch entsprechende Reaktionen, wie sie aus der klinischen Analytik bekannt sind, in farbige Substanzen überführt werden oder in chemischen Re aktionen Anlaß zur Bildung farbiger Reaktionsprodukte geben, die ein Maß für den zu bestimmenden Analyt darstellen.

Für optische Bestimmungen, seien sie visuell oder apparativ, insbesondere für reflexionsphotometrische Bestimmungen, ist es vorteilhaft, wenn die erfindungsgemäß eingesetzte asymme trisch poröse Membran nur eine geringe Naßtransparenz auf weist, d. h. der Reflexionsgrad der erfindungsgemäß besonders vorteilhaft einsetzbaren Membran sollte nach Benetzung mit dem Lösungsmittel der zu untersuchenden Lösung größer als 20%, noch besser jedoch größer als 50% sein. Auch in diesem Zusammenhang hat sich für die Untersuchung wäßriger Lö sungen, wie es Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin etc. sind, Polysulfonmembranen, wie beispielsweise die BTS-Membran von Memtec Timonium, Maryland, USA, vorteilhaft erwiesen.

Die Kombination der Filtereigenschaft asymmetrisch poröser Membranen mit geringer Naßtransparenz erweist sich als be sonders vorteilhaft, wenn flüssige Proben untersucht werden sollen, die gefärbte partikuläre Komponenten enthalten. So bringt die erfindungsgemäße Verwendung entsprechender asym metrisch poröser Membranen große Vorteile beim Einsatz in Verfahren zur trägergebundenen Bestimmung von Substanzen in Vollblut. Bei Aufgabe von Vollblut auf die großporige Seite einer ausreichend hydrophilen Membran mit einem Asymmetrie faktor größer als 10, vorzugsweise größer als 100, wobei die Poren auf der feinporigen Seite der asymmetrisch porösen Mem bran etwa 0,003 bis 3 µm groß sind, werden die roten Blutkör perchen (Erythrozyten) daran gehindert, zur feinporigen Seite der Membran zu gelangen. Sie werden von Plasma oder Serum ge trennt, welches die gelösten Probeninhaltsstoffe und gegebe nenfalls gelöste Reagenzien und entsprechende Reaktionspro dukte durch Kapillarkraft zur feinporigen Seite der Membran transportiert. Die zu bestimmende Substanz, die bereits ur sprünglich in der Probe vorlag oder auf der Membran durch Reagenzkontakt in der Probenflüssigkeit freigesetzt oder ge bildet wird, wird hierbei auf der feinporigen Seite gleichmä ßig verteilt und angereichert, wenn sie vom Membranmaterial nicht oder nicht wesentlich adsorbiert wird.

Auf diese Art und Weise sind empfindlichere Bestimmungen, als es ohne den Anreicherungseffekt der Fall wäre, möglich. Da durch, daß gleichzeitig mit der Anreicherung auch eine gleichmäßige Verteilung der zu bestimmenden Substanz auf der feinporigen Seite der asymmetrisch porösen Membran erfolgt, können Messungen mit sehr kleinen Variationskoeffizienten durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur trägergebundenen Bestim mung einer Substanz hat sich als besonders vorteilhaft erwie sen für die Bestimmung von Hämoglobin oder Hämoglobinderiva ten aus Vollblut. Aus den Werten für die Hämoglobinkonzen tration im Blut kann man auch auf den Hämatokrit, das ist der Anteil der zellulären Bestandteile am Volumen des Blutes, rückschließen.

Hämoglobin und Hämoglobinabkömmlinge, wie beispielsweise Hä miglobinrhodanid, Hämiglobincyanid, Hämiglobin, Oxihämoglobin oder alkalisches Hämatin werden bei Einsatz ausreichend hy drophiler asymmetrisch poröser Membranen auf der feinporigen Seite sehr stark angereichert.

Ein erfindungsgemäßer Testträger zur Bestimmung von Hämoglo bin oder Hämoglobinderivaten enthält als wesentlichen Be standteil eine asymmetrisch poröse Membran, die mit Wasser benetzbar ist, die das zu bestimmende Hämoglobin oder Hämo globinderivat nicht wesentlich adsorbiert und die eine hämo lysierende Substanz trägt oder eine solche Substanz in einer über der Membran angeordneten Schicht enthält. Diese Schicht kann auch fehlen, wenn die hämolysierende Substanz der Blut probe direkt zugegeben wird, d. h. vor Aufgabe der Blutprobe auf den Testträger.

Hämolysierende Mittel sind dem Fachmann bekannt. Beispiels weise können für den erfindungsgemäßen Testträger Detergen zien, wie beispielsweise anionische, kationische oder nicht ionogene Detergenzien eingesetzt werden. Beispiele für anio nische Detergenzien sind Natriumnonylsulfat, Natriumdodecyl sulfat, Natriumdodecylsulfonat, Natriumdeoxycholat, Natrium dioctylsulfosuccinat (DONS) oder Natriumdiamylsulfosuccinat (DANS). Als kationische Detergenzien sind beispielsweise Cetylpyridiniumchlorid, Cetyldimethylethylammoniumbromid oder Cetyltrimethylammoniumbromid einsetzbar. Unter den nicht ionogenen Detergenzien sind insbesondere Polyoxyethylenäther bekannt. Erfindungsgemäß kann als hämolysierendes Mittel eine Substanz oder eine Mischung aus mehreren Substanzen einge setzt werden.

Der erfindungsgemäße Testträger kann das Hämolysemittel di rekt auf der asymmetrisch porösen Membran tragen oder es kann sich in einer weiteren Schicht, die über der großporigen Sei te der asymmetrisch porösen Membran angeordnet ist, befinden. Soll für das Hämolysemittel keine weitere Schicht eingesetzt werden, bringt man zweckmäßigerweise das Hämolysemittel durch Imprägnierung auf die asymmetrisch poröse Membran. Es ist auch denkbar, das Hämolysemittel in einer streichfähigen Paste auf die großporige Seite der Membran aufzubringen und dort zu trocknen. Bei Einsatz einer separaten Schicht kann ein geeignetes Trägermaterial ebenfalls mit einer Lösung des Hämolysemittels imprägniert oder mit einer streichfähigen Masse des Hämolysemittels beschichtet werden. Die Art des Trägermaterials spielt hierbei keine Rolle, solange es keine Störung der Bestimmungsreaktion verursacht. Als mögliche Stö rung könnte man sich beispielsweise die Adsorption von Hämo globin an das Trägermaterial oder störende Reaktionen des Trägermaterials mit Hämoglobin oder Hämoglobinderivaten vor stellen. Als geeignet hat sich beispielsweise ein Glasfaser vlies erwiesen.

Als Zusatz zum hämolysierenden Mittel haben sich Puffersub stanzen sowie Substanzen, welche zu einer Oxidation bzw. Kom plexierung des Hämoglobins führen, als vorteilhaft erwiesen. Als Puffersubstanzen kommen hierbei solche in Frage, die ei nen pH-Wert im Bereich von 2-12, vorzugsweise 6-8 ein stellen können. Als besonders vorteilhaft sind diesbezüglich Phosphatpuffer (pH 5-8), Citratpuffer (pH 2-8), Citrat- Phosphat-Borat-Puffer (pH 2-12) zu nennen.

Zur Oxidation von Hämoglobin können alle Substanzen einge setzt werden, die Eisen oxidieren, nicht aber die Struktur des Hämoglobins zerstören. Als besonders vorteilhaft haben sich höherwertige Metallsalze und -komplexverbindungen erwie sen, wobei Kaliumhexacyanoferrat (III) ganz besonders bevor zugt ist. Zur Komplexierung des hierbei entstandenen Hämiglo bin können Substanzen aus der Gruppe Halogenide und Pseudo halogenide eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Cyaniden, Fluoriden oder Rhodaniden. Das er findungsgemäße Verfahren ist jedoch auch für den Nachweis von nichtkomplexiertem Hämiglobin geeignet.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform eines erfindungsge mäßen Testträgers zur Bestimmung von Hämoglobin ist die asym metrisch poröse Membran auf einem steifen Material, wie bei spielsweise einer Plastikfolie angeordnet, damit der Testträ ger besser und einfacher handhabbar ist und um die asymme trisch poröse Membran bei der Durchführung des Tests nicht mit den Fingern berühren zu müssen. Die asymmetrisch poröse Membran ist dabei so auf diesem Träger befestigt, daß entwe der die Aufgabe der zu untersuchenden Probe oder die Bestim mung auf der Oberfläche der asymmetrisch porösen Membran er folgen kann, die dem Träger zugewandt ist. Bei der Aufgabe der Probe auf der dem Träger zugewandten Oberfläche der asym metrisch porösen Membran bedeutet dies, daß das steife Trä germaterial für die Probe durchlässig sein muß. Im einfach sten Falle befindet sich ein Loch in dem Träger und unter dem Loch ist die asymmetrisch poröse Membran so befestigt, daß die Probe durch das Loch auf die Membran aufgegeben werden kann.

Ist die Oberfläche der asymmetrisch porösen Membran, von der die Vermessung her erfolgen soll, dem Träger zugewandt, darf der Träger diese Vermessung nicht stören. Hierfür ist es beispielsweise denkbar, daß der Träger bei optischen Meß verfahren lichtdurchlässig ist. Eine weitere Möglichkeit be steht auch hier darin, daß sich ein Loch in dem Träger befin det und die Membran über diesem Loch auf dem Trägermaterial so befestigt ist, daß die entsprechende Oberfläche der asym metrisch porösen Membran vermessen werden kann.

Vorteilhafte Ausführungsformen erfindungsgemäßer Testträger zur Bestimmung von Hämoglobin sind in Fig. 4, 5 und 6 dar gestellt. Fig. 7 zeigt einen Testträger, mit dem die gleich mäßige Verteilung einer Substanz auf der feinporigen Seite einer asymmetrisch porösen Membran demonstriert werden kann.

Der Testträger gemäß Fig. 4 besteht aus einem Streifen (1) aus steifem Material, wie beispielsweise einer Plastikfolie mit einem Loch (4). Über dem Loch (4) befindet sich eine asymmetrisch poröse Membran (3), die mit einem beidseitig klebenden Band (2) auf dem Streifen (1) befestigt ist. Die asymmetrisch poröse Membran (3) ist so angebracht, daß ihre feinporige Seite zum Streifen (1) zeigt. Ähnliche Testträger aufbauten sind beispielsweise aus EP-A-02 56 806 oder EP-A- 04 07 800 bekannt. Im Gegensatz zum Stand der Technik enthält der erfindungsgemäße Testträger zur Bestimmung von Hämoglobin jedoch ein hämolysierendes Mittel sowie gegebenenfalls noch weitere Substanzen wie beispielsweise Puffersubstanz und/oder Hämoglobin oxidierende bzw. komplexierende Mittel in der asymmetrisch porösen Membran (3). Blut (5) wird auf die groß porige Seite der asymmetrisch porösen Membran (3) gegeben, die Erythrozyten werden in der Membran (3) hämolysiert und das freigesetzte Hämoglobin oder entsprechende Hämoglobin abkömmlinge, beispielsweise bei Anwesenheit von oxidierenden oder komplexierenden Substanzen als zusätzlichen Reagenzien, in der Membran (3) auf der feinporigen Seite der asymmetrisch porösen Membran (3) gleichmäßig verteilt und angereichert. Durch das Loch (4) wird die Konzentration des Hämoglobins bzw. der Hämoglobin-Abkömmlinge auf der feinporigen Seite der asymmetrisch porösen Membran (3) bestimmt.

Der Testträger gemäß Fig. 5 unterscheidet sich von demjenigen gemäß Fig. 4 dadurch, daß die asymmetrisch poröse Membran (3) so auf dem Streifen (1) befestigt ist, daß die großporige Oberfläche der Membran (3) dem Streifen (1) zugewandt ist.

Blut (5) wird durch das Loch (4) auf die großporige Seite der asymmetrisch poröse Membran (3) gegeben. Die Vermessung er folgt von der dem Loch (4) gegenüberliegenden Seite von der feinporigen Oberfläche der Membran (3) aus.

In Fig. 6 ist ein Testträger dargestellt, der über der groß porigen Oberfläche der asymmetrisch porösen Membran (3) eine Schicht (6) trägt, die mit allen oder mit einem Teil der für den Test erforderlichen Reagenzien imprägniert sein kann. Beispielsweise kann diese Schicht (6) die für die Hämolyse der Erythrozyten erforderlichen Substanzen enthalten. Bei Aufgabe des Blutes (5) auf die Schicht (6) werden diese Sub stanzen gelöst und gelangen mit der Probenflüssigkeit in die Membran (3). Die Beobachtung der Nachweisreaktion erfolgt von der feinporigen Seite der Membran (3) durch das Loch (4).

In Fig. 7 ist ein Testträger dargestellt, bei dem sich auf einem Streifen (8) aus steifem, durchscheinendem Material mit Schmelzkleber (7) befestigt eine asymmetrisch poröse Membran (3) befindet, die so angebracht ist, daß die feinporige Ober fläche dem Streifen (8) zugewandt ist. Über der Membran (3) ist eine Schicht (6), beispielsweise ein Glasfaservlies so angebracht, daß sie die Membran (3) nicht berührt, durch Druck von oben jedoch mit ihr in Kontakt gebracht werden kann. In der Ausgangslage liegt deshalb ein Spalt (9) zwi schen Membran (3) und Schicht (6) vor. Nach Aufgabe der flüs sigen Probe auf Schicht (6) verweilt die Probe dadurch dort, ohne in die Membran (3) zu gelangen. Die Verweildauer ist frei wählbar. Erst nach Druck auf die Schicht (6), so daß diese Schicht mit der Membran (3) in Berührung gebracht wird, wird ein Flüssigkeitsübertritt von der Schicht (6) in die Membran (3) ermöglicht. Durch den durchscheinenden Streifen (8) hindurch kann die feinporige Seite der asymmetrisch porö sen Membran (3) beobachtet werden. Die Konzentration einer nachweisbaren Substanz kann so durch den Streifen (8) hin durch vermessen werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher er läutert, die jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung auf diese konkreten Ausführungsformen verstanden werden sollen.

In den Abbildungen wird folgendes gezeigt

Fig. 1 Diagramm einer rasterelektronischen EDX-Mikroana lyse eines mit Kohlenstoff bedampften Querschnitts durch eine mit K₃ [Fe(CN)₆] getränkte asymmetrisch poröse Membran.

Fig. 2 Darstellung der remissionsphotometrischen Farb intensität über den Querschnitt einer mit Tartra zin getränkten asymmetrisch porösen Membran.

Fig. 3 Darstellung der remissionsphotometrischen Farb intensität über den Querschnitt einer mit Indi gotin getränkten asymmetrisch porösen Membran.

Fig. 4-6 Querschnitte durch vorteilhafte Ausführungsformen erfindungsgemäßer Testträger.

Fig. 7 Querschnitt durch einen Testträger, mit dem die gleichmäßige Verteilung einer Substanz auf der feinporigen Seite einer asymmetrisch porösen Mem bran demonstriert wird.

Beispiel 1

a) Auf die großporige Seite einer asymmetrisch porösen Mem bran (BTS 25, Hersteller Fa. Memtec Timonium, Maryland, USA) werden 10 µl verschiedener Farbstofflösungen gegeben.

Herstellung der Farblösungen:

1. Indigotin (Hersteller Aldrich, Steinheim, Deutschland, Katalog-Nr. 22,929-6)
Stammlösung: 20 mg/10 ml Wasser lösen
Verdünnung: 10 µl Stammlösung in 20 ml Wasser lösen
Konzentration der Farblösung = 1 mg/l.
2. Toluidinblau (Hersteller Fluka, Buchs, Schweiz, Katalog- Nr. 89640)
- a) In Ethanol:
  Stammlösung: 20 mg/10 ml Ethanol lösen
  Verdünnung: 100 µl Stammlösung in 10 ml Ethanol lösen
  Konzentration der Farblösung = 20 mg/l.
- b) In Wasser:
  Stammlösung: 20 mg/10 ml Wasser lösen
  Verdünnung: 100 µl Stammlösung in 10 ml Ethanol lösen
  Konzentration der Farblösung = 20 mg/l.
3. Rhodamin B (Hersteller Aldrich, Steinheim, Deutschland, Katalog-Nr. 25,242-5)
Stammlösung: 12,5 mg in 10 ml Ethanol lösen
Verdünnung: 100 µl Stammlösung in 10 ml Ethanol lösen
Konzentration der Farblösung = 1,25 mg/l.
4. Coomassie blue (Hersteller Serva, Heidelberg, Deutschland, Katalog-Nr. CJ42655)
Stammlösung: 20 mg in 8 ml Ethanol lösen
Verdünnung: 70 µl Stammlösung in 10 ml Ethanol lösen
Konzentration der Farblösung = 17,5 mg/l.
5. Tartrazin (Hersteller Serva, Heidelberg, Deutschland, Katalog-Nr. CJ19140)
Stammlösung: 20 mg in 2 ml Wasser lösen
Verdünnung: 50 µl Stammlösung in 10 ml Wasser lösen
Konzentration der Farblösung = 50 mg/l.
6. Safranin (Hersteller Aldrich, Steinheim, Deutschland, Katalog-Nr. 10,214-8)
- a) In Ethanol:
  Stammlösung: 20 mg in 10 ml Ethanol lösen
  Verdünnung: 100 µl Stammlösung in 10 ml Ethanol lösen
  Konzentration der Farblösung = 20 mg/l
- b) In Wasser:
  Stammlösung: 20 mg in 10 ml Wasser lösen
  Verdünnung: 100 µl Stammlösung in 10 ml Wasser lösen
  Konzentration der Farblösung = 20 mg/l.
7. Acid green 41 (Hersteller Aldrich, Steinheim, Deutschland, Katalog-Nr. 21,071-4)
Stammlösung: 20 mg in 10 ml Ethanol lösen
Verdünnung: 400 µl Stammlösung in 10 ml Ethanol lösen
Konzentration der Farblösung = 80 mg/l.
8. Bromphenol Blau (Hersteller Aldrich, Steinheim, Deutschland, Katalog-Nr. 11,440-5)
Stammlösung: 10 mg in 5 ml Puffer pH 9 lösen
Verdünnung: 40 µl Stammlösung in 10 ml Puffer lösen
Konzentration der Farblösung = 8 mg/l.
9. Kaliumhexacyanoferrat III (Hersteller Aldrich, Steinheim, Deutschland, Katalog-Nr. 22,768-4)
Stammlösung: 20 mg in 10 ml 0,1 N Phosphatpuffer, pH3 lösen
Konzentration der Farblösung = 2000 mg/l.
Aufgrund des Farbeindrucks, der nach Aufgabe der Lösung auf die großporige Seite auf der feinporigen Seite ent steht, kann beurteilt werden, ob eine Anreicherung auf der feinporigen Seite erfolgt (siehe Ergebnistabelle).
- b) Zur Überprüfung auf Adsorption oder Nichtadsorption von Substanzen an Membranen werden Filtrationsexperimente durchgeführt. Dazu werden die Farblösungen aus a) durch mehrere Lagen Membranen gefiltert. Die Konzentration an Farbstoff in den Lösungen vor und nach der Filtration wird photometrisch bestimmt.

Durchführung der Messungen

Von 10 ml der jeweiligen Farblösung wurden 2 ml abgenommen und in einer 10 mm Küvette mit einem UV/VIS Spektrometer, Mo dell 845 A, Fa. Hewlett Packard im Vergleich zum reinen Lö sungsmittel vermessen.

Aus einer BTS25-Membran (Fa. Memtec Timonium, MD, USA) wurden Scheiben mit einem Durchmesser von 60 mm gestanzt. Pro Ad sorptionsversuch wurde ein Stapel von 5 Membranscheiben, mit der grobporigen Seite nach oben, in einen Membranfilterhalter der Fa. Sartorius (Göttingen, BRD) gespannt. Die Glasfritte wurde vorher aus dem Filterhalter entfernt.

Der Filterhalter wurde auf eine Saugflasche gesetzt. Die ver bliebenen 8 ml Farblösung wurden unter Anlegung eines ge ringen Unterdrucks durch die Membranlagen gesaugt. Das Fil trat wurde dann entsprechend der Ausgangslösung vermessen.

Aus den Extinktionen wurden die Konzentrationen berechnet.

Ergebnisse

Es zeigte sich, daß alle Farbstoffe, deren Konzentration we niger als 15% abnahm, den gefundenen Anreicherungseffekt er gaben, während solche Farbstoffe, deren Konzentrationen stär ker abnahmen, den Effekt nicht zeigten.

c) Prüfung, ob die getesteten Lösungen die Membran benetzen, erfolgt folgendermaßen: Ein Tropfen der Lösung mit 20 µl Volumen wird auf die grobporige Seite der 15 × 15 mm großen Membran aufgesetzt. Die Zeit, bis zum vollständigen Einsaugen wird gemessen. Der Versuch wiederholt, mit dem Unterschied, daß auf die feinporige Seite aufgegeben wird.

Liegen beiden Zeiten unter 20 sec., gelten die Lösungen als benetzend.

Beispiel 2

Eine asymmetrisch poröse Membran BTS 25 (Fa. Memtec Timonium, MD, USA) wurde mit einer Lösung von 1% Natriumdodecylsulfat, 0,1N Phosphatpuffer pH 7 und 0,7 mmol/l K₃Fe(CN)₆ getränkt. Die Flüssigkeitsaufnahme betrug umgerechnet 115 ml/m². Die flüssigkeitsbeladene Membran wurde 30 Minuten bei 50°C ge trocknet. Nach Kühlung mit flüssigem Stickstoff wurde die ge tränkte Membran gebrochen. Der Querschnitt wurde mit Kohlen stoff bedampft und in einem Rasterelektronenmikroskop mit EDX-Mikroanalyse der Fa. Cambridge, Nußloch, Deutschland auf Eisen untersucht.

Es kann gezeigt werden, daß sich Eisen auf der feinporigen Seite der Membran stark angereichert hat (Fig. 1). Dies wurde visuell bestätigt durch deutliche Unterschiede in der Gelb färbung der feinporigen und der grobporigen Seite. Eisensig nale auf der grobporigen Seite ergaben sich durch Blick auf die Oberfläche infolge einer leichten Schräglage der Probe in der Meßhalterung.

Beispiel 3

Zur Untersuchung von auf der feinporigen Seite einer asym metrisch porösen Membran anreichernden Farbstoffen wurden Querschnitte von BTS 25-Membranen (Fa. Memtec Timonium, MD, USA) nach Kontakten mit den entsprechenden Farblösungen aus Beispiel 1 hergestellt. Die Membranen wurden dazu mit einer neuen Rasierklinge zerschnitten. Der Querschnitt wurde in einem Lichtmikroskop mit angeschlossenem Farbvideoprinter photografiert und als vergrößerter Videoprint ausgedruckt. Der Farbausdruck wurde anschließend auf einem remissions photometrischen Scanner, Elscript 400, Fa. Hirschmann, Deutschland abgescannt. Aus 4 Meßfahrten wurde ein Mittelwert gebildet. Damit konnte der optische Eindruck quantitativ dar gestellt werden. Beispielhaft sind in Fig. 2 die Ergebnisse von Tartrazin und in Fig. 3 die Ergebnisse mit Indigotin als sich anreichernden Substanzen dargestellt. Die grobe Struktur auf der großporigen Seite täuscht im Diagramm mehr Farbe vor, als tatsächlich vorhanden ist, da Schwarz vom Scanner auch als Farbe interpretiert wird.

Beispiel 4

10 µl Hämiglobincyanidlösung (7 g/dl) werden auf die grob porige Seite einer 12 × 8 mm großen asymmetrischen Membran (BTS 25, Memtec Timonium, Maryland, USA) aufgegeben. Die Remission auf der feinporigen Seite wurde nach acht Sekunden bei 567 nm gemessen. Bei 50 Messungen wurde ein Mittelwert der Remission von 40,25% mit einem Variationskoeffizient von 1,14% beobachtet.

Beispiel 5

Eine asymmetrisch poröse Membran (BTS 25, Memtec America Corp. Timonium, Maryland, USA) mit einer Breite von 28 cm wurde in einer Lösung von 1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat, 0,1 N Phosphatpuffer pH 7 und 0,7 mmol/l Kaliumhexacyanoferrat (III) getränkt. Die Flüssigkeitsaufnahme betrug etwa 115 ml/m². Die flüssigkeitsbelastete Membran wurde 30 Minuten bei 50°C getrocknet. Die trockene Membran wurde in 8 mm breite Streifen geschnitten, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebe bandes auf eine 420 µm dicke PVC-Folie, die im Bereich der Membranapplikation mit einem 6 mm-Durchmesser großen Loch versehen war, so aufgeklebt, daß im Bereich des Loches die Membran nicht von dem doppelseitigen Klebestreifen bedeckt wurde. Die Orientierung der asymmetrischen Membran wurde so gewählt, daß die feinporige Seite zum Loch zeigte (vgl. Fig. 4). Anschließend wurden im Bereich des Loches ca. 10 µl Voll blut auf die großporige Seite der Membran aufgegeben. Der ge tüpfelte Teststreifen wurde in ein geeignetes Meßgerät einge führt und nach 44 Sekunden auf der feinporigen Seite ausge messen. Zwischen der Probenaufgabe und dem Meßzeitpunkt bil dete sich auf der feinporigen Seite eine gleichmäßig dunkle Färbung aus. Obwohl der Testaufbau keinerlei zusätzliche Maß nahmen zur Verteilung des Blutes auf der Aufgabenseite be inhaltete, ergab sich eine unerwartet hohe Präzision der Er gebnisse. Der Variationskoeffizient betrug 1,6% bei n = 10 (n = Anzahl der Messungen).

Beispiel 6

Ein Teststreifenaufbau analog Beispiel 5 wurde realisiert mit dem Unterschied, daß die großporige Seite der Membran zum Loch zeigte (vgl. Fig. 5). Die Aufgabe des Blutes erfolgte durch das Loch in der Trägerfolie. Dies erleichterte etwas die Treffgenauigkeit bei der Probenaufgabe. Gemessen wurde von der feinporigen Seite her. Die Ergebnisse waren ver gleichbar mit denen aus Beispiel 5.

Beispiel 7

Ein Teststreifenaufbau analog Beispiel 5 (entspricht Fig. 4) wurde realisiert mit dem Unterschied, daß die Tränklösung die folgende Zusammensetzung hatte:
0,3 Gew.-% Natriumdioctylsulfosuccinat (DONS) (E. Merck, Darmstadt, Deutschland)
0,3 Gew.-% Natriumdiamylsulfosuccinat (DANS) (Cyanamid, Wolfratshausen/Obb., Deutschland)
0,2 Gew.-% Saponin
0,2 Gew.-% Kaliumhexacyanoferrat (III) in
0,1 mol/l Citratpuffer, pH 6,8.

Die Durchführung der Messung entsprach Beispiel 5. Der Va riationskoeffizient betrug in diesem Fall 1,25% bei n = 10.

Beispiel 8

Eine asymmetrisch poröse Membran (BTS 25) wurde in Test streifen zwischen eine klare, transparente, 200 µm dicke Folie (Pokalon, Lonza, Weil am Rhein, Deutschland) und ein Glasfaservlies (Trapo 83/14, Fa. J.C. Binzer, Hatzfeld/Eder, Deutschland) so montiert, daß die großporige Seite zum Glas faservlies zeigte, zwischen der Membran und dem Glasfaser vlies aber keine Berührung stattfand (vgl. Fig. 7). Das Glas faservlies wurde mit Hämiglobincyanid getränkt. Nach erfolg ter Tränkung wurden die Teststreifen in einem geeigneten Ge rät reflexionsphotometrisch bei 567 nm vermessen. Dabei wurde vor Meßbeginn durch die Meßeinrichtung der mechanische Kon takt zwischen dem getränkten Glasfaservlies und der asymme trischen Membran hergestellt. Bei einer Hämiglobincyanidkon zentration von 7 g/dl wurde eine Remission von 32,69% be obachtet. Der Variationskoeffizient betrug 1,77%.

Beispiel 9

Der Versuch nach Beispiel 8 wurde wiederholt, aber ohne die Membran zwischen dem Glasfaservlies und der transparenten Fo lie. Die Ergebnisse zeigten bei diesem Vorgehen einen Varia tionskoeffizienten von 5,84%.

Ein Vergleich der Beispiele 8 und 9 zeigt deutlich, daß die verwendete Membran zu einer Vergleichmäßigung der Farbabbil dung führt. Die Anwendung ist nicht auf analytische Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobins im Blut beschränkt, sondern kann immer dann erfolgen, wenn es notwendig oder wünschens wert ist, die Homogenität einer Farbabbildung zu steigern.

Claims

1. Verwendung einer asymmetrisch porösen Membran zur gleichmäßig verteilten Anreicherung einer Substanz, die nicht oder nicht wesentlich an der Membran adsorbiert wird, in einer Membran-benetzenden Lösung auf der fein porigen Seite der Membran.

2. Verfahren zur gleichmäßig verteilten Anreicherung einer Substanz auf einer Seite einer Membran, dadurch gekenn zeichnet, daß eine Membran-benetzende Lösung der Sub stanz mit einer asymmetrisch porösen Membran, an der die Substanz nicht oder nicht wesentlich adsorbiert wird, kontaktiert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Asymmetriefaktor der asymmetrisch porösen Membran größer als 10 ist.

4. Verfahren zur trägergebundenen Bestimmung einer Substanz in einer flüssigen Probe, bei dem von einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 und 3 Gebrauch gemacht wird und bei dem eine Lösung der zu bestimmenden Substanz mit einer asymmetrisch porösen Membran kontaktiert oder die zu bestimmende Substanz in der Probe durch eine oder mehrere auf der Membran oder auf einer der Membran vor gelagerten Schicht vorliegende Stoffe freigesetzt oder gebildet wird und auf der Membran von der feinporigen Seite her bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz nicht oder nicht wesentlich an der Membran adsorbiert wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die asymmetrisch poröse Membran einen Asymmetriefaktor größer als 10 besitzt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich net, daß die Porengröße auf der feinporigen Seite der asymmetrisch porösen Membran etwa 0,003 bis 3 µm be trägt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß die asymmetrisch poröse Membran nach Benetzung durch das Lösungsmittel der zu untersuchenden flüssigen Probe noch mehr als 20% einer Meßstrahlung reflektiert.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz Hämoglobin oder ein Hämoglobinderivat ist.

9. Testträger zur Durchführung eines Verfahrens gemäß An spruch 8, enthaltend eine asymmetrisch poröse Membran, die Hämoglobin nicht oder nicht wesentlich adsorbiert und die selbst eine hämolysierende Substanz trägt oder eine solche Substanz in einer vorgelagerten Schicht ent hält.

10. Testträger gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die asymmetrisch poröse Membran zusätzlich eine Substanz trägt, die zur Oxidation oder Komplexierung freien Hämoglobins führt.

11. Testträger gemäß einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die asymmetrisch poröse Membran auf einem festen Material so befestigt ist, daß die Aufgabe der zu bestimmenden Substanz in der Probe oder die Be stimmung der Substanz in der Probe auf der Seite der asymmetrisch porösen Membran erfolgt, die dem festen Ma terial zugewandt ist.

12. Testträger gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Material durchscheinend ist.

13. Testträger gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Material ein Loch enthält, über dem die asymmetrisch poröse Membran befestigt ist.