DE3618605A1

DE3618605A1 - DEVICE FOR DETECTING SUBSTANCES INCENTIVELY TO PHOTON EMISSION

Info

Publication number: DE3618605A1
Application number: DE19863618605
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Dr Ansorge; Christian Schwager; Josef Stegemann
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 1986-06-03
Filing date: 1986-06-03
Publication date: 1987-12-10
Also published as: WO1987007719A1

Abstract

An apparatus for the detection of substances which migrate in a retarding medium, especially gel, and which can be excited for photon emission by energy irradiation by means of an excitation beam comprises a carrier for the retarding medium, in which the substances move along at least one path, a beam source for generating the excitation beam which crosses the path and a detector arrangement for the emission photons. In order to make the arrangement as sensitive as possible it is provided that at least in the area of the excitation beam the cross section, perpendicular to the direction of migration, of the retarding medium has sustantially the form of an elongate rectangle, the length of the short side of which is of the magnitude of the cross section dimensions, the excitation beam entering the cross section on one of the two short rectangle sides through an inlet part, crossing the cross section in the direction parallel to the two long rectangle sides and leaving on the other short rectangle side through an outlet part. A detector arrangement detects the emission photons passing through one of the long rectangle sides.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäß dem Oberbe griff des Anspruchs 1.The invention relates to a device according to the Oberbe handle of claim 1.

Bei einer Vielzahl von Untersuchungsverfahren wird so vorge gangen, daß man die Probe, deren Zusammensetzung zu er mitteln ist, längs einer Bahn sich bewegen läßt (aufgrund beispielsweise elektrischer oder magnetischer Kräfte, Kapillarkräfte, angelegten Gas- oder Flüssigkeitsdrucks oder dergl.), wobei sich bei dieser Bahnbewegung eine räumliche Aufteilung der Probe ergibt aufgrund unterschiedlicher Wanderungsgeschwindigkeit der die Probe bildenden unter schiedlichen Stoffe. Gleiche Stoffe haben gleiche Wande rungsgeschwindigkeit und bilden daher entlang der Bahn wandernde Banden, die detektiert werden können. Bei Ver wendung angefärbter Stoffe ausreichender hoher Konzen tration in den Banden, können diese visuell beobachtet werden oder, ggf. automatisch, mit Hilfe optischer Ab tasteinrichtungen (Scanner, Fotodioden oder dergl.). Bei geringer Konzentration der Stoffe innerhalb der Banden ist eine Beobachtung häufig nicht mehr möglich. In diesem Falle kann man so vorgehen, daß man die Stoffe radio aktiv markiert und eine Momentaufnahme der sich nach einer gewissen Laufzeit ausgebildeten Bandenstruktur der Bahn durch Anlegen eines Photofilms an den Träger anfertigt. Dieses, insbesondere bei der Gel-Elektro phorese angewandte Verfahren hat eine Reihe von Nach teilen, insbesondere der große erforderliche Aufwand (Handhabung radioaktiver Stoffe mit beschränkter Lebens dauer (Halbwertszeit)), zeitaufwendige, nur durch ge schultes Personal durchführbare Auswertung der Aufnahmen, die auch bei optischer Abtastung der Aufnahme und nachfolgender Rechnerauswertung (Zeitschrift Nucleic Acids Res. 14, 417 bis 424, 1986) aufgrund der oft schlechten Auflösung benachbarter Banden nicht wesentlich ver bessert wird. Ein weiteres Beispiel für ein Anwendungs gebiet der Vorrichtung der eingangs genannten Art liegt in der Chromatographie, bei welcher ebenfalls die unter schiedliche Wanderungsgeschwindigkeit der zu unter suchenden Stoffe zu deren Analyse ausgenutzt wird. Die Erfindung liegt jedoch bevorzugt, wenn auch nicht aus schließlich, auf dem Gebiete der Elektrophorese, insbe sondere Dünnschicht-Elektrophorese.This is done in a large number of examination procedures went that you got the sample, its composition to him is averaging, can be moved along a path (due to for example electrical or magnetic forces, Capillary forces, applied gas or liquid pressure or The like.), with this orbital movement a spatial Division of the sample results due to different Migration speed of the sample forming under different fabrics. The same fabrics have the same walls tion speed and therefore form along the path migrating bands that can be detected. At Ver use of dyed substances with a sufficiently high concentration tration in the bands, these can be observed visually or, if necessary automatically, with the help of optical Ab scanning devices (scanners, photodiodes or the like.). at low concentration of substances within the bands observation is often no longer possible. In this Trap one can proceed in such a way that one radio active marked and a snapshot of the after band structure developed over a certain period of time Web by applying a photo film to the support makes. This, especially with the gel electro phoresis method applied has a number of after share, especially the great effort required (Handling of radioactive materials with limited life duration (half-life)), time-consuming, only through ge trained staff can evaluate the recordings, which also with optical scanning of the recording and subsequent computer evaluation (Nucleic Acids magazine Res. 14, 417 to 424, 1986) due to the often poor Resolution of neighboring bands is not significantly different is improved. Another example of an application area of the device of the type mentioned is in chromatography, in which the under different migration speed of the to under searching substances is used for their analysis. the Invention, however, is preferred, if not complete finally, in the field of electrophoresis, esp special thin-film electrophoresis.

Aus der Zeitschrift BIO/TECHNOLOGY 3, Mai 1985, Seiten 395, 396 ist eine Vorrichtung der eingangs genannten Art bekannt, bei der bei der Gel-Elektrophorese zur Sequenzierung von DNA so vorgegangen wird, daß man den "Primer" der nach der Didesoxy-Methode gewonnen DNA- Fragmente markiert, und zwar jeweils mit anders farbigem Fluoreszenzfarbstoff für die vier Ansätze entsprechend den vier Didesoxy-Nukleotiden (s. auch Zeitschrift Nachr. chem.tech.Lab. 34, 5, Seiten 430, 431, 1986). Eines dieser Farbstoffe ist Rhodamin-isothiocyanat (Emissionswellen länge 580 mm). Die DNA-Bruchstücke können dann in einer einzigen Spur eines Polyacrylamid-Gels getrennt und mit einem Laser photometrisch vermessen werden. Das Gel befindet sich hierbei in einem dünnen Rohr. An demjenigen Ende des Gels, zu welchem die Banden laufen, ist der Laser angeordnet, der jedes Band beleuchtet, sobald es an ihm vorbeiläuft. Die daraufhin von den Fluoreszenz stoffen mit der entsprechenden Wellenlänge abgegebenen Emissionsphotonen werden von der Detektoranordnung auf genommen und registriert mit Zuordnung zu einer der vier Wellenlängen. Aus der Abfolge der den vier Desoxynucleo tiden zugeordneten Emissionsmaxima läßt sich im Prinzip unmittelbar die DNA-Sequenz ablesen. In der Praxis er geben sich doch schwerwiegende Meßprobleme, insbesondere Auflösungsprobleme, da die Konzentration der Fluoreszenz stoffe in den Banden äußerst gering ist.From the journal BIO / TECHNOLOGY 3, May 1985, pages 395, 396 is a device of the type mentioned at the beginning known to be used in gel electrophoresis Sequencing of DNA is proceeded so that one the "Primer" of the DNA obtained by the dideoxy method Fragments marked, each with a different color Fluorescent dye for the four approaches accordingly the four dideoxy nucleotides (see also the journal Nachr. chem.tech.Lab. 34, 5, pp. 430, 431, 1986). One of these Dye is rhodamine isothiocyanate (emission waves length 580 mm). The DNA fragments can then be stored in a single trace of a polyacrylamide gel separated and be measured photometrically with a laser. The gel is located in a thin tube. On the one The end of the gel to which the gangs run is that Laser arranged that illuminates each band as soon as it is walks past him. Which then from the fluorescence substances emitted with the corresponding wavelength Emission photons are picked up by the detector array taken and registered with assignment to one of the four Wavelengths. From the sequence of the four deoxynucleo tides associated emission maxima can in principle read the DNA sequence immediately. In practice he did there are serious measurement problems, especially Resolution problems because of the concentration of fluorescence substances in the gangs is extremely low.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei einer Vorrichtung der eingangs genannten Art die Meßempfind lichkeit zu erhöhen.The invention is based on the object at a Device of the type mentioned above, the measuring sensitivity opportunity to increase.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs gelöst.This task is made possible by the distinguishing features of claim 1 in conjunction with the features of Solved the generic term.

Es wurde erkannt, daß bei der bekannten Anordnung mit Gel-Elektrophorese innerhalb eines dünnen Glasröhrchens der Laserstrahl beim zweimaligen Durchqueren der Röhr chenwand beim Eintritt bzw. Austritt aus dem Glasröhrchen eine relativ hohe Untergrund-Strahlung (insbesondere Lichtstreuung) erzeugt, die von der auf den Innenraum des Röhrchen fokussierten Detektoranordnung praktisch nicht ausgeblendet werden kann. Auch wurde erkannt, daß der Laserstrahl lediglich ein geringes Teilvolumen des Gels erfaßt. Würde man den Laserstrahl etwa entsprechend dem Innendurchmesser des Röhrchens aufweiten, so würde dies dementsprechend die vom Glas in die Detektoranord nung gestreute Laserlicht-Intensität unzumutbar erhöhen. Bei der Erfindung dagegen wird durch den zwischen den beiden langen Rechteckseiten des Querschnitts verlaufenden, zu diesen Seiten lediglich geringfügigen Abstand aufweisenden Laserstrahl praktisch der gesamte Querschnitt erfaßt. Die zu überwachende Bahn bzw. Bahnen innerhalb des Querschnitts können so weit weg von dem Einlaßteil und dem Auslaßteil verlaufen, daß sämtliche im Bereich von Einlaßteil und Auslaßteil erzeugte Streustrahlung zuverlässig von der Detektor anordnung ausgeblendet werden kann.It was recognized that with the known arrangement Gel electrophoresis inside a thin glass tube the laser beam when crossing the tube twice wall at the entrance or exit from the glass tube a relatively high level of background radiation (especially Light scattering) generated by the on the interior of the tube-focused detector array is practical cannot be hidden. It was also recognized that the laser beam only covers a small part of the volume of the Gels recorded. One would use the laser beam roughly accordingly expand the inside diameter of the tube, so would this corresponds to the amount from the glass into the detector arrangement increase the scattered laser light intensity unreasonably. In the invention, however, is by the between both long sides of the rectangle of the cross-section running to these pages only slightly Spaced laser beam practically the entire Cross-section detected. The track or tracks to be monitored within the cross section can be so far away from that The inlet part and the outlet part run, that all in the area of the inlet part and outlet part Scattered radiation generated reliably by the detector arrangement can be hidden.

Es sei darauf hingewiesen, daß der Anregungsstrahl besonders bevorzugt ein Laserstrahl ist, aufgrund der erzielbaren hohen Intensitäten, wenn auch ein von einer inkohärenten Strahlenquelle abgegebener Anregungsstrahl in Frage kommt. Entsprechend der Vielzahl möglicher Anregungsmechanismen (Chemoluminiszenz; Thermoluminis zenz oder dergl.) kommen auch andere Arten von Anregungsstrahlen in Frage, bei spielsweise Röntgenstrahlen; auch muß die Wellenlänge der Emissionsphotonen nicht im sichtbaren Bereich liegen.It should be noted that the excitation beam a laser beam is particularly preferred, due to the achievable high intensities, albeit one of one incoherent radiation source emitted excitation beam can be considered. According to the multitude of possible Excitation mechanisms (chemiluminescence; thermoluminis zenz or the like.) come other types of excitation rays are also in question for example X-rays; also must the wavelength of the emission photons are not in the visible range.

Um möglichst verlustfrei den Anregungsstrahl in den Quer schnitt eintreten zu lassen und auch wieder aus treten zu lassen, werden die Maßnahmen des Anspruchs 2 vorgeschlagen. Das Ein- und Auskoppeln des Anregungs strahls aus Einlaßteil bzw. Auslaßteil wird durch die Maßnahmen des Anspruchs 3 noch weiter verbessert.In order to pass the excitation beam in the transverse direction with as little loss as possible cut in and out again to let occur, the measures of claim 2 suggested. The coupling and decoupling of the excitation jet from inlet part or outlet part is through the measures of claim 3 are further improved.

Die Weiterbildung gemäß Anspruch 4 bringt den Vorteil minimaler Streustrahlung des Anregungsstrahls in dem Abbremsmedium, insbesondere Gel, da dann die Intensität der Raman-Streuung und Raleigh- Streuung minimal ist. The development according to claim 4 has the advantage minimal scattered radiation of the excitation beam in the Braking medium, especially gel, there then the intensity of Raman scattering and Raleigh Scatter is minimal.

Um diese Polarisationsrichtung auch bei herkömmlichen Lasern mit vertikaler Polarisation zu erhalten, werden die Maßnahmen des Anspruchs 5 vorgeschlagen.To this direction of polarization even with conventional To obtain lasers with vertical polarization the measures of claim 5 proposed.

Um mit baulich einfachen Mitteln eine genaue Justierung des Strahlengangs des Anregungsstrahls durch den Innen raum des Gehäuses zu ermöglichen, werden die Maßnahmen des Anspruchs 6 vorgeschlagen.In order to achieve an exact adjustment with structurally simple means the path of the excitation beam through the interior To enable space of the housing, the measures of claim 6 proposed.

Besonders bevorzugt ist die Anordnung gemäß Anspruch 7. Mit einem einzigen Anregungsstrahl können auf diese Weise mehrere Bahnen im one-line-Betrieb überwacht werden. Bei der DNA-Sequenzierung werden sowohl bei dem Verfahren nach Maxam und Gilbert sowie nach Sanger vier, den vier Nukleotidbasen G, A, T, C entsprechende Ansätze der zu untersuchenden DNA zubereitet und einer Elektrophorese mit je einer Bahn für jeden Ansatz unterzogen. Mit der erfindungsgemäßen Anordnung lassen sich diese vier Bahnen durch einen einzigen Laserstrahl überwachen. Da jeder Bahn eine Detektoranordnung zugeordnet ist, kann für sämtliche Ansätze derselbe Farbstoff, insbesondere Fluorenszenz farbstoff eingesetzt werden. Dieser ist besonders be vorzugt ein an den Primer angehefteter Fluoro-Farb stoff, insbesondere Tetramethyl-Rhodamin. Dieser zeichnet sich durch hohe Absorption und damit große Wirksamkeit aus sowie durch geringe Bandbreite (52 nm Linienbreite bei halber Maximalintensität) aus bei einer Absorbtionswellenlänge von 560 nm und einer Emissionswellenlänge von 575 nm. Durch diese one- line-Vermessung der vier getrennten Bahnen mit jeweils optimalem Fluoreszenzfarbstoff in jeder Bahn und ge trennter Registrierung der Emission jeder Bahn ergibt sich eine außerordentlich gute Trennung der einzelnen Emissionspeaks unmittelbar aufeinanderfolgender Banden sowohl innerhalb einer einzigen Bahn als von zu Bahn.The arrangement according to claim 7 is particularly preferred. In this way, several tracks can be monitored in one-line operation with a single excitation beam. In DNA sequencing, both the Maxam and Gilbert and Sanger methods, four batches of the DNA to be examined corresponding to the four nucleotide bases G , A , T , C are prepared and subjected to electrophoresis with one lane for each batch. With the arrangement according to the invention, these four paths can be monitored by a single laser beam. Since a detector arrangement is assigned to each track, the same dye, in particular fluorescent dye, can be used for all approaches. This is particularly preferably a fluoro dye attached to the primer, in particular tetramethyl rhodamine. This is characterized by high absorption and thus great effectiveness as well as by a narrow bandwidth (52 nm line width at half maximum intensity) with an absorption wavelength of 560 nm and an emission wavelength of 575 nm optimal fluorescent dye in each lane and ge separate registration of the emission of each lane results in an extremely good separation of the individual emission peaks of immediately consecutive bands both within a single lane and from to lane.

Die Weiterbildung der Erfindung gemäß Anspruch 8 dient der weiteren Unterdrückung des Signal-Untergrunds durch Ausblenden von Störstrahlung. Hierzu trägt auch die Weiterbildung der Erfindung gemäß Anspruch 9 und 10 bei.The development of the invention according to claim 8 is used the further suppression of the signal background Suppression of interference radiation. The Further development of the invention according to claims 9 and 10 at.

Die erfindungsgemäße Anordnung läßt sich zwar mit be sonderem Vorteil für die DNA-Sequenzierung mit Auf teilung in vier Bahnen anwenden, wie vorstehend be schrieben worden ist. Aufgrund der erfindungsgemäß er zielten wesentlichen Verbesserung des Signal-Rauschver hältnisses kann die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch auch mit Erfolg für die eingangs beschriebene bekannte Vierfarben-Methode mit einer einzigen Bahn eingesetzt werden. Hierbei ist es auch möglich, mehrere Proben gleichzeitig in nebeneinanderliegenden Bahnen jeweils mit Vierfarben-Mischung durch die erfindungsgemäße Vor richtung zu analysieren. Die jeweilige Detektoranordnung jeder Bahn weist dann der Anzahl der unterschiedlichen Emissions-Photonenwellenlängen entsprechend mehrere Sensoren auf. Durch entsprechende Strahl-Filterung können den Sensoren jeweils die Photonen der zugeordneten Wellenlänge zugeleitet werden. Man kann jedoch auch gemäß Anspruch 12 den Strahl richtungsmäßig aufspalten (durch Prisma, Strichgitter, Fresnel′sche Zonenplatte) in Teilstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge. Die Sensoren können dann gemäß Anspruch 13 positionsempfindliche Detektoren sein,vorzugsweise in Form einer CCD-Zeile, einer Photodio den-Zeile oder eines Photomultipliers mit unterteilten Positionsbereichen.The arrangement according to the invention can be with be special advantage for DNA sequencing with Auf use division in four lanes as described above has been written. Due to the invention he aimed to significantly improve the signal-to-noise ratio However, the device according to the invention can also with success for the well-known one described at the beginning Four-color method used with a single lane will. It is also possible to have several samples at the same time in adjacent lanes with four-color mixture by the inventive Vor analyze direction. The respective detector arrangement each track then assigns the number of different ones Emission photon wavelengths correspondingly several Sensors on. Through appropriate beam filtering can each of the sensors the photons of the assigned Wavelength are fed. However, one can also according to Claim 12 split the beam directionally (by Prism, line grating, Fresnel zone plate) in Partial beams of different wavelengths. The sensors can then position sensitive according to claim 13 Detectors, preferably in the form of a CCD line, a photodio den line or a photomultiplier with subdivided position areas.

Um einen schnellen Wechsel des das Abbremsmedium für die zu untersuchenden Stoffe, insbesondere Gel-Schicht enthaltenden Gehäuses zur schnellen Vorbereitung der nächsten Messung durchführen zu können ohne aufwendige Justierarbeiten, werden die Maßnahmen des Anspruchs 14 vorgeschlagen. Der Träger für das Gehäuse kann mit der Halterung für die Strahlquelle über eine optische Bank, einen optischen Tisch oder dergl. verbunden sein.In order to quickly change the braking medium for the substances to be examined, especially gel layer containing housing for quick preparation of the to be able to carry out the next measurement without time-consuming Adjustment work, the measures of claim 14 suggested. The carrier for the housing can with the Holder for the beam source via an optical bench, an optical table or the like. Be connected.

Bevorzugt für die Gel-Elektrophorese ist das als Gel- Träger dienende Gehäuse gemäß den Merkmalen des Anspruchs 15 ausgebildet. Die Gel-Schicht kann gemäß DE-OS 30 24 288 hergestellt worden sein; die von der Detektoranordnung entferntere der beiden zueinander parallelen Platten kann auf eine thermostatische Platte gemäß dem deutschen Patent 30 46 729 aufgelegt sein oder selbst eine Wand dieser thermostatischen Platte bilden. Die Ausbildung des Trägers als das Gel einschließendes Gehäuse ist be sonders bevorzugt, wenn auch die Erfindung anwendbar ist auf nicht abgedeckte Gel-Schichten auf einem Träger. Der artige Gel-Schichten haben zwar im allgemeinen keine völlig konstante Dicke entlang der jeweiligen Bahn; da es bei dem erfindungsgemäßen one-line-Verfahren jedoch nur auf die relative Abfolge der Banden ankommt, kann diese ungleichmäßige Dicke in Kauf genommen werden.Preferred for gel electrophoresis is the gel Carrier serving housing according to the features of claim 15 trained. The gel layer can according to DE-OS 30 24 288 have been made; that of the detector array more distant of the two parallel plates can on a thermostatic plate according to the German Patent 30 46 729 or even a wall form this thermostatic plate. Training of the carrier as the housing enclosing the gel is be particularly preferred if the invention is also applicable on uncovered gel layers on a support. The like gel layers generally do not have any completely constant thickness along the respective path; there however, in the case of the one-line method according to the invention only the relative sequence of the bands is important this uneven thickness must be accepted.

Gemäß den Ansprüchen 16-18 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung bevorzugt zur Gel-Elektrophorese und Fluoreszenzanregung durch Laserstrahl ausgebildet.According to claims 16-18 is the invention Device preferred for gel electrophoresis and Fluorescence excitation formed by laser beam.

Die erfindungsgemäß Vorrichtung eignet sich besonders bevorzugt zur DNA-Sequenzierung, wenn auch andere An wendungen in Frage kommen. Erfindungsgemäß kann die DNA-Sequenzierung im one-line-Betrieb mit automatischer Auswertung vorgenommen werden, wobei die hohe Sensitivität besonders hervorzuheben ist. Gemäß Anspruch 19 kann jedoch bedarfsweise eine "Mo mentaufnahme" der Banden auf dem Träger angefertigt werden, indem entwe der der Anregungsstrahl in Wanderungsrichtung gegenüber dem Träger ver lagert wird oder umgekehrt zur entsprechenden Abtastung des Banden musters.The device according to the invention is particularly suitable preferred for DNA sequencing, albeit a different type applications come into question. According to the invention, the DNA sequencing in one-line operation with automatic Evaluation can be made, with the high sensitivity particularly is to be emphasized. According to claim 19, however, a "Mo ment recording "of the bands on the carrier are made by entwe which ver the excitation beam in the direction of travel with respect to the carrier is stored or vice versa for the corresponding scanning of the band pattern.

Die Erfindung wird im folgenden an bevorzugten Ausführungsbeispielen an Hand der Zeichnung erläutert:The invention is illustrated below in terms of preferred exemplary embodiments explained on the basis of the drawing:

Es zeigt: It shows:

Fig. 1 eine Schemaansicht des Gesamtsystems; Fig. 1 is a schematic view of the overall system;

Fig. 2 eine teilweise geschnittene Detailansicht der Anordnung in Fig. 1 im Bereich des Gel-Trägers; FIG. 2 shows a partially sectioned detailed view of the arrangement in FIG. 1 in the area of the gel carrier; FIG.

Fig. 3 eine perspektivische, teilweise abgebrochene vereinfachte Darstellung einer Halterung für den Gel-Träger und3 shows a perspective, partially broken away, simplified representation of a holder for the gel carrier and FIG

Fig. 4 eine perspektivische Teilansicht einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit spektraler Detektions-Aufteilung. Fig. 4 is a partial perspective view of another embodiment of the invention with spectral detection division.

Der generelle Aufbau einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Fig. 1 zu ent nehmen. Man erkennt einen mit 10 bezeichneten Laser (Argon-Laser, Spectra-Physics, Modell 166, Wellenlänge 514,5 nm), der einen Anregungsstrahl 12 abgibt mit vertikaler Polarisation, angedeutet durch einen Richtungs pfeil A′. Ein 90°-Polarisator 14 im Strahlengang zwischen Laser 10 und einem Elektrophorese-Gel-Träger 16 bewirkt eine Drehung der Polarisationsrichtung in die horizontale (Pfeil B′). Es folgt ein Fokussier-System 18, welches den Strahlquerschnitt von 2 mm Durchmesser auf 0,3 bis 0,4 mm reduziert. Die Laser-Ausgangsleistung liegt im Bereich zwischen 50 bis 800 mW. Die Teile 10, 14 und 18 bilden eine Strahlquelle 20. Sie sind in üblicher Weise auf einem nicht näher dargestellten Träger, insbesondere optischer Tisch bzw. optische Bank, montiert, auf welchem die Platte 16 ebenfalls starr montiert ist, insbesondere unter Verwendung der in Fig. 3 dargestellten Halterung 21. Diese besteht aus einer mit dem Träger starr verbundenen, insbesondere über die Befestigungslöcher 22 in nicht dargestellter Weise befestigten Grundplatte 24, an welcher ein im Horizontal-Querschnitt im wesentlichen U-förmiger Anlagekörper 26 starr befestigt. An vertikalen Stirn flächen 28 der Seitenschenkel 30 der U-Form wird die jeweilige Platte 16 angelegt und an den Seitenschenkeln 30 starr befestigt, beispielsweise mit Hilfe von Feder elementen, die einerseits an die vom Körper 26 abgewandte Deckplatte 32 des Trägers 16 angreifen und anderer seits in Befestigungsausnehmungen 34 der Seitenschenkel 30 eingreifen. Die unteren Enden der beiden Seitenschenkel 30 sind jeweils mit einer Ausnehmung 36 versehen, in welche ein nicht dargestellter Trog einschiebbar ist, welcher das untere Ende der Platte 16 in üblicher Weise aufnimmt und welcher mit der unteren Elektrode zur Er zeugung des elektrischen Feldes für die Elektrophorese versehen ist.The general structure of a first embodiment of the device according to the invention is shown in FIG. 1. One recognizes a laser labeled 10 (argon laser, Spectra-Physics, model 166, wavelength 514.5 nm), which emits an excitation beam 12 with vertical polarization, indicated by a directional arrow A '. A 90 ° polarizer 14 in the beam path between the laser 10 and an electrophoresis gel carrier 16 causes the direction of polarization to rotate in the horizontal direction (arrow B '). This is followed by a focusing system 18 which reduces the beam cross-section from 2 mm in diameter to 0.3 to 0.4 mm. The laser output power is in the range between 50 and 800 mW. The parts 10 , 14 and 18 form a beam source 20 . They are mounted in the usual way on a carrier (not shown in detail), in particular an optical table or optical bench, on which the plate 16 is also rigidly mounted, in particular using the holder 21 shown in FIG. 3. This consists of a base plate 24 rigidly connected to the carrier, in particular fastened via the fastening holes 22 in a manner not shown , to which a contact body 26 , which is essentially U-shaped in horizontal cross section, is rigidly fastened. On vertical end faces 28 of the side legs 30 of the U-shape, the respective plate 16 is applied and rigidly attached to the side legs 30 , for example with the help of spring elements that attack on the one hand the cover plate 32 of the carrier 16 facing away from the body 26 and on the other hand engage in fastening recesses 34 of the side legs 30. The lower ends of the two side legs 30 are each provided with a recess 36 into which a trough, not shown, can be inserted, which receives the lower end of the plate 16 in the usual way and which with the lower electrode to generate the electric field for electrophoresis is provided.

Wie Fig. 2 zeigt, kann im Strahlengang zwischen Laser 10 und Träger 16 ferner ein Glasplättchen 38 mit vertikaler Drehachse 40 parallel zu den planparallelen Plättchen seiten 42 vorgesehen sein, um eine Parallelverschiebung des Anregungsstrahls 12 in horizontaler Richtung ent sprechend dem Drehwinkel des Plättchen 38 zu ermöglichen. Der Strahl 12 wird in bekannter Weise beim Durchtritt durch die beiden Seitenflächen 42 zweifach abgelenkt jeweils um den gleichen Winkel, jedoch in entgegenge setzten Richtungen, so daß sich die gewünschte parallele Verschiebung in horizontaler Ebene ergibt. Eine genaue Justiermöglichkeit des Anregungsstrahls 12 ist deshalb von Vorteil, weil der Strahlquerschnitt mit einem Durch messer von beispielsweise 0,3 bis 0,4 mm angenähert der Gel-Schicht-Dicke a in etwa 0,5 mm entspricht.As Fig. 2 shows, a glass plate 38 with a vertical axis of rotation 40 parallel to the plane-parallel plate sides 42 can also be provided in the beam path between the laser 10 and the carrier 16 to allow a parallel shift of the excitation beam 12 in the horizontal direction accordingly to the angle of rotation of the plate 38 enable. The beam 12 is deflected twice in a known manner when passing through the two side surfaces 42 each at the same angle, but in opposite directions, so that the desired parallel displacement results in the horizontal plane. Precise adjustment of the excitation beam 12 is advantageous because the beam cross-section with a diameter of, for example, 0.3 to 0.4 mm approximately corresponds to the gel layer thickness a approximately 0.5 mm.

Die Gel-Schicht-Dicke wird durch die entsprechend dicke, in den Fig. 1 und 2 angedeutete, zur Wanderungs richtung W parallele Abstandsstreifen 46 festgelegt, die an den vertikalen Längsrändern zweier gleichformatiger zueinander paralleler Platten 48 und 50 angeordnet sind und diese im Abstand a voneinander halten. Wenigstens eine der beiden Platten 50, nämlich die einer Detektor- Anordnung 52 zugewandte Platte 50, besteht aus wenig fluoreszentem, farblosem Glas mit hochgenau planparallelen Seitenflächen (z.B. B 270, Firma DESAG, BRD). Die Gel- Herstellung kann gemäß der DE-OS 30 24 288 erfolgen. Die von der Detektoranordnung 52 abgewandte Platte 48 kann mit Hilfe einer thermostatischen Platte beispielsweise gemäß der DE-OS 30 46 729 thermostatisiert sein, ggf. eine Frontplatte dieser thermostatischen Platte selbst bilden. Als Gel kommt ein Polyacrylamid-Gel in Frage mit einer (horizontalen) Breite von 100 mm und einer Länge von 400 mm. Auch kürzere Gele (200 mm) kommen in Frage. Der Einstrahlpunkt des Anregungsstrahls 12 liegt beispielsweise etwa 100 mm vor dem unteren Ende der Platten 48, 50.The gel layer thickness is determined by the correspondingly thick, indicated in Figs. 1 and 2, to the migration direction W parallel spacer strips 46 , which are arranged on the vertical longitudinal edges of two plates 48 and 50 of the same size and parallel to each other and these at a distance a keep each other. At least one of the two plates 50 , namely the plate 50 facing a detector arrangement 52 , consists of low-fluorescent, colorless glass with highly precise plane-parallel side surfaces (eg B 270, DESAG, Germany). The gel production can be carried out according to DE-OS 30 24 288. The plate 48 facing away from the detector arrangement 52 can be thermostatted with the aid of a thermostatic plate, for example in accordance with DE-OS 30 46 729, and possibly form a front plate of this thermostatic plate itself. A polyacrylamide gel with a (horizontal) width of 100 mm and a length of 400 mm can be used as the gel. Shorter gels (200 mm) can also be used. The point of irradiation of the excitation beam 12 lies, for example, approximately 100 mm in front of the lower end of the plates 48 , 50 .

Um das Laserlicht möglichst verlustfrei in den Gel- Querschnitt gelangen zu lassen, ist ein Einlaß-Teil 56 in eine entsprechende Lücke des in den Fig. 1 und 2 linken Randstreifens eingesetzt mit einer der Randstreifen dicke a entsprechenden Dicke und einer Breite in verti kaler Richtung von etwa 10 mm. Die Länge des Einlaß- Teils 56 (in horizontaler Richtung) beträgt beispiels weise 15 mm. Da das in Fig. 2 rechte Ende des Einlaß- Teils 56 mit der Innenlängskante 58 des Randstreifens 46 fluchtend und die Breite des Randstreifen 46 in horizon taler Richtung lediglich 10 mm beträgt, steht das Ein laß-Teil 56 über den Plattenumriß vor. Die vom Anregungs strahl 12 durchsetzten, zu diesem senkrechten Stirnflächen 60 des Einlaß-Teils 56 sind mit optischer Qualität plan parallel poliert. Gleichen Aufbau weist ein in gleicher Höhe wie das Einlaß-Teil 56 angeordnetes Auslaß-Teil 62 in einer Durchbrechung des gegenüberliegenden Rand streifens 46 auf. Das Auslaß-Teil 62 dient der verlust armen und damit reflexionsarmen Auskopplung des An regungsstrahls aus dem Gel-Querschnitt. Diese Anordnung stellt sicher, daß der Laserstrahl mit hoher Intensität ohne merkliche Divergenz in den Gel-Querschnitt eingekoppelt wird und diesen ohne stärkere Reflexionen oder Lichtstreueffekte wieder verläßt. Die absolut glatte Innenseite von Einlaß- und Auslaßteil 56 bzw. 62 ergibt zudem bei der Gelherstellung (mit bereits eingesetzten Teilen 56 bzw. 62) eine entsprechend glatte polymeri sierte Geloberfläche mit minimaler Streuung und Reflexion des auftreffen den Laserstrahls. Man erhält daher einen vorteilhaft niedrigen Meß-Untergrund.In order to let the laser light lossless enter the gel cross-section as possible, an inlet part 56 is inserted into a corresponding hole of the left in FIGS. 1 and 2, the edge strip with one of the edge strips thick a corresponding thickness and a width in verti Kaler direction of about 10 mm. The length of the inlet part 56 (in the horizontal direction) is, for example, 15 mm. Since the right end in Fig. 2 of the inlet part 56 with the inner longitudinal edge 58 of the edge strip 46 is aligned and the width of the edge strip 46 in horizon tal direction is only 10 mm, the A laß part 56 is above the plate outline. The interspersed by the excitation beam 12 , perpendicular to this end faces 60 of the inlet part 56 are polished flat parallel with optical quality. The same structure has an outlet part 62 arranged at the same height as the inlet part 56 in an opening in the opposite edge strip 46 . The outlet part 62 is used for the low-loss and thus low-reflection decoupling of the excitation beam to from the gel cross-section. This arrangement ensures that the laser beam is coupled into the gel cross-section with high intensity without noticeable divergence and leaves it again without stronger reflections or light scattering effects. The absolutely smooth inside of inlet and outlet part 56 and 62 also results in the gel production (with parts 56 and 62 already inserted) a correspondingly smooth polymerized gel surface with minimal scattering and reflection of the laser beam impinging. An advantageously low measurement background is therefore obtained.

Die Detektor-Anordnung dient zur gleichzeitigen, ge sonderten Erfassung der im Ausführungsbeispiel insgesamt vier mit A, T, G, C bezeichneten Bahnen längs derer während der Elektrophorese vier zu untersuchende Proben in Richtung W wandern unter Bildung von Banden aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der Bestandteile der Proben. Die im Ausführungsbeispiel angegebene Bezeichnung der vier Bahnen mit den Buch staben A, T, G und C soll die Basen angeben, bei denen im jeweiligen Probenansatz die DNA-Fragmente jeweils abgebrochen sind (entsprechend den üblichen DNA-Sequenzie rungsmethoden nach Maxam-Gilbert bzw. nach Sanger). Um die von den Nachfragmenten jeweils gleicher Molekül-Länge gebildeten, in Fig. 1 mit 66 bezeichneten Banden trotz ihrer äußerst geringen Konzentration ohne die Verwendung radioaktiver Markierungen in einfacher Weise detektieren zu können, sind die DNA-Fragmente mit einem Fluorophor markiert. Hierfür kommt insbesondere, wenn auch nicht ausschließlich, der an den Fragmenten belassene Primer in Frage, der mit einem Tetramethyl-Rodamin versehen ist. Dieser Farbstoff zeichnet sich durch hohe Absorption und damit große Wirksamkeit aus sowie durch relativ geringe Linienbreite (52 nm Linienbreite bei halber Maximal- Intensität). Absorptions-Wellenlänge liegt bei 560 nm, die Emissions-Wellenlänge bei 575 nm.The detector arrangement is used for simultaneous, separate detection of the total of four paths designated by A, T , G , C in the exemplary embodiment along which four samples to be examined migrate in the direction W during electrophoresis, forming bands due to the different migration speeds of the components of the Rehearse. The designation of the four lanes given in the exemplary embodiment with the letters A , T , G and C is intended to indicate the bases at which the DNA fragments are broken off in the respective sample preparation (in accordance with the usual DNA sequencing methods according to Maxam-Gilbert or according to Sanger). The DNA fragments are marked with a fluorophore in order to be able to detect the bands of the same molecule length formed by the respective fragments and denoted by 66 in FIG. 1 despite their extremely low concentration without the use of radioactive labels. For this purpose, the primer left on the fragments, which is provided with a tetramethyl rodamine, is particularly, if not exclusively, suitable. This dye is characterized by high absorption and thus great effectiveness as well as by a relatively small line width (52 nm line width at half the maximum intensity). The absorption wavelength is 560 nm, the emission wavelength is 575 nm.

Die durch den Anregungsstrahl 12 des Lasers 10 induzierten Emissions-Photonen der jeweils den Laserstrahl gerade queren den Bande 66 werden von einer Sammel- und Abbildungsoptik 70 jeweils für jede Bahn A, T, G oder C gesondert erfaßt (numerische Apertur 1, 2; Brennweite 50 mm) und auf eine Ausblend-Anordnung 72 mit vier Blenden 74 abgebildet. Jede Blende wird von einem der jeweiligen Bandenlänge entsprechenden horizontalen Schlitz gebildet mit einer Schlitzhöhe in vertikaler Richtung von 0,4 mm entsprechend dem Durchmesser des Abtaststrahls 12. Auf diese werden die aus Bereichen außerhalb der jeweiligen Bande stammenden Photonen weitmöglichst ausgeblendet.The induced by the excitation beam 12 of the laser 10 emission photons of each of the laser beam just traversing the band 66 are recorded separately for each path A , T , G or C by collecting and imaging optics 70 (numerical aperture 1 , 2 ; focal length 50 mm) and shown on a masking arrangement 72 with four diaphragms 74 . Each diaphragm is formed by a horizontal slot corresponding to the respective band length with a slot height in the vertical direction of 0.4 mm corresponding to the diameter of the scanning beam 12 . The photons coming from areas outside the respective band are masked out as far as possible on these.

Das durch die jeweilige Blende 74 tretende Licht wird in jeweils einen Lichtleiter 76 eingespeist, die jeweils in einer Filteranordnung 78 münden. Die Filteranordnungen dienen zum Wegfiltern von Photonen mit von den Emissions- Photonen abweichender Wellenlänge. Jede Filteranordnung umfaßt einen nicht fluoreszenten Filter zum Durchlaß größerer Wellenlängen (Schott BRD Nr. KV 550) sowie einen Bandpaß- Interferenz-Filter (Schott BRD Typ AL 575) mit bei 18 Nanometern liegenden Breite bei halber Maximal-Intensität. Diese Filter halten Raman-Streu- und Raleigh-Streu-Photonen von den nachfolgenen Sensoren ab. Die Sensoren sind in einem mit 80 bezeichneten Block einge baut und unter der Bezugsziffer 82 symbolisch angedeutet. Als Sensoren kommen bevorzugt Photomultiplier in Frage (EMI London, Typ 9954 A) mit entsprechener Versorgungs elektronik. Alternativ können auch Photodioden oder andere übliche Lichtdetektoren eingesetzt werden. Die vom Detektor block 80 abgegebenen Meßsignale werden über eine mit 84 bezeichnete Leitung einer Datensammel- und Speichereinheit 86 zugeführt, die wiederum mit einem Mikro-Computer 88 zur Datenauswertung verbunden ist. In Fig. 1 ist ein mit dem Mikro verbundener Bildschirm 90 zu erkennen sowie ein vom Mikrocomputer gesteuerter Printer 92.The light passing through the respective diaphragm 74 is fed into a respective light guide 76 , each of which opens into a filter arrangement 78 . The filter arrangements serve to filter away photons with a wavelength that differs from the emission photons. Each filter arrangement comprises a non-fluorescent filter for the passage of larger wavelengths (Schott BRD No. KV 550) and a bandpass interference filter (Schott BRD type AL 575) with a width of 18 nanometers at half maximum intensity. These filters keep Raman scattering and Raleigh scattering photons from the subsequent sensors. The sensors are built into a block labeled 80 and are symbolically indicated by reference numeral 82. The preferred sensors are photomultipliers (EMI London, type 9954 A) with appropriate supply electronics. Alternatively, photodiodes or other conventional light detectors can also be used. The measurement signals emitted by the detector block 80 are fed via a line denoted by 84 to a data collection and storage unit 86 , which in turn is connected to a microcomputer 88 for data evaluation. In FIG. 1, a screen 90 connected to the micro can be seen, as well as a printer 92 controlled by the microcomputer.

Aufbau und Betrieb der Anordnung gemäß Fig. 1 ist aus dem Vorstehendem im wesentlichen bereits ersichtlich. Nach Justierung von Laser 10 und Träger 16, erleichtert durch die an Hand von Fig. 3 bereits erläuterte Halterung 20 sowie durch das Justierplättchen 38 gemäß Fig. 2 und nach Ein justierung der Detektoranordnung 52, wird die Elektro phorese in Gang gesetzt, beispielsweise bei einer an das Gel 54 angelegten Spannung von 1000 bis 1500 V, 50°C und einer Leistung von 20 W. Im dargestellten Beispiel hat eine Bande 66′ der Bahn G als erste und einzige bereits den Abtaststrahl 12 passiert unter Erzeugung eines ent sprechenden Peaks der dieser Bahn G zugeordneten Meßkurve auf dem Bildschirm 90 und im Printer 92. Hieraus ergibt, sich daß das kürzeste DNA-Fragment in einer Guanin-Base an seinem dem Primer gegenüberliegenden Ende endet. Als nächstes wird eine mit 66′′ bezeichndete Bande in der Bahn T den Abtaststrahl 12 queren mit entsprechender Peak erzeugung in der zugeordneten Meßkurve T. Hieraus läßt sich unmittelbar schließen, daß auf die Guanin-Base eine Tymin -Base folgt.The structure and operation of the arrangement according to FIG. 1 can essentially already be seen from the foregoing. After adjustment of the laser 10 and carrier 16, facilitated by reference to FIG. 3 above-explained bracket 20 and by the Justierplättchen 38 of FIG. 2 and by a calibration of the detector array 52, the electromagnet is phoresis set in motion, for example when a applied to the gel 54 voltage of 1000 to 1500 V, 50 ° C and a power of 20 W. In the example shown, a band 66 'of the path G is the first and only one that has already passed the scanning beam 12 , generating a corresponding peak of this Trace G assigned to the measurement curve on the screen 90 and in the printer 92 . It follows that the shortest DNA fragment ends in a guanine base at its end opposite the primer. Next, a band marked with 66 '' in the path T will cross the scanning beam 12 with a corresponding peak generation in the associated measurement curve T. From this it can be concluded immediately that the guanine base is followed by a tymine base.

Auf diese Weise läßt sich im Prinzip die gesamte Basen sequenz eines zu untersuchenden DNA-Stücks unmittelbar im one-line-Betrieb ermitteln.In this way, in principle, the entire bases sequence of a piece of DNA to be examined directly in the determine one-line operation.

Die Ausführungsform gemäß Fig. 4 bezieht sich auf die Vier-Farben-Methode gemäß der Zeitschrift Bio/Technolo gy vol. 3; Mai 1986, 395, 396, bei der die vier Ansätze A, T, G und C der DNA-Fragmente mit vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gekenn zeichnet sind, beispielsweise durch entsprechend anders farbige Markierung des Primers. Aufgrund dieser Unterscheid barkeit der Ansätze können die vier Ansätze vermischt werden und eine aus dieser Mischung gewonnene Probe in einer einzigen Bahn M durch Gel- Elektrophorese untersucht werden. Dies ist in Fig. 4 angedeutet, wobei der Anregungsstrahl wiederum mit 12 bezeichnet ist und der Gel-Schichtträger mit 16′. In der Detektions-Anordnung 52′ ist der Einfach heit halber die Sammel- und Abbildungsoptik weggelassen. Man erkennt dagegen eine Einrichtung 94 zum Aufspalten des ein fallenden Detektionsstrahls 96 in Teilstrahlen 98 unter schiedlicher Wellenlänge entsprechend den unterschiedlichen Wellenlängen der Primer-Fluorophore. Die Einrichtung 94 ist durch ein Prisma symbolisiert; es kommen auch andere Bau arten in Frage, wie z.B. Strichgitter oder Dünnschicht-Filter nach entsprechender Strahlteilung.The embodiment according to FIG. 4 relates to the four-color method according to the journal Bio / Technology vol. 3; May 1986, 395, 396, in which the four approaches A , T , G and C of the DNA fragments are marked with four different fluorescent dyes, for example by correspondingly differently colored marking of the primer. Because of this differentiability of the approaches, the four approaches can be mixed and a sample obtained from this mixture can be examined in a single lane M by gel electrophoresis. This is indicated in Fig. 4, the excitation beam in turn being denoted by 12 and the gel layer support by 16 '. In the detection arrangement 52 'for the sake of simplicity, the collecting and imaging optics are omitted. On the other hand, one recognizes a device 94 for splitting the incident detection beam 96 into partial beams 98 at different wavelengths corresponding to the different wavelengths of the primer fluorophores. The device 94 is symbolized by a prism; there are also other types of construction in question, such as line grids or thin-film filters after appropriate beam splitting.

Die Teilstrahlen 98 werden Einzeldetektoren 82′ zugeführt unter Zwischenschaltung einer Filteranordnung 78′ in An passung an die jeweilige Teilstrahl-Wellenlänge. Von den Einzeldetektoren 82′ gehen jeweils elektrische Signal- Leitungen 84′ aus, die in eine Datensammel- und Speicher anordnung 86 entsprechend Fig. 1 einmünden.The partial beams 98 are supplied to individual detectors 82 'with the interposition of a filter arrangement 78 ' in adaptation to the respective partial beam wavelength. From the individual detectors 82 'each electrical signal lines 84 ' go out, which open into a data collection and storage arrangement 86 as shown in FIG.

Bei der DNA-Sequenzierung nach der zuletzt beschriebenen Methode wird also eine einzige DNA-Fragment-Probe als Mischung der unterschiedlich markierten vier Ansätze einer Gel-Schicht-Elektrophorese unterzogen, wobei dann die bei spielsweise in der Bahn M in Fig. 4 aufgrund unterschied licher Wandungsgeschwindigkeiten aufgespaltenen Banden von der Detektoranordnung 52′ beim Durchqueren des Anregungs strahls 12 im one-line-Verfahren detektiert werden. Durch die wellenlängenmäßige Aufspaltung in die Teilstrahlen 98 und Messung der jeweiligen Intensität durch die den einzelnen Teilstrahlen und somit den Basen C, G, T und A jeweils zugeordneten Einzeldetektoren 82′ läßt sich un mittelbar der jeweilige Basentyp, der gerade detektierten Bande 66 feststellen.In DNA sequencing according to the method described last, a single DNA fragment sample is subjected to a gel layer electrophoresis as a mixture of the four differently labeled batches, in which case the for example in lane M in FIG. 4 due to different Licher Wall speeds split bands from the detector assembly 52 'when crossing the excitation beam 12 can be detected in the one-line process. Due to the wavelength splitting into the partial beams 98 and measurement of the respective intensity by the individual detectors 82 'assigned to the individual partial beams and thus the bases C , G , T and A , the respective base type, the band 66 just detected, can be determined directly.

In Fig. 4 ist angedeutet, daß man mit Hilfe des Anregungs strahls 12 eine DNA-Sequenzierung in einer zur Bahn M be nachbarten Bahn M′ vornehmen kann, und zwar ggf. gleich zeitig mit der DNA-Sequenzierung in der Bahn M. Hierzu ist eine zweite der Bahn M′ zugeordnete Detektoranordnung 52′′ vorzusehen, von welcher jedoch lediglich das Prisma der Einrichtung 94′′ zur Aufspaltung des einfallenden Detektionsstrahls 96′′ in vier Teilstrahlen 98′′ ange deutet ist.In FIG. 4, it is indicated that it is possible to make with the help of the excitation beam 12 is a DNA sequencing in a web to be M adjacent lane M ', namely, if necessary, simultaneously with the DNA sequencing in the web M. For this purpose, a second detector arrangement 52 '' assigned to the path M 'is to be provided, of which, however, only the prism of the device 94 ''for splitting the incident detection beam 96 ''into four partial beams 98 ''is indicated.

Mit der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Maßnahme wird ein großer Fortschritt bei der DNA-Sequen zierung erzielt. Die DNA-Sequenz wird im one-line-Ver fahren während der Elektrophorese bestimmt durch un mittelbares Einlesen in einen Rechner. Die in der am selben Tage eingereichten Anmeldung des gleichen Anmelders mit dem Titel "Verfahren zur DNA - Markierung" beschriebene Art und Weise der Markierung des Primers mit einem einzigen Fluorophor, nämlich mit Tetramethyl- Rodamin, ist zuverlässig und einfach durchzuführen und mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung besonders vorteilhaft zu kombinieren. Die Anregung der Fluoreszenz durch einen Laser-Anregungsstrahl, welcher die Gel-Schicht parallel zur Gel-Ebene über ihre gesamte Breite senkrecht zur Wanderungsrichtung durch setzt, liefert eine bislang noch nicht erzielte außer ordentlich hohe Empfindlichkeit der Messung. Hierzu trägt auch die wirksame und bauliche einfache Art der Ein kopplung und Auskopplung des Laserlichts in bzw. aus der Gel-Schicht bei. Es können gleichzeitig eine Viel zahl von Bahnen durch einen einzigen Anregungsstrahl erfaßt werden. Es sind keine mechanisch bewegten Teile vorgesehen, was die Meßgenauigkeit erhöht. Der Meß untergrund ist weitgehend reduziert, wozu auch die ge wählte Polarisationsrichtung des Anregungsstrahls bei trägt. Es ergibt sich eine gute Zählstatistik, da der Anregungsstrahl ständig die zu untersuchende Bahn bzw. die zu untersuchenden Bahnen quert. Im Vergleich zu einer möglichen Anordnung, bei der der Laserstrahl mehr oder weniger rechtwinklig auf die Gel-Schicht gerichtet ist und die vier Spuren abwechselnd abtastet, ergibt sich bei der Erfindung der wesentliche Vorteil, daß der Laser strahl ohne Unterbrechung sämtliche vier Spuren gleich zeitig detektiert. Auch ist bei der erfindungsgemäßen Anordnung der Einfluß von Unregelmäßigkeiten oder Ver schmutzungen des die Gel-Schicht abdeckenden Glases be seitigt. Es bereitet nämlich keine Schwierigkeiten, das relativ kleine Einlaßteil mit optischer Qualität herzu stellen. Falls man von der bevorzugten Ausführungsform abweichend einen gepulsten Laser statt eines kontinuier lich arbeitenden Lasers einsetzt, ergibt sich die Mög lichkeit, die Fluoreszenz nach Beendigung des Laser impulses zu detektieren mit dem Vorteil weiter reduzierten Untergrundes.With the measure according to the invention described above, a great advance in DNA sequencing is achieved. The DNA sequence is determined in the one-line process during electrophoresis by direct reading into a computer. The filed on the same day application of the same applicant with the title "Method of DNA - mark" manner described the marker of the primer with a single fluorophore, namely, tetramethyl rhodamine, is reliable and easy to carry out and with the inventive apparatus particularly advantageous to combine. The excitation of the fluorescence by a laser excitation beam, which passes through the gel layer parallel to the gel plane over its entire width perpendicular to the direction of migration, provides an extremely high sensitivity of the measurement that has not yet been achieved. The effective and structurally simple way of coupling and decoupling the laser light into and out of the gel layer also contributes to this. A large number of trajectories can be detected simultaneously by a single excitation beam. No mechanically moving parts are provided, which increases the measurement accuracy. The measurement background is largely reduced, which also contributes to the selected direction of polarization of the excitation beam. The result is good counting statistics, since the excitation beam constantly crosses the path or paths to be examined. Compared to a possible arrangement in which the laser beam is directed more or less at right angles to the gel layer and alternately scans the four tracks, the main advantage of the invention is that the laser beam detects all four tracks simultaneously without interruption . Also, in the arrangement according to the invention, the influence of irregularities or contamination of the glass covering the gel layer is eliminated. Namely, there is no difficulty in making the relatively small inlet part with optical quality. If, in deviation from the preferred embodiment, a pulsed laser is used instead of a continuously operating laser, there is the possibility of detecting the fluorescence after the end of the laser pulse with the advantage of a further reduced background.

Mit der vorstehend beschriebenen Anordnung läßt sich ohne weiteres eine automatische DNA-Sequenzierung, be ginnend mit der Base 1 durchführen, verglichen mit der Base 40 bis 50 bei der herkömmlichen Autoradiograph- Technik. Die erfindungsgemäß mögliche automatische Datenanalyse macht eine Quantifizierung der Bandenab stände sowie der relativen Bandenintensitäten möglich.With the arrangement described above, automatic DNA sequencing, starting with base 1, can be carried out easily, compared with base 40 to 50 in the conventional autoradiograph technique. The automatic data analysis possible according to the invention makes it possible to quantify the band spacings and the relative band intensities.

Zur Fig. 4 sei angemerkt, daß die Einzeldetektoren 82′ von Einzel-Photodioden gebildet werden können. Es kommen jedoch auch andere Detektor-Formen, wie z.B. eine CCD-Zeile (Charge-Coupled-device) oder Photodioden-Zeile. Abweichend von der dargestellten vertikalen Anordnung des Gels, kann dieses auch anders orien tiert sein, da der Stofftransport auf Grund des angelegten elektrischen Feldes erfolgt. Dies gilt auch bei Einsatz einer nicht dargestellten Anordnung für Gaschromatographie, bei der die treibende Kraft für die zu untersuchenden Stoffteilchen vom Gasdruck herrührt (bzw. Flüssigkeitsdruck im Falle der Flüssigkeits-Chromatographie). Gemeinsam ist den Anordnungen nach der Erfindung die Erfassung der Stoffteilchen durch ei nen den länglichen Querschnitt des Abbremsmediums in Längs richtung durchsetzenden Anregungsstrahl.To Fig. 4 it should be noted that the individual detectors 82 'can be formed by individual photodiodes. However, there are also other forms of detectors, such as a CCD line (charge-coupled device) or a photodiode line. Notwithstanding the illustrated vertical arrangement of the gel, this can also be oriented differently, since the material transport takes place due to the applied electric field. This also applies when using an arrangement for gas chromatography, not shown, in which the driving force for the substance particles to be examined comes from the gas pressure (or liquid pressure in the case of liquid chromatography). What the arrangements according to the invention have in common is the detection of the substance particles by means of an excitation beam penetrating the elongated cross section of the braking medium in the longitudinal direction.

Claims

1. A device for the detection of in a decelerating medium, in particular gel, wandering, to photon emission by energy radiation by means of an excitation beam excitable substances, comprising

- a carrier for the braking medium through which the substances move along at least one path,
- a beam source for generating the excitation beam crossing the web,
- a detector arrangement for the emission photons,

characterized in that, at least in the region of the excitation beam (12), the cross-section of the braking medium ( 54 ) perpendicular to the direction of travel has essentially the shape of an elongated rectangle with a length of the short side of the rectangle preferably in the order of magnitude of the beam cross-sectional dimensions,
that the excitation beam on one of the two short sides of the rectangle through an inlet part ( 56 ) enters the cross section, traverses the cross section in a direction parallel to the two long sides of the rectangle and leaves on the other short side of the rectangle through an outlet part (62 ), and that the detector arrangement ( 52 ) receives the emission photons passing through one of the long sides of the rectangle.

2. Apparatus according to claim 1, characterized in that at least one of the parts inlet part ( 56 ), outlet part ( 62 ) has end faces ( 60 ) which are parallel to the beam axis of the excitation beam ( 12) and perpendicular.

3. Apparatus according to claim 2, characterized in that the end faces ( 60 ) are optically polished.

4. Apparatus according to claim 1, characterized in that the polarization direction ( B ') of the excitation beam (12 ) in the braking medium runs essentially parallel to the direction of observation of the detector arrangement ( 52 ).

5. Apparatus according to claim 4, characterized in that the beam source (20 ) comprises a 90 ° polarizer ( 14 ).

6. Apparatus according to claim 5, characterized by a to the migration direction (W ) substantially pa rallel axis of rotation ( 40 ) rotatable plate ( 38 ) with plane parallel side surfaces ( 42 ) in the excitation beam (12 ) between's beam source ( 10 ) and braking medium .

7. The device according to claim 1, characterized by at least two mutually parallel tracks ( A ; T ; G ; C ) which are each detected separately by the detector arrangement ( 52 ).

8. The device according to claim 1, characterized in that the detector arrangement (52 ) comprises a collecting and imaging optics ( 70 ) each with a diaphragm ( 74 ) in each of the web ( A ; T ; G ; C) associated image plane for Blocking out interference radiation.

9. The device according to claim 1, characterized in that the detector arrangement ( 52 ) comprises at least one Filteran arrangement ( 78 ) for filtering away photons with a wavelength different from the emission photons.

10.Vorrichtung according to claim 9, characterized in that the filter arrangement (78 ) comprises filters for Raleigh or Raman scattered light.

11. The device according to claim 1, characterized in that the detector arrangement ( 52 ') has at least two sensors ( 82 ') for different emission photon wavelengths.

12. The device according to claim 11, characterized in that the detector arrangement (52 ') comprises a device for splitting the incident beam ( 96 ) into partial beams ( 98 ) of different wavelengths, as well as the part radiate respectively associated sensors ( 82 ').

13. The device according to claim 12, characterized in that the sensors ( 82 ') comprise position-sensitive detectors, preferably in the form of a CCD line, a line of photodiodes, or a photomultiplier with subdivided position areas.

14.Vorrichtung according to claim 1, characterized by a holding tion for the beam source ( 20 ) rigidly connected holder ( 21 ) for the carrier ( 16 ).

15.Vorrichtung according to claim 1, characterized in that the carrier ( 16 ) is formed by a braking medium ( 54 ) a closing housing which comprises two zueinan the parallel plates ( 32 , 48 ) which define the long rectangular sides of the cross section, and to the direction of migration ( W ) parallel spacer strips (46 ) which define the short rectangular sides of the cross section and that the inlet part ( 56 ) and the outlet part ( 62 ) are each inserted in a space formed between spacer strip sections.

16.Vorrichtung according to claim 15, characterized in that the interior of the housing is provided with a gel layer ( 54 ) for gel electrophoresis.

17.Vorrichtung according to claim 16, characterized in that the excitation beam (12 ) is a light beam.

18. Device according to claim 17, characterized, that the excitation beam is a laser beam.

19.Vorrichtung according to claim 1, characterized, that the excitation beam is in migration relative to the carrier direction is shiftable.

20. Use of the device according to one of the previous claims for DNA sequencing.