DE3505728A1 - Verfahren zum sterilisieren biologischer medien vermittels durch lichtpulse bewirkter, selektiver photolyse und derart hergestellter produkte - Google Patents
Verfahren zum sterilisieren biologischer medien vermittels durch lichtpulse bewirkter, selektiver photolyse und derart hergestellter produkteInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation biologischer Medien oder Flüssigkeiten wie
Blut oder Blutbestandteile (beispielsweise Blutplasma, Blutserum, Blutfaktor VIII usw.) sowie genetisch aufgebauter
Protein- und Impfstoffe.. Der hier verwendete Ausdruck "Sterilisation" bedeutet die gesteuerte Veränderung
von Nukleinsäurestrukturen in Gegenwart von Proteinen vermittels durch Lichtimpulse bewirkter Photolyse,
um deren Virulenz und Infektionsfähigkeit weitgehend bzw. praktisch vollkommen zu unterbinden, während die
Funktionsfähigkeit der anwesenden Proteine im wesentlichen bzw. weitgehend erhalten bleibt.
Es ist Aufgabe der Erfindung, alle oder zumindest im wesentlichen alle im zu sterilisierenden Medium vorhandenen,bekannten
ebenso wie bislang unbekannten, auf DNA oder RNA aufgebauten Agensien in deutlichem Ausmaß bzw. praktisch
vollständig zu zerstören einschließlich der infektiösen Nukleinsäure-Moleküle, die in der Lage sind,
sich in Viroide oder Viruse oder Bakterien zu transformieren, während im Medium ebenfalls vorhandene Proteine in
hohem Maße oder praktisch vollständig intakt bleiben. Bis zur vorliegenden Erfindung war es nicht möglich, wirkungsvoll
und gezielt Nukleinsäurestrukturen durch Photolyse zu zerstören, ohne gleichzeitig anwesende Proteine
in hohem Maße bzw. weitgehend funktionsunfähig zu machen. Das Verfahren nach der Erfindung eignet sich für eine
Vielzahl von biologischen Medien; es soll nachstehend an drei Beispielen näher erläutert werden.
Blutsterilisation:
Obwohl in der Vergangenheit bereits eine Vielzahl unterschiedlicher
Verfahren vorgeschlagen wurde, war es bisher nicht möglich, eine effektive Sterilisation vor der Bluttransfusion
sicherzustellen, weshalb ein bedeutender Prozentsatz von Blutempfängern Hepatitis bzw. AIDS entwickelte.
(Vgl. New England Journal of Medicine, Vol. 310, S. 69
bis 75, 1984).
Bereits vorgeschlagene Verfahren beinhalten beispielsweise die Filterung von Blut durch Bakterien- und/oder
Viral-Filter sowie den Zusatz von Antibiotika. Beide
Verfahren haben sich in der Praxis als unzuverlässig und ineffizient erwiesen. Insbesondere war es schwierig,
eine ausreichend hohe Blutdurchflußgeschwindigkeit durch Filter aufrechtzuerhalten; der Zusatz von potentiell
toxisch wirkenden Stoffen ist nicht wünschenswert. Es ist allgemein üblich, Transfusionslösungen vor der
Anwendung auf die Anwesenheit bestimmter Pathogene hin zu untersuchen. Solche Untersuchungen sind jedoch nicht
100%ig verläßlich und außerdem zeitraubend und kostspielig. Darüber hinaus sind für zahlreiche Pathogene bisher
keine Testmethoden bekannt.
Gentechnologisch aus Säugetierzellkulturen hergestellte proteinhaltige Produkte:
In der DNA Rekombinationstechnik wird bislang oftmals für die Herstellung proteinhaltiger Produkte von manipulierten
Bakterienstammen, wie beispielsweise E.CoIi, ausgegangen.
Während gewisse Produkte, wie z.B. Insulin, so erfolgreich ohne die Verwendung von Säugetier-Zellkulturen
hergestellt werden können, lassen sich andere Proteine nicht einfach von derartigen Stämmen ableiten, da diese
nicht in der Lage sind, das gewünschte Protein-Endprodukt als Komplex mit anderen Molekülen, beispielsweise Kohlehydratmolekülen,
zu bilden. Es besteht die Auffassung, daß eine große Anzahl erwünschter Protein-Produkte auf
genetischem Wege nicht ohne den Einsatz von Säugetier-Zellkulturen hergestellt werden können.
Allerdings sind bei der Verwendung derartiger Zellkulturen gewisse Probleme zu erwarten. (Vgl. "Injectable Monoclonal
Antibody Products: Regulatory Concerns" von Bruce Merchant, vorgetragen beim Regulatory Affairs Professional
Society Meeting am 9. Nov. 1983; "Points to Consider in
the Production and Testing of New Drugs and Biologicals Produced by Recombinant DNA Technology", Department of
Health and Human Services, 18. Nov. 1983).
In der Regel sekretieren tierische Zellen ihre Protein-Produkte
nicht direkt in das umgebende Medium. Um diese Produkte zu ernten, wird man in der Regel die Zellwandmembranen
zerstören müssen, um so den Austritt der Protein-Produkte in das Medium und die nachträgliche Isolierung
und Reinigung zu ermöglichen. Als Folge der zerstörten Zellwände wird gleichzeitig auch Zeil-DNA
und/oder -RNA freigegeben. Da viele der leicht zu kultivierenden Zellkulturen Krebszellstämme sind, muß sichergestellt
werden, daß die erzeugten Protein-Endprodukte kein aktives DNA und/oder RNA enthalten. Diese Notwendigkeit
besteht auch dann, wenn verbesserte Trenn- und Reinigung smethoden angewendet werden sollten. Unabdingbare
Voraussetzung zur sicheren Anwendung der Endprodukte ist deren Freiheit von jeglichem aktiven DNA/RNA. (Vgl.
"Engineering Tomorrows Vaccines" von T. Wilson, Biotechnology 2(1), S. 29-40, Januar 1984).
Herstellung von Impfstoffen:
Für die Herstellung von Impfstoffen bedarf es ebenfalls "getöteter" bzw. abgeschwächter Viren. Im letzteren Fall ist es häufig wünschenswert, ein Verfahren vorzusehen, bei dem einerseits die Infektivität der Viren abgeschwächt, andererseits aber diese so weit intakt bleiben, um die gewünschte Immunreaktion hervorzurufen.
Für die Herstellung von Impfstoffen bedarf es ebenfalls "getöteter" bzw. abgeschwächter Viren. Im letzteren Fall ist es häufig wünschenswert, ein Verfahren vorzusehen, bei dem einerseits die Infektivität der Viren abgeschwächt, andererseits aber diese so weit intakt bleiben, um die gewünschte Immunreaktion hervorzurufen.
Die genauen Vorgänge, die zu einer viralen Abschwächung unter gleichzeitigem Aufrechterhalten der immunogenen
Wirksamkeit führen, sind nicht bekannt. Als Theorie wurde vorgeschlagen, daß bestimmte Abschwächungs- bzw. Abtötungsverfahren
für Viren zu einer Veränderung der Struktur der einzelnen oder aller Proteinhüllen bzw. der Nukleinsäuren
oder beider führen, so daß diese einerseits nicht mehr in der Lage sind, ernsthafte Infektionen auszulösen,
andererseits aber zumindest einen Teil der Proteinhülle des Virus und möglicherweise auch der Nukleinsäuren so
weit intakt lassen, um als antigene Determinanten zu wirken und so zur Antikörper-Bildung als Reaktion auf den
Impfstoff zu führen.
Es sind verschiedene Verfahren bekannt geworden, um Viren abzutöten bzw. abzuschwächen, wie beispielsweise chemische
Verfahren und Techniken der Zellkultivierung. In der Literatur wird zwar beschrieben, daß bestimmte Viren gegen
ultraviolettes Licht nicht tolerant sind; andererseits wird berichtet, daß ÜV Strahlung benutzt werden kann, um
Viren zu desaktivieren, ohne ihre Wirksamkeit zum Auslösen der Immunreaktion zu zerstören. (Vgl. US Patent 4 021
'Mikroverkapselung des Virus möglich, wenn üV Licht gut toleriert wird1 und US Patent 4 071 619 'gereinigte und
konzentrierte lebende Vaccine werden mit UV von 5.000 bis 200.000 erg/cm2 bestrahlt, um den Virus abzutöten,
ohne jedoch dessen immunogene Eigenschaften zu zerstören') .
Darüberhinaus besteht ein Bedürfnis nach verbesserten Verfahren
zur gezielten Desktivierung, die es gestatten, einerseits die Proteinhüllen weitgehend zu erhalten, während
andererseits die Nukleinsäure-Strukturen möglichst vollständig zerstört werden.
UV Bestrahlung zum Sterilisieren:
UV Bestrahlung zum Sterilisieren:
Es ist bekannt, bestimmte Materialien mit UV Bestrahlung zu sterilisieren. Hierzu werden die zu steriliserenden
Materialien der Strahlung üblicher UV Quellen im Bereich von 50 bis 1000 Watt und einer Zeitspanne von einigen Minuten
bis zu einigen Stunden ausgesetzt.
Erhöhte Aufmerksamkeit wurde in der Vergangenheit der Wirkung von UV Strahlung auf biogische Systeme zuteil, insbesondere
wegen möglicher mutagener, zellularer, molekularer und/oder abtötender Wirkungen auf Bakterien und
Viren. Es ist beispielsweise bekannt, daß bestimmte DNA bei Bestrahlung in einem Wellenlängenbereich von 230 bis
470 nm inaktiviert werden, und daß die Empfindlichkeit
der DNA abhängig von der Wellenlänge ist. Diese Wirkung wurde bei der Verwendung üblicher Strahlungsquellen wie
5 Quecksilber-Xenon- oder Metalldampflampen beobachtet.
Die Wirkung kontinuierlicher UV Bestrahlung zum Zerstören von DNA wird beschrieben in "Oxygen-Independent Inacti-
vation of Haemophilus Influenzae Transforming DNA by
Monochromatic Radiation: Action Spectrum, Effect of Histidine and Repair", Cabrera Juarez et al, Photochemistry
and Photobiology, 23, S. 309-313 (1976). Wirkung der UV Strahlung im Molekularbereich:
Es ist der Fachwelt bekannt, daß ausgewählte organische Verbindungen unter UV Bestrahlung besonders reagieren.
So weiß man beispielsweise, daß verschiedene organische Verbindungen unterschiedliche Absorptions-Koeffizienten
haben, also die Fähigkeit, Energie zu absorbieren, sich von Verbindung zu Verbindung ebenso wie mit der Wellenlänge
der Strahlung ändert. Es ist ferner bekannt, daß das von einem organischen Molekül absorbierte Licht dieses
von seinem Grundzustand auf ein höheres Energieniveau bringen kann, und daß das Molekül in diesem Zustand
in der Regel nur sehr kurze Zeit verbleibt ("Lebensdauer" des Energiezustandes); und weiterhin, daß im Molekül
in diesem Zustand eine Reaktion ablaufen kann, die zur dauerhaften Änderung seiner Struktur führt; oder aber,
daß das Molekül spontan in seinen Grundzustand zurückkehrt, oder in einem Zwischenzustand auf dem Weg dorthin
verharrt. Zur allgemeinen Beschreibung des Verhaltens organischer Moleküle bei UV Bestrahlung wird die folgende
Literaturstelle genannt: "Some Principles Governing the Luminescence of Organic Molecules", R.M. Hochstrasser,
erschienen in 'Excited States of Biopolymers1, herausgegeben
von Robert F. Steiner, Plenum Publishing Corp. (1983) .
Das Verhalten von Proteinen und deren Aminosäuren unter der Einwirkung von UV Bestrahlung wurde bereits ausführlich untersucht. Im Unterschied zu den meisten Amino.-säuren, die Bestandteile der Proteine sind und UV Licht von mehr als 220 nm Wellenlänge nicht wesentlich absorbieren, wird von einigen Aminosäuren, wie beispielsweise Tryptophan und, in geringerem Ausmaß, Phenylalanin und Tyrosin, UV Strahlung in bedeutendem Umfang absorbiert. Als Folge davon werden bei den genannten Aminosäuren
Das Verhalten von Proteinen und deren Aminosäuren unter der Einwirkung von UV Bestrahlung wurde bereits ausführlich untersucht. Im Unterschied zu den meisten Amino.-säuren, die Bestandteile der Proteine sind und UV Licht von mehr als 220 nm Wellenlänge nicht wesentlich absorbieren, wird von einigen Aminosäuren, wie beispielsweise Tryptophan und, in geringerem Ausmaß, Phenylalanin und Tyrosin, UV Strahlung in bedeutendem Umfang absorbiert. Als Folge davon werden bei den genannten Aminosäuren
strukturverändernde chemische Reaktionen eingeleitet, ein Vorgang, der als "Photolyse" bezeichnet wird.
Es ist bekannt, daß der photochemische Zerfall von Tryptophan im wässrigen Medium durch Bestrahlung im Wellenlängenbereich
zwischen 240 und 310 nm erfolgt, und daß die Ausbeute dieser photochemischen Reaktion, als
Quantenausbeute ausgedrückt, ihren Maximalwert bei einer Bestrahlung im Wellenlängenbereich von 240 bis 250 nm
erreicht. (Vgl. "Ultraviolet Action Spectrum for Tryptophan Destruction in Aqueous Solution" von Raymond F.
Borkman, Photochemistry and Photobiology, 26, S. 16-166 (1977).
Bestimmte Wirkungen ultrakurzer Bestrahlung von Picosekunden - Dauer auf das Verhalten von Tryptophan wurden
unter verschiedenen Gesichtspunkten in einer Anzahl von Studien untersucht. So ist beispielsweise bekannt, daß
die Zeitspanne der Fluoreszenz von angeregtem Tryptophan in wässriger Lösung von einer Vielzahl von Faktoren abhängig
ist, wie beispielsweise pH, Temperatur etc.; die durchschnittliche Fluoreszenzdauer beträgt um 3 Nanosekunden.
Bei als Proteinbaustein vorliegendem Tryptophan sind die Verhältnisse wesentlich komplexer und sind bisher Gegenstand
einer Vielzahl von zum Teil widersprüchlichen Diskussionen. So wurde beispielsweise festgestellt,daß die
Fluoreszenzdauer bei den Tryptophan enthaltenden Hämoproteinen (die in roten Blutkörperchen vorkommen) unter
einer Nanosekunde liegt. (Vgl. "Non-Exponential Fluorescence Decay of Aqueous Tryptophan arid Two Related Peptides
by Picosecond Spectroscopy" von G.R. Fleming et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75(10), S. 4652-4656, 1978;
und "The Rates of Photodestruction of Tryptophan Residues in Human and Bovine Ocular Lens Proteins" von Borkman et
al, Exp. Eye Res., 32, S. 747-754, 1981; und "Fluorescence Lifetimes of Chromophores in Intact Human Lenses and Lens
Proteins" von Borkman et al, Exp. Eye Res., 32, S. 313-322 und 314, 1980; und "The Destruction of Tryptophanyl
Residues in Trypsin by 280 nm Radiation" by Volkert et
al, Photochemistry and Photobiology, 17, S. 9-16, 1973). Tryptophan ist die am wenigsten in den menschlichen Proteinen
verbreitete Aminosäure; es ist gleichzeitig auch die am stärksten durch UV im Bereich von 240 bis 310 nm
zerstörbare Aminosäure und dient dann als Pfad für die Proteinschädigung in diesem Wellenlängenbereich.-'Tryptophan
enthaltende Proteine können durch UV Bestrahlung desaktiviert werden entweder als Folge der Photolyse des
Tryptophans oder als Folge der Photolyse anderer aromatischer Reste. Obwohl sich die vorliegende Erfindung mit
der Erhaltung der Proteine allgemein befaßt, wird in der Folge Tryptophan häufig beispielhaft verwendet.
In "klassischen1 photochemischen Reaktionen veranlaßt
ein einzelnes Photon ein Molekül, sich chemisch zu verändern. Werden Moleküle ausreichend intensiver Strahlung
ausgesetzt, so können dadurch andere, photochemische Reaktionswege eröffnet werden, wobei ein Molekül mehr als
ein Photon absorbiert. In der Literatur der letzten 30 Jahre wurden zahlreiche Beispiele für chemische Veränderungen
durch Aufnahme von mehr als einem Photon pro Molekül beschrieben.
Das bekannteste Beispiel ist die Photosynthese in grünen Pflanzen durch aufeinanderfolgende Absorption von "gelben"
und "roten" Photonen. Ein anderes Beispiel sind die Moleküle mit metastabilen Tripletzuständen. Der übergang in
den langlebigen Tripletzustand erfolgt häufig als Folge der Absorption eines Photons durch das Molekül. Die Moleküle
im Tripletzustand können ein weiteres Photon gleicher oder anderer Farbe absorbieren, wodurch ein chemischer
Vorgang eingeleitet wird. Dieses Konzept bildet die Grundlage einer Monographie von V.S. Letokhov "Non-linear
Laser Chemistry", Springer Verlag New York, 1983. Derartige Phänomene wurden an Peptid-Molekülen untersucht,
die aus einer Kette von Aminosäure-Molekülen einschließlich Tryptophan, Alanin und Glyzin bestanden. (Vgl.
"Multiple Photon Processes in Molecules Induced by Pico-
second UV Laser Pulses", Antonov et al, S. 310-314;
"Picosecond Phenomena I", Springer Verlag, New York, 1979). Nach dieser Untersuchung ist bei Bestrahlung
eines Peptids mit Picosekunden-Impulsen die Wahrscheinlichkeit der Absorption eines oder mehrerer Photonen
durch ein Molekül in angeregtem Zustand sehr viel größer als bei Bestrahlung mit Nanosekunden-Impulsen.
Die Nukleinsäurebestandteile von DNA und RNA und intakte DNA und ihr Verhalten bei ultrakurzer, hochintensiver
UV Bestrahlung war Gegenstand mehrerer Untersuchungen, über diese Untersuchungen berichtet Stanley L. Shapiro
in "Ultrafast Techniques Applied to DNA Studies", Biological Events Probed by Ultrafast Laser Spectroscopy,
herausgegeben von R.R. Alfano, S. 361-383, Academic Press, New York, 1982. Darin werden ultrakurze Lichtimpulse vorgeschlagen
zur gezielten Veränderung oder auch zur völligen Zerstörung komplexer Moleküle. Weiterhin wurde die
selektive, photochemische Reaktion in Nukleinsäuren und ihren Komponenten untersucht, obwohl das Absorptionsband
von DNA sehr breit ist, mit einer Absorptionsspitze bei 26 5 nm. (Vgl. "Selective Action on Nulceic Acids Components
by Picosecond Light Pulses", Angelov et al, Applied Physics, 21, S. 391-395, 1980). Wegen der nichtspezifischen Natur der Absorptionsspektren von DNA-und
RNA-Strukturen und wegen deren Ähnlichkeit mit den Absorptionsspektren der Proteine war es bis zur vorliegenden
Erfindung nicht möglich, DNA/RNA einer effizienten, selektiven PhotoIyse zu unterziehen, ohne die im gleichen
Medium anwesenden Proteine photolytischer Reaktion zu unterwerfen.
Es ist bekannt, daß DNA und seine Komponenten beim Einwirken hochintensiver, ultrakurzer UV Laserstrahlung nacheinander
zwei UV Quanten und damit eine Energiemenge absorbieren können, die die Ionisationsgrenze überschreitet.
Als Folge davon entstehen einige Photoprodukte, die in ihrer Struktur von den bei kontinuierlicher (cw) UV Strahlung
auftretenden abweichen. Es wurde weiterhin vorge-
schlagen, daß bei Ultrakurζ-UV-Bestrahlung im Picosekundenbereich
die Effizienz des photochemisehen Abbaus von DNA-Komponenten um den Faktor 10 größer ist
als bei Bestrahlung im Nanosekunden-Bereich, und weiterhin, daß die Zweistufen-Erregung der Moleküle durch
Laserbestrahlung von zahlreichen Parametern der Laserstrahlen abhängt, wie den Wellenlängen der für die erste
bzw. die zweite Stufe benutzten Strahlung sowie der zeitlichen Aufeinanderfolge der betreffenden Laserlicht-Impulse
und von deren Intensität usw. Es wurde auch bereits beschrieben, daß durch die geeignete Auswahl dieser
Parameter die Zweistufen photochemische Reaktion und Zerstörung für einen bestimmten Nukleinsäuretypus
in ihrem Wirkungsgrad gesteigert werden kann. Danach können Viren durch UV Bestrahlung mit Intensitäten von
7 9
10 bis 10 W/cm2 durch Einzelstrangbruch in der DNA desaktiviert werden, während UV Bestrahlung mit niedrigeren Intensitäten zur Inaktivierung als Folge der Bildung von Pyrimidin-Dimeren des Cyclobutantyps führt.
10 bis 10 W/cm2 durch Einzelstrangbruch in der DNA desaktiviert werden, während UV Bestrahlung mit niedrigeren Intensitäten zur Inaktivierung als Folge der Bildung von Pyrimidin-Dimeren des Cyclobutantyps führt.
Vgl. "High-Power UV Ultrashort Laser Action on DNA and its Components" by Angelov et al, Picosecond Phenomena
III, herausgegeben von Hochstrasser et al, S. 336 bis Springer Verlag, New York, 1980.
Es wurde weiterhin beschrieben, daß Mehrstufen, durch eine Vielzahl von Photonen erzeugte Erregungen von Atomen und Molekülen eine Basis für nicht lineare Photochemie bilden. Vgl. Antonov et al, Picosecond Phenomena I, Springer Verlag, New Yor, 1979, und "Optical Detection of the Triplet State of Uracil", D.H. Williams et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 36 (b), S. 912-918, 1969.
Es wurde weiterhin beschrieben, daß Mehrstufen, durch eine Vielzahl von Photonen erzeugte Erregungen von Atomen und Molekülen eine Basis für nicht lineare Photochemie bilden. Vgl. Antonov et al, Picosecond Phenomena I, Springer Verlag, New Yor, 1979, und "Optical Detection of the Triplet State of Uracil", D.H. Williams et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 36 (b), S. 912-918, 1969.
Weitere Ausführungen zur Quantenmechanik der Nukleinsäuren und der Proteine:
Die Wechselwirkung zwischen Licht einer konventionellen Strahlungsquelle und einem Beispiel von Molekülen läßt sich unter Berücksichtigung einiger einfacher, physikalischer Grundprinzipien leicht ableiten. Eine Quelle für
Die Wechselwirkung zwischen Licht einer konventionellen Strahlungsquelle und einem Beispiel von Molekülen läßt sich unter Berücksichtigung einiger einfacher, physikalischer Grundprinzipien leicht ableiten. Eine Quelle für
monochromatisches Licht kann durch ihre Wellenlänge des
ausgestrahlten Lichtes und ihre Intensität, ausgedrückt als Energie/Einheit der beleuchteten Fläche pro Zeiteinheit,
beschrieben werden. In der Quantenmechanik wird die Lichtenergie nach der Planck'sehen Gleichung E = Hv dargestellt,
wobei E die Energie eines Photons, h das Plancksche Wirkungsquantum und ν die Frequenz des Lichtes ist.
Die Lichtintensität kann dann als Photonen pro cm2 pro
-2 —1 Sekunde oder Quanten, cm , Sek. ausgedrückt werden.
Die Konzentration der im Beispiel ausgewählten Moleküle im Zielgebiet der bestrahlten Probe kann in Mol/l ausgedrückt
werden (Molarität, M). Wenn das Licht die Probe durchstrahlt, wird es wenigstens teilweise von den Molekülen
absorbiert. Die Absorption ist ein charakteristisches Datum für die betreffende Molekülart und variiert
in ihrer Effizienz mit der Wellenlänge der Strahlung. Der Extinktionskoeffizient, e, ist ein Maß für die Absorption
und hat die Dimension M cm . Eine graphische Darstellung, in der der Extinktionskoeffizient gegen die
Wellenlänge aufgetragen ist, stellt das Absorptionsspektrum der betreffenden Moleküle dar.
Quantenmechanisch ist die Absorption eines Photons durch ein Molekül von einem Übergang oder einem Wechsel im
Quantenzustand des Moleküls begleitet. In einem typischen Fall kann angenommen werden, daß vor Einstrahlung des
Lichtes sich alle Moleküle im Grundzustand befinden. Bei der Bestrahlung mit Licht gehen einige Moleküle vom
Grundzustand in einen angeregten Zustand (höherer Energie) über. Ein Molekül kann nicht unbegrenzt in einem angeregten
Zustand verbleiben und muß seine überschüssige Energie in irgendeiner Weise wieder abgeben. Das Schicksal
eines einzelnen Moleküls ist nicht vorhersehbar; es kann nur in Form der quantenmechanischen Wahrscheinlichkeiten
bzw. als Quantenausbeute (Q) ausgedrückt werden. Ein wichtiger Parameter eines jeden angeregten Zustandes ist
dessen Lebensdauer (T), definiert als die mittlere Zeitdauer, in der ein ungestörtes Molekül in seinem angereg-
ten Zustand verbleibt.
Die Anregung eines Moleküls mit Licht kann verschiedene Folgen haben. Das Molekül kann spontan in den Grundzustand
zurückkehren, und zwar entweder direkt oder über einen Zwischenzustand. Es kann stattdessen ein weiteres
Photon absorbieren und in einen noch höheren Energiezustand übergehen. Eine weitere Möglichkeit besteht im Ablauf
einer photochemischen Reaktion, die zur Veränderung seiner chemischen Struktur führt. In vielen Fällen ist die
eingetretene Veränderung permanent; das Molekül kann damit nicht mehr in seinen ursprünglichen Grundzustand zurückkehren.
Wird eine solche Photolyse verwendet, um eine chemische Veränderung in einer DNA oder einem Protein
hervorzurufen, dann kann damit deren biologische Funktionsfähigkeit verringert oder völlig zerstört werden.
Absorptionskoeffizient, Lebensdauer des angeregten Zustandes und Quantenausbeute sind spezifische Molekülcharakter
istika und wurden, wie oben beschrieben, für eine Zahl von Molekülen experimentell bestimmt. Aufgrund der
charakteristischen Daten für ein Molekül und der Parameter der Strahlungsquelle kann der Ablauf der photochemisch
bewirkten chemischen Reaktion berechnet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestrahlung eines Mediums, das Nukleinsäuren, beispielsweise in Form von
DNA Molekülen, und Proteine enthält. Die folgende Berechnung zeigt, daß bei Bestrahlung eines solchen Mediums mit
einer konventionellen UV Lichtquelle,wie beispielsweise
einer Entladungsröhre, sowohl die DNA als auch die Proteine zerstört werden, da in beiden Fällen die absorbierte
UV Strahlung zur Photolyse führt. Die nachfolgenden Berechnungen gehen vom Lambert-Beerschen Absorptionsgesetz
aus, das die Strahlungsumwandlungrate pro Molekül (r) als das Produkt aus Absorptionsquerschnitt und Lichtintensitat
bestimmt:
r = I χ s
-2 -1 wobei I ,die Lichtintensität in Photonen cm Sek. ,und
s der Absorptionsquerschnitt,^ cm2, ist. Der Absorptionsquerschnitt
(s) ergibt sich aus dem Extinktionskoeffizien-
-21
ten nach s = 3,82 χ 10 χ e, wobei der Extinktionskoeffizient in der Einheit M cm"'' und s in cm2 ausgedrückt
ist. Die Über-Alles Rate der photochemischen Reaktion pro Molekül, R, ist das Produkt aus Strahlungsumwandlung srate und photochemischer Quantenausbeute:
R = IxsxQ
Wenn R bekannt ist, kann die Wahrscheinlichkeit (P), daß ein bestimmtes Molekül während eines bestimmten Zeitraumes
von t Sekunden nicht reagiert, wie folgt berechnet werden:
p = 10-(R χ t)/2,303
In dieser Berechnung wird die Abschwächung des Lichtstrahles beim Durchgang durch die Probe vernachlässigt.
Diese Annäherung gilt, wenn die Probe in genügend dünner Schicht vorliegt oder der Extinktionskoeffizient genügend
klein ist, so daß die Intensitätsabschwachung der Strahlung beim Durchgang durch die Probenschicht gering bleibt.
Beispielsweise enthält Blutplasma eine Anzahl von verschiedenen Proteinmolekülen. Die meisten Aminosäuren, die
die einzelnen Bausteine der Proteine darstellen, absorbieren keine nennenswerten Mengen an Strahlung im Nahsowie
im Mittel-UV Lichtbereich und werden durch UV Bestrahlung nicht beeinflußt. Wie oben dargelegt, bildet
Tryptophan eine bemerkenswerte Ausnahme. Ein typisches Plasma-Protein enthält nur wenige (0 bis 15) Tryptophanbausteine,
aber schon eine kleine Anzahl reicht aus, um das Protein für photochemische Schädigung empfindlich zu
machen. Vgl."Atlas of Protein Sequence and Structure", Vol. 5, Ergänzung 3. M.O. Dayhoff ed. (National Biochemical
Research Foundation, Silver Spring, MD., 1976). Wie oben beschrieben, wurden sowohl der Extinktionskoeffizient als auch die photochemische Quantenausbeute
für Tryptophan bestimmt, wodurch es möglich ist, die Rate zu schätzen, mit der eine bestimmte Lichtquelle ein bestimmtes
Protein zerstört. Vgl."Handbook of Biochemistry and Molecular Biology", 3. Ausgabe. Band 2 (Chemical
Rubber Co., Cleveland, 1976); G.R. Fleming et al, Chemistry, 75, S. 4652 (1978) und die darin angezogenen
Literaturstellen; und Raymond F. Borkman, Photochemistry
and Photobiology, 26, S. 163 (1977) supra. Wird Blutplasma von einem Spender mit einer Virus-Infektion
entnommen, so kann ein Kubikzentimeter Plasma bis zu einer Million Viren enthalten. Ein Virus besteht
aus einer oder mehreren von einer Hülle umgebenen DNA (oder RNA) Molekülen. Die Hülle besteht in der Regel aus
Proteinen oder einem Protein-Lipid-Komplex. Andere infektiöse
Erreger, Viroide genannt, bestehen nur aus einem RNA Molekül. Die Viralhülle ist UV durchlässig, während
die nukleotide Basis der DNA- oder RNA-Moleküle alle stark
UV absorbierend sind. Eine ausreichend große Dosis UV Strahlung bewirkt die photochemische Schädigung in der
viralen DNA und als deren Ergebnis einen irreversiblen Verlust der Infektiosität. Wie Wirkung der UV Bestrahlung
bzw. die Desaktivierungsrate von Viren unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ist Gegenstand zahlreicher
Untersuchungen. Für eine definierte Strahlungsquelle gestatten diese Daten, die Quantenausbeute der viralen Desaktivierung
zu bestimmen, und des weiteren einen Vergleich zwischen Schädigung von Viren und von Proteinen
anzustellen. Vgl. Photochemistry and Photobiology, 26,
S. 163 (1977) supra.
Extinktionskoeffizienten und Absorptionsquerschnitt bei
einer Wellenlänge von 266 nm.
Art e(M~1cm~1) s(1017cm2)
Tryptophan 4.000 1,5
Nukleinsäure (Durchschnitt) 10.000 3,8 Virales DNA Molekül 1 χ 109 3,8 x 1O5
Plasma-Protein 40.000 15,0
Anmerkung: Die Zahlen in Tabelle I beziehen sich auf ein 5 Protein mit 10 Tryptophan und auf eine virale DNA aus
50.000 Nukleinsäure-Basenpaaren. Der oben angeführte Extinktionskoeffizient
ist ein Durchschnittswert der vier
verschiedenen Basenpaare in der DNA, deren Absorptionsspektren sehr ähnlich sind. Einige Viren enthalten RNA statt
DNA; die spektralen Eigenschaften der beiden Polymere sind sehr ähnlich. Tyrosin und Phenylalanin sind zwei weitere
Aminosäuren, die eine bemerkenswerte UV Absorption aufweisen. Ihre Extinktionskoeffizienten bei 266 nm sind 700
bzw. 100.
Konzentration der Viren in infizierten menschlichen Organismen ....... ca. 10 /ml
Konzentration der Proteine im menschlichen
Plasma ca. 10 M.
Strahlungsfluß (Produkt aus Strahlungsintensität und Bestrahlungszeit, Ixt) bei 254 nm, erforderlich
zur Reduzierung der Aktivität der DNA um
90 % ca. 1,3 x 1017Photonen/cm2
Quantenausbeute für die virale Zerstörung 2 χ 10 Tabelle I zeigt die Quantenausbeute und die Querschnitte
für ein Modellvirus und ein ein Tryptophan enthaltendes Modellprotein im nahen UV Bereich des Spektrums. Da die
Standardmenge von 450 ml infizierten Blutes 4,5x10 Viren
enthalten kann, sollte die virale Aktivität mindestens um
einen Faktor 10 reduziert werden, um eine erfolgreiche Sterilisation zu erreichen. Mit anderen Worten: die Wahrscheinlichkeit,
daß ein individueller Virus unreagiert ver-
—8
bleibt, soll geringer als 10 sein. Aus diesen Daten läßt sich errechnen, daß eine kontinuierliche Strahlungsquelle
bleibt, soll geringer als 10 sein. Aus diesen Daten läßt sich errechnen, daß eine kontinuierliche Strahlungsquelle
18 von 260 nm, die einen Strahlungsfluß von 2x10 Photonen
pro cm2 liefert, erforderlich ist, um die Bedingung zu erfüllen, unreagierte Viren mit großer Wahrscheinlichkeit
— 8
unter 10 zu halten. Eine solche Strahlung bedingt gleichzeitig
die massive Zerstörung der ebenfalls vorhandenen
— 11
Proteine (P = 10 für das Musterprotein aus Tabelle I).
Proteine (P = 10 für das Musterprotein aus Tabelle I).
Hieraus ergibt sich, daß eine derartige Strahlungsbehandlung zur Sterilisation biologischer Flüssigkeiten vollkommen
unbrauchbar ist.
Es soll angemerkt werden, daß das Lambert-Beer Gesetz nicht in allen Fällen eine exakte Beschreibung der Wahrschein-
lichkeit des photochemisehen Vorganges gibt, da dieses
nur für relativ geringe Lichtintensitäten zutrifft. Moderne, gepulste Laser sind in der Lage, Pikosekunden
— 1 2
(10 Sek.) Lichtpulse extrem hoher Intensität zu liefern. Ein einziger Laserpuls kann eine Energie von mehr
(10 Sek.) Lichtpulse extrem hoher Intensität zu liefern. Ein einziger Laserpuls kann eine Energie von mehr
als einem Gigawatt (10 Watt) liefern, während kontinuierliche Laser oder klassische UV Quellen, wie Entladungslampen,
in einem Bereich zwischen 10 bis 1000 Watt arbeiten. Die Wirkung derartiger, intensiver Strahlungspulse
auf gegenständliche Moleküle wird verständlich bei einem Vergleich der Figuren 1 und 2. Ist die Intensität der einfallenden
Photonen vergleichsweise gering, so ist die Wahrscheinlichkeit, daß ein durch diese angeregtes Molekül
in diesem Zustand ein weiteres Photon absorbiert, sehr gering. Wie in Fig. 1 dargestellt, besteht vielmehr
eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß ein durch ein einziges Photon vom Grundzustand A in den angeregten Zustand B angehobenes
Molekül spontan der Photolyse unterworfen wird bzw. in einen niedrigeren Energiezustand übergeht und/
oder in den Grundzustand zurückkehrt, ohne ein weiteres Photon zu absorbieren. Auf der anderen Seite ist die Energie
eines Pikosekunden-Impulses sehr hoch; in diesem Fall
besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß während der Dauer des Anregungszustandes ein zweites Photon absorbiert
wird und das Molekül so einen Energiezustand erreicht, der beim einfachen "Einphoton" Vorgang entsprechend Lambert-Beer
nicht erzielbar ist.
In letzter Zeit sind auch Untersuchungen zur Desaktivierung unter Anwendung quantenmechanischer Prinzipien bekannt
geworden. Vgl. A. Andreoni et al, "Two-Step Laser Photobiology: Application For Cancer Treatment", 13. Int.
Quantum Electronics Conference, S. 142; A. Anders "Laser Fluorescence Spectroscopy of Biomolecules: Nucleic Acids",
Optical Engineering, 22(5), S. 592-595 (1983)?. Bisher war
es jedoch nicht möglich, die vorzugsweise Photolyse von DNA- und RNA-Nukleinsäuren in Gegenwart von Proteinen
durchzuführen und damit eine effiziente Sterilisierung zu
erzielen. Dieses Ziel wird nach der vorliegenden Erfindung in wirtschaftlicher und verläßlicher Weise erreicht.
Die besondere Leistung der Erfindung und deren Vorteile ergeben sich besonders klar im Lichte der US Patent-Schriften
4 395 397, 3 837 373, 3 941 670, 3 817 703, 3 955 921, 4 042 325 und 4 265 747; keine der genannten
Patentschriften gibt eine Lehre für die selektive und wirksame Photolyse von Nukleinsäuren in biologischen Medien,
ohne darin ebenfalls vorhandene Proteine oder anderes biologisches Material in unzulässiger oder störender Weise
anzugreifen. In diesem Zusammenhang sei insbesondere auf US-PS 4 395 397 hingewiesen. Ziel der dort beschriebenen
Erfindung ist es, unerwünschte Zellen, beispielsweise Krebszellen, in einer Suspension lebender Zellen abzutöten.
Nach dem dort beschriebenen Verfahren werden zunächst die Krebszellen identifiziert und markiert mit Hilfe fluoreszierender
Antikörper. Sodann werden die derart markierten Zellen einzeln nacheinander mittels Laserstrahlung abgetötet.
Im Gegensatz dazu benötigt das Verfahren nach der Erfindung, wie in der weiteren Beschreibung verdeutlicht,
zu seiner Durchführung weder eine Identifizierung noch eine Markierung der zu desaktivierenden Nukleinsäuren bzw.
zum Sterilisieren des diese enthaltenden Mediums. Vielmehr können nach dem Verfahren nach der Erfindung sterilisierte
Produkte wie beispielsweise Blut hergestellt werden, ohne die darin vorhandenen, auf Nukleinsäuren basierenden Pathogene
wie Krebszellen oder Viren zu kennen. Das erfindungsgemäße Verfahren bedarf keiner Markierung und keiner
Auslösung durch das Signal eines fluoreszierenden Farbstoffes oder ein anderes Signal. Die nach der Erfindung
behandelte biologische Lösung bleibt damit frei von allen chemischen oder sonstigen Zusätzen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, biologische Medien nach einem Verfahren zu behandeln, das es ermöglicht, Nukleinsäuren
selektiv bzw. gegenüber in solchen Medien gleichzeitig vorhandenen Proteinen durch photolytische Reaktion
abzuschwächen bzw. zu zerstören, sowie die Herstel-
lung von Produkten nach dem Verfahren.
Nach dem beanspruchten Verfahren wird das zu behandelnde Medium Lichtimpulsen ausgewählter Wellenlänge und Flußintensität
ausgesetzt, deren Strahlung von Nukleinsäuren sowohl im Grundzustand, unter Überführung in einen angeregten
Zustand, als auch im angeregten Zustand unter übergang in einen höheren, Photolyse bewirkenden Energiezustand,
absorbiert wird, wobei die ausgewählte Strahlung von gleichzeitig im Medium vorhandenen Proteinen in keinem
Zustand in einem Maß absorbiert wird, das zu wesentlicher photolytischer Reaktion ausreicht.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die virale Aktivität wesentlich, beispielsweise mindestens um
4
einen Faktor von 10 , reduziert, während die Funktionalitat der Proteine höchstens um 40% reduziert wird.
einen Faktor von 10 , reduziert, während die Funktionalitat der Proteine höchstens um 40% reduziert wird.
Solche Ergebnisse konnten bis zur vorliegenden Erfindung nicht erzielt werden. Im Hinblick auf den beschriebenen
Stand der Technik und auch grundsätzlich ist es überraschend und unerwartet, daß die Nukleinsäuren in ihrem
angeregten Zustand eine wirksame Photolyse erfahren, während die gleichzeitig im gleichen Medium vorhandenen Proteine
unter identischen Bedingungen im wesentlichen intakt bleiben.
Vorzugsweise ist das biologische Medium eine Lösung ausgewählt aus Blut, Blutbestandteilen bzw. aus solchen, die aus tierischen Zellen genetisch aufgebaute Proteine enthalten, sowie Impfstoffe, die virale DNA oder RNA in einer Proteinhülle enthalten. Alle genannten Medien haben ein gemeinsames Kennzeichen: sie enthalten Nukleinsäuren (beispielsweise in Form von DNA oder RNA) und Proteine.
Vorzugsweise ist das biologische Medium eine Lösung ausgewählt aus Blut, Blutbestandteilen bzw. aus solchen, die aus tierischen Zellen genetisch aufgebaute Proteine enthalten, sowie Impfstoffe, die virale DNA oder RNA in einer Proteinhülle enthalten. Alle genannten Medien haben ein gemeinsames Kennzeichen: sie enthalten Nukleinsäuren (beispielsweise in Form von DNA oder RNA) und Proteine.
Nach den verschiedenen .Ausführungsformen der Erfindung
werden in einer Lösung, die Proteine, beispielsweise Tryptophan-haltige Eiweißkörper, und Nukleinsäuren enthält,
die Nukleinsäuren selektiv photolysiert bzw. desaktiviert. Nach einer Ausführungsform wird die Lösung mit
einem bzw. einer Folge von ersten Lichtpuls(en) einer ersten Wellenlänge bestrahlt, deren Intensität ausreicht,
um einen Teil der Nukleinsäuren von ihrem Grundzustand in einen angeregten Zustand anzuheben; und weiterhin mit einem
bzw. einer Folge von zweiten Lichtpuls(en), der bzw. die vorzugsweise von den Nukleinsäuren im angeregten Zustand
absorbiert wird bzw. werden unter überführung derselben in einen höheren Energiezustand, in welchem eine spontane
Photolyse eintritt. Bei der Durchführung dieser Verfahrensformen werden die Intensitäten und die Wellenlängen für den
ersten und zweiten Lichtpulse derart gewählt, daß eine möglichst geringe Photolyse der Aminosäuren der Proteine,
so des Tryptophan, erfolgt. Dies kann beispielsweise mit ersten und zweiten Lichtpulsen bzw. Pulsfolgen erzielt
werden, die praktisch von gleicher Wellenlänge und Intensität sind, oder mit Lichtpulsen praktisch gleicher Wellenlänge,
jedoch verschiedener Flußdichte (Intensität), oder mit solchen, die sowohl unterschiedliche Wellenlängen als
auch Flußdichten aufweisen. Die Lichtpulse können entweder wiederholt oder in Sequenzen appliziert werden, wie
nachfolgend beschrieben.
Allgemein ausgedrückt, wird nach der Erfindung eine Folge von Lichtpulsen benutzt, die nach Fluß, Dauer, Sequenz,
zeitlicher Aufeinanderfolge und Wellenlänge entsprechend ausgewählt sind, um das gewünschte Resultat der Strahleneinwirkung
zu erzielen, nämlich in Gegenwart von Proteinen selektiv DNA/RNA photolytisch zur Reaktion zu bringen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, biologische Medien mittels Strahlungspulsen zu sterilisieren.
Gegenstand der Erfindung sind auch biologische Medien, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt sind.
Fig. 1 stellt gewisse Energiezustände von DNA und Tryptophan sowie bestimmte photochemische Vorgänge als Ergebnis
der Bestrahlung dieser Stoffe nach konventionellen Methoden dar, die überwiegend als "Ein-Photon" photochemische
Prozesse ablaufen.
Fig. 2 gibt in ähnlicher Darstellung wie in Fig. 1 die sich zusätzlich abspielenden photochemischen Vorgänge an DNA
und Tryptophan wieder, wie sie nach einer der erfindungs-
gemäßen Ausführungsformen bei Bestrahlung mit zwei ultrakurzen
Laserstrahlpulsen bzw. Pulsfolgen verschiedener Wellenlängen hervorgerufen werden.
Nach einer vorzugsweisen Ausgestaltungsform der vorliegenden
Erfindung durchfließt das biologische Medium in einer dünnen Schicht den Zielbereich der Laserstrahlung.
Der Ausdruck "dünne Schicht" heißt, daß mindestens 10% der eingestrahlten Lichtenergie von der Schicht durchgelassen
wird. Abhängig von der Art des Mediums entspricht dies Schichtdicken von 0,1 bis mehreren Millimetern; vorzugsweise
werden Schichten von unter 0,5 mm, und beispielsweise von 0,2 mm Dicke verwendet.
Die Durchflußgeschwindigkeit der Flüssigkeit durch den Zielbereich
hängt von der Größe der vom auftreffenden Laserstrahl überdeckten Fläche sowie von Intensität und Wiederholungsrate
der Pulse, wie nachfolgend beschrieben, ab. Es kann beispielsweise angenommen werden, daß in der Regel
die Durchflußzeit im Bezug auf jeden Millimeter Zielraumfläche etwa 5 ml/Sek. beträgt. Der Querschnitt eines verwendeten
Quarzkanals kann entweder quadratisch oder rechteckig sein, wobei die Größe der Oberfläche im Zielbereich
der Weite des einfallenden Lichtstrahls entspricht oder etwas kleiner ist.
Das erfindungsgemäß verwendete pulsierende Licht stammt vorzugsweise von einem gepulsten Laser. Die Zeitfolge, in der Pulse erzeugt und ausgesendet werden, hängt vom Laser selbst ab und wird mit "Wiederholungsrate" oder "Wiederholungsfrequenz" bezeichnet. Bei der Behandlung biologischer Medien werden Lichtpulse vorzugsweise auf. eine kleine Fläche gerichtet, die kreisförmig sein oder jede andere beliebige Form aufweisen kann und als "Zielbereich" bezeichnet wird. Dieser Bereich ist in der Regel zu klein, um die gesamte Probenmenge gleichzeitig dem Lichtstrahl auszusetzen. Um die vollständige Bestrahlung sicherzustellen, kann wahlweise entweder die Probe so lange den Durchflußzyklus durch den Zielbereich wiederholen, bis diese vollständig bestrahlt ist, oder es kann dafür gesorgt werden,
Das erfindungsgemäß verwendete pulsierende Licht stammt vorzugsweise von einem gepulsten Laser. Die Zeitfolge, in der Pulse erzeugt und ausgesendet werden, hängt vom Laser selbst ab und wird mit "Wiederholungsrate" oder "Wiederholungsfrequenz" bezeichnet. Bei der Behandlung biologischer Medien werden Lichtpulse vorzugsweise auf. eine kleine Fläche gerichtet, die kreisförmig sein oder jede andere beliebige Form aufweisen kann und als "Zielbereich" bezeichnet wird. Dieser Bereich ist in der Regel zu klein, um die gesamte Probenmenge gleichzeitig dem Lichtstrahl auszusetzen. Um die vollständige Bestrahlung sicherzustellen, kann wahlweise entweder die Probe so lange den Durchflußzyklus durch den Zielbereich wiederholen, bis diese vollständig bestrahlt ist, oder es kann dafür gesorgt werden,
daß der Strahl die Probenfläche rasterförmig überstreicht;
oder aber die gesamte Probe kann in ausreichend kleine Mengen geteilt werden, die jeweils im Zielbereich untergebracht
werden können.
Um im letzteren Fall sicherzustellen, daß alle Teilproben die volle Strahlendosis erhalten, ist es zweckmäßig, den
Bestrahlungszyklus mehrfach zu wiederholen. Nach einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung
kann Blutplasma oder Blutserum in Gegenwart unbeschädigter roter Blutzellen sterilisiert werden. Rote Blutzellen
enthalten keine DNA und sind gegen Bestrahlung mit Wellenlängen und Lichtströmen nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren relativ widerstandsfähig. Rote Blutzellen weisen
jedoch eine optische Dichte auf, die ausreicht, um den größten Teil der auf sie auftreffenden Strahlung zu absorbieren
und hinter ihnen befindliche Teile des Mediums gegen die Strahlung abzuschirmen. Zur Behandlung von Gesamt-Blutwird
daher vorgeschlagen, im Zielbereich einen oder mehrere dünne Durchflußkanäle anzuordnen, deren Durchmesser
so gering bemessen wird, daß die roten Blutzellen im Gänsemarsch in der Mitte des Kanals durch den Zielbereich wandern.
Das die roten Blutzellen umgebende Plasma wird aus entgegengesetzten bzw..einer Mehrzahl von Richtungen bestrahlt,
um sicherzustellen, daß dieses die erwünschte Strahlungsmenge erhält.
Die Quantenausbeute des photochemischen Zwei-Photon-Verfahrens, wie es nach der vorliegenden Erfindung benutzt
wird, hängt von der Intensität der einfallenden Lichtstrahlung ab. Für eine Laservorrichtung wird der Energiegehalt
und die Zeitdauer der Pulse zunächst durch den Laserstrahl selbst bestimmt. Die Intensität im Zielbereich kann praktisch
auf jeden beliebigen Wert gebracht werden, und zwar mit Hilfe einer Linsenvorrichtung, die den Querschnitt des
Laserstrahls im Zielbereich bestimmt. Aus diesem Grund kann eine große Zahl verschiedener Laser im erfindungsgemäßen
Verfahren benutzt werden. Die Auswahl wird damit im wesentlichen von den Kosten, der Zuverlässigkeit und dem er-
wähnten Durchsatz bestimmt.
Gepulste Laser sind zur Zeit mit Pulswiederholungsraten zwischen 0,1 Hz (Pulse/Sek.) bis 10 Hz lieferbar. Laser
mit hoher Wiederholungsrate liefern in der Regel schwache Strahlungspulse. Dies erfordert in der Regel, den Strahl
im Zielbereich auf eine sehr kleine Fläche zu fokussieren, um so die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche
Intensität zu erreichen. Laser mit sehr geringen Wiederholungsraten erzeugen typisch Strahlungspulse von enormer
Energie, sind derzeit jedoch noch recht unzuverlässig. Zur Lieferung von sowohl hoher Spitzenleistung, wie sie für
den erfindungsgemäß vorgeschlagenen "Zwei-Photon"-Prozeß erforderlich ist, als auch hoher Leistung über der Zielbereichfläche,
wie dies zum Erzielen eines ausreichenden Durchsatzes an bestrahltem Medium erforderlich ist, haben
sich Laser als geeignet erwiesen, die eine Puls-Wiederholungsrate zwischen 10 und 1 000 000 Hz aufweisen, vorzugsweise
zwischen 100 und 10 000 Hz, und die in der Lage
— 8 sind, Strahlungspulse von einer Zeitdauer unter 2x10
Sek., vorzugsweise zwischen 1x10 und 1x10 Sek. von
extrem hoher Intensität zu liefern. Der Laser kann ein konventioneller, beispielsweise ein YAG-Laser mit zugeordneten
optischen Komponenten sein, der so dimensioniert ist, daß er die entsprechende Wellenlänge, Intensität und PuIsfrequenz
zu liefern in der Lage ist.
Gepulste Laser arbeiten in der Regel bei einer bestimmten, unveränderlichen Wellenlänge. Es sind eine Anzahl von Verfahren
bekannt, um zusätzliche Wellenlängen vom ursprünglichen Strahlungspuls abzuleiten, beispielsweise durch Erzeugen
von harmonischen Lichtschwingungen, mittels synchronem Farbstofflaserbetrieb bzw. optischer, parametrischer
Oszillation. Bei Ausgestaltungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen Pulse verschiedener Wellenlängen
angewendet werden , können diese aus einer einzigen PuIsquelle unter Verwendung eines der oben genannten, zum Stand
der Technik zählenden, Verfahren erzeugt werden.
Während bei der weiteren Beschreibung verschiedener erfindungsgemäßer
Ausführungsformen im allgemeinen von Pulsdauer und Lichtstrom (Fluß) gesprochen wird, ist es für
den Durchschnittsfachmann offen, diese Größen in Bezug zu Intensität, Größe des Zielbereichs, Durchsatzgeschwindigkeit
und Auswahl einer geeigneten Laservorrichtung zu setzen.
Obgleich Blutserumproteine gegenüber nicht-linearer Desaktivierung
empfindlich sind, ist es entsprechend der vorliegenden Erfindung möglich, diese Proteine praktisch unversehrt
zu erhalten bei entsprechender Wahl der Wellen-r längen und Intensitäten des ersten und zweiten Pulses, um
so die Photolyse von Nukleinsäuren zu bevorzugen. Beispielsweise kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erreicht werden, daß die Effizienz der Tryptophan-Photolyse nur etwa um einen Faktor von 3 ansteigt, während
gleichzeitig jene der DNA/RNA Photolyse um einen Faktor von etwa 5 000 gesteigert wird. Es soll betont werden, daß die
Erhöhung des Effizienzunterschiedes der Photolyse von Nukleinsäuren und Proteinen, wie sie nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erzielt wird, für die Desaktivierung von Viruskörpern unter weitestgehendem Aufrechterhalten der
Funktionalität von anwesenden Proteinen von größter Bedeutung ist. Die Zahlenwerte "3" und "5 000" sollen nur beispielhaften
Charakter haben und werden nicht auf jeden Fall zutreffen.
Als Beispiel zur Beschreibung eines Verfahrens nach der Erfindung soll der in Fig. 2 dargestellte Zwei-Photon-Prozeß
dienen. Der erste Lichtpuls ist in seiner Intensität verhältnismäßig
niedrig gewählt, so daß nur ein Teil der Moleküle in den Zustand B angehoben wird, entsprechend dem
Lambert-Beerschen Gesetz. Von diesen angeregten Molekülen erreichen beim Tryptophan ca. 13% und bei den Nukleinsäuren
ca. 1% den Zustand C als Folge innermolekularer Eigenvorgänge. Ein zweiter Strahlungspuls von extrem hoher Intensität
wird nun benutzt, um weitere Absorptionsvorgänge zu bewirken, nämlich das Erreichen von höheren Energie-
zuständen D, E und P, die in Demonstrationsversuchen nachgewiesen
wurden und zur sehr hohen Wahrscheinlichkeit des Eintretens photochemischer Reaktionen führen. Vgl. D.H.
William et al, supra, und D.V. Bent et al, Journal of the American Chemical Society, 97, S. 2612 (1975). Es ist
von Bedeutung, daß der Grundzustand A im allgemeinen keine Photonen in effizienter Weise vom zweiten Puls absorbiert,
weil kein passender Quantenzustand zur Verfügung steht. Die Folge dieses "Zwei-Puls"-Bestrahlungsverfahrens ist,
daß praktisch jedes Molekül, das den Triplet-Zustand C erreicht, unter dem Einfluß des zweiten Lichtpulses gezwungen
wird, photochemisch zu reagieren. Die Zahl der photochemischen Reaktionen hängt in diesem Fall von der
Zahl der produzierten Triplets ab. Dies bedingt, daß die Ausbeute der Photolyse beim Tryptophan um den Faktor 3
erhöht wird, während gleichzeitig die Ausbeute der DNA Photolyse um den Faktor 5 000 vergrößert ist. Diese Wirkung
des "Zwei-Puls"-Verfahrens ist in Fig. 2 dargestellt.
Nach diesem Beispiel kann die Voraussetzung für die Steri-
—8
lisation (P geringer als 10 ) erreicht werden unter Ver-
lisation (P geringer als 10 ) erreicht werden unter Ver-
14 Wendung eines Strahlungsflusses von nur 4,6x10 Photonen
pro cm2 bei 260 nm. Dies ergibt einen Wert von P für die Proteine von 0,99, gleichbedeutend damit, daß 99% der
Proteinfunktionalität des behandelten Mediums erhalten bleibt.
In einer beispielhaften allgemeinen Ausführung beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln einer Lösung von
Proteinen und Nukleinsäuren wie DNA und RNA, zur selektiven Desaktivierung der Nukleinsäuren, das die folgenden
Schritte enthält: (a) Bestrahlen der Lösung mit einem ersten Lichtpuls von einer ersten Wellenlänge und ausreichendem
Lichtstrom, um einen Teil der Nukleinsäure-Moleküle
aus dem Grundzustand in den angeregten Zustand anzuheben, der aber nicht ausreicht, um die Proteine z.u desaktivieren;
(b) Bestrahlen mit einem zweiten Lichtpuls, während sich die Nukleinsäure-Moleküle im angeregten Zustand
befinden, wobei dieser zweite Lichtpuls vorzugsweise
von Nukleinsäure-Molektilen im angeregten Zustand absorbiert
wird, nicht aber in bemerkenswertem Ausmaß von Proteinen in ihrem Grundzustand oder einem angeregten Zustand,
wobei die von den Nukleinsäuren absorbierten zweiten Photonen diese in einen noch höheren Energiezustand anheben,
der zur PhotoIyse derselben führt, während durch den Gesamtprozeß
nur eine minimale Anzahl von Proteinmolekülen photolytisch zersetzt wird. Bedingungen für diese Ausführungsform
sind: der angeregte Zustand der Nukleinsäure-Moleküle ist ein Singlet- oder Triplet-Zustand; der zweite
Strahlungspuls wird während der Lebensdauer dieses angeregten Zustandes zugeführt; dies kann sichergestellt werden,
wenn beispielsweise der zweite Strahlungspuls innerhalb einer Pikosekunde auf den ersten Strahlungspuls
folgt; es können auch beide Pulse gleichzeitig erfolgen. Die Wellenlänge des ersten Pulses liegt zwischen
220 und 280 nm; die Zeitdauer eines jeden ersten
—8
Pulses ist geringer als 2x10 Sek., und liegt vorzugsweise
zwischen 1x10 und 9x10" Sek.; der Strahlungs-14
fluß des ersten Pulses beträgt weniger als 5x10 Photonen
13 14 pro cm2, und vorzugsweise zwischen 1x10 und 5x10
Der zweite Puls hat eine Wellenlänge von etwa 350 nm, vorzugsweise eine solche zwischen 350 und 410 nm oder zwischen
500 und 560 nm; seine Länge oder Zeitdauer beträgt weniger
—8 —10
als 2x10 Sek., vorzugsweise zwischen 9x10 und Ix
-12
10 Sek.; der Strahlungsfluß des zweiten Pulses beträgt
10 Sek.; der Strahlungsfluß des zweiten Pulses beträgt
15 18 17
1x10 bis 1x10 , und vorzugsweise 1x10 Photonen/cm2
Die genannten Lichtpulse sind gepulste Laserstrahlen; sie werden vorzugsweise von der Emission eines gepulsten Lasers
abgeleitet; die zu bestrahlende Flüssigkeit wird der Strahlung im Zielbereich in einer sehr dünnen Schicht ausgesetzt,
die eine Dicke von weniger als 0,5 mm, vorzugsweise von 0,2 mm aufweist; die Lösung fließt durch den Zielbereich
mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Sek.; die genannte Lösung ist beispielsweise Blut oder ein Blutbestandteil,
der Plasma-Proteine enthält; sie kann weiterhin Blutzellen enthalten; die Bestrahlung erfolgt aus verschiedenen
Richtungen, um sicherzustellen/ daß auch bei Anwesenheit von Blutzellen das gesamte Plasma und Serum, das die
Zellen umgibt, der Strahlung ausgesetzt wird. Wie sich aus den vorstehenden Ausführungen ergibt, führt
das erfindungsgemäße Verfahren zu einem völlig neuartigen Konzept für Sterilisationsverfahren. Danach werden
Pulse intensiven Laserlichtes verwendet, um in Gegenwart von Proteinen, beispielsweise Tryptophan-haltiger Proteine,
bevorzugt und gezielt eine Photolyse der DNA/RNA zu bewirken.
Nach einer Ausführungsform werden Aufeinanderfolgen von Strahlungspulsen bzw. Pulsreihen benutzt, deren Wellenlänge,
Zeitdauer und Aufeinanderfolge bewirken, daß die Strahlung der zweiten Pulse oder der Pulsfolgen im wesentliehen
oder überhaupt nur von den Molekülen absorbiert werden können, die bereits unter der Wirkung eines ersten
Pulses bzw. einer ersten Pulsfolge in einen angeregten Zustand versetzt sind. Damit können die Zweitpulse von extrem
hoher Intensität sein, ohne unerwünschte Reaktionen im biologischen Medium in wesentlichem oder nennenswertem
Umfang hervorzurufen.
Der Erstpuls bzw. Pulsfolgen werden danach so gewählt, daß die Wellenlänge (n) zwischen 220 und 280 nm und der Strahlungsfluß
im Zielbereich (Target) 5x10 Photonen/cm2
oder etwas weniger beträgt. Dieser erste Puls bzw. die Pulsfolge überführt DNA oder RNA aus dem Grundzustand in einen
angeregten Zustand. Ein zweiter Puls höherer Intensität bzw. eine Folge solcher Pulse mit einer Wellenlänge von
etwa 300 nm und einem Strahlungsfluß im Zielbereich zwisehen
1x10 und 1x10 Photonen/cm2 wird appliziert,
während sich DNA-und RNA-Moleküle im angeregten Zustand befinden.
Als Folge werden diese in einem nicht-linearen Vorgang in einen noch höheren Energiezustand überführt,
worauf Photolyse und damit die Desaktivierung von DNA und/ oder RNA eintritt.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden zur Sterilisation die ersten und zweiten
Lichtpulse bzw. Pulsfolgen gleichzeitig oder, beispielsweise, innerhalb der Triplet Lebensdauer (etwa 1 Mikrosekunde)
aufeinanderfolgend appliziert. Wie oben beschrieben, werden die ersten und zweiten Lichtpulse bzw. PuIsfolgen
wieder so gewählt, daß die Aminosäuren der Proteine praktisch intakt bleiben, und nur ein minimaler Prozentsatz
durch Photolyse zerstört wird, beispielsweise weniger als 1%. Bei dieser Ausführungsform beträgt die Zeit-
—8 dauer des ersten Pulses weniger als 2x10 Sek., vorzugs-
—10 — 12
weise etwa 1x10 bis 1x10 Sek., bei einem Strahlungsfluß
von 1x10 bis 1x10 , und vorzugsweise von
weniger als 5x10 Photonen/cm2.
Ein niederiger Strahlungsfluß des ersten Pulses bedingt einen verringerten Angriff auf die Proteine; gleichzeitig
bedingt dieser jedoch auch eine Reduktion der Anzahl der angeregten DNA oder RNA Moleküle. Der Strahlungsfluß des
ersten Pulses bzw. der ersten Pulsfolge wird erfindungs-
13 14 gemäß vorzugsweise im Bereich von 1x10 und 5x10 bzw.
14 14
1x10 und 5x10 Photonen/cm2 gewählt. Der zweite Puls hat eine bevorzugte Wellenlänge von über 350 nm, und vorzugsweise eine solche im Bereich zwischen 350 und 410 bzw. 500 und 560 nm, während seine Zeitdauer bevorzugt weniger
1x10 und 5x10 Photonen/cm2 gewählt. Der zweite Puls hat eine bevorzugte Wellenlänge von über 350 nm, und vorzugsweise eine solche im Bereich zwischen 350 und 410 bzw. 500 und 560 nm, während seine Zeitdauer bevorzugt weniger
—8
als 2x10 Sek. beträgt und vorzugsweise im Bereich zwischen
1 χ 10 und 1 χ 10 Sek. liegt. Zur Erhöhung der
Wahrscheinlichkeit der Photolyse der sich im angeregten Zustand (Triplet) befindlichen DNA/RNA Moleküle hat jeder
der zweiten Pulse bzw. Pulsfolgen eine höhere Intensität als der erste Puls, beispielsweise einen Strahlungsfluß
15 18 17
von 1x10 bis 1x10 , vorzugsweise von etwa 1x10 Photonen/cm2.
Zur Vereinfachung der Darstellung wurde vorstehend der angeregte (Zwischen-) Zustand als Triplet Zustand bezeichnet;
ebenso können andere Anregungszustände, so beispielsweise
der erste, angeregte Singlet Zustand als Zwischenzustand dienen. In anderen Ausführungsformen kann das Verfahren
nach der Erfindung mit Strahlungspulsen bzw. Pulsfolgen gleicher Wellenlänge durchgeführt werden.
Entsprechend einer Ausführung wird das im Zielbereich in dünner Schicht angeordnete biologische Medium, beispielsweise
eine Blutfraktion, zur Sterilisation wie beschrieben einer Folge erster Pulse ausgesetzt mit einer Wellenlänge
im Bereich von 220 bis 280 nmf wobei jeder dieser "ersten" Laserpulse eine Zeitdauer von
— R
weniger als 2x10 Sek., und die Folge der"ersten" Laser-
weniger als 2x10 Sek., und die Folge der"ersten" Laser-
13 16
pulse einen Strahlungs strom von 1x10 bis 1x10 Photonen/cm2
im Zielbereich aufweist. Folgen"zweiter"Laserpulse höherer Intensität werden simultan oder sequentiell
mit einer Zeitspanne von höchstens 1 Mikrosekunde, vorzugsweise einer Pikosekunde, nach dem Ende jedes ersten
Pulses appliziert, wobei die Wellenlänge größer/gleich
—8 350 nm ist, und die Pulsdauer weniger als 2 χ 10 Sek.
beträgt, und der Strahlungsfluß der Pulsfolge zwischen 1 χ
15 18
10 und 1x10 Photonen/cm2 ist. Wie oben ausgeführt, beträgt
die Wellenlänge der zweiten Pulse 350 bis 410 bzw. 500 bis 560 nm. Die Pulsfolgefreguenz der ersten Lichtpulse
liegt im Bereich von 10 und 1 000 000 Pulsen/Sek. Werden Strahlungspulse der gleichen Wellenlänge benutzt,
liegt diese bevorzugt im Bereich zwischen 180 bis 295 nm, vorteilhaft zwischen 220 und 290nm, und vorzugsweise zwischen
220 und 280 nm. Die Zeitdauer eines jeden Pulses beträgt vorteilhaft wieder weniger als 1x10 Sek., vorzugs-
—8
weise weniger als 1x10 Sek., und liegt bevorzugt im
weise weniger als 1x10 Sek., und liegt bevorzugt im
—9 —12 —10
Bereich von 5x10 bis 1 χ 10 Sekunden bzw. von 1x10
-12 -5
bis 1x10 Sek. Wird eine Pulsdauar von 1x10 bis 1 χ
10" Sek. benutzt, kann angenommen werden, daß der Triplet
Zustand den Zwischenzustand darstellt, während für eine
—10 —14
Pulsdauer von 1x10 bis 1x10 Sek. angenommen wird,
daß dies für den Singlet Zustand der Fall ist. Bei Verwendung von Pulsen gleicher Wellenlängen werden
vorteilhaft die Bedingungen so gewählt, daß der Singlet Zustand als Zwischenzustand auftritt, d.h., die Dauer der
Pulse wird im oben genannten Bereich ausgewählt. Werden Pulse gleicher Wellenlängen benutzt, so beträgt der Strah-
15 lungsfluß jeden Pulses im Zielgebiet mehr als 1x10 Pho-
1 5 tonen/cm2, und liegt bevorzugt im Bereich von 1 χ 10 bis
1 8
1x10 ; als besonders vorteilhafter Wert hat sich ein
1x10 ; als besonders vorteilhafter Wert hat sich ein
17
solcher von 1x10 Photonen/cm2 erwiesen. Der Gesamtstrahlungsfluß
der Pulse ist vorzugsweise um eine Größen-Ordnung größer als der eines jeden einzelnen Pulses. Weiterhin
hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, 10 Wiederholungen eines jeden der Einzelpulse per Volumeneinheit
des zu behandeln_den Mediums anzuwenden. Werden Pulse verschiedener Wellenlängen verwendet, so wird
die Dauer des ersten Pulses vorzugsweise wie oben beschrieben gewählt. Die ersten Strahlungspulse haben vorteilhafterweise
eine Wellenlänge von 180 bis 350 nm, und vorzugsweise eine solche von 220 bis 290 nm, wobei sich ein Bereich
zwischen 220 und 280 nm als besonders günstig erwiesen hat. Die ersten Pulse haben vorteilhafterweise einen
18 Strahlungsfluß von weniger als 1 χ 10 Photonen/cm2, wobei
14 sich ein Wert von weniger als 5x10 , und insbesondere
13 14
ein solcher von 1x10 bis 5x10 Photonen/cm2 als besonders
zweckmäßig ergeben hat.
Der gesamte Strahlungsfluß der Folge von ersten Pulsen
13 18
liegt zwischen 1x10 und 1x10 Photonen/cm2, und vor-
13 16
teilhaft zwischen 1x10 und 5x10 . Besonders ausgezeichnete
Ergebnisse werden bei einem Strahlungsfluß von 1x1014 bis 5x1014 Photonen/cm2 erzielt.
Jeder der Strahlenpulse der zweiten Pulsfolge besitzt
15
einen Fluß von über 1x10 , und zweckmäßig zwischen 1x10
1 8
und 1x10 , wobei besonders gute Resultate mit Werten
und 1x10 , wobei besonders gute Resultate mit Werten
1 7
von 1x10 Photonen/cm2 erzielt wurden. Die Summe der Strahlungsflüsse dieser Pulsfolge liegt vorteilhaft aus den bereits erörterten Gründen etwa um eine Zehnerpotenz über jenem der einzelnen Lichtpulse. Die Wahl der Wellenlänge für den zweiten Puls hängt von der Zeitdauer ab, die für die ersten Pulse gewählt wird.
von 1x10 Photonen/cm2 erzielt wurden. Die Summe der Strahlungsflüsse dieser Pulsfolge liegt vorteilhaft aus den bereits erörterten Gründen etwa um eine Zehnerpotenz über jenem der einzelnen Lichtpulse. Die Wahl der Wellenlänge für den zweiten Puls hängt von der Zeitdauer ab, die für die ersten Pulse gewählt wird.
Wird für den ersten Puls eine Dauer gewählt, die, wie oben
— ausgeführt, den Triplet Übergang bevorzugt bewirkt (1x10
bis 1 χ10~ Sek.), so wird die Wellenlänge für die zweiten
Pulse zweckmäßig größer als 300 nm, vorzugsweise im
Bereich zwischen 300 und 700 nm, gewählt. Als besonders geeignet hat sich der Bereich von 300 bis 450 nm, und vorzugsweise
jener von350bis 410 nm, erwiesen. Die Dauer eines jeden zweiten Pulses beträgt dann in der Regel weniger
als 1x10 , zweckmäßig weniger als 1x10 Sek. Besonders
zweckentsprechend hat sich eine Pulsdauer von we-
-8 -9 -12
niger als 1x10 , etwa im Bereich von 5x10 bis 1x10
Sekunden, und vorzugsweise von 1x10 bis 1x10 Sek.
erwiesen. Jeder dieser Zweitpulse wird vorzugsweise innerhalb von 1 χ 10 Sekunden nach dem Erstpuls bzw. gleichzeitig
mit einem solchen appliziert. Wird für den Erstpuls eine Dauer gewählt, die bevorzugt
den übergang in den Singlet Zustand bewirkt (1x10 bis
-14
1x10 Sek.), so beträgt die Wellenlänge der Zweitpulse vorzugsweise über 300 nm, und liegt vorzugsweise zwischen 300 und 700 nm und bevorzugt zwischen 500 und 560 nm. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Wellenlängen zwischen 520 und 540 nm erzielt. Die Dauer jedes Zweit-
1x10 Sek.), so beträgt die Wellenlänge der Zweitpulse vorzugsweise über 300 nm, und liegt vorzugsweise zwischen 300 und 700 nm und bevorzugt zwischen 500 und 560 nm. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Wellenlängen zwischen 520 und 540 nm erzielt. Die Dauer jedes Zweit-
—10 —12
pulses beträgt vorzugsweise 1x10 bis 1x10 Sek., bzw.
—11 —12
weniger als 3x10 bzw. 3x10 Sek., wobei sich der
—11 —12
Bereich von 1x10 bis 1x10 Sek. als besonders günstig
erwiesen hat. Jeder Zweitpuls folgt dem Erstpuls, bei-
-12 spielsweise, im Abstand von 3x10 Sek., vorteilhafter-
— 12
weise von 1x10 Sek., oder wird zugleich mit diesem appliziert.
weise von 1x10 Sek., oder wird zugleich mit diesem appliziert.
Wie aus den oben stehenden Ausführungen ersichtlich, betrifft die vorliegende Erfindung im weitesten Sinne ein
Verfahren zum Behandeln biologischer Medien vermittels gepulster Strahlung, die aufgrund der gewählten Wellenlänge(n)
und Intensität(en) Pulse bevorzugt, die die Aktivität der im Medium vorhandenen Nukleinsäuren im Vergleich
zur Funktionalität der ebenfalls in diesem vorhandenen Proteine durch photolytische Reaktion verringert bzw. unter
weitgehendem Aufrechterhalten der Proteinfunktionalität praktisch völlig zerstört.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
betrifft Verfahren zum Abschwächen bzw. Abtöten von Viren für Impfstoffe und nach diesen hergestellte Impfstoffe.
Diese Verfahren eignen sich auch für Viren, die eine Nukleinsäure und beispielsweise eine Tryptophan enthaltende
Proteinhülle enthalten. Die Strahlungsbehandlung wird wieder mit Hilfe ultrakurzer Laserpulse verschiedener
Wellenlänge und hoher Intensität durchgeführt, die die nicht-lineare Photolyse der Nukleinsäure-Komponenten bewirkt
und gleichzeitig die Proteinhülle weitgehend unversehrt beläßt.
Das Verfahren nach dieser Ausführungsform enthält die folgenden, wesentlichen Verfahrensschritte:
(a) Herstellen einer Lösung, die Viren mit einem Nukleinsäureanteil
und einer Tryptophan enthaltenden Hülle enthält;
(b) Bestrahlen der genannten Lösung in Form einer im Strahlungszielbereich
angeordneten dünnen Schicht mit einem bzw. einer Anzahl von Lichtpuls(en) einer ersten Wellenlänge im
Bereich von 220 bis 280 nm und einer Pulsdauer von weniger
—8
als 2x10 Sek. sowie mit einem Gesamtstrahlungsstrom von
als 2x10 Sek. sowie mit einem Gesamtstrahlungsstrom von
1 χ1013 bis 1 χ1016 Photonen/cm2; und
(c) Bestrahlen der Lösung im Zielbereich mit einem bzw. einer Anzahl von Lichtpuls(en) einer zweiten Wellenlänge
im Bereich von etwa 350 nm, wobei jeder Zweitpuls eine
— ft
Dauer von weniger als 2x10 Sek. aufweist und der Strah-
1 5 lungsstrom jedes Zweitpulses wenigstens 1x10 Photonen/
cm2 beträgt, wobei der Zweitpuls innerhalb höchstens einer Mikrosekunde auf den Erstpuls folgt, so daß der Nukleinsäureanteil
des Virus weitgehend desaktiviert bzw. praktisch vollkommen unschädlich gemacht wird, während die Veränderungen
der Proteinhülle gering bleiben. Vorzugsweise Bedingungen hierfür sind wie folgt: Der Gesamtstromfluß
der Strahlungspulse des ersten Wellenlängenbereiches liegt zwischen 1x10 und 5x10 Photonen/cm2;
jeder der genannten Zweitpulse besitzt einen Strahlungs-
17 18
strom zwischen 1x10 bis 1x10 Photonen/cm2; jeder der
ersten und zweiten Strahlungspulse besitzt eine Dauer von
_ι η — 12
etwa zwischen 9x10 und 1x10 Sekunden. Die Zweitpulse
liegen entweder im Wellenlängenbereich zwischen 360 und 410 oder zwischen 500 und 560 nm. Die genannten Erstpulse
werden in einer Frequenz zwischen 10 und 1 000 000 Pulsen/Sekunde appliziert. Die Erst- und Zweitpulse werden
kurz aufeinanderfolgend oder praktisch gleichzeitig appliziert.
Die Dicke der dünnen Schicht im Zielbereich beträgt weniger als 0,5 mm und vorzugsweise 0,2 mm.
Die genannte Lösung fließt durch jeden mm des Zielbereichs mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Sek. und die Lichtpulse
sind Laserpulse.
Weitere vorzugsweise Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zum Herstellen von Tryptophan-haltigen
Proteinen und nach diesen hergestellte Proteine. Zur Herstellung derartiger Proteine werden Säugetier-Zellkulturen
verwendet. Dann werden die erzeugten Proteine in einem Auffangmedium (Erntemedium) freigesetzt
und anschließend die so in das Medium gelangten Nukleinsäure-Bestandteile
durch erfindungsgemäße Strahlungseinwirkung weitgehend bzw. praktisch vollständig desaktiviert
bzw. abgetötet.
Da Impfstoffe, die auf abgeschwächten bzw. abgetöteten Viren beruhen, eine bestimmte Maximalmenge ungeschädigter
Viren enthalten dürfen, und da weiterhin für die Wirksamkeit solcher Impfstoffe eine vollkommen intakte Proteinhülle
nicht erforderlich ist, kann davon ausgegangen werden, daß in diesem Anwendungsbereich eine Reduktion der
4
viralen Aktivität von 10 , vorzugsweise eine solche von 10 , ausreicht, und die photolytische Reaktion der viralen Proteinhülle bis zu etwa 20 bis 40% zulässig ist. Anders liegen die Verhältnisse bei Blut und dessen Fraktionen und bei Medien mit Säugetierzellkulturen oder vermittels solcher hergestellten Produkten. In solchen Fällen ist eine Reduzierung der viralen Aktivität von mindestens
viralen Aktivität von 10 , vorzugsweise eine solche von 10 , ausreicht, und die photolytische Reaktion der viralen Proteinhülle bis zu etwa 20 bis 40% zulässig ist. Anders liegen die Verhältnisse bei Blut und dessen Fraktionen und bei Medien mit Säugetierzellkulturen oder vermittels solcher hergestellten Produkten. In solchen Fällen ist eine Reduzierung der viralen Aktivität von mindestens
6 8
10 , vorzugsweise 10 , erforderlich, wobei die Protein-Desaktivierung
20 bis 35% nicht überschreiten, vorzugsweise
jedoch bei 2 bis 5% oder darunter liegen sollte. In Fällen, wo Protein-Produkte für andere als pharmazeutische
Anwendungen bestimmt sind, kann in der Regel eine geringere Ausbeute an unversehrten Proteinen in Kauf genommen
werden, um andere Verfahrensparameter zu optimieren.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Beispielen dargestellt.
Dieses Beispiel betrifft die Anwendung des Verfahrens entsprechend
der vorliegendenErfindung für die Sterilisation eines menschliches Plasma enthaltenden biologischen Mediums.
Die Proteinaktivität des Plasmas kann nach Standard-Methoden, wie beispielsweise dem "Partial Thromboplastin
Time" (PTT)-Verfahren bestimmt werden. Bei dem genannten Verfahren wird die Koagulationszeit als Maß benutzt: ein
Anstieg von 2 Sekunden bedeutet eine 10%ige Abnahme der Aktivität der Plasma-Proteine. Für das vorliegende Beispiel
wird das Plasma mit einem Säugetier-Virusr Simian
Virus 40 (SV 40), infiziert, einem leicht zu bestimmenden Virus von etwa der gleichen Größe wie der Hepatitis A
Virus. Die Plasma-Probe fließt durch eine Quarzküvette von 0,55 mm2 Querschnitt. Die Durchflußgeschwindigkeit wird
mit Hilfe einer Pumpe auf 3x10 ml/Sek. eingestellt, was
einer Fließgeschwindigkeit durch den Zielbereich von 1,2 χ
—1
10 cm/Sek. entspricht. Ein Q-gesteuerter Nd:YAG Laser wird mit einer Wiederholungsrate von 20 Hz betrieben und
10 cm/Sek. entspricht. Ein Q-gesteuerter Nd:YAG Laser wird mit einer Wiederholungsrate von 20 Hz betrieben und
— 9 erzeugt Strahlungspulse von 5x10 Sek. Dauer. Mit Hilfe
der harmonischen Frequenzvervielfachung werden aus dem ursprünglichen Strahlungspuls zwei Pulse hergeleitet, und
zwar ein Erstpuls mit einer Wellenlänge von 266 nm und ein Zweitpuls mit einer Wellenlänge von 353 nm. Der Erstpuls
von 266 nm wird so*\ge rieht et, daß er 2x10 Photonen
enthält, während der Zweitpuls von 353 nm 1,2x10 Photonen
enthält.
Die Strahlungspulse werden mit Hilfe einer Optik auf einen quadratischen Zielbereich von 4x10 cm2 Fläche fokussiert.
1 3 Dies bewirkt einen Strahlungsfluß von 5x10 Photonen/cm2
1 η
bei 266 nm und 3x10 Photonen/cm2 bei 353 nm. Die Pulse treffen im Zielbereich praktisch gleichzeitig ein. Unter diesen Bedingungen ist die Probenverweilzeit im Zielbereich pro mittlerem Volumen-Element etwa 0,5 Sek., was der Bestrahlung mit einer Puls-Wiederholungsrate von 10 entspricht. Der von der Pulsfolge bewirkte Fluß beträgt damit 1x10 Photonen/cm2.
bei 266 nm und 3x10 Photonen/cm2 bei 353 nm. Die Pulse treffen im Zielbereich praktisch gleichzeitig ein. Unter diesen Bedingungen ist die Probenverweilzeit im Zielbereich pro mittlerem Volumen-Element etwa 0,5 Sek., was der Bestrahlung mit einer Puls-Wiederholungsrate von 10 entspricht. Der von der Pulsfolge bewirkte Fluß beträgt damit 1x10 Photonen/cm2.
Anschließend wurde die Probe auf ihre Virus- und Protein-Aktivität
hin untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß die Virus-Aktivität, gemessen als Titer von SV 40, um
einen Faktor von 10 verringert ist, während die Protein-Aktivität bei 90% ihres ursprünglichen Wertes verbleibt.
Dieses Beispiel betrifft das Verfahren nach der Erfindung in einer Variante, bei der mit Strahlungspulsen gleicher
Wellenlänge gearbeitet wird, um ein menschliches Plasma enthaltendes biologisches Medium zu sterilisieren.
Für dieses Beispiel wurde das Plasma gezielt mit Bakteriophage T4 versetzt und dessen Titer bestimmt mittels
Plaque-Bildung auf einer E.CoIi Gastkultur. Die Protein-5
Aktivität wird nach der PTT Methode bestimmt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die zu behandelnde Plasma-Probe
fließt durch eine Quarzküvette von 2x0,05 cm Querschnitt.
Der Laserstrahl tritt durch die 2 cm Frontseite ein und legt in dem in der Küvette befindlichen Medium
einen optischen Weg von 0,05 cm zurück. Eine Pumpe hält die Durchflußgeschwindigkeit auf 1 ml/Sek., was einer
Fließgeschwindigkeit durch den Zielbereich van 10 cm/ Sek. entspricht. Ein Excimer-Laser wird so betrieben,
daß er Pulse einer Wellenlänge von 258 nm mit einer Wiederholungsrate
von 200 Hz. erzeugt. Jeder Puls hat eine
— 8 17
Zeitdauer von 1 χ 10 Sek. und enthält 1x10 Photonen.
Die Pulse werden durch eine Zylinderlinse auf den Ziel-
bereich der Küvette gerichtet. Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Sek. braucht ein durchschnittliches
Volumenelement des Mediums 0,05 Sek., um den Zielbereich zu durchfließen und erhält somit 10 Laserpulse.
Der von jedem Puls gelieferte Strahlungsfluß beträgt 1 χ
17
10 Photonen/cm2 und der Gesamtstrahlungsfluß pro Vo-
10 Photonen/cm2 und der Gesamtstrahlungsfluß pro Vo-
1 8
lumenelement damit 1x10 Photonen/cm2.
Unter diesen Bedingungen wurde die Nukleinsäure-Aktivität, wie anhand des T4 Titers festgestellt werden konnte,
um einen Faktor von 10 reduziert, während die Protein-Aktivität 65% ihres ursprünglichen Wertes behielt.
Das Beispiel 2 wird wiederholt mit dem Unterschied, daß
-12
der Excimer-Laser Pulse von 5x10 Sekunden und 5x10
Photonen/Puls bei einer Wellenlänge von 258 nm und einer Wiederholungsrate von 200 Hz liefert. Die gleiche Probe
von mit T4 infiziertem menschlichem Plasma (wie im Beispiel 2) fließt durch eine Quarzküvette mit 0,5x0,05 cm
Querschnitt; die Durchflußmenge liegt bei 0,5 ml/Sek., was einer Fließgeschwindigkeit von 20 cm/Sek. durch den
Zielbereich entspricht. Die Laserpulse werden mit Hilfe einer Zylinderlinse auf einen Zielbereich der Küvette von
0,1x0,5 cm gerichtet. Bei einem Durchfluß von 0,5 ml/Sek.
beträgt die Verweilzeit im Zielbereich für die mittlere Volumeneinheit 5x10 Sek.; diese erhält demnach nur einen
einzigen Laserpuls. Der Strahlungsfluß im Zielbereich be-
1 7
trägt damit 1x10 Photonen/cm2.
trägt damit 1x10 Photonen/cm2.
Unter diesen Bedingungen wurde die Nukleinsäure-Aktivität um den Faktor 10 reduziert, während die Protein-Aktivität
mindestens 90% des ursprünglichen Wertes behielt.
Dieses Beispiel betrifft die Sterilisation der menschliehen
Blutfraktion Faktor VIII. Die Aktivität des Faktors VIII kann nach bekannten kolorimetrischen Methoden genau
bestimmt werden; Meßvorrichtungen sind im Handel erhältlich.
Eine Probe des handelsüblichen, gefriergetrockneten Faktor VIII Präparats wird nach den Beipackzettel-Angaben
aufbereitet und sodann gezielt mit Bakteriophage T7 infiziert und dessen Titer mittels Plaque-Bildung
auf einer E.CoIi Gastkultur bestimmt. Die rekonstituierte,
infizierte Lösung durchfließt eine Quarzküvette von 0,1x0,05 cm Querschnitt. Die Laserpulse
treffen auf der 0,1 cm Frontseite der Küvette auf, so daß der optische Weg im Medium 0,05 cm beträgt. Eine Pumpe
hält die Fließgeschwindigkeit auf 2x10~3 iril/Sek. Ein
Passiv-Phasengekoppelter Nd:YAG Laser wird mit einer Wiederholungsrate von 20 Hz. betrieben und liefert Pulse von
-1 2
20 χ 10 Sek. Dauer, wobei Strahlungspulse von 532 und 266 nm Wellenlänge mittels harmonischer Frequenzvervielfachung aus der Originalstrahlung abgeleitet werden. Die Pulse von 532 nm Wellenlänge werden so eingestellt, daß
20 χ 10 Sek. Dauer, wobei Strahlungspulse von 532 und 266 nm Wellenlänge mittels harmonischer Frequenzvervielfachung aus der Originalstrahlung abgeleitet werden. Die Pulse von 532 nm Wellenlänge werden so eingestellt, daß
15
jeder 5x10 Photonen enthält, während jeder 266 nm Puls
jeder 5x10 Photonen enthält, während jeder 266 nm Puls
11
1 χ 10 Photonen enthält. Mittels einer optischen Anordnung aus Spiegeln und Linsen wird bewirkt, daß die 266 nm
Pulse mit ihrem Spitzenwert im 1 χ10~ Sek. vor den
Spitzenwerten der 532 nm Pulse im Zielbereich eintreffen, dessen Querschnitt eine Größe von 5 χ 10 cm2 aufweist.
Ein mittleres Volumenelement des aus. rekonstituiertem und mit T7 infiziertem Faktor VIII bestehenden Mediums wird
von je 5 Pulsfolgen mit 266 bzw. 532 nm Wellenlänge ge- . troffen. Der Strahlungsfluß jedes 266 nm Pulses beträgt
2x10 Photonen/cm2, und jedes 532 nm Pulses 1x10
Photonen/cm2. Das mittlere Volumenlement erhält damit einen Gesamtfluß von 1x10 Photonen/cm2 bei 266 nm und
5x10 Photonen/cm2 bei 532 nm Wellenlänge.
Die nachfolgende Analyse zeigt, daß die Nukleinsäure-Aktivität um einen Faktor von 10 reduziert wurde, während
die Protein-Aktivität zu 98% erhalten blieb.
BEISPIELE 5-11
Das Verfahren nach Beispiel 4 wird mit den gleichen Parametern (d.h., Fließgeschwindigkeit des Mediums, Zielbereich,
Querschnitt der Quarzküvette) wiederholt, wobei jedoch der Nd:YAG Laser benutzt wird, um Farbstofflaser
zur Abgabe von Strahlungspulsen veränderbarer bzw. unterschiedlicher Wellenlänge anzuregen. Jedes Mal, wenn der
Nd:YAG Laser feuert, werden zwei Farbstofflaserpulse von
-12
je 5x10 Sek. Dauer gleichzeitig erzeugt. Die Ergebnisse entsprechender Versuchsreihen sind nachstehend tabellarisch zusammengestellt:
BEISPIEL Wellenl.d. Erstpulse Wellenl. d.Zweitpulse
je 5x10 Sek. Dauer gleichzeitig erzeugt. Die Ergebnisse entsprechender Versuchsreihen sind nachstehend tabellarisch zusammengestellt:
BEISPIEL Wellenl.d. Erstpulse Wellenl. d.Zweitpulse
Nr. (Strahlenfluß = 2 χ 1013 Pho- (Strahlenfluß = 2 χ 1018 Photonen/cm2 pro Puls) tonen/απ2 pro Puls)
5 260 530
6 270 530
7 290 530
8 240 530
9 260 400 10 260 600
11 260 700
BEISPIEL Bruchteil d. ursprüngl. %-Satz d. ursprüngl.
Nr. Aktivität (Titer von T7) Protein-Aktivität (%)
5 5 χ 10~7 98
6 1 χ 10~6 98
7 1 χ 10"1 98
8 1 χ 10"3 99
9 1 χ 10~5 98 10 1 χ 10"4 98
11 1 χ 10~3 98
Dieses Beispiel betrifft ein Verfahren zum Behandeln von biologischen Medien, die menschliches Gesamtblut enthalten.
Für die Untersuchung wird Blut gezielt mit Bakteriophagen T4 nach der PTT Methode infiziert und die Aktivi-
tat des Koagulations-Proteins (Gerinnungsfaktor) bestimmt.
Die Sauerstoff-Affinität der Hämoglobin-Proteine wird nach Standard-Verfahren gemessen. Es wird eine Laservor-
-13
richtung verwendet, die Pulse von 1x10 Sekunden
Dauer liefert, wobei jeder Puls einen Strahlungsfluß von 5x10 Photonen bei einer Wellenlänge von 260 nm aufweist.
Die Puls-Wiederholungsrate beträgt 200 Hz. Das Probenmedium fließt durch eine Quarzküvette mit einem
Querschnitt von 0,5 χ 0,5 cm in einer Menge von 0,5 ml/
cm; das entspricht einer Pließgeschwindigkeit durch den Strahlenzielbereich von 20 cm/Sekunde. Die Laserpulse werden
mittels einer Zylinderlinse auf den Zielbereich von 0,1 χ 0,5 cm gerichtet. Der Strahlungsfluß jeden Pulses
1 7
im Zielbereich beträgt so 1x10 Photonen/cm2. Laserpulse der genannten Zeitdauer und Intensität durchdringen ("bleichen") rote Blutzellen. Das Ergebnis zeigt, daß die Nukleinsäure-Aktivität, bestimmt vom Titer von T4, um den Faktor 10 verringert ist, während 90& der ursprünglichen Aktivität des Gerinnungsfaktors erhalten blieben. Die Sauerstoff-Affinität der Hämoglobin-Proteine zeigt keine merkliche Veränderung.
im Zielbereich beträgt so 1x10 Photonen/cm2. Laserpulse der genannten Zeitdauer und Intensität durchdringen ("bleichen") rote Blutzellen. Das Ergebnis zeigt, daß die Nukleinsäure-Aktivität, bestimmt vom Titer von T4, um den Faktor 10 verringert ist, während 90& der ursprünglichen Aktivität des Gerinnungsfaktors erhalten blieben. Die Sauerstoff-Affinität der Hämoglobin-Proteine zeigt keine merkliche Veränderung.
Zusammenfassend betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zum Sterilisieren biologischer Medien, das allgemein angewendet
werden kann und das es erlaubt, durch erfindungsgemäße Einwirkung von Licht (Photonen), vorzugsweise von
intensiven Laserlichtpulsen, selektiv DNA und RNA enthaltende Nukleinsäuren in der Gegenwart von Proteinen der
Photolyse zu unterwerfen.
- Leerseite
Claims (1)
15. FEB. 1985 *
Verfahren zum Sterilisieren biologischer Medien vermittels durch Lichtpulse bewirkter, selektiver
Photolyse und derart hergestellterProdukte
Patentansprüche:
1. Verfahren zur Behandlung von biologischen Medien
zur bevorzugten Herabsetzung bzw. vollständigen Zerstörung der Aktivität darin enthaltener Nukleinsäuren, die daneben
gleichzeitig ein oder mehrere Proteine enthalten, dadurch gekenzeichnet, daß das biologische
Medium Lichtpulsen ausgewählter Wellenlänge und Intensität ausgesetzt wird, deren Strahlung von den Nukleinsäuren
sowohl im Grundzustand unter Überführung in einen angeregten Zustand, als auch im angeregten Zustand unter Übergang
in einen noch höheren, eine photolytische Reaktion hervorrufenden Energiezustand, absorbiert wird, wobei die ausgewählte
Strahlung von den Proteinen weder im Grundzustand noch im angeregten Zustand in einem Ausmaß absorbiert wird,
das ausreicht, um eine photolytische Reaktion derselben herbeizuführen, die eine bzw. eine wesentliche Verringerung
der Funktionsfähigkeit der Proteine zur Folge hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Medium eine Lösung ist, die Blut,
Blutbestandteile, aus Säugetierzellen genetisch aufgebaute proteinartige Produkte bzw. ein Impstoff ist, der virale
DNA und RNA mit deren Proteinhülle enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Nukleinsäuren durch die photo-
4 lytische Reaktion mindestens um einen Faktor 10 reduziert und die Funktionalität der Proteine höchstens um 40% herabgesetzt
wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Medium ausgewählt ist aus Nukleinsäuren
in Form von pathogenen DNA und RNA enthaltendem Blut, Blutplasma, Blutserum, Blutfaktor VIII und Blutfaktor
XI, bzw. aus mit Hilfe von Säugetierzellen genetisch hergestellten proteinartigen Produkten, die Nukleinsäuren
in Form von Säugetier-DNA oder -RNA enthalten, und Impfstoffe, die Nukleinsäuren in Form viraler DNA und RNA
in einer Proteinhülle enthalten; und daß die virale Aktivität der Nukleinsäuren mindestens um einen Faktor von
10 , vorzugsweise von 10 , reduziert wird und gleichzeitig die Funktionalität der Proteinhülle mindestens zu 60%,
besser zu 65%, erhalten bleibt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Medium Nukleinsäure(n) und
Tryptophan-Proteine in wässriger Lösung enthält und die virale Aktivität der Nukleinsäure in dieser Lösung weitgehend
verringert wird, ohne daß die Proteinfunktionen in nennenswertem Ausmaß beeinträchtigt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1 zum Behandeln von
Nukleinsäure(n) und Proteine enthaltenden biologischen Medien, dadurch gekennzeichnet, daß diese der Bestrahlung
mit einer Vielzahl von Laserpulsen ausgewählter Wellenlänge und Intensität ausgesetzt werden, so daß die Nukleinsäuren
wesentlich stärker durch Photolyse zerstört werden als die Proteine.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Laserstrahlpulse alle annähernd
die gleiche Wellenlänge aufweisen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der genannten Pulse eine Wellenlänge in
einem Bereich von 220 bis 280 nm aufweist und eine Dauer von weniger als 1 x10" Sekunden hat, wobei die Dauer vor-
— 9 —15 zugsweise im Bereich von 5x10 bis 1x10 Sek. liegt,
-12
und bevorzugt 1x10 Sek. beträgt, und daß der Strahlungsfluß
größer als 1x10 Photonen/cm2 ist, und vor-
1 c ίο
zugsweise im Bereich zwischen 1x10 bis 1x10 und
17 1R
bevorzugt zwischen 1x10 und 1x10 liegt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gepulste Licht aus Laserstrahlung unterschiedlicher
Wellenlängen besteht.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die genannte Laserstrahlung erste Pulse bzw. Pulsfolgen einer ersten Wellenlänge aufweist mit
einer Intensität, die ausreicht, um einen erheblichen Prozentsatz der im Medium vorhandenen Nukleinsäuren aus dem
Grundzustand in einen höheren Energiezustand zu überführen, jedoch unzureichend, um bei den ebenfalls vorhandenen
Proteinen zu einer photoIytisehen Reaktion zu führen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Laserstrahlung zweite Pulse bzw. Puls
folgen aufweist, die vorzugsweise von den im angeregten Zustand befindlichen Nukleinsäuren absorbiert werden, jedoch
nicht oder nicht in beträchtlichem Ausmaß von den Proteinen, und damit zur photolytischen Reaktion der Nukleinsäuren
führen unter Minimierung einer Protein-Photolyse.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 9, 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die genannte Laserstrahlung einen oder mehrere Erstpulse enthält, deren Wellenlänge und Intensität
so gewählt werden, daß ihre Strahlung von den Nukleinsäuren im Grundzustand unter Überführung in einen
angeregten Zustand absorbiert wird; sowie einen oder xnehrere Zweitpulse einer Wellenlänge und Intensität, die so gewählt
werden, daß die Strahlung von Nukleinsäuren im angeregten Zustand unter überführung in einen noch höheren,
eine photolytische Reaktion auslösenden Energiezustand, absorbiert wird, während die vorhandenen Proteine für
ihre photolytische Reaktion in nennenswertem Umfang nicht ausreichend Strahlung absorbieren.
5
5
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß der genannte angeregte Zustand der Nukleinsäuren ein Singlet oder Triplet Zustand ist, und daß die genannten
zusätzlichen Zweitpulse bzw. Pulsfolgen während der Lebensdauer der Nukleinsäuren im angeregten Zustand appliziert
werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Erst- und zweitpulsetbzw. Pulsfolgen
gleichzeitig appliziert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß jeder der genannten Zweitpulse innerhalb einer Mikrosekunde auf den Erstpuls folgt, und daß die Erst- und
Zweitpulse entweder als Einzelpulse oder als eine Vielzahl von Pulsen abwechselnd appliziert werden.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß jeder der genannten Erstpulse im Wellenlängenbereich von 180 bis 350 nm liegt, vorzugsweise im Bereich
von 180 bis 295nmf und eine Dauer von weniger als 1x10
Sek. aufweist, vorzugsweise eine solche im Bereich von
-5 -14
1x10 bis 1x10 , und besonders vorteilhaft im Bereich von 1 χ 10~ bis 1x10 Sekunden; und daß deren Intensi-
1x10 bis 1x10 , und besonders vorteilhaft im Bereich von 1 χ 10~ bis 1x10 Sekunden; und daß deren Intensi-
1 ο
tat weniger als 1x10 Photonen/cm2 beträgt, und vorzugs-
13 14
weise in einem Bereich von 1x10 bis 1x10 liegt; und
daß jeder Zweitpuls im Wellenlängenbereich zwischen 300 bis 700 nm liegt, vorzugsweise im Bereich von 300 bis 450 bzw.
500 bis 560 nm; und eine Dauer von weniger als 1x10
aufweist, vorzugsweise eine solche von 1x10 bis 1x10
— 9 — 1 2
Sek., und besonders vorteilhaft von 5x10 bis 1 χ 10
1 5 Sekunden; und daß die Intensität größer als 1x10 Pho-
1 ο tonen/cm2 ist und vorzugsweise 1x10 nicht übersteigt.
-12 zeichnet, daß der Zweitpuls innerhalb von 3x10 Sek.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß der Zweit]
auf den Erstpuls folgt.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß der Zw<
Erstpuls folgt.
net, daß der Zweitpuls innerhalb von 1x10 Sek. auf den
19. Verfahren zum Sterilisieren einer biologischen Flüssigkeit, die pathogene DNA und RNA enthält bzw. in der
solche vermutet werden, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: (a) Bestrahlen der Flüssigkeit mit
einem oder einer Folge von Erstpulsen einer Wellenlänge von 220 bis 280 nm, wobei jeder der Erstpulse eine Dauer
—8
von weniger als 2x10 Sek. und vorzugsweise eine solche
von weniger als 2x10 Sek. und vorzugsweise eine solche
— 9 —12
zwischen 9x10 und 1x10 Sek./Puls aufweist, und die
1 Gesamtintensität in diesem Wellenlängenbereich 1x10
bis 1x10 , und vorzugsweise . 1x10 bis 5x10 Photonen/cm2
beträgt; und (b) Bestrahlen der Flüssigkeit mit einer oder einer Folge von Zweitpulsen einer Wellenlänge
von 300 nm oder größer, vorzugsweise von 350 bis 410 nm bzw. von 510 bis 560 nm, und einer Zeitdauer von weniger als
1x10 Sekunden, vorzugsweise von 9x10 und 1x10
Sek. und einer Intensität pro Puls von wenigstens 1x10
17 18
und vorzugsweise von 1x10 bis 1x10 Photonen/cm2, wobei
die Zweitpulse innerhalb einer Mikrosekunde jedem Erstpuls folgen, so daß die DNA und RNA enthaltenden Pathogene im
wesentlichen bzw. praktisch vollständig desaktiviert werden und die Funktionalität von in der Flüssigkeit vorhandenen
Proteinen im wesentlichen unverändert erhalten bleibt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Erstpuls mit einer Folgefrequenz von 10 bis
1 000 000 Pulsen/Sekunde appliziert wird.
21. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet,
daß Erst- und Zweitpulse praktisch gleichzeitig appliziert werden.
22. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet,
daß Erst- und Zwe<btpulse bzw. Pulsfolgen abwechselnd appliziert werden.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit in einer dünnen Schicht im Zielbereich
der Bestrahlung angeordnet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Schicht weniger als 0,5 mm und vor-
-15 zugsweise weniger als 0,2 mm beträgt.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit den Zielbereich mit einer solchen
Geschwindigkeit durchfließt, daß jede Teilmenge derselben dem Gesamtstrahlungsstrom aus Erst- und Zweitpulsen
bzw. der Folge solcher Pulse ausgesetzt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit jeden Millimeter des Zielbereichs
mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/Sek. passiert.
27. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lichtpulse Laserstrahlenpulse sind.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtpulse von einem einzigen Laser abgeleitet
werden.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
daß die Flüssigkeit aus den folgenden biologischen Medien ausgewählt ist: Blut, Blutbestandteilen wie Blutplasma,
Blutfaktoren oder Blutserum, genetisch aufgebau-
ten proteinartigen Produkten einschließlich solcher, die mittels Säugetierzellkulturen hergestellt sind, sowie
Impfstoff-Zwischenprodukten, die virale DNA oder RNA in einer Proteinhülle enthalten.
5
5
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Pulse aus mehreren Richtungen auf
die Flüssigkeit im Zielbereich einwirken.
31. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 zum Herstellen eines Impfstoffes mit abgetöteten Viren, dadurch
gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte enthält: (a)Herstellen einer Viren enthaltenden Lösung, deren Viren
Nukleinsäuren in Tryptophan-haltigen Hüllen aufweisen;
(b) Bestrahlen der Lösung in dünner Schicht im Zielbereich der Strahlung mit einem oder einer Folge von Erstpulsen
einer Wellenlänge zwischen 220 und 280 nm, einer Einzel-
—8
pulsdauer von weniger als 2x10 Sek./Puls, und einer Gesamtintensität
des Pulses bzw. der Pulsfolge im ersten Wellenlängenbereich von 1x10 bis 1x10 Photonen/cm2 ;
und (c) Bestrahlen der genannten Schicht im Zielbereich mit einem oder einer Folge von Zweitpulsen höherer Intensität
und einer Wellenlänge im Bereich von etwa 350 nm oder
—8
mehr, einer Dauer von weniger als 2x10 Sek. und einer
Gesamtintensität des Pulses bzw. der Pulsfolge im genannten
1 5 zweiten Wellenlängenbereich von wenigstens 1x10 Photonen/
cm2, wobei jeder der Zweitpulse bzw. Pulsfolgen den Zielbereich
in weniger als 1 Mikrosekunde nach dem Erstpuls bzw. der Erstpulsfolge erreicht, um so den Nukleinsäureanteil
des genannten Virus zu desaktivieren, während die Proteinhülle in ihrer Funktionalität weitgehend erhalten bleibt.
32. Verfahren zum Herstellen von Tryptophan enthaltenden Proteinen, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:
(a) Herstellen Tryptophan-haltiger Proteine mittels Säugetierzellkulturen; (b) Ernten der genannten
Proteine durch Einbringen in ein geeignetes Medium;
und (c) Desaktivieren der in das Medium gelangten Nukleinsäure-Komponenten
durch Einwirkung einer Mehrzahl von hochintensiven Laserpulsen verschiedener, bestimmter
Wellenlängen, welche von Nukleinsäuren im Grundzustand und im angeregten Zustand absorbiert werden, um so deren
photolytische Reaktion auszulösen, wodurch ein Proteinreiches Endprodukt hergestellt wird, das frei von Nukleinsäuren
ist.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der zur Desaktivierung der Nukleinsäuren dienende
Verfahrensschritt darin besteht, daß das Medium mit einem Erstpuls bzw. einer Folge von Erstpulsen mit einer ersten
Wellenlänge bestrahlt wird, dessen bzw. deren Intensität ausreicht, um einen Teil der Nukleinsäuren aus dem Grundzustand
in einen angeregten Zustand anzuheben, die jedoch nicht ausreicht, um die Funktionalität der anwesenden Proteine
wesentlich einzuschränken.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium während des Anregungszustandes der
Nukleinsäuren mit einem Zweitpuls bzw. einer Folge von Zweitpulsen bestrahlt wird, der bzw. die von den Nukleinsäuren
im angeregten Zustand absorhiert wird bzw. werden, wobei diese in einen noch höheren, eine photolytische Reaktion
auslösenden Energiezustand angehoben werden, während die Zweitpulsstrahlung von den Proteinen in keinem
Energiezustand wesentlich absorbiert wird, so daß keine nennenswerten photolytischen Reaktionen der Proteine eintreten.
35. Ein biologisches Medium bzw. eine solche Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß dies bzw. diese entsprechend
dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 18 behandelt wird.
36. Ein Blutbestandteil oder Blut, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Produkt entsprechend den Verfahren
nach den Ansprüchen 1 bis 18 bzw. 29 und 30 behandelt wird.
37. Ein Virusimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß dieser entsprechend den Verfahren nach den Ansprüchen
bis 18 und 31 bis 34 behandelt wird.
38. Ein Proteinprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß dieses entsprechend den Verfahren nach den Ansprüchen
bis 34 behandelt wird.
39. Ein Plasmaproteine enthaltender Blutbestandteil, dadurch gekennzeichnet, daß dieser entsprechend den Verfahren
nach den Ansprüchen 1 bis 30 behandelt wird.
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