DE3419823A1

DE3419823A1 - Process and device for the preliminary purification and concentration of particles from cells

Info

Publication number: DE3419823A1
Application number: DE19843419823
Authority: DE
Inventors: Klaus 8060 Dachau Müller
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1984-05-26
Filing date: 1984-05-26
Publication date: 1985-11-28
Also published as: DE3419823C2

Abstract

The invention relates to a process for the preliminary purification and concentration of the particles released from disrupted cells, and to a device for carrying out the same. The object on which the invention is based is to provide a process and devices with which an improved isolation and concentration of particles (e.g. chloroplasts) from a cell homogenate is made possible in a single working step, specifically by separating the particles on the basis of their different sizes. The achievement is characterised in that the cell homogenate is loaded onto a filtering layer which consists of spheres of a particular diameter, and in that a centrifugal force is applied to the cell homogenate together with the filtering layer, resulting in a separation of particles according to size.

Description

Verfahren und Einrichtung zurProcedure and facility for

Vorreinigung und Anreicherung von Partikeln aus Zellen Verfahren und Einrichtung zur Vorreinigung und Anreicherung von Partikeln aus Zellen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorreinigung und Anreicherung der aus aufgebrochenen Zellen freigesetzten Partikeln sowie eine Einrichtung zur Durchführung desselben.Pre-cleaning and enrichment of particles from cells procedure and device for pre-cleaning and enrichment of particles from cells. The invention relates to a process for pre-cleaning and enrichment of the broken up Cells released particles and a device for carrying out the same.

Die Belastung der Umwelt mit Schadstoffen nimmt vor allem in den Industriestaaten immer mehr zu. Cadmium als eines der ökologisch bedeutendsten Umweltgifte (z.B. Stove et al, 1972) wird durch Industrie, Straßenverkehr, häusliche Abfälle und auch durch Verwendung von Klärschlämmen und Düngemitteln in der Landwirtschaft verbreitet.The pollution of the environment with pollutants increases especially in the industrialized countries more and more to. Cadmium as one of the most ecologically important environmental toxins (e.g. Stove et al, 1972) is used by industry, road transport, and domestic waste as well widespread through the use of sewage sludge and fertilizers in agriculture.

Aufgrund der langen Verweilzeit des Cd im Boden (z.B.Due to the long residence time of the Cd in the soil (e.g.

20 Jahre in Waldboden), Pflanze, Tier und Mensch ist mit einer fortschreitenden Konzentration zu rechnen; bereits jetzt sind lt. UBA-Bericht (Anonymus 1980) gesundheitliche Schäden für den Menschen nicht mehr auszuschließen. Die Festsetzung von Grenzwerten für Emissionen darf sich deshalb nicht wie bisher nach dem Stand der Technik richten, sondern nach den tatsächlichen individuellen Belastungsgrenzen der biologischen Systeme.20 years in forest floor), plant, animal and man is progressing with a Concentration to be expected; According to the UBA report (Anonymous 1980) there are already health-related Damage to humans can no longer be ruled out. The setting of limit values emissions must therefore not be based on the state of the art as before, but according to the actual individual exposure limits of the biological Systems.

Als Kriterium für die zu ergreifenden Maßnahmen zur Abwendung von ökologischen Schäden sind die bisherigen Kenntnisse kaum ausreichend: Viele der bis jetzt veröffentlichten Experimente wurden bei unrealistisch hohen Cd-Konzentrationen durchgeführt; anhand der Ergebnisse kann zwar das Spektrum aller denkbaren Cd-Wirkungen erfaßt werden. Die ersten in einem Ökosystem auftretenden Effekte können damit aber nicht ermittelt werden. Ein Extrapolieren der so ermittelten Daten auf die ökologisch bedeutsamen Konzentrationsbereiche erlaubt keine signifikanten Aussagen, da auf diese Weise die vielfältigen, z.T. ausgeprägten Wechselwirkungen des Cd mit anderen Faktoren unberücksichtigt bleiben.As a criterion for the measures to be taken to avert The previous knowledge is hardly sufficient for ecological damage: many of the Experiments published to date have been performed at unrealistically high Cd concentrations carried out; based on the results, the spectrum of all conceivable Cd effects can be detected. The first to appear in an ecosystem However, effects cannot be determined with it. An extrapolation of the thus determined Data on the ecologically significant concentration ranges does not allow any significant Statements, since in this way the diverse, partly pronounced interactions of the CD with other factors are not taken into account.

Es war daher notwendig, an einer aquatischen Organismenart, der photosynthetisch aktiven, einzelligen Alge Euglena gracilis, die ersten erkennbaren Schadwirkungen von Cd und deren physioligische Ursachen in den Zellen festzustellen. Für die in diesem Rahmen zu bestimmende räumliche und zeitliche Verteilung des Cd innerhalb der Zelle zu untersuchen, waren die bisher bekannten und verwendeten Verfahren ungeeignet.It was therefore necessary to work on an aquatic species of organism that is photosynthetic active, unicellular alga Euglena gracilis, the first recognizable harmful effects of Cd and its physiological causes in the cells to be determined. For the in Spatial and temporal distribution of the CD within this framework to be determined To examine the cell, the previously known and used methods were unsuitable.

Nahezu alle bekannten Verfahren zur Reinigung und Anreicherung von Chloroplasten bestehen nämlich aus zwei verschiedenen Zentrifugationsschritten (z.B. Robinson & Stocking, 1968). Im ersten Schritt nach dem Aufschluß der Zellen werden die Chloroplasten sedimentiert; manchmal erst noch eine Sedimentierung der Zellhüllen und größeren Zellbruchstücke vorgeschaltet. Der zweite Schritt besteht in einer isopyknischen Zentrifugation in einem Dichtegradienten (meist Saccharose, Sorbit, Ficoll, Dextran, Silikagel oder Percoll) mit anschliessender Fraktionierung des Gradienten, der Zonen von Chloroplasten mit unterschiedlichem Intaktheitsgrad enthält.Almost all known processes for the purification and enrichment of Chloroplasts consist of two different centrifugation steps (e.g. Robinson & Stocking, 1968). In the first step after the cells have been disrupted the chloroplasts are sedimented; sometimes a sedimentation of the Cell envelopes and larger cell fragments are connected upstream. The second step is in an isopycnic centrifugation in a density gradient (usually sucrose, Sorbitol, Ficoll, Dextran, silica gel or Percoll) with subsequent fractionation of the gradient, the zones of chloroplasts with different degrees of intactness contains.

Zur Isolierung und Anreicherung von Chloroplasten (Zellorganellen, d.h. Unterstrukturen der Zelle, in der die Photosynthesereaktionen ablaufen) und anderer Zellpartikein mußte demnach ein neues Verfahren entwickelt werden, bei dem eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleistet ist und artifizielle Veränderungen der Cd-Gehalte während der Gewinnung der Zellorganellen auszuschließen bzw. quantitativ zu bestimmen sind. Zur Ermittlung der Aufnahmegeschwindigkeit von Cd in die Chloroplasten mußte außerdem eine schneller durchführbare Gewinnungsmethode gefunden werden.For the isolation and enrichment of chloroplasts (cell organelles, i.e. substructures of the cell in which the photosynthetic reactions take place) and of other cell particles, a new process had to be developed in which a very good reproducibility of the results is guaranteed and artificial Rule out changes in the Cd content during the extraction of the cell organelles or to be determined quantitatively. To determine the recording speed of Cd in the chloroplasts also had to be extracted more quickly being found.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand nunmehr darin, ein Verfahren und Einrichtungen zu bieten, mit denen eine verbesserte Isolierung und Anreicherung von Partikeln (z.B. Chloroplasten) aus Zellhomogenat in einem einzigen Arbeitsschritt ermöglicht wird und zwar durch eine Trennung der Teilchen aufgrund ihrer unterschiedlichen Größen.The object on which the invention is based now consisted in a method and facilities to provide that improved insulation and accumulation of particles (e.g. chloroplasts) from cell homogenate in a single Work step is made possible by a separation of the particles due to their different sizes.

Die Lösung ist in den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 beschrieben.The solution is described in the characterizing features of claim 1.

Die weiteren Ansprüche geben vorteilhafte Einrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an.The further claims give advantageous devices for implementation of the method according to the invention.

Zur Vorreinigung und Anreicherung der aus den aufgebrochenen Zellen freigesetzten Chloroplasten wurde demnach erfindungsgemäß ein Verfahren entwickelt, durch das in einem Arbeitsschritt die nicht aufgeschlossenen Zellen, Zellhüllen und größeren Zellbruchstücke abgetrennt und die Chloroplasten sedimentiert werden. Dabei wird durch Zentrifugieren das Zelihomogenat vorzugsweise durch eine Glasperlenschicht filtriert. Abhängig von der gewählten Größe der Glasperlen werden die größeren Partikeln an der Oberfläche der Glasperlenschicht zurückgehalten, die Chloroplasten sowie kleinere Teilchen passieren die Glasperlen. Bei geeigneter Zentrifugationsdauer und -beschleunigung werden die Chloroplasten im Sediment angereichert und die kleineren Partikeln bleiben im Uberstand. Die resuspendierten Chloroplasten werden danach durch Dichtegradientenzentrifugation nachgereinigt.For pre-cleaning and enrichment of the broken cells released chloroplasts, a method was therefore developed according to the invention, through which the undigested cells, cell envelopes, in one work step and larger cell fragments are separated and the chloroplasts are sedimented. It will by centrifuging the cell homogenate, preferably through filtered through a layer of glass beads. Depending on the chosen size of the glass beads the larger particles are retained on the surface of the glass bead layer, the chloroplasts and smaller particles pass through the glass beads. With suitable The duration and acceleration of centrifugation accumulate the chloroplasts in the sediment and the smaller particles remain in the supernatant. The resuspended chloroplasts are then purified by density gradient centrifugation.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der Figuren 1 bis 3 sowie der Tabelle näher beschrieben.The invention is illustrated below using an exemplary embodiment described in more detail by means of FIGS. 1 to 3 and the table.

Die Figur 1 zeigt einen Füllzylinder 1, dessen unteres Ende 2 leicht konisch verjüngt ausgebildet ist. In diesem konischen Bereich 2 befindet sich eine Packung 3 aus vorzugsweise Glasperlen 4, deren Größe zwar im vorliegenden Fall gleich ist, aber auch unterschiedlich sein kann, was von den in einem Zellhomogenat 5 enthaltenen Partikeln abhängt.FIG. 1 shows a filling cylinder 1, the lower end 2 of which is slightly is conically tapered. In this conical area 2 there is one Pack 3 of preferably glass beads 4, the size of which is the same in the present case is, but what can also be different from those contained in a cell homogenate 5 Depends on particles.

Dieser Füllzylinder 1 wird auf die Öffnung 6 eines Zentrifugenröhrchens 7 unter Zwischenlage eines Nylonnetzes 8 aufgesetzt. Das Netz 8 bildet die Stützschicht für die Glasperlen 4. Anstelle des Netzes 8 ist es auch denkbar, die untere öffnung des Füllzylinders 1, der vorzugsweise aus Plastikmaterial besteht, auch als Siebboden eines Glaszylinders auszubilden.This filling cylinder 1 is on the opening 6 of a centrifuge tube 7 placed with a nylon net 8 in between. The network 8 forms the support layer for the glass beads 4. Instead of the net 8, it is also conceivable to use the lower opening of the filling cylinder 1, which is preferably made of plastic material, also as a sieve bottom to form a glass cylinder.

Nach dem Einfüllen der Suspension 5, die aus größeren, den zu isolierenden mittelgroßen und kleineren Partikeln sowie dem Suspensionsmedium besteht, in den Füllzylinder 1 stellt sich der in Figur 2 dargestellte Zustand der Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens ein. Die Suspension 5 verweilt auf der Glasperlenpackung 3.After filling in the suspension 5, which consists of larger, the to be isolated medium-sized and smaller particles as well as the suspension medium consists in the Filling cylinder 1 shows the state of the device shown in FIG Implementation of the procedure. The suspension 5 lingers on the glass bead package 3.

Bei der Zentrifugation der kompletten Einrichtung (entsprechend Figur 2) wird der in Figur 3 dargestellte Zustand erreicht (der Füllzylinder 1 mit der Glasperlenpackung 3 ist bereits als vom Zentrifugenröhrchen abgehoben gekennzeichnet): Die größeren Partikeln 11 verbleiben oberhalb der Packung 3, die kleineren und mittleren Teilchen haben die Glasperlen 4 durchdrungen, die mittelgroßen Partikeln befinden sich im Sediment 10, während die kleineren Teilchen im überstand 9 suspendiert sind.When centrifuging the entire device (according to Fig 2) the state shown in Figure 3 is reached (the filling cylinder 1 with the Glass bead pack 3 is already marked as lifted from the centrifuge tube): The larger particles 11 remain above the packing 3, the smaller and medium-sized ones Particles have penetrated the glass beads 4, which are medium-sized particles in the sediment 10, while the smaller particles are suspended in the supernatant 9.

Für die o.a. Aufgabenstellung waren nur die im Sediment 10 angereicherten Partikeln von Interesse. Eine Weiterverwendung der größeren 11 oder der kleineren Partikel 9 ist ebenfalls möglich, da auch diese entsprechend angereichert werden. Außerdem kann die hier im Prinzip dargestellte und getestete Einrichtung auch entsprechend einer Kaskade erweitert werden: Durch übereinandersetzen mehrerer Füllzylinder 1 mit Packungen 3 von Glasperlen verschiedener Größen können mehrere Partikelgrößen gleichzeitig isoliert und angereichert werden.Only those enriched in sediment 10 were used for the above task Particles of interest. A further use of the larger 11 or the smaller one Particles 9 are also possible, since these are also enriched accordingly. In addition, the device shown and tested here in principle can also be used accordingly of a cascade: By stacking several filling cylinders 1 With packs 3 of glass beads of different sizes, several particle sizes can be made be isolated and enriched at the same time.

Im Rahmen der methodischen Untersuchungen zur Isolierung von Chloroplasten aus Euglena gracilis wurden eine häufig für diesen Zweck eingesetzte Methode der Vorreinigung der Cpl-Suspension (2-malige Sedimentation) mit der neu entwickelten verglichen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle gegenübergestellt. Chlorophyll dient hier als Marker für die Chloroplasten.As part of the methodical studies for the isolation of chloroplasts from Euglena gracilis a method often used for this purpose became Pre-cleaning of the CPL suspension (2-time sedimentation) with the newly developed compared. The results are compared in the table. Chlorophyll is used here as a marker for the chloroplasts.

In der Tabelle sind unter Methode "A" die absoluten und relativen Chlorophyllausbeuten aus vier typischen Chloroplastenisolierungen nach der normalen Methode dargestellt. Diese Ergebnisse entsprechen sehr gut den aus der Literatur bekannten Resultaten anderer Experimentatoren. Unter "B" sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Chlorophyllgehalte von 7 verschiedenen Chloroplastenisolierungen nach der erfindungsgemäßen Methode für jede der bei verschiedenen Od- und Zn-Konzentrationen angezogenen Kulturen (Nr. 1 bis 4) angegeben. Zur Demonstration der Qualität des neuen Reinigungsverfahrens wurden alle aus den o.a. Schwermetalluntersuchungen erhaltenen Ergebnisse herangezogen. Damit wird belegt, daß die angegebenen Daten sich nicht nur auf Isolierungen mit optimalem Verlauf beziehen, sondern dem unter Zeitdruck ablaufenden Routineverfahren entsprechen. Die Isolierung nach der neuen Methode "B" ergibt nach der Vorreinigung wie auch nach der Anreicherung im Dichtegradienten und Fraktionierung der Chloroplasten eine etwa 5-fach höhere Ausbeute an Chloraplasten als nach Methode "A". Dies ist auf eine verbesserte Trennung der Chloroplasten von den nicht aufgeschlossenen Zellen und größeren Zellbruchstücken zurückzuführen.In the table under method "A" are the absolute and relative Chlorophyll yields from four typical chloroplast isolations after normal Method shown. These results correspond very well to those from the literature known results of other experimenters. Under "B" are the mean values and Standard deviations of the chlorophyll contents of 7 different chloroplast isolations according to the method according to the invention for each of the different Od and Zn concentrations cultivated cultures (No. 1 to 4) indicated. To demonstrate the quality of the All new cleaning methods were obtained from the above-mentioned heavy metal investigations Results used. This proves that the data given are not refer only to insulations with an optimal course, but to the one under time pressure correspond to running routine procedures. Isolation according to the new method "B" results after the pre-cleaning as well as after the enrichment in the density gradient and fractionating the chloroplasts produces an approximately 5-fold higher yield of chloroplasts than by method "A". This is due to improved separation of the chloroplast from due to the undigested cells and larger cell fragments.

Die Chlorophyllanalysen zeigen, daß das neue Verfahren noch einen weiteren Vorteil bietet: Zwar ist der Chlorophyllgehalt des Rohhomogenats bei Verwendung der Methode "A" ebenfalls gut reproduzierbar, aber der Anteil der nach Durchlaufen des Verfahrens gewonnenen Chloroplasten ist relativ großen Schwankungen unterworfen im Gegensatz zu der neu entwickelten Methode "B", was durch die prozentualen Chlorophyllanteile der Fraktionen, bezogen auf Rohhomogenat, verdeutlicht wird. Die Reproduzierbarkeit der neuen Methode "B" beträgt etwa +10 % ohne Berücksichtigung der unterschiedlichen Anzuchtbedingungen. Dies entspricht ungefähr der statisti schen Streuung der Chlorophyllbestimmungen.The chlorophyll analyzes show that the new method is another offers another advantage: Although the chlorophyll content of the raw homogenate is used method "A" is also easily reproducible, but the proportion of after iterations the chloroplast obtained by the process is subject to relatively large fluctuations in contrast to the newly developed method "B", which is due to the percentage of chlorophyll the fractions, based on raw homogenate, is made clear. The reproducibility the new method "B" is about + 10% without taking into account the different Growing conditions. This roughly corresponds to the statistical spread of the chlorophyll determinations.

Legende zur Tabelle: Vergleich eines üblichen Verfahrens (A) mit einer neu entwickelten Methode (B) zur Vorreinigung der Chloroplastensuspension (Kultur-Nrn. entsprechen verschiedenen, bei der Anzucht der Algenzellen verwendeten Cd-und Zn-Konzentrationen) Methode A: Methode B: 2-malige Sedimentation Glasperlenfiltration K u l t u r - N r . K u l t u r - N r . 1 2 3 4 1 2 3 4 Probenahme aus der jeweils 150 ml jeweils 24 ml Kultur (mg Chlorophyll)1) (mg Chlorophyll)2) Algen- 9,77 8,82 15,4 3,36 1,30 1,19 2,12 1,79 Suspension #0,03 #0,05 #0,18 #0,05 Rohhomo- 0,59 0,62 0,92 0,17 0,34 0,36 0,62 0,57 genat #0,07 #0,03 #0,05 3) gereinigte 0,17 0,11 0,58 0,02 0,16 0,14 0,29 0,23 Cpl #0,08 #0,02 #0,11 #0,08 bezogen auf Algensuspension in %: Rohhomo- genat 6,0 7,1 6,3 5,1 26,2 25,2 29,3 31,8 gereinigte Cpl 1,7 1,2 3,8 0,6 11,5 12,1 13,4 12,6 bezogen auf Rohhomogenat in %: gereinigte Cpl 28 17 63 12 44 48 46 40 1) keine Angabe der Standard-Abw., da nur je 1 Probenahme 2) Mittelw. / Standard-Abw. für jeweils n = 7 Isolierung 3) Mittelwert aus 2 Chl-Analysen (0,50 und 0,62 mg) - Leerseite -Legend to the table: Comparison of a conventional method (A) with a newly developed method (B) for pre-cleaning the chloroplast suspension (culture numbers correspond to different Cd and Zn concentrations used in the cultivation of the algae cells) Method A: Method B: 2-time sedimentation glass bead filtration Culture - N o. Culture - N o. 1 2 3 4 1 2 3 4 sampling from each 150 ml each 24 ml Culture (mg chlorophyll) 1) (mg chlorophyll) 2) Algae 9.77 8.82 15.4 3.36 1.30 1.19 2.12 1.79 Suspension # 0.03 # 0.05 # 0.18 # 0.05 Raw homo- 0.59 0.62 0.92 0.17 0.34 0.36 0.62 0.57 genat # 0.07 # 0.03 # 0.05 3) Purified 0.17 0.11 0.58 0.02 0.16 0.14 0.29 0.23 Cpl # 0.08 # 0.02 # 0.11 # 0.08 based on algae suspension in%: Raw homo- genat 6.0 7.1 6.3 5.1 26.2 25.2 29.3 31.8 cleaned Cpl 1.7 1.2 3.8 0.6 11.5 12.1 13.4 12.6 based on raw homogenate in%: cleaned Cpl 28 17 63 12 44 48 46 40 1) No specification of the standard deviation, since only 1 sample is taken each 2) Average. / Standard dev. for each n = 7 isolation 3) Mean value from 2 Chl analyzes (0.50 and 0.62 mg) - blank page -

Claims

Claims: 1. Process for pre-cleaning and enrichment of Subcellular particles released from broken cells, characterized in that that the cell homogenate (5) is applied to a filter layer (3) which consists of Balls (4) of a certain diameter, and that common to the Zelihomogenat (5) a centrifugal force is exerted with the filter layer (3), whereby a separation of particles (9 - left) according to size.

2. Device for performing the method according to claim 1, characterized through a) a centrifuge tube (7), b) a filling cylinder (1) for the cell homogenate (5; 9-11) and the balls (4), the filling cylinder (1) on the opening of the centrifuge tube (7) can be placed, and c) a sieve (8) as a holder for the balls (3, 4) between the filling cylinder (1) and the centrifuge tube (7).

3. Device according to claim 2, characterized in that the filling cylinder (1) is closed at its lower opening by means of the sieve (8).

4. Device according to claim 2, characterized in that between the filling cylinder (1) and the centrifuge tube (7) a net (8) is clamped.

5. Device according to claim 2 or 3 or 4, characterized in that that the balls (4) are made of glass of a predetermined size.