DE3329892A1 - Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden - Google Patents

Description

Glawe, DeIfs, Moll & Partner - ρ 10936/83 - Seite 7

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden der im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel I. Die erfindungsgemäß hergestellten Oligonucleotide weisen definierte Sequenzen auf und können als spezifische Primer und Probes eingesetzt werden bzw. sind für die Synthese kompletter Gene von großer Bedeutung (Arzneimittelforschung 3Ό, 3a, 548, (1980)).

Oligonucleotide werden nach dem neusten Stand der Technik entweder nach der Phosphat- oder Phosphittriestermethode unter Verwendung polymerer Träger hergestellt (Nachr. Chem. Tech. Lab. 2S^, 230 (1981)). Um definierte Sequenzen aufbauen zu können, müssen die einzelnen Bausteine (Nucleoside bzw. Nucleotide) mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden. Hier werden für den Schutz der exocyclischen Aminogruppen der heterocyclischen Nucleobasen allgemein basenlabile Acylgruppen, für die Verankerung der Oligonucleotidkette mit dem polymeren Träger in üblicher Weise eine basenlabile Esterbindung und für den Schutz der primären 5'-OH-Gruppe die säurelabilen Tritylethergruppen verwendet. Als Phosphatschutzgruppe der Phosphattriester-Methode wird üblicherweise entweder die 2-Chlorphenyl- oder 4-Chlorphenylgruppe in esterartiger Bindung verwendet, die nur durch den Angriff einer Base oder eines Nucleophils am Phosphoratom entfernt werden kann. Ein solcher Schritt ist an sich unerwünscht, da damit

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• β-

die Gefahr einer Spaltung der internucleotidischen Phosphatesterbindung gegeben ist. Diese Gefahr wurde durch die Verwendung von Oximat-Anionen (Tetrahedron Lett. J_9, 2727 (1978)) stark reduziert, obwohl diese auch im entscheidenden Schritt in unerwünschter Weise am Phosphoratom angreifen und darüberhinaus den Nachteil aufweisen, daß eine verhältnismäßig geringe Menge an erwünschtem Oligonucleotid mit sehr großen Mengen an nicht flüchtigen und schwer extrahierbaren Salzen verunreinigt ist. Dies erschwert nicht nur die Aufarbeitung und nachfolgende Reinigung des synthetisierten Oligonucleotids,sondern führt auch zu erheblichen Substanzverlusten .

In der Phosphittriester-Methode wird üblicherweise die Methylgruppe in esterartiger Bindung als Phosphatschutzgruppe verwendet, die durch Angriff eines Nucleophils am Methyl-C-Atom entfernt werden kann (J. Amer. Chem. Soc. 99^, 3526 (1977)). Da ein Angriff am P-Atom vermieden wird, wird die Gefahr einer Spaltung der Internucleotidbindung ebenfalls vermieden. Als Nucleophil wird üblicherweise Thiophenol/Triethylamin verwendet, die unangenehm zu handhaben sind und außerdem zu nicht flüchtigen, schwer extrahierbaren Verbindungen führen, die - wie oben erwähnt - sowohl die Aufarbeitung erschweren als auch zu erheblichen Materialverlusten führen.

Obwohl die eigentliche Synthese von Oligonucleotiden nach der Festphasen-Phosphit - bzw. Phophattriester-Methode recht effizient und schnell verläuft, ist die Herstellung von Oligonucleotiden definierter Sequenz nach wie vor sehr zeitaufwendig. Dies liegt vor allem an den Problemen der nachfolgenden Aufarbeitung und Reinigung, die ein Mehrfaches der eigentlichen Synthesezeit beanspruchen. An diesem Punkt setzt das Verfahren der Erfindung ein, das hier

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eine entscheidende technische Verbesserung bietet.

Um zu Verbindungen der im Anspruch 1 angegebenen Formel I zu gelangen, in denen B eine Nucleobase, z.B. Adenin (A), Guanin (G) , Cytosin (C) , Thymin (T) oder üracü (U) oder deren Analoga und R Wasserstoff, Hydroxyl bzw. mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sowie η eine ganze Zahl von 1 bis 200 bedeuten, sind erfindungsgemäß verschiedene, definierte Reaktionsschritte durchzuführen:

^a) Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II.

R der allgemeinen Formel II kann Wasserstoff sein; es handelt sich dann bei den Verbindungen der Formel I um Oligodesoxynucleotide. Die Gruppe R kann auch Hydoxyl- oder gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sein. Derartige Schutzgruppen sind z.B. Trityl, Itonoinetiioxytrityl _una Dimethoxytrityl, Acyl, z.B. Acetyl, Benzoyl; Tetrahydropyranyl, Methoxytetrahydropyranyl > o-Nitrobenzyl sowie Silylether wie z.B. t-Butyl-Diphenylsilylether. Eine allgemeine Übersicht über in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppen findet sich z.B. in Tetrahedron 1981, Seite 363 - 369, Liebigs Ann. Chem. 1978, 839 - 850, sowie Nucleic Acids Research, Symposium Series No. 7, 1980, 39 - 59.

2
R ist ebenfalls eine in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe gemäß den vorgenannten Veröffentlichungen, vorzugsweise die säurelabile 4,4-Dimethoxy- oder 4,4,4-Trimethoxytritylgruppe. B¹ kann ebenfalls eine in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe gemäß den oben genannten Vorveröffentlichungen aufweisen.

.. .10

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Das Nucleosid der Formel II wird erfindungsgemäß mit einem Phosphinderivat der allgemeinen Formel III gemäß Anspruch 1 umgesetzt.

In der allgemeinen Formel bedeutet X Chlor, Brom, CN oder SCN; L bedeutet Chlor, Brom, CN, SCN oder einen Aminrest

4 4

der Formel -NIL· (Formel VIII), wobei die Gruppen R primäre, sekundäre oder tertiäre Alkyreste mit 1-10 Kohlenstoffatomen sind oder zusammen einen Cycloalkylrest mit 5-7 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls mit AUcykverzweigungen,und/oder einem oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefelatomen als Heteroatome enthalten kann,bedeuten. Die Gruppe L kann auch einen reaktiven heterocyclischen Rest bilden, der Imidazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, 3-Nitro-1,2,4-triazolyl, Thiazolyl, Pyrrolyl, Benztriazolyl (gegebenenfalls mit Substituenten im Phenylrest) oder Benzhydroxytriazolyl (gegebenenfalls mit Substituenten im Phenylring) und dergleichen bilden.

R des Phosphinderivats der allgemeinen Formel (III) ist erfindungsgemäß eine mit Hilfe von Basen durch ß-Eliminierung entfernbare Gruppe der allgemeinen Formel VII, in der Y Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet. Z stellt eine elektronenziehende Gruppe dar, z.B. Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, CN, NO₂, CF₃, CCl₃ oder CBr₃. Z kann weiterhin Phenyl, Phenylthio, Phenylsulfoxy oder Phenylsulfonyl bedeuten, wobei die Phenylreste in o, o¹-Stellung und/oder p-Stellung mit Halogen, CN oder NO₂ substituiert sein können.

Die Umsetzung gemäß Schritt a erfolgt in Gegenwart einer organischen Base.

b) Umsetzung des in Schritt a erhaltenen Nucleosidphosphorigsäure-Derivates der Formel IV.

...11

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. AA-

Die Umsetzung der Verbindung gemäß Formel IV erfolgt mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V gemäß Anspruch 1. Es können lösliche oder unlösliche, d.h. vernetzte, polymere Träger verwendet werden, z.B. modifiziertes Silicagel, Glas, insbesondere "controlled pore glass", Polyester, Polyamid, Polyvinylalkohol, Polysiloxan, Polystyrol oder dergleichen. Als Verankerungsfunktion zwischen Träger und Nucleosid kommen vorzugsweise Esterbindungen in Betracht, einschließlich solcher, die sich von Lävulinyl- oder ß-Benzoylpropionylrest ableiten; die letztgenannten Esterbindungen können unter neutralen Bedingungen mit Hydrazin gespalten werden. Auch die säurelabile Trityletherbindung, gegebenenfalls mit Substiuenten in den Phenylringen, kommt als Verankerungsmöglichkeit in Betracht, vgl. Liebigs Ann. Chem. 1974, 959.

c) Oxidation des in Stufe b erhaltenen trägergebundenen Nucleotidonucleosids der allgemeinen Formel VI.

Die Oxidation führt zu einer Phosphatgruppe; sie kann z.B. mit Jod/H^O, H₃O₂ oder organischen Persäuren oder allgemein durch Oxidation durch Einführung von O, S oder Se durchgeführt werden.

d) Maskierung freier primärer 5'-OH-Gruppen, die bei der Reaktion gemäß Stufe b (im Produkt der Formel V) nicht umgesetzt wurden.

Diese freien Hydroxylgruppen werden mit einer permanenten Schutzgruppe maskiert, z.B. durch Reaktion mit Acetanhydrid.

e) Abspaltung der Schutzgruppe(n) R

Die Abspaltung erfolgt beispielsweise unter Verwendung

. ..12

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ja· ■

einer Protonsäure oder Lewissäure wie ZnBr₀ oder Dialkyl-

aluminiumchlorid, wenn R eine Tritylgruppe oder Methoxyderivat derselben darstellt.

f) Einführung weiterer Nucleosidphosphat- oder Oligonucleosidphosphateinheiten.

Die Stufen a - e können wiederholt werden, wobei mindestens ein Nucleosidphosphatrest eingeführt wird. Beim Einsatz von Oligonucleosidphosphateinheiten werden selbstverständlich Kettenverlängerungen um mehr als eine Nucleosidphosphateinheit erreicht.

g) Abspaltung sämtlicher Schutzgruppen

Diese Abspaltung kann in der Weise erfolgen, daß mit wässrigem Ammoniak in einem Schritt die N-Acylgruppen der heterocyclischen Basen, die Esterbindung zwischen Oligonucleotid und Träger (gegebenenfalls kann letztere unter neutralen Bedingungen auch mit Hydrazin gespalten werden) und die Phosphatschutzgruppe gemäß dem allgemeinen Schema 1 am Schluß der Beschreibung durch ß-Eliminierung abgespalten werden. Es wird dann ein Oligonucleotid mit nur 5'-terminaler Tritylschutzgruppe erhalten, das in an sich bekannter Weise nach Entfernung der flüchtigen Base (Ammoniak) direkt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an "reversed phase"-Material gereinigt werden kann.

Die Zwischenprodukte der allgemeinen Formel IV gemäß Anspruch 1 stellen neue Verbindungen dar. Sie liegen in Form recht stabiler, in reiner Form darstellbarer Verbindungen vor, sind leicht zu handhaben und dennoch recht reaktiv im Sinne der Knüpfung von Internucleotidbindungen. Der Einsatz von R als eine durch Basen über ß-Eliminierung

...13

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entfernbare Schutzgruppe ermöglicht es zum ersten Mal, bis auf die 5'-Tritylgruppe alle Schutzgruppen in einem Schritt abzuspalten, wobei vorteilhafterweise durch Verwendung flüchtiger Basen das gewünschte Oligonucleotid in nur sehr geringem Maße mit Fremdstoffen verunreinigt ist und damit direkt nachfolgend durch die noch vorhandene hydrophobe 5'-Tritylgruppe über "reversed phase"-HPLC gereinigt werden kann.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ergibt sich daraus, daß durch die Entfernung der Schutzgruppe durch ß-Eliminierung kein Angriff am P-Atom erfolgt und damit an keiner der neu geknüpften Internucleotidbindungen während des Entschützens gespalten werden kann. Das Verfahren der Erfindung führt damit bei stark reduziertem Zeitaufwand zu insgesamt reineren Produkten als die bisher verfügbaren Verfahren.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, wobei Phophinderivate zur Anwendung kommen, in denen R ein ß-Cyanethy!gruppe ist. Einzelheiten der Reaktion und physiklische Kenndaten der hergestellten Verbindungen ergeben sich aus den Schemata 2 und 3, der Tabelle 1, sowie den Figuren 1 - 7 am Schluß der Beschreibung.

Beispiel 1:

Herstellung von Phosphinderivaten der allgemeinen Formel III:

Monochlor-ß-cyanethyl-phosphoramidite:

Eine allgemeine Übersicht über die Reaktion ist aus Schema ersichtlicht.

Dichlor-ß-cyanethoxyphosphin (1_) wird mit einigen Verbesserungen

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im übrigen jedoch wie in Can. J. Chem. J58, 2686 (1980)) dargestellt:

137,5 g (1,0 Mol) PCl₃ werden in einem Dreihalskolben mit Tropftrichter mit 300 ml Ether und 79_f0 g (1 Mol) Pyridin versetzt; die Mischung wird auf -78° unter Argon abgekühlt. Dann wird eine Lösung von 71,0 g (1 Mol) ß-Cyanethanol in 150 ml trockenem Ether tropfenweise über 1 bis 1,5 Stunden gegeben. Das Kältebad wird entfernt; man rührt weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur (unter Umständen werden erneut 300 ml Ether zugegeben, um eine bessere Rührfähigkeit zu gewährleisten). Rührer und Tropftrichter werden unter Argon entfernt; das Gemisch wird über Nacht bei 0⁰C aufbewahrt. Die festen Salze werden unter Argon entfernt; der Niederschlag wird zweimal mit je 75 ml Ether gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden im Vakuum konzentriert; der Rückstand wird schließlich im Vakuum destilliert: Siedepunkt 70 - 75° C/0,4 mm.

Monochlor-ß-cyanethy!phosphoramidite (2) :

Zu einer Lösung des N-trimethylsilylierten sekundären Amins (0,1 Mol) oder sekundären Amin (0,2 Mol) in 30 ml Ether wird tropfenweise bei -20° C unter Argon eine Lösung von 17,2 g (0,1 Mol) ß-Cyanethylphosphordichloridit (JJ in 60 ml Ether im Verlauf von 1 bis 1,5 Stunden zugetropft. Nach 20stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Aminhydrochlorid entfernt; die verbleibende Lösung wird konzentriert. Der Rückstand wird schließlich im Vakuum in einer Kurzwegdestille destilliert.

Die physikalischen Eigenschaften der so erhältlichen Verbindungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

31

Die Figuren 1a, 1b und 1c zeigen P-NMR-Spektren von drei verschiedenen Monochlor-ß-cyanethylphosphoramiditen.

. ..15

Glawe, DeIfs_f Moll & Partner - ρ 10936/83 - Seite ¹^O 298

Das N-Morpholinderivat ist thermisch zu instabil/ um destilliert werden zu können. Die Präparation ist dennoch so rein, daß der Rückstand direkt für die Herstellung der aktivierten Nucleosid-Derivate verwendet werden kann. Die

31 Reinheit ist gewöhnlich entsprechend den P-NMR-Spektren

größer als 95%.
Nucleosid-ß-cyanethylphosphoramidite:

Die Darstellung der entsprechend geschützten Nucleosidß-cyanethylphosphoramidite ist aus Schema 3 ersichtlich.

Die Synthese gelingt in Analogie zu Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981) mit einigen Verbesserungen in guten Ausbeuten.

3.0m Mol des N-geschützten 5'-dimethoxytritylierten Desoxynucleosidswerden mit THF/Toluol azeotrop getrocknet, in 15 ml trocknen THF gelöst und mit 12,0 m Mol N, N₇ N-Diisopropylethylamin zugegeben. Zu dieser Lösung werden unter kräftigem Rühren tropfenweise im Verlauf von 2 Minuten unter Argon 6,0 m Mol des Monochlor-ß-cyanethylphosphoramidits zugefügt. Nach kurzer Zeit (2 bis 5 Minuten) fällt Aminhydrochlorid aus. Die Suspension wird für weitere 30 bis 40 Minuten gerührt. Aminhydrochlorid wird unter Argon abfiltriert und gründlich mit trockenem THF (10bis 15 ml) nachgewaschen. Die gesamte organische Phase wird konzentriert und in Argon-gesättigtem Ethylacetat gelöst (100 ml). Die organische Phase wird zweimal mit je 50 ml Argon-gesättigter 10%-wässriger Natriumcarbonatlösung extrahiert. Die organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zu einem Schaum eingedampft. Der Schaum wird mit wenig Ethylacetat oder Toluol aufgelöst und in η-Hexan bei -78° C gefällt. Die aktivierten Nucleoside sind stabil für mehrere Monate, wenn man sie unter Argon bei -20° C aufbewahrt.

...16

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- JIk-

Figur 2 zeigt das P-NMR-Spektrum eines der aktivierten Desoxynucleoside.

Synthese von d(CGGTACCG)

100 mg "controlled pore glass" (CPG), beladen mit insgesamt 8 μ Mol N-Isobutyryl-desoxyguanin (vgl. Tetrahedron Lett 24, 747 (1983)) wird nacheinander mit den 5'-dimethoxytritylierten N-acylierten ß-Cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen der Desoxynucleoside C, C, A, T, G, G und C kondensiert, wobei jeweils 20 bis 25 Äquivalente des Phosphor amidites in Acetonitril mit jeweils 75-80 Äquivalenten sublimiertem Tetrazol aktiviert werden. Die Kondensationen sind nach längstens 30 Minuten beendet; die Kopplungsausbeute beträgt mehr als 94%. Nach der Kondensation folgt jeweils eine Oxidation mit J₂/H₂O und Maskierung nicht umgesetzter 5'-OH-Gruppen mit Acetanhydrid. Anschließend erfolgt Abspaltung der Dimethoxytritylgruppe entweder mit 3% Trichloressigsäure in Nitromethan/1 % Methanol oder ZnBr₂/Nitromethan/1% H₂O.

Die Gesamtausbeute des geschützten Oktanucleotids am Ende aller Kondensationsschritte beträgt 55%, bezogen auf das trägergebundene Desoxyguanosin.

Die vollständige Entschützung und Abspaltung vom Träger wird in einem Schritt durch Umsetzung der Glasperlen mit konzentriertem wässrigen Ammoniak (3 ml) bei 50° C in 16 Stunden erreicht. Anschließend werden die Glasperlen gründlich mit 50% wässrigem Methanol gewaschen (3 mal mit je 3 ml). Die flüssige Phase wird durch Einengen (Entfernung des Methanols) und Gefriertrocknung entfernt. Anschließend wird ein Aliquot nach Filtration durch Millipore-Filter durch HPLC an RP 18 gereinigt, wie aus Figur 3 ersichtlich ist.

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- Λ-

Die Fraktionen, die das 5·-dimethoxytritylierte Oligonucleotid enthalten, werden gesammelt; der flüchtige Puffer wird im Vakuum ^ara Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird mit 1 ml 80%-iger Essigsäure versetzt. Die Essigsäure wird nach 45 Minuten bei Raumtemperatur durch Gefriertrocknung entfernt.

Das so erhaltene Material wird in üblicherweise (Liebigs Ann. Chem. 1978, 982) mit T4-Polynucleotidkinase und γ- P-ATP phosphoryliert. Das erhaltene Produkt wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese im Vergleich zu einem Homo-oligodT-Wellenlängenstandard (Nucleic Acids Res. £, 2096 (1979) (Figur 4) und gemäß Figur 5 durch Sequenzierung (Liebigs Ann. Chem. 1978, 982) charakterisiert.

Die Figuren 6a bis 6c zeigen die Ergebnisse (HPLC, Gelelektrophorese, Sequenzierung) der Synthese von d (GGGATCCC) unter Verwendung der Nucleosid-ß-cyanethyl-N^-dimethylphosphoamidite. Die Figuren 7a bis 7c zeigen die Ergebnisse (HPLC, Gelelektrophorese, Sequenzierung der Synthese von d (GGGATATCCC) unter Verwendung der

Nucleosid-ß-cyanethyl-N-morpholinophosphoamidite.

Die in den Figuren 3, 6a und 7a wiedergegebenen Ergebnisse wurden durch Anwendung eines Gradienten von 10 -25 Vol.-% CH₃CN, 5 min., und 25 - 29 Vol.-% CH₃CN, 30 min. in 0,1 M Triethylammoniumacetat bei pH 7,0 erhalten.

. ..18

uctL-tiii vuii nuuutiuxuL -u -yyan« uiy xpiiujJiiuLaiiaui

1) fü*

Verbindung 3a 3b 3c s;

L = Ν,Ν-Dimethylamino L = Ν,Ν-Diisopropylamino L = N-Morpholino ·?

Siedepunkt 90-92°/0.6 mm 103-5°/0.08 mm ^

Chemischer Shift²* . ' g

für ³¹P-NMR in 175,97 ppm 179,82 ppm 168,22 ppm η

CH₃CN *

Chemischer Shift 4.01, 4.17 (2t, P-OCH₂,2H) 4.02, 4.2 (2t, POCH₂,2H) 3.96, 4.1 (2t, POCH₂,2Η)

für ¹H-NMR in ppm 2.71 (t,-CHg-CN ,2H) 3.8 (m,N(CH)₂,2H) 3.67 (t,0(CH₂J₂,4H)

2.77 (t,-CH₂CN,2H) 3.17 (m,P-N(CH₂J₂,4H)

2.7 (d,N(CH₃J₂,6H) 1.29 (d,N-CH(CH₃J₂,12H) 2.74 (t,CH₂-CN₂,2H)

Massenspektrum (2L)⁺=I₈O, 182 (+2), 145 (|)⁺=236, 238 (+2), 201 (|)⁺=222, 224 (+2), 187

(-Cl), 136 (-C₂H₆N), 110 (-Cl), 166 (-C₃H₄NO), (-Cl), 152 (-C₃H₄NO), (-C₃H₄NO) 136 (-C₆H₁₄N) 136 (-C₄H₈O)

1 ) ' Das Rohprodukt weist nach Abtrennung von Aminhydrochlorid und von im Hochvakuum bei.

31
Raumtemperatur flüchtigen Verbindungen nach dem P-NMR-Spektrum eine Reinheit von

93-95% auf. CO

Die chemischen Shifts sind in Aceton-d_g mit 80%-iger H₃PO₄ als externem Standard gemessen.

to O

Schema 1. 3

Entfernung der Gruppe R durch ß-Eliminierung. _o

(D H hh

I O)

I H

YYO YY O S"

ι ι r* I ·' ' ©Ι φ -8

Z-C-C-O-P=O > Z-C=C-Y + 0-P=O+ BH '

HYO O ^ ¹O

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ro co αϊ co ro

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Claims (3)

1. GLAWE, DELFS₁ MOLL & PARTNER

   Prof. Dr. Hubert Köster Hamburg

   Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden

   ρ 10936/83
   M/US

   PATENTANWÄLTE

   ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT

   RICHARD GUWE KUUS DELFS DR-ING. DIPL-ING. ULRICH MENGDEHL WALTER MOLL Dia.-CHEM.DR.RER.NAT DIPL-PHYS. DR. RER. NAT HEINRICH NIEBUHR OFF. BEST. DOLMETSCHER DIPL.-PHYS. DR. PHIL. HABIL 8000 MÜNCHEN 26 ZOOO HAMBURG 13 POSTFACH 162 POSTFACH 25 70 LIEBHERRSTR. 20 ROTHENBAUM- TEL. (089)22 6548 CHAUSSEE 58 TELEX 5 22 505 SPEZ TEL (040! 410 20 08 TELECOPIER (089) 223938 TELEX 21 29 21SPEZ HAMBURG

   Patentansprüche

   M.JVerfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden der allgemeinen Formel I

   (I)

   in der

   B eine Nucleobase,

   R Wasserstoff, Hydroxyl oder mit in der Nucleotidchemie

   Glawe, DeIf s, Moll & 5ar£jier -ρ .irO93£/&3 - Seite 2

   3329832

   üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl und η eine ganze Zahl von 1 - 200 bedeuten, mit den folgenden Reaktionsschritten:

   a) Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II

   ^r2°-]/OsJ (id

   OH R⁴

   in der

   R wie oben definiert ist, sowie

   2
   R eine in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe und

   B¹ die gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschützte Nucleobase B bedeuten,

   mit einem Phosphinderivat der allgemeinen Formel III

   3 ^ ^Χ

   R-⁵ - O - P (HI)

   in der R eine abspaltbare Schutzgruppe sowie X und L mit Hydroxylgruppen der Zuckerreste der Nucleotide bzw. Nucleoside reagierende Gruppen sind, in Gegenwart

   Glawe, DeIfs, Moll & Partner - ρ 10936/83 - Seite

   einer Base,

   b) Umsetzung des in Schritt a) erhaltenen Nucleotidderivats der Formel IV

   (IV)

   12 3
   in der B¹, R , R , R und L wie oben definiert sind, mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V

   (V)

   in der B' und R wie oben definiert sind und T den polymeren Träger bedeutet,

   Glawe, DeIfs, Moll & Partner - ρ 10936/83 - Seite 4

   c) Oxidation des in Schritt b) erhaltenen trägergebun denen Nucleosidonucleotids der allgemeinen Formel VX

   (VI)

   12 3
   in der B¹, R , R , R und T wie oben definiert sind, unter Ausbildung von Phosphotr!estergruppen.

   d) Maskierung freier primärer 5 -OH-Gruppen, die bei der Reaktion gemäß Schritt b) nicht umgesetzt wurden, mit in der Nucleotidchemie üblichen, permanenten Schutzgruppen ,

   e) Abspaltung der Schutzgruppe R ,

   f) gegebenenfalls ein- oder mehrfache Wiederholung der Schritte a) bis e) zur Einführung weiterer Nucleosidphosphat- oder Oligonucleosidphosphateinheiten, sowie

   g) Spaltung der Nucleosid-Trägerbindung und gegebenenfalls Abspaltung aller in den Oligonucleosidphosphaten

   Glawe, DeIfs, Moll & Partner - ρ 10936/83 - Seite 5

   vorhandenen Schutzgruppen, dadurch gekennzeichnet, daß

   man in Stufe a) als Phosphinderivat der allgemeinen

   3 Formel III eine Verbindung verwendet, in der R eine

   Gruppe der Formel VII

   Y Y
   Il
   Z-C-C- (VII)

   I I

   H Y

   in der

   die Gruppen Y, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Methyl und/oder Ethyl und

   Z eine elektronenziehende Gruppe darstellen, wobei in dem Phosphinderivat der Formel III X Chlor, Brom, CN oder SCN, und

   L Chlor, Brom, CN oder SCN, einen sekundären Aminrest der Formel (VIII)

   - NR2 (VIII)

   wobei die Gruppen R primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylreste mit 1-10 Kohlenstoffatomen sind, oder zusammen einen Cycloalkylrest mit 5-7 Kohlenstoff-

   • .. 6

   Glawe, Delfs, Moll & Partner - ρ 10936/83 - Seite 6

   atomen, der ein oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome als Heteroatome enthalten kann, bilden, oder Imidazol· , Triazol , Tetrazol , 3-Nitro-1,2,4-Triazol , Thiazol-, Pyrrol, Benztriazol, gegebenenfalls substituiert im Phenylrest, oder Benzhydroxytriazol, gegebenenfalls substituiert im Phenyrest, sind,

   bedeuten.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Phosphinderivat der Formel (III) einsetzt, in

   der X Chlor, L eine Ν,Ν-Dimethyl-, -Diethyl- oder -DiLsopro-
3. 3 pylamingruppe oder N-Morpholinogruppe und R eine ß-Cyanethylgruppe ist.