DE3048799A1 - Reagenzstreifen fuer analytische zwecke - Google Patents
Reagenzstreifen fuer analytische zweckeInfo
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Description
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH 2418 +GbrnH
Reagenzstreifen für analytische Zwecke
Die Erfindung betrifft eine neue Methode zur chemischen Analyse von Bestandteilen von Flüssigkeiten, insbesondere
eine neue Form der Zugabe der festen Reagentien, mittels Reagenzstreifen.
Da eine direkte physikalische oder physikochemische Analyse nur in Sonderfällen möglich ist, bildet die
chemische Analyse, d.h. die Zugabe von geeigneten Reagentien und die Bestimmung der dadurch bewirkten Reaktion immer
noch die wichtigste, qualitative und quantitative Untersuchungsmethode für Bestandteile von Flüssigkeiten.
Die Reagentien werden dabei häufig im Überschuß zugegeben, müssen jedoch bei anderen Analysenverfahren, wie einer
kinetischen Bestimmung oder der Maßanalyse, in genauer Dosierung zugefügt werden. Wegen der guten Dosierbarkeit
werden feste Reagentien vor der Zugabe normalerweise in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und ein
aliquoter Teil der Lösung für die Analyse benutzt. Um dem Benutzer das, insbesondere bei mehreren Reagentien,
mühsame Abwiegen und' Lösen zu ersparen, sind solche
Reagenzlösungen in fertiger Form bereits seit langem im Handel erhältlich. Reagentien, die in Lösung miteinander
unverträglich sind, müssen dabei getrennt gelöst und kurz vor der Benutzung vereinigt werden.
Reagentien, "die in Lösung instabil sind, werden üblicherweise als "Reagenztablette" unter Zusatz geeigneter
Tablettierhilfsmittel, oder als Lyophilisat in Ampullen angeboten, die kurz vor der Benutzung durch Zugabe eines
Lösungsmittels zur Reagenzlösung rekonstituiert werden können.
Reagen2tabletten haben dabei den Nachteil, daß sie entweder
bei Bearbeitung und Lagerung durch Abrieb ihre Masse und damit die Menge an Reagentien verändern
können, oder so hart gepreßt werden müssen, daß ihre Wiederauflösung Schwierigkeiten bereitet. Eine Störung
der Analyse durch die Tablettierhilfsstoffe, insbesondere Gleitmittel und Formtrennmittel, schränkt ihre
allgemeine Verwendbarkeit ein.
Die Lyophilisierung von Reagenzlösungen in Ampullen, ist von der Rekonstituierbarkeit her optimal und gestattet
auch miteinander "unverträgliche" Reagentien als "Schichtenlyophilisat" übereinander einzufrieren
und zu trocknen. Das Verfahren ist jedoch sehr aufwendig und teuer.
In der DE-OS 23 o1 999 wurde vorgeschlagen, in Lösung instabile Substanzen dergestalt zu stabilisieren, daß
man einen saugfähigen Träger, beispielsweise Filterpapier, mit der Reagenzlösung tränkt, trocknet oder
lyophilisiert und Stücke geeigneter Größe und damit geeigneter Reagenzmenge auf einem als'faischstäbchen"
dienenden Handgriff, beispielsweise aus Kunststoff, aufklebt. Durch Rühren mit diesem Mischstäbchen in
einer entsprechenden Menge eines Lösungsmittels beziehungsweise der Testflüssigkeit, werden die Reagentien
wieder eluiert und das fertige Analysengemisch erhalten. Obwohl diese Technik im Prinzip brauchbar ist,
zeigt sich, daß von so hergestellten Mischstäbchen nur sehr gut lösliche Stoffe rasch und vollständig abgelöst
werden, die üblichen Reagentien aber unvollständig eluiert werden. Abgesehen davon, daß man dadurch unnötig
große Mengen von Reagentien auf den Träger imprägnieren
muß, ist die eluierte Menge auch noch von den Bedingungen der Elutian ( Zeit, Rührgeschwindigkeit, Temperatur,
Viskosität etc.) abhängig, so daß eine exakte Konzentration
nicht garantiert werden kann.
Es stellte sich deshalb die Aufgabe, die vorerwähnten
"Mischstäbchen" so zu verbessern, daß Reagenzstreifen erhalten werden, von denen sich die Reagentien rasch,
reproduzierbar und möglichst vollständig ablösen lassen.
Erfindungsgemäß wird dies dadurch gelöst, daß der saug-
1-0 fähige Träger nicht auf den Handgriff aufgeklebt, sondern
mit einem darüberllegenden Kunststoffnetz, das auf einander
gegenüberliegenden Seiten des saugfähigen Trägers am Handgriff befestigt ist, angeklemmt wird (Einsiegeln)·
Das Einsiegeln von reagenzhaltigen,saugfähigen Trägern zwischen einem Kunststoffgriff und einem dünnen Netz,
ist bereits in der DE-AS 21 18 455 beschrieben, jedoch wird bei den dort beschriebenen ca. 6 χ 6 mm
großen Testpapieren selbst im Harnstrahl kein "Auswascheffekt" beobachtet (Spalte 3, 76-16). Es ist deshalb
als überraschend anzusehen, daß von einem solchen Reagenzstreifen durch kurzes Rühren in einem Lösungsmittel
die Reagentien praktisch quantitativ eluiert werden, während sie von einem entsprechenden aufgeklebten
Träger (gemäß der DE-OS 23 o1 999), dessen Oberseite für den Zutritt des Lösungsmittels völlig frei
liegt, nur unvollkommen abgelöst v/erden.
Die Ablösungsgeschwindigkeit läßt sich noch steigern, wenn die für die Aufnahme größeren Reagensmengen notwendig
werdenden dickeren Papiere in mehrere Lagen dünner Papiere unterteilt werden, wodurch eine zusätzliche
ORiGINAL INSPECTED
• ·
a u m m
Querdurchströmung bewirkt wird. Solche getrennten Papierlagen können auch dazu dienen, unverträgliche
Reagenzien physikalisch voneinander zu trennen.
Darüberhinaus, kann die Durchströmung und damit die Elutionsgeschwiiidigkeit verbessert werden, wenn zwischen
solche Papierlagen, beziehungsweise zwischen Papier und Handgriff, ein weiteres Kunststoffnetz mit eingeklemmt
wird. Für den Fall, daß in verschiedenen Papierlagen unterschiedliche Reagentien verwendet werden, wird durch
-J0 solche Zwischennetze eine eventuell verbliebene Interaktion
mit Sicherheit ausgeschaltet.
Obwohl auch Naturfaser- oder Metalldrahtnetze vom Prinzip her brauchbar sind, werden wegen der einfachen Verarbeitung
und des günstigeren Preises, erfindungsgemäß bevorzugt Kunststoffnetze, beispielsweise aus Polyamid,
Polyester, PVC etc., zum Einsiegeln und als Zwischen- und Unterlegnetze verwendet. Maschenweiten von 5o - 25o ,u,
vorzugsweise 1oo - 15o yu haben sich für die Abdecknetze
Maschenweiten von 8o - 25o ,u, vorzugsweise 1oo - 2oo ^u
für die Unterlegnetze bewährt. Die Fadenstärken liegen üblicherweise zwischen 1o und 5o /U. Gewebte oder gewirkte
Netze kommen gleicherweise infrage, wobei die Einzelfäden an den Kreuzungspunkten zusätzlich miteinander
verschweißt oder verklebt sein können.
Als saugfähige Träger kommen bevorzugt Papiere oder Vliese aus Baumwolle, Zellstoff, regenerierter Cellulose,
Kunstfasern beispielsweise aus Polyamid, Polyester etc. oder Gemische davon infrage, wobei Materialien die eine
chemische Bindung oder Reaktion oder feste Komplexe mit den Reagentien eingehen, natürlich ausgeschlossen sind.
ORIGINAL INSPECTED
Wegen der leichten Ablösbarkeit und guten Saugfähigkeit, scwie ihrer guten Verarbeitbarkeit auch nach
Imprägnierung mit viel Reagenz, werden Polyamid- und Polyamid-/Cellulose-Papiere besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Reagenzstreifen erlauben auch empfindliche
feste Reagenzien in stabiler Form zu lagern und rasch zur Reagenzlösung zu rekonstituieren. Über die Dicke
und Größe des verwendeten Trägers, sowie die Konzentration der zur. Imprägnierung verwendeten Reagenzlösung, läßt
sich die Reagenzkonzentration in der fertigen Lösung in weiten Bereichen steuern. Bei größerem Reagenzbedarf
lassen sich auch mehrere Papiere über oder nebeneinander an einem Händgriff befestigen. Die Aufteilung der
Reagentien auf mehrere Papierstücke erlaubt es» entsprechende
Reagenzpapiere für unterschiedliche Teste, beispielsweise Puffermischungen, zusammen zu fertigen
und beim Einsiegeln in geeigneter Zusammensetzung zu kombinieren.
Der Aufbau der erfindungsgemäßen Reagenzstreifen ist
beispielhaft in den beigefügten Figuren gezeigt.
Figur 1 zeigt in Seitenansicht (1a) und Aufsicht (1b), einen erfindungsgemäßen Reagenzstreifen mit einem Handgriff
(1), einem Reagenzpapier (2), einem Abdecknetz (3), welches an den Haftstellen (4) mit dem Handgriff verbunden
ist.
Figur 2 zeigt die Seitenansicht, eines Reagenzstreifens
mit zwei getrennten, doppellagigen Reagenzpapieren (2) auf der einen und zwei getrennten einlagigen Reagenzpapieren
(2) auf der anderen Seite des Handgriffs (1).
•as* ··
Figur 5 zeigt einen weiteren Reagenzstreifen, bei dem die Reagenzpapiere durch ein Zwischennetz (6)
getrennt und durch ein Unterlegnetz (7) vom Handgriff (1) abgehoben sind.
Die technische Herstellung der Reagenzstreifen erfolgt zweckmäßig durch kontinuierliches Zusammensiegeln
oder -kleben langer Kunststoff-, Reagenzpapier- und Netzbahnen in einer bekannten Siegelvorrichtung. Das
Auseinan,derschneiden der erhaltenen Bänder in Querrichtung zu Streifen der gewünschten Breite kann in Analogie
zu der in der DE-AS 21 18 455 beschriebenen Weise erfolgen. Für die in den folgenden Beispielen beschriebenen
Teste wurden die Reagenzstreifen entsprechend hergestellt, obwohl sich Labormuster und Kleinserien natürlich
auch durch Befeuchten von vorher hergestellten leeren Reagenzstreifen mit einer abgemessenen Menge einer
Reagenzlösung und anschließendem Trocknen herstellen lassen.
Die Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sollen diese nicht beschränken.
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Reagenzstreifen für die Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GQT) in Serum.
In eine Meßküvette von 1o mm Schichtdicke wird ein
Reagenzstreifen von 7 - 8 cm Länge und 6 mm Breite eingebracht, der in trockener Atmosphäre aufbewahrt, 1 Jahr
bei Raumtemperatur stabil ist und an dessem unteren Ende in zwei von einander getrennten Bezirken je ein Reagenzpapier
mit der Fläche 6 χ 6 mm zwischen einem feinmaschigen Gewebe von ca. 12o u Maschenweite und der
Trägerfolie befestigt sind. Der eine Bezirk enthält o,4 /U Mol Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH),
o,2 mg Na2 CO3 und o,3 mg NaHCO3, der andere Bezirk
enthält 28 ,u Mol s<-Ketoglutarat, 1,7 U Lactatdehydrogenase
(LDH), 1,1 U Malatdehydrogenase (MDH) und o,2 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
(Tris-Puffer). Anschließend wird 2 ml Substrat-Puffergemisch von pH 7,8 ,
das bei Raumtemperatur 1 Jahr haltbar ist und 88 mMol/1 Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
264 mMol/1 L-Asparaginsäure-Na und o,5 g Natriumazid enthält, zugegeben.
Es wird dann o,2 ml Serum zupipettiert, während ca. 5 Sekunden mit dem Reagenzstreifen gut gemischt, dieser
entfernt und bei Raumtemperatur 2 Minuten stehen gelassen.
Die Aktivitäten der Glutamatoxalacetattransaminase (GOT) werden
dann photometrisch bei 334 mm, 34o mm oder 366 mm durch kontinuierliche Registrierung oder Extinktionsablesung
nach bestimmten Zeitintervallen (z.B. jeweils nach 60 Sekunden) gemessen. Soll eine größere Menge Reagenzlösung
etwa 1o ml für eine Serienmessung hergestellt werden, so gelingt dies einfach durch Vervielfachen der
r-
Flächen von ο,56 cm" mit der beschriebenen Substanz-
2
konzentration auf z.B. je 1,8 cm (Reagenzstreifen 1o mm breit und die eingesiegelten Reagenzpapiere haben eine Fläche von je 18 χ 1o mm).
konzentration auf z.B. je 1,8 cm (Reagenzstreifen 1o mm breit und die eingesiegelten Reagenzpapiere haben eine Fläche von je 18 χ 1o mm).
Wird ein solcher Streifen ca. 5 - 1o Sekunden in 1o ml
des oben beschriebenen Puffer-Substratgemisches eluiert, so entsteht eine Reaktionslösung mit folgender Zusammensetzung:
Tris-Puffer (pH =7,8) 88 mMol/1
■ L-Aspartat . 264 mMol/1
NADH o,2o mMol/1
LDH 66o U/l
MDH 46o U/l
.Λ,-Ketoglutarat 13,2 mMol/1
Diese Lösung ist in für Serienmessungen üblicher Weise einzusetzen.
Reagenzstreifen für die Bestimmung von Triglyceriden
im Serum '
In einem geeigneten Glasgefäß, in welchem 13 ml einer über 1 Jahr bei Raumtemperatur stabilen Pufferlösung
von pH 8,1 vorgelegt wurde und die o,1 mol/1 Glycylglycinv o,16 mol/1
NH4Cl, 1 mmol/1 Natriumcholat, o,2? 0 Detergenz und
1 g/l Natriumazid enthält, wird ein Reagenzstreifen von ca. loo mm Länge und Io mm Breite eingestellt, der in
zwei Bezirken je 2 übereinanderliegend^ Reagenzpapiere
der Fläche 1ο χ 15 mm analog dem Beispiel 1 in eingesiegelter
Form enthält. Zur Beschleunigung der Substanzablösung in den Reagenzpapierbezirken ist
zusätzlich je 1 Gewebe mit ca. 25o ,u Maschenweite von der Fläche Io χ 15 mm unterlegt· Der am· unteren Ende
des Reagenzstreifens ahgeklemmteReagenzbezirk enthält auf dem einen Reagenzträger 13 mg NAD und auf dem darüberliegenden
Reagenzträger 3,9 mg 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT).
Der danebenliegende Reagenzbezirk enthält 2 Reagenzträger mit je 45 U Glycerindehydrogenase, 6 U Diaphorase,
13 U Cholesterinesterase.
Der Reagenzstreifen \vird 5 Sekunden intensiv bewegt, anschließend
wird 5 Minuten lang stehen gelassen, nochmais 5 Sekunden bewegt und der eluierte Reagenzträger
verworfen.
Es entsteht eine Reaktionslösung mit folgender Zusammensetzung:
Es entsteht eine Reaktionslösung mit folgender Zusammensetzung:
| Glycylglycin | o,1 mol/1 |
| NH4Cl | o,16 mol/1 |
| Na-Cholat | 1 mmol/1 |
| Detergenz | o,2°6 |
| MTT | 27o mg/1 |
| NAD | 1ooo mg/1 |
| Glycerindehydro | |
| genase | 6 KU/1 |
| Diaphorase | 4oo U/l |
| Cholesterinesterase | 9oo U/l |
ORIGINAL INSPECTED
Ui
Der Triglyceridgehalt im Serum wird ermittelt, in dem zu 2 ml dieser Reaktionslösung o,o2o ml Probe
hinzugegeben und nach 5o Minuten Inkubation bei 2o - 250C die Extinktion bei Hg 578 nm gegen einen
Reagentienleerwert CRL) ermittelt wird. Die Konzentration
(C) der Triglyceride wird berechnet nach
C("mg/1oo ml] = 498,5 χ (E-ERL)
Beispiel 3
Reagenzstreifen für die Bestimmung von Harnsäure im Serum
In einem geeigneten Glasgefäß, in welchem 8o ml einer 1 Jahr bei RT stabilen o,1 molaren Kaliumphosphat-Pufferlösung
pH 7,o, welche zusätzlich ο,5° Detergenz und 1 mmol/1 N-Ethyl- N-(2-hydroxi-ethyl)-m-toluidin (EHT)
enthält, vorgelegt ist, wird ein Reagenzstreifen von ca. 12o mm Länge und Io mm Breite eingestellt, der in
3 Bezirken je 2 übereinandergelegte Reagenzträger der Fläche 1o χ 15 mm analog den vorausgegangenen Beispielen
in eingenetzter Form enthält. Die beiden am unteren Ende des Reagenz Streifens angeklemmten Bezirke enthalten pro
Reagenzträger 2,5 mg 3-Methylbenz-thiazolonhydrazon-6-Sulfosäure
(SMBTH) zusammen mit je 1,7 mg K4 Fe (CN)6
und darüberliegend je 1 Reagenzsträger mit 6 Einheiten Uricase. Der' dritte Reagenzbezirk enthält 2 Reagenzträger
mit je 6 Einheiten Uricase, 5 mg Tris/Citratpuffer pH 7 und 2o Einheiten. Peroxidase (POD). Der - m trockener
Atmosphäre aufbewahrt - 1 Jahr bei RT stabile Reagenzstreifen wird,wie im Beispiel 2 beschrieben,eluiert.
rf-
Es entsteht eine Reaktionslösung mit folgender Zusammensetzung:
Kaliumphosphat-Puffer
pH 7,o o,1 mol/1
EHT 1 mmol/1
Detergenz o,5°o
SMBTH o,2 mmol/1
K42Je (CN)6] 2o mg/1
Uricase 255 U/l
POD 47o U/l
Der Harnsäuregehalt im Serum wird ermittelt, indem zu 2 ml dieser Reaktionslösung o,o5o ml Probe hinzugegeben
und nach 2o Minuten Inkubation bei 2o -25 C die Extinktion bei Hg 578 nm gegen einen Standard
ermittelt wird.
In analoger Weise wurden die bekannten Testkombinationen der Anmelderin für
Glukose (GOD/PAP-Methode) Cholesterin (CHOD/PAP-Methode) Glutamatpyruvat-transaminase
(UV-Methode)
auf Reagenzstreifen übertragen.
Stabilität und Funktionsfähigkeit entsprechen den vorstehenden
Beispielen.
rl«'
Leerseite
Claims (9)
- PatentansprücheReagenzstreifen, bestehend aus einem Handgriff, an dessen unterem Teil ein mit einem Reagenz imprägnierter saugfähiger Träger befestigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der saugfähige Träger mit einem dünnen Netz, welches auf einander gegenüberliegenden S.eiten des Trägers auf dem Handgriff angeklebt oder angesiegelt ist, an dem Handgriff angeklemmt ist.
- 2. Reagenzstreifen gemäß Anspuch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere saugfähige Träger nebeneinander oder sand-Ιο wichartig übereinander auf dem Handgriff befestigt sind.
- 3. Reagenzstreifen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Träger unterschiedliche Reagentien tragen.
- 4. Reagenzstreifen nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem saugfähigen Träger und dem Handgriff ein Unterlegnetz mit eingeklemmt ist.
- 5. Reagenzstreifen nach Ansprüchen 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen zwei übereinanderliegenden Trägern ein Zwischennetz eingeklemmt ist.
- 6. Reagenzstreifen nach Ansprüchen .1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Handgriff und die Net^e aus Kunststoff und der saugfähige Träger aus Cellulose-Papier oder Polyamid- beziehungsweise Polyamid/Cellulose-Vlies besteht
- 7. Verwendung von Reagenzstreifen gemäß einer der Ansprüche 1 - 6 zur Herstellung von Reagenzlösungen, dadurch gekennzeichnetr 4§ß man 4§H Reagens streifen in eiflSftt geeigneten Lösungsmittel oder Diluens eluiert.
- 8. Methode zur chemischen Analyse von Bestandteilen von Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man die festen Reagentien mit e.inem Reagenz streifen gemäß einem der Ansprüche 1-6 zufügt.
- 9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Reagenzstreifen direkt in die Testlösung gibt.lo. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Reagenzstreifen in.einem Diluens eluiert und einen aliquoten Teil der entstandenen Lösung für die Analyse benutzt.
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