DE3027929C2

DE3027929C2 - Herstellung von Polysaccharid-Copolymerisaten aus Träger mit enzymatischer Aktivität

Info

Publication number: DE3027929C2
Application number: DE3027929A
Authority: DE
Inventors: Pietro Milano Cremonesi
Original assignee: Italfarmaco SpA
Current assignee: Italfarmaco SpA
Priority date: 1980-02-28
Filing date: 1980-07-23
Publication date: 1982-12-09
Also published as: NL185855B; IT8020213A0; IT1141249B; CA1154715A; FR2477175B1; SE450493B; ES499862A0; ES8202043A1; DE3027929A1; GB2071669A; FR2477175A1; US4338401A; NL8100728A; NL185855C; GB2071669B; JPS56140891A; SE8100864L

Description

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Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch I angegebene Verfahren. Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf festen Matrices bekannt. Es wird ständig versucht, neue Verfahren zu entwickeln, durch die sich eine derartige Immobilisierung von Enzymen auf festen Matrices vereinfachen läßt.

Zur Immobilisierung wurden bisher verschiedene Verfahrensweisen angewendet. Beispielsweise bedient man sich häufig der Adsorption an einer festen Matrix. Ferner wurde die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen dem Makromolekül des Enzyms und einem festen Träger, der entweder in entsprechender Weise aktiviert ist oder entsprechende reaktive Gruppen enthält, vorgeschlagen. Ferner wurde vorgeschlagen, Enzyme innerhalb eines entsprechenden Trägers, beispielsweise in polymeren Gelen, Membranen auf Proteinbasis oder synthetischen Polymerisaten einzuschließen. Schließlich existiert auch der Vorschlag, entsprechende Monomere in Gegenwart von Enzymen zu polymerisieren oder ein entsprechendes Monomeres mit besonders aktivierten Enzymen zu copolymerisieren. Die beiden letztgenannten Verfahrensweisen bieten gegenüber den erstgenannten Verfahrensweisen einige Vorteile, da die feste Matrix, auf die das Enzym aufgebracht wird, für den speziellen Verwendungszweck in geeigneter Weise unter Gewährleistung entsprechender physiko-chemischer Eigenschaften, wie mechanischer Stabilität, Porosität sowie hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften, hergestellt werden kann. Immobilisierungsverfahren unter Anwendung von Polymerisationsreaktionen sind beispielsweise aus der FR-OS 73 25 614 bekannt. Diese Verfahren beruhen jedoch auf einer vorherigen Umsetzung mit einem Vinylmonomeren, das eine reaktive Gruppe enthält, und einem Enzym, wobei ein Vinylgruppen aufweisendes Enzym gebildet wird. Anschließend folgt dann die durch Katalysatoren, die keine spezifischen Initiatoren für Immobilisierungsreaktionen sind, initiierte Copolymerisation.

In anderen Fällen werden Polymerisationsreaktionen in Gegenwart von Enzymen durchgeführt, jedoch wird dabei die Immobilisierung der Enzyme mit funktionellen Reagentien erzielt, die Quervernetzungen zwischen den b5 Enzymen und den Polymerisaten hervorrufen. Beispielsweise handelt es sich um Bromcyan, Chlortriazin oder Carbodiimid und um Polymerisate auf der Basis von Polyhydroxyäthylacrylat oder Polyacrylsäure.

Der Ausdruck »Copolymerisation von Proteinen« bezeichnet Verfahren analog der vorstehend erläuterten Methode; vgl. Jaworek, H. Botsch und J. Maier, Methods in Enzymology, Bd. 44, Hrsg. Klaus Mosbach, Academic Press, New York 1976, S. 195 bis 201 sowie DE-OS 22 60 185 und 21 28 743.

Diese Verfahreil beruhen auf der Vinylierung von Enzymen mit bifunktionellen Monomeren, beispielsweise Acrjlierungs- und/oder Alkylierungsmiiteln, wie 3,4-Epoxybuten, 2,3-Epoxypropylacrylat und Acryloylchlorid. Mit diesem Verfahren ist es möglich, verschiedene vinylierte Enzyme hauptsächlich unter Verwendung von Polyacrylamidgel als Träger zu immobilisieren, wobei das Verhältnis von synthetischem Polymerisat zu Enzym im allgemeinen über 10:1 liegt

Aufgabe der Erfindung ist es, feste Matrices mit darin immobilisierten Enzymen in »technisch aktiver Form« zur Verfügung zu stellen. Ferner sollen erfindungsgemäß sowohl bei Synthesen als auch bei chemischen oder biologischen Analysen als Katalysatoren Substanzen verwendet werden, die die spezifische Aktivität der natürlichen Enzyme, die bei den Immobilisierungsreaktionen verwendet werden, aufweisen.

Erfindungsgemäß gelingt die Immobilisierung einer sehr großen Anzahl von Enzymen, vorzugsweise in den oberflächlichen Bereichen oder in leicht zugänglichen Bereichen der Matrix, die als fester Träger dient und die aus Polysacchariden unter Verwendung geringer Mengen an Vinylmonomeren besteht. Dabei liegt der Anteil der Vinylmonomeren häufig unter der Enzymmenge oder entspricht dieser. Das erfindungsgemäße Verfahren macht alle Vorreaktionen mit bestimmten Substanzen entbehrlich. Derartige Vorreaktionen sind häufig bei vinylierten Enzymen erforderlich. Sie führen zu nicht-homogenen Produkten in bezug auf den Substitutionsgrad und sind häufig für Enzyminaktivierungen verantwortlich. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, sämtliche Nachteile, die bei durch energiereiche Strahlung initiierten Copolymerisationsreaktionen auftreten, zu beseitigen. Derartige Reaktionen führen häufig zu einer Enzyminaktivierung und/oder zu Produkten mit kinetischen Eigenschaften, die sich von denen der als Ausgangsmaterialien verwendeten freien Enzyme grundlegend unterscheiden. Insbesondere wurden bisher verschiedene an Copolymerisaten immobilisierte Enzyme hergestellt, wobei die vinylierten Enzyme auf Polykohlenhydrat-Matrices immobilisiert wurden. Jedoch führte diese Reaktion nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen.

Es wurde nunmehr erfindungsgemäß festgestellt, daß durch geeignete Wahl des zum Start der Polymerisationsreaktion verwendeten Systems, durch geeignete Wahl der als Träger verwendeten Matrix und durch geeignete Wahl des Vinylmonomeren und des Enzyms die Herstellung von auf einer vorgeformten, in wäßriger Phase unlöslichen Matrix möglich ist, wobei in der Matrix im wesentlichen die ursprüngliche biologische Aktivität des Enzyms erhalten bleibt.

Insbesondere ist es erfindungsgemäß möglich, Produkte mit erhöhter Immobilisierung des Enzyms und mit kinetischen Eigenschaften, die denen des freien Enzyms im Vergleich zu herkömmlichen Produkten näherkommen, zu erhalten, wobei ein wesentlich einfacheres Verfahren angewendet werden kann. Die Produkte werden je nach Art der als Träger verwendeten Matrix in Form von Pulvern, Fasern, Kügelchen, Filmen, Folien oder Gelen erhalten.

Das Wesen der Erfindung liegt darin, daß in Gegenwart von Eisen(III)-chlorid unter Einwirkung von UV-Licht freie Radikale gebildet werden, die gemäß dem nachstehenden Reaktionsschema leicht ihre Aktivität auf die Matrix sowie auf das Enzym und das Vinylmonomere übertragen:

FeCl₃ + hv + Träger = Träger.
FeCh + hv + Enzym = Enzym.
FeCb + hv + Monomer = Monomer.

Die Bildung des auf dem Copolymerisat immobilisierten Enzyms verläuft über eine Polymerisation des Monomeren und endet entsprechend den üblichen möglichen Reaktionen, die während der Wachstumsphase des Polymerisats zur Beseitigung von Makroradikalen führen, d.h. hauptsächlich durch Übertragung auf monomere Moleküle, Übertragung auf Makromoleküle, wie das Enzym, Übertragung auf Makromoleküle des Trägers oder Kombination von zwei Makroradikalen.

Erfindungsgemäß wird eine Suspension oder Lösung eines Polykohlenhydrats in einem wäßrigen Medium verwendet. Das Vinylmonomere und das Enzym werden zweckmäßig in wäßriger Lösung gleichzeitig zugesetzt. Anschließend folgt die Zugabe des Katalysators, der aus einem Eisen(III)-Salz besteht. Anschließend wird in der Suspension oder Lösung gelöster Sauerstoff durch Durchleiten von Sauerstoff oder einem anderen Inertgas entfernt. Sodann wird eine Quelle für UV-Licht mit einem Spektrum von etwa 250 bis etwa 340 ιτιμ zur Bestrahlung des Materials verwendet. Die Bestrahlungszeit beträgt einige Minuten bis etwa 1 Stunde. Das auf diese Weise erhaltene feste Material kann nach gründlichem Waschen direkt verwendet, in feuchtem Zustand aufbewahrt oder lyophilisiert werden.

Als Vinylmonomere besonders bevorzugt sind Methylacrylat, Glycidylmethacrylat, Acrylnitril, N₁N'-Bisacryloylpiperazin und Ν,Ν',Ν''-Tris-acryloyl-s-hexahydrotriazin.

Es ist festzuhalten, daß das Eisen(lll)-Salz in den üblicherweise angewendeten Konzentrationen in vielen Fällen als Inhibitor von enzymatischen Reaktionen wirkt. Erfindungsgemäß ist aber die dem Eisen zuzuschreibende Hemmwirkung wesentlich reduziert oder entfällt sogar ganz.

Es wurde festgestellt, daß die Bildung des am Copolymerisat immobilisierten Enzyms während des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt. Diese Bildung läßt sich durch den nachstehenden Versuch nachweisen.

Immobilisierung von Albumin mit
Methylacrylat

100 mg Albumin werden in 5 ml Wasser gelöst. 250 ml Methylacrylat werden zugesetzt. Das Material wird mit einer Niederdruck-QuecksilberdampHampe, beispielsweise einer Philips-Lampe, in Gegenwart von 0,1 bis lOOmillimolar FeCl₃ mit UV-Licht bestrahlt. Zur Entfernung von gasförmigem Sauerstoff wird Stickstoff durch die Lösung geleitet. Die Umsetzung wird 30 Minuten durchgeführt. Das gebildete Produkt fällt aus der milchigen Lösung durch Zusatz von 1 Volumteil Methanol bei Temperaturen von 4 bis 20⁰C aus. Der Niederschlag wird gewonnen und mehrmals mit Aceton, in dem das Polymethylacrylat aber nicht das Albumin löslich ist, bei Temperaturen von 4 bis 10⁰C extrahiert, um das eventuell gebildete Homopolymerisat, d. h. Polymethylacrylat, zu entfernen.

Der in Aceton unlösliche Rückstand wird wiederholt

mit einem Puffer vom pH-Wert 5,6, in dem Albumin löslich ist, extrahiert, um gegebenenfalls vorhandenes nicht umgesetztes Albumin zu entfernen. Die Extraktion mit Aceton und der wäßrigen Lösung wird mit dem Rückstand wiederholt Auf diese Weise erhält man einen in Aceton und Wasser unlöslichen Rückstand als Endprodukt, der der IR-Analyse unterzogen wird. Das IK-Spektrum zeigt Adsorptionsbanden für Albumin und Polymethylacrylat, was die Bildung eines Copolymerisats bestätigt

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es ganz aligemein möglich. Copolymerisate mit beliebigen Enzymen und insbesondere mit proteolytischen Enzymen, wie Papain, Trypsin und Chymotrypsin, herzustellen. Das Verfahren eignet sich auch zur Anwendung auf hydrolytische Enzyme, wie Amylasen, Cellulasen, /J-Glucuronidasen, Acrylsulfatasen, Esterasen, Heparinasen, Penicillinamidasen und Ureasen, Oxidasen, wie Aminoacidooxidasen, Diaphorasen, Glucoseoxidasen und Peroxidasen, Dehydrogenasen, wie Steroid-dehydrogenasen, Milchsäure-dehydrogenasen, Alkohol-dehydrogenasen, Katalasen und Isomerasen, wie Invertasen und Steroid-isomerasen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung in bezug auf verschiedene Monomere, verschiedene Enzyme und verschiedene Träger.

Beispiel 1

Herstellung von Cellulose-Copolyglycidylmethylacrylat-Peroxidase

100 mg Cellulose, die in verschiedenen physikalischen Formen, wie Fasern, Filmen oder Folien vorliegt, werden in 10 ml Wasser suspendiert Sodann werden 0,1 bis 100 mg FeCI₁ zugesetzt, wobei der pH-Wert auf etwa 4 eingestellt wird. Hierauf werden 1 bis 100 mg einer Peroxidase, beispielsweise Meerettichperoxidase, und 1 bis 100 mg Glycidylmethacrylat zugesetzt. Das Gemisch wird mit einer Niederdruck-Quecksilberdampflampe mit UV-Licht bestrahlt, wobei dafür Sorge getragen wird, daß die thermische Strahlung an einem entsprechenden Filter absorbiert wird. Die Copolymerisation wird unter Stickstoff 30 Minuten durchgeführt.
Das erhaltene feste Material wird mehrmals mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 6 und anschließend mehrmals mit 0,3 m NaCl-Lösung gewaschen. Schließlich wird die enzymatische Aktivität des Copolymerisats bestimmt, indem man eine für Peroxidase spezifische Reaktion durchführt, beispielsweise eine spektrophotometrische Bestimmung mit H2O2-Gujacol oder p-Aminophenazon. Die Wirksamkeit der Reaktion, ausgedrückt als Anteil der immobilisierten enzymatischen Aktivität, bezogen auf die zur Umsetzung gebrachte enzymatische Aktivität, multipliziert mit 100, beträgt 10 bis 24 Prozent, je nach der Enzymkonzentration.

Das Copolymerisat kann auch in feuchtem Zustand bei Temperaturen von 4 bis 5⁰C aufbewahrt werden und behält dabei mehr als 1 Jahr 80 Prozent seiner Aktivität. Die analytischen Eigenschaften stehen mit der Bildung von Cellulose-Polyglycidylmethacrylat-Peroxidase in Einklang.

Beispiel 2

Herstellung von Cellulose-Copolymethylacrylat-Peroxidase

Die Reaktion von Beispiel 1 wird mit Methylacrylat als Vinylmonomerem wiederholt. Das bei der Umset-

zung erhaltene feste Material wird mit Lösungen vom pH-Wert 5,3 gewaschen. Bei der Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Copolymerisats ergibt sich eine Immobilisierungswirkung von 3 Prozent.

Beispiel 3

Herstellung von
Cellulose-Copolyacrylnitril-Peroxidase

Die Umsetzung von Beispiel 1 wird mit folgenden Abänderungen wiederholt: Es werden 5 g Cellulose in Form von gequollenen Kügelchen und Acrylnitril als Vinylmonomeres verwendet Das Copolymerisat zeigt nach Waschen mit Lösungen vom pH-Wert 5,3 Peroxidase-Aktivität Die Immobilisierungswirkung beträgt 70 Prozent

Beispiel 4

Herstellung von
Cellulose-Copolymethylmethac.ylat-Peroxidase

Die Umsetzung von Beispiel 2 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß als Vinylmonomeres Methylmeth- «crylat verwendet wird. Die Immobilisierungswirkung beträgt 7 Prozent.

Beispiel 5

Herstellung von
Cellulose-Copoly-ihexahydro-tris-acryloyl-s-triazin)

Die Umsetzung von Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß als Monomeres Hexahydro-trisacryloyl-s-triazin verwendet wird. Die Immobilisierungswirkung beträgt 28 Prozent.

Beispiel 6

Herstellung von
Cellulose-Copoly-ibis-acryloyl-piperazin)

Die Umsetzung von Beispie! 1 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß als Vinylmonomeres Bis-acryloylpiperazin verwendet wird. Die Immobilisierungswirkung beträgt 20 Prozent.

Beispiel 7

Herstellung von
Sepharose-CopoIyglycidyl-methacrylat-Cellulase

100 mg Sepharose® werden in 10 ml Wasser suspendiert. Sodann werden 0,1 bis 100 mg FeCl₃ zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 4 bis 5,1 eingestellt. Sodann werden 100 mg Cellulase, wie Cellulase F, und 1 bis 100 mg Glycidylmethacrylat zugesetzt. Es kann auch eines der in den Beispielen 2 bis 6 eingesetzten Monomeren verwendet werden. Die Temperatur wird unter 20°C eingestellt. Die UV-Bestrahlung wird mit einer Niederdruck-Quecksilberdampflampe vorgenommen. Die Copolymerisation wird 30 Minuten durchgeführt Das Copoiymerisat wird gemäß Beispie! 1 gewaschen. Die enzymatische Aktivität wird unter Verwendung von Carboxymethylcellulose als Substrat ermittelt Die Immobilisierungswirkung, bezogen auf die enzymatische Aktivität beträgt 82 Prozent

Beispiel 8

Herstellung von
Sepharose-Copolyglycidyl-methacrylat-oc-Amylase

a-Amylase wird gemäß Beispiel 7 immobilisiert Die Immobilisierungswirkung beträgt 5 Prozent

Beispiel 9

Herstellung von Sepharose-Copoly-(hexahydrotris-acryloyl-s-triazin)-Peroxidase

Die Immobilisierungsreaktion von Beispiel 7 wird mit folgenden Abänderungen wiederholt: Als Enzym wird Peroxidase und als Vinylmonomeres wird Hexahydrotris-acryloyl-s-triazin verwendet. Die Immobilisierungswirkung beträgt 38 Prozent.

Beispiel 10

Herstellung von Sepharose-Copolyglycidylmethacrylat-Glucoseoxidase

Die Umsetzung von Beispiel 6 wird mit der Abänderung wiederholt, daß als Enzym Glucose-oxidase (E. C.) verwendet wird. Die Immobilisierungswirkung beträgt 52 Prozent.

Beispiel 11

Herstellung von
Srärke-Copolyglycidylmethacrylat-Peroxidase

100 mg Stärke werden in 10 ml Wasser gelöst. Sodann werden folgende Bestandteile zugesetzt: 0,1 bis 100 mg FeCb unter Einstellung des pH-Werts auf 4 und 1 bis 100 mg Glycidylmethacrylat-Peroxidase. Es kann auch eines der Monomeren der Beispiele 2 bis 7 verwendet werden. Die Temperatur wird unter 20° C eingestellt. Sodann wird eine UV-Bestrahlung mit ein^r Niederdruck-Quecksilberdampflampe vorgenommen. Die Copolymerisation wird 30 Minuten durchgeführt Der erhaltene Niederschlag wird gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die enzymatische Aktivität des Copolymerisats wird ermittelt. Die Immobilisierungswirkung, bezogen auf die Aktivität, beträgt 40 Prozent. Die analytischen Eigenschaften des Produkts entsprechen der Bildung vonStärke-Polyglycidylmethacrylat-Peroxidase.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, auf einer Matrix gleichzeitig mehrere Enzyme zu immobilisieren.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid-Copolymerisaten mit enzymatischer Aktivität, d a durch gekennzeichnet, daß man eine Suspension eines Polysaccharids in einem wäßrigen Medium mit einem Vinylmonomeren und einem Enzym und anschließend mit einem Eisen(IH)-Salz als Katalysator versetzt, das erhaltene Gemisch mit UV-Licht bestrahlt und das auf diese Weise erhaltene feste Material gründlich wäscht

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vinylmonomeres Methylacrylat, Glycidylmethacrylat, Acrylnitril, Bis-acryloylpiperazin oder symmetrisches N,N',N"-Trisacryloylhexahydrotriazin verwendet