DE2915872C2

DE2915872C2 - Polysaccharide und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2915872C2
Application number: DE2915872A
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Shin-Nanyo Yamaguchi Igarashi; Hisao Takemoto
Original assignee: Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1978-04-20
Filing date: 1979-04-19
Publication date: 1985-02-21
Also published as: IT1165039B; SE443804B; GB2019863A; CA1157408A; AU523757B2; FR2423540B1; GB2019863B; FR2423540A1; IT7922028A0; AU4616479A; SE7903415L; DE2915872A1; US4312979A

Description

2. Verfahren zur Herstellung des Polysaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man In einem Kulturmedium Pseudomonas vlscogena, FERM-P Nr. 3811, ATCC-Nr. 31504 bzw. DSM-Nr. 1634 züchtet, das extrazellular gebildete Polysaccharid In dem Medium anreichert, von diesem abtrennt und gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Methanol In einer Konzentration unter 5 Gew.-« vorhanden Ist.

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharide sowie ein Verfahren zu Ihrer Herstellung. Polysaccharide werden taxonomlsch entsprechend Ihrem Ursprung als solche, die aus Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen stammen, klassifiziert.

Beispiele von aus Pflanzen stammenden Polysacchariden sind Cellulose, Pectin, Amylose-karrageenln, Agar-Agar. Beispiele von aus Tieren stammenden Polysacchariden sind Heparin und Chondroltln-Schwefelsäure.

Es Ist bekannt, daß einige Mikroorganismen Polysaccharide erzeugen. Einige dieser Polysaccharide sind Dextran, Xanthangumml, Pullan oder Curdlan. Sie werden bereits In der Industrie verwendet. Der Hauptzuckerbestandteil dieser genannten mikrobiologisch erzeugten Polysaccharide Ist in jedem Fall Glucose. Andererseits 1st Galactose In Polysacchariden, wie Gummiarabikum, Tragantgummi, Ghattlgumml, Arabo-Galactan, enthalten, die aus wesentlich höher organisierten Pflanzen stammen. Diese Polysaccharide können für einige Zwecke verwendet werden, für die sie durch die oben erwähnten, mikrowellen Polysaccharide nicht ersetzt werden können.

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharide, wie sie Im Kennzeichen des Hauptanspruchs definiert sind. Sie enthalten u. a. AUose als Zuckerbestandteil. AUose gehört zu der Klasse der Aldohexosen, und man hat nicht angenommen, daß sie natürlich vorkommt.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide enthalten weiterhin Galactose als einen überwiegenden Zuckerbestandteil. Die Summe der Gehalte an Allose und Galactose beträgt mindestens 56 Mol-%.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharlds, das dadurch gekennzeichnet Ist, daß man In einem Kulturmedium Pseudomonas vlscogena, FERM-P 3811, ATCC 31504 bzw. DSM züchtet, das extrazellulär gebildete Polysaccharid In dem Medium anreichert und von diesem abtrennt und gewinnt.

Die strukturellen und physlko-chemlkallschen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Polysaccharide sind wie folgt:

(1) Bestandteilszucker und Ihr Verhältnis Im Vorhandensein;

Allose etwa 6 bis etwa 12 Mol-%

Galactose etwa 50 bis etwa 60 Mol-%

Glucose etwa 10 bis etwa 20 Mol-%

Mannose etwa 7 bis etwa 14 Mol-%

Glucuronsaure etwa 10 bis etwa 12 Mol-%.

Da die Bindungen zwischen Mannose und Glucuronsäure relativ hydrolysebeständig sind, können die analytischen Werte der Mannose, abhängig von dem verwendeten analytischen Verfahren, geringer sein.

(2) Elementaranalyse

Man erhält Werte, die sehr eng an denen liegen, die man aus der allgemeinen Formel C_nK_2nO_n berechnet.

(3) Schmelzpunkt s Die Polysaccharide zeigen keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzen sich über einer Temperatur von etwa 210 bis 220° C.

(4) Infrarotsprektrum

Die Spektren zeigen die folgenden Absorptionen:

im Bereich von 3400 cm"¹ O-H-Dehnung

Im Bereich von 2890 cm*¹ C-H-Dehnung

im Bereich von 1620 cm"¹ Dehnung der Carboxylatanlonen

•m Bereich von 880 cm"¹ bedingt durch die Orientierung der /J-Glucosldo-Blndungen

(5) Ultravlolett-Absorptionsspektren

Die Spektren zeigen keine klare, charakteristische Absorption.

(6) ¹³C-kernmagnetische Resonanzspektn-n

Man beobachtet ein Methylsignal der Acetylgruppen und ein Carboxylsignal im Carbonylabsorptlonsbereich. Jedoch konnte das Carbonylsignal der Acetylgruppen nicht bestätigt werden. Man nimmt daher an, daß, obgleich ein Teil der Hydroxylgruppen acetyllert 1st, das Verhältnis der Acetylierung relativ gering 1st.

(7) Löslichkeit in Lösungsmitteln

Die Polysaccharide sind in Wasser löslich, jedoch in Methanol, Äthanol, Äthern oder Aceton unlöslich.

(8) Farbreaktion

Anthron-Reaktlon positiv

Ninhydrin-Reaktion negativ

Dische's Carbazol-Reaktlon positiv

Dische's Cysteln-Schwefelsäure-Reaktlon positiv

(9) Azidität
Sauer.

(10) Aussehen

Es zeigt ein weißes, baumwollartiges oder ein faserartiges Aussehen In trockenem Zustand.

(11) Molekulargewicht Es Hegt zwischen etwa 1 χ 10⁴ und etwa 1 χ ΙΟ⁷.

(12) Spezifische RotatloTi " ~ —-----

[tx]²J = elwd +30 bis etwa +35° (c= 1, Wasser)

(13) Aussehen der wäßrigen Lösung

Eine wäßrige Lösung des Polysaccharide 1st farblos und transparent und viskos.

(14) Verhalten gegenüber Calclumsalzen

Das Polysaccharid wird In alkalischer, wäßriger Lösung zu einem Gel zusammengeballt, wenn Calciumhydroxid oder ein Calclumsalz, wie Calciumchlorid, zu der Lösung gegeben wird.

Die Polysaccharide sind nützlich als viskose Materlallen, Stabilisatoren, Emulgiermittel, Mittel zur Verbesserung der Qualität, wie Im Faüe von Dextran, Xanthangumml, Gummis von Pflanzen, und werden für die Erzeugung von Nahrungsmitteln, Pharmazsutlka und Kosmetika verwendet. Die Polysaccharide können ebenfalls als formbare Rohmaterialien für biozersetzbare Fllmformllnge verwendet werden, da die Polysaccharide zu Filmen verarbeitet werden können. DIi; Polysaccharide können ebenfalls als Ausflockungshilfsmittel verwendet werden, da die Polysaccharide zu einem Gel In wäßriger Lösung in Anwesenheit eines Calciumsalzes zusam- so menballen.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide können durch Kultivierung von Pseudomonas vlscogene., FERM-P Nr. 3811 bzw. ATCC-Nr. 31504, der aus dem Boden von der Anmelderin Isoliert worden 1st, In einem Nährmedium erzeugt werden, wobei das Polysaccharid In dem Medium angereichert wird und anschließend das Polysaccharid abgetrennt und gewonnen wird.

Die taxonomlschen Eigenschaften werden In der JP-OS 1 18 585/1978 beschrieben und sind wie folgt:

(A) Untersuchung der Zellmorphologie nach der Inokulierung bei 30° C während 6 bis 24 Stunden auf einem Nährbrühenagar:

(1) Zellform Stäbchen «>

(2) Zellgröße etwa 1,0 χ 0,7 (μ)

(3) Anordnung einzeln oder paarweise

(4) Motllltät bewegliche durch polare Geißeln

(5) Endsporen (Endosporen) keine

(6) Anfärbbarkelt negativ

(7) Säurebeständigkeit negativ

(B) Kultureigenschaften

(1) Kultivierung auf einer Nährbrühenagarplatte nach der Inokulation bei 30° C während 2 Tagen;

(a) Rate für die Kolonleblldung normal

(b) Form der Kolonien kreisförmig, etwa 3,5 Im Durchmesser

(c) Oberfläche der Kolonien glatt

(d) Erhöhung des Wachstums konvex

(e) Kanten der Kolonien vollständig (0 Inhalt der Kolonien amorph

(g) Farbe der Kolonien schwach gelb

(h) Durchlässigkeit der Kolonien opak

(1) Glänzen der Kolonien glänzend 0) Bildung von löslichem Farbstoffmaterlal keine

(2) Bewertung auf einer Nährbrühenagarschrägkultur nach der Inokulation bei 30° C während 2 Tagen:

(a) Wachstum übermäßiges Wachstum

(b) Form des Wachstums ausbreitend

(c) Querschnittsansicht der Kolonien flach

(d) Glitzern des Wachstums glitzernd

(e) Oberfläche der Kolonien glatt (0 Durchlässigkeit der Kolonien opak

(g) Farbe der Kolonien schwach gelb

(h) Theologische Eigenschaften der Kolonien dickflüssig

(3) Kultivierung In einer Nährbrühe nach der Inokulation bei 30° C während 2 Tagen:

(a) Wachstum auf der Oberfläche membranartig

(b) Trübung mäßig trüb

(c) Präzipitatlonsblldung kompakt

(d) Bildung von Gas keine

(e) Verfärbung des Mediums keine

(4) Kultivierung in einem Nährbrühenagarstich nach der Inokulation bei 30° C während 2 Tagen:

(a) Ort des Wachstums am besten oben

(b) Durchstichlinie pappilenartlg

(5) Kultivierung in einem Nährbrühengelatlnestlch nach der Inokulation bei 20° C während 2 Wochen: (a) Verflüssigung der Gelatine keine

(6) Wachstum In Milch

(a) Reaktion

(b) Gasbildung

(c) Koagulation oder Verflüssigung

(C) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion des Nitrats

(2) Denitrifikation

(3) MR-Test

(4) VP-Test

(5) Bildung von Indol

(6) Bildung von Schwefelwasserstoff

(7) Hydrolyse der Stärke

(8) Ausnutzung von Citronensäure

(9) Ausnutzung einer anorganischen Stickstoffquelle

(10) Bildung von Farbmaterial

(ΪΪ) Ulease bzw. Urease

(12) Oxldase

(13) Catalase

(14) Wachstumsbereich

(15) Sauerstofferforderals

(16) O-F-Test

(17) Säure- oder Gasbildung aus Zuckern

Verfärbung

keine

Koagulation

es findet eine Reduktion zu N₂ statt

die Stickstoffquelle in entweder der NO₃- oder NH₃-Form wird ausgenutzt

es wlrd_eln grünes, fluoreszierendes Material gebildet

4 bis 10 Im pH und bei einer Temperatur von 10 bis 42° C

aerob

Oxidation

Zucker

Wachstum

Säure

Gas

L-Arbinose D-Xylose

FoiUetzung Zucker Wachstum Säure Gas

D-Glucose + (+) 5

D-Mannose +

D-Fructose + + ~

D-Galactose + +

Maltose + - - ^l0

Saccharose + ^;

Lactose + - ~

Threpharose + - ~

D-Sorbit +

D-Mannit + - ~

Inosit + - -

Glycerin + + ~ ₂₀

Stärke +

Pseudomonas vlscogena kann unter Verwendung verschiedener Klassen organischer Substanzen als Kohlenstoffquelle wachsen z. B. von Methanol, Äthanol, Isopropanol, Äthylenglykol, Propylenglykol, Glycerin oder Glucose. Insbesondere können sich die erfindungsgemäßen Polysaccharide in beachtlichem Ausmaß in Medien 25; ansammeln, wenn der Mikroorganismus unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle kultiviert wird. Die geeignete Menge an Methanol In der Kultur ist eine Konzentration unter 5 Gew.-«, und besonders bevorzugt ist eine Konzentration Im Bereich von 0,5 bis 3 Gew.-« wegen des guten Bakterienwachstums und der Fortpflanzung. · \

Als Stickstoffquelle des Mediums können anorganische Stickstoffverbindungen, die bei bekannten Fermente- 3°! tlonen verwendet werden, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniak, Dlammonlumphosphat, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, und/oder organische Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Harnstoff, Malsquellwasser, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt, verwendet werden.

Außer den obigen können Mineralsalze, z. B. Calclumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Phosphate, Eisensalze, Mangansalze, Zinksalze und Kupfersalze verwendet werden. Die Zugabe von organischen Materialien, wie .35, Sojabohnenprotelnhydrclysatlösung, Hefeextrakt, Vitamine oder Aminosäuren, 1st für die Aktivierung des Bakterienwachstums günstig. Die Kultivierung wird aerob, normalerweise in einem Temperaturbereich von 20 bis 42° C und bevorzugt 25 bis 38° C und in einem pH-Bereich von 5 bis 9 und bevorzugt von 5,5 bis 7,5 mittels . einer Schüttel- oder untergetauchten Kultur, durchgeführt.

Tabelle I zeigt ein Beispiel eines synthetischen Mediums, das Methanol enthält und das bei der vorliegenden «. Erfindung verwendet werden kann.

Tabelle I ,

Während der Kultivierung kann sich der pH-Wert der Kultur auf einen niedrigeren Wert ändern, abhängig 55 von dem verwendeten Medium.

In einem solchen Fall können Alkalien, wie Ammoniak, Natriumhydroxid oder Kallumhydroxid, zur ; Aufrechterhaltufflg des pH-Wertes auf einem vorbestimmten Wert zugegeben werden. '

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide besitzen ein Molekulargewicht, das Im Bereich von etwa 1 χ 10 bis etwa 1 χ 10' liegt. Die Molekulargewichtswerte können sich etwas andern, abhangig von den Züchtungsbedln- » gungen, z.B. dem Konzentrationsverhältnis der Kohlenstoff- und der Stickstoffquellen, Änderungen in der ; Konzentration der Phosphate usw. Sie können sich weiterhin geringfügig ändern in Abhängigkeit von dem Verhältnis von Methanol und Ammoniak, wenn eine Losungsmischung aus Methanol und Ammoniak als Neutralisatlonsmlttel verwendet wird. '■■·.

Die Abtrennung der Allose als Zuckerbestandteil enthaltenden Polysaccharide aus der Kultur erfolgt z. B. wie ⁶ⁱ folgt.

Nach der Kultlvation wird die Kultur einer Zentrifugentrennung oder Filtration unter Verwendung eines Filterhilfsmittels zur Entfernung der Zellen unterworfen.

Methanol	1,5	Gew.-«
Diammonlum-monohydrogenphosphat	0,40	Gew.-«
Monokalium-dihydrogenphosphat	0,10	Gew.-«
Dlkallum-monohydrogenphosphat	0,10	Gew.-*
Magnesiumsulfat-heptahydrat	0,05	Gew.-*
ElsendD-sulfat-heptahydrat	0,001	Gew.-«
Calclumchlorid-dihydrat	0,001	Gew.-«
Hefeextrakt	0,02	Gew.-«
Wasser pH 7,0	Rest

Die Kultur wird auf geeignete Welse verdünnt, und dann werden die Zellen, wie oben erwähnt, entfernt, wenn die Viskosität der Kultur hoch Ist. Rohe Polysaccharide werden als weiße Fasern durch Zugabe eines In Wasser löslichen organischen Lösungsmittels wie Aceton, Methanol, Äthanol, In dem obigen, überstehenden Material erhalten.

Die rohen Polysaccharide werden erneut In Wasser nach dem Waschen mit einem Äther und Äthanol gelöst, in der Wärme behandelt, wie 15 Minuten bei 80⁰C, durch Zugabe von Trichloresslgsäure wird das Protein entfernt und dann wird zur Entfernung der Niederschläge zentrifugiert oder filtriert.

Das entstehende, überstehende Material wird einer Dialyse und einer Lyophlllslerung unterworfen, wobei man gereinigte Polysaccharide In Form weißer Fasern erhält.

Es Ist nicht erforderlich, das Polysaccharld zu einem trockenen Feststoff aufzubereiten, wenn es in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden kann.

Pseudomonas viscogena bildet das erfindungsgemäße Polysaccarid, das Allose als Bestandteilszucker enthält, in hoher Konzentration und mit sehr hoher Rate bei der Ausnutzung der Kohlenstoffquelle. Beisptelswele 1st es möglich, die Polysaccharide In einer Menge von 30 g/l, bezogen auf das Kulturmedium, zu bilden, wenn die Züchtung In einer eingetauchten Kultur unter Verwendung von Methanol als Kohlenstotiqueiie durchgeführt wird. Es Ist weiterhin möglich, die Ausbeute an Polysaccharid auf etwa 30%, bezogen auf die Menge an verwendetem Methanol, einzustellen
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1,0 1 einer Lösung, die die gleiche Zusammensetzung, wie in Tabelle I angegeben, aufweist, mit Ausnahme von Methanol, wird in einen 2,0 1 Fermentationskessel des Mlni-Krugtyps gegeben. Nachdem der Kessel 15 min bei 120° C sterilisiert worden 1st, werden 20 ml Methanol In den Kessel unter Bildung des Mediums zugegeben, wobei die Sterilität aufrechterhalten wird.

50 ml Impfkultur, die durch Kultivieren von einem Pseudomona«: viscogena TS-1004-Stamm (= FERM-P Nr. 3811) In einem Medium der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung bei 30⁰C während 24 h erhalten worden 1st, wurden in den Kessel gepflanzt. Die Züchtung erfolgte bei 30° C während 48 h mit einer submersen Kultur, wobei die Rotationsgeschwindigkeit des Rührers 800 U/mln beträgt und Luft in einer Menge von 1 1/mln eingeblasen wird, wobei Methanol, das Ammoniakwasser enthält, zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Kultur bei 7,0 zugegeben wird.

Das Molverhältnis von Methanol zu Ammoniak in dem Ammoniakwasser enthaltenden Methanol beträgt 10 :1. Die Menge an Methanol, die zu der Kultur während der Züchtung zugegeben wurde, beträgt 73 g.

Nach der Züchtung werden 2 1 Wasser zu der Kultur zugegeben, und dann wird die Kultur 30 min bei 5° C und 10 000 U/mln zentrifugiert, um Bakterienzellen und feste Materialien zu entfernen. Das entstehende, überstehende Material wird unter Rühren In 9 1 Aceton gegossen. Das in Aceton unlösliche Produkt wird abfiltriert und ausreichend mit Äthanol und Äther gewaschen und lyophlllslert. Man erhält 15,3 g rohes Polysaccharid.

10 g des so entstehenden, rohen Polysaccharids werden In 1 1 Wasser gelöst und Trichloressigsäure wird zu der Lösung zugegeben, so daß die Lösung eine Konzentration an Trtchloresslgsäure von 3 Gew.-% erreicht. Nach dem Stehenlassen der Lösung über Nacht wird die Losung 20 min bei 5° C und 10 000 U/min zur Entfernung fester Materialien zentrifugiert. Das überstehende Material wird erneut In die dreifache Menge an Aceton zur erneuten Ausfällung des Polysaccharids gegossen.

Nach der Abtrennung des entstehenden Polysaccharldnlederschlags wird dieser erneut In Wasser aufgelöst, und eine wäßrige Lösung aus Cetyltrimethyl-ammonlumbromld wird zu der Lösung zur Ausfällung des Polysaccharids als Komplex mit Cetyltrimethyl-ammoniumbromid zugegeben.

Der Komplex wird ausreichend mit Wasser und Äthanol zur Entfernung von überschüssigem Cetyltrimethylammonlumbromld gewaschen. Dann wird eine wäßrige Lösung aus Natriumchlorid zu dem Komplex zu seiner Auflösung gegeben.

In die entstehende Lösung aus Polysacchartd wird die 3fache Menge an Äthanol zur Ausfällung des Polysaccharids gegeben. Der Niederschlag wird abgetrennt, lyophllislert und erneut in Wasser gelöst. Die enstehende Lösung wird In ein Cellophanrohr für die Dialyse gegeben und einer Dialyse In strömendem Wasser während 3 Tagen unterworfen. Dann wird die 3fache Menge an Aceton in die Lösung für die Ausfällung gegeben. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und lyophllislert; man erhält ein gereinigtes Polysaccharid. Die Ausbeute beträgt 8 g.
Die physlko-chemlkallschen Eigenschaften des so entstehenden, gereinigten Polysaccharids sind wie folgt:

Elementaranalyse:
* berechnet aus

HON

CMiJO_n: 40,00% 6,67% 53,33%

gefunden: 40,25% 6,06% 53,02% 0,67%

Schmelzpunkt:

Das Polysacchartd zeigt keinen klaren SchmelzpunktTTJer Gewichtsverlust, der bei einer Temperatur von 210 bis 220° C beginnt und der von exothermer Wärme begleitet wird, wird In einer Dlfferentlalthermowaage beobachtet, die mit einem Aufzeichnungsgerät ausgerüstet 1st, wobei man eine Rate von 10° C/mln für die Temperaturerhöhung In Anwesenheit von Luft verwendet.

Infrarot-Absorptionsspektren:

Die mit einer KBr-Tablette gemessenen Spektren sind In Fig. 1 dargestellt. Aus der Figur sind die oben erwähnten, charakteristischen Absorptionen erkennbar.

Ultravlolett-Absorptlonsspektren:

Die Ultravlolett-Absorptlonsspektren werden In einer wäßrigen Lösung, In der die Konzentration an Polysaccharid 0,097 Gew.-% beträgt, gemessen und sind In Flg. 2 dargestellt. Aus der Figur 1st erkennbar, daß die Spektren keine klare charakteristische Absorption aufzeigen, daß die Absorption jedoch etwas unter 310 nm und etwas unter 250 nm zunimmt. ;

¹³C kernmagnetische Resonanzabsorptionsspektren:

Signale, die durch chemische Verschiebungen hervorgerufen werden, werden bei 27,15 ppm wnd 176,97 ppm. '5 beobachtet in «5-Werten in schwerer Wasserlösung. Sie können dem ¹³C der Methylgruppen in den Acetylgruppen und der Carbonylgruppen in carboxyllschen Gruppen zugeordnet werden. Es wurde jedoch das Carbonylsignal der Acetylgruppen, das man Im Bereich von 169,0 ppm in <5-Werten finden müßte, nicht festgestellt. Man nimmt daher an, daß, obgleich ein Teil der Hydroxylgruppen acetyliert 1st, das Verhältnis der Acetyllerung gering Ist.

Aussehen, Löslichkeit und Farbreaktion:

Die gleichen Eigenschaften und Reaktionen, wie sie bereits erwähnt wurden, wurden beobachtet.

Molekulargewicht:

Es verteilt sich zwischen 1,0 χ 10⁵ und 5 χ 10⁶. Der Vertellungspeak liegt bei 2 χ 10'.

Die Messung erfolgt mittels Gelpermeatlonschromatographle an einer Lösung des Polysaccharlds. Die Bedlngungen sind wie folgt:

Menge der Probe 100 μΐ

Säule 0,96 cm χ 60 cm

Packmaterial hydrophiles Gel

Elulerungsmlttel eine Mischung von Lösungen aus

^M/,5 KH₂PO,, ^M/,5 Na₂HPO₄ und ^M/₁₀ KCl

Detektor Dlfferentlalreferaktometer

Standard Dextran

Spezifische Drehung:

+i2,T(c=T, Wasser)

Aussehen der wäßrigen Lösung; Azidität; und Verhalten gegenüber Calclumsalzen:

Das Polysaccharid zeigt in wäßriger Lösung ein farbloses und transparentes Aussehen. Die Lösung zeigt eine Viskosität von 180 cP, gemessen bei einer Konzentration von 1 Gew.-% bei Zimmertemperatur, bestimmt mit einem Rotatlonsviskometcr. Die Zugabe einer wäßrigen Lösung aus Cetyltrlmethyl-ammonlumbromld in die Lösung ergibt einen weißen Niederschlag. Der gleiche weiße Niederschlag wird durch Zugabe einer Lösung von Cetylpyridlniumchlorid erhalten. Dementsprechend ist das Polysaccharid sauer.

Die Zugabe einer wäßrigen Calciumchlorldlösung zu einer wäßrigen Lösung des Polysaccharide, deren pH-Wert durch Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 10 eingestellt wurde, ergibt eine Aggregation zu einem Gel.

Die Zugabe einer wäßrigen Calclumhydroxidlösung anstelle von wäßriger Calclumchloridlösung und wäßriger Natriumhydroxidlösung ergibt das gleiche Ergebnis.

ZücRerbestandteÜe und Zusammensetzung sowie chemische Struktur IQ mg des gereinigter. Polysaccharids werden in 0,5 ml Schwefelsäure (2 N) gelöst und in einem geschlossenen Rohr 8 h bei 100° C für die Hydrolyse erhitzt. Die entstehende Hydrolyselösung wird mit Bariumcarbonat neutralisiert und filtriert. Mit dem Filtrat wird eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt.

Das Filtrat wird auf eine Slllkagelplatte aufgetragen und unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Pyridin und Wasser (Volumenverhältnis = 6:4:3) entwickelt. Dann wird mit Wasser gesättigtes n-Butanol, das p-Anlsldlnhydrochlorid in einer Menge von 396 enthält, aufgesprüht und dann wird bei 110 bis 120°C erhitzt.

Das Vorhandensein von Allose, Galactose, Glucose, Mannose und einer Uronsäure wird beobachtet.

Für die quantitative Bestimmung der neutralen Zucker wird das Filtrat durch eine mit einem stark sauren ω Kationenaustauschharz In ff-Form gepackte Säule geleitet, und die Säule wird mit Wasser gewaschen. Die durchgelaufene Lösung wird kondensiert.

Es wird eine Aldltol-Acetylierung und anschließend eine Gaschromatographie mit der kondensierten Lösung durchgeführt, entsprechend denn Verfahren, das In »General Polysaccaride Chemistry«, herausgegeben von Harada und Koizumi, veröffentlicht von Kodansha (1974), auf Seite 68 folgendermaßen beschrieben Ist: 1 ml der kondensierten Lösung wird nach Zugabe von 10 mg Natriumborhydrid über Nacht stehengelassen. In die Lösung wird eine überschüssige Menge eines stark sauren Katlonenaustauschharzes In H⁺-Form gegeben, und das Gemisch wird mehrere Minuten heftig zur Zersetzung der überschüssigen Menge an Natriumborhydrid

Säule	0,4 cm χ 200 cm Glassäule
Packmaterial	3% ECNSS-M ·)
	*auf Diatomeenerde, behandelt mit DMCS) als Träger**
	(100 bis 120 mesh = 0,149 bis 0,125 mm)
Säulentemperatur	190° C
Temperatur am Eingang	240° C
Träger	Stickstoff 40 m!/mln
Detektor	Wasserstofflonen-Flammenart

geschüttelt. Nach der Filtration wird das Filtrat Im Vakuum getrocknet. Methanol wird zu dem entstehenden, getrockneten Produkt «geben, das erneut bet Zimmertemperatur Irn Vakuum getrocknet wird. Dann werden die Methanolzugabe und das Trocknen Im Vakuum zehnmal wiederholt.

Die Acetylierung erfolgt durch Zugabe von 0,2 ml einer Lösung aus Pyrldin und Essigsäureanhydrid, wobei das Mischverhältnis 1:1 Im Volumen zu dem trockenen Produkt beträgt. Man erhitzt 2 h bei 100° C. Nach dem Kühlen wird eine geringe Wassermenge zu dem Reaktionsprodukt gegeben, und es wird bei Zimmertemperatur Im Vakuum getrocknet. Die Zugabe von Wasser und das Trocknen im Vakuum werden viermal wiederholt. Das verbleibende Produkt wird in einer geringen Menge Chloroform gelöst und die entstehende Lösung wird als Probe fur die Gaschromatographie verwendet. Die Bedingungen sind wie folgt:

*) ECNSS-M = Copolymeres von Ethylenglycolsucclnat und /8-Cyanethylmethylsllicon _DMCS = Dlmethy]chlorsilan_

Der Nachwels der Uronsäure wurde wie folgt durchgeführt: 7,0 g gereinigtes Polysaccharid werden In 900 ml Schwefelsäure (2N) gelöst und für die Hydrolyse 8 h In siedendem Wasser erhitzt. Die entstehende Hydrolyse lösung wird mit Barlumcarbonat neutralisiert und filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule von 2,0 cm χ 13 cm, gepackt mit einem stark sauren Kationenaustausch in H⁺-Form, geleitet, und die Säule wird mit Wasser gewaschen. Die entstehende, durchgelaufene Lösung wird zu einem Sirup kondensiert. 5 g Sirup werden der Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine Cellulosesäule (CF-U, 4,1 cm χ 54 cm, hergestellt von Whatman), ein Lösungsgemisch aus n-Butanol, Pyrldin und Wasser in einem Verhältnis von 10 : 3 :3 im Volumen als erstes Elulerungsmlttel und ein Lösungsgemisch aus Äthanol und Wasser in einem Verhältnis von 1: 2 Im Volumen als zweites Elulerungsmlttel verwendet werden. Die Elulerungsbedlngungen sind: 27 ml/h und 17 ml/Glas. Jede Fraktion wird der Papierchromatographie nach einem absteigenden Verfahren unter Verwendung eines Papiers (3MM, hergestellt von Whatman) und eines Lösungsgemisches aus n-Butanol, Pyrldin und Wasser als Entwlcklungsnilttel zur Fraktionierung und Isolierung der Fraktionen von Mannose, Glucose, Galactose und Uronsäure unterworfen. Die so fraktionierte Uronsäurefraktlon wird in einer geringen Wassermenge gelöst und, eine überschüssige Menge an Natriumborhydrid wird In die entstehende Lösung gegeben, die dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen wird. In die Lösung gibt man eine überschüssige Menge eines stark sauren Kationenaustauschharzes in H⁺-Form, und das entstehende Gemisch wird zur Zersetzung des überschüssigen Natriumborhydrids heftig geschüttelt. Nach der Filtration wird das Filtrat im Vakuum getrocknet und Methanol wird zugegeben. Das Verfahren der Methanolzugabe und des Trocknens wird zehnmal wiederholt. Dann wird das Produkt mit einem trockenen, stark sauren Katlonenaustauschharz In H*-Form und wasserfreiem Methanol vermischt und 2 h bei 100° C erhitzt. Nach dem Kühlen und Filtrieren werden Wasser und Natriumborhydrid In die Lösung gegeben, die dann über Nacht stehengelassen wird. Mit der Lösung wird eine Aldltol-Acetylierung und eine Gaschromatographie auf gleiche Weise durchgeführt, wie bei der oben erwähnten Aldltol-Acetylierung und Gaschromatographie der neutralen Zucker.

Man seilt fest, daß die Uronsäure nur eine ist und Glucuronsäure 1st, da nur ein Peak, der dem von acetyllertem Alditol der Glucose entspricht, beobachtet wird. Die quantitative Bestimmung der Glucuronsäure wird durch das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren durchgeführt. 1,60 mg gereinigtes Polysaccharid werden In 0,50 ml Wasser gelöst und mit Eis gekühlt. In die Lösung gibt man 3,0 ml konzentrierte Schwefelsäure unter Kühlen mit Eis und gutem Rühren. Die Lösung wird 20 min In siedendem Wasser erhitzt und unmittelbar mit kaltem Wasser auf Zimmertemperatur abgekühlt. In die Lösung gibt man 0,1 ml elnur 0,l»lgen Lösung aus Carbazol, hergestellt durch Auflösen von 10 mg Carbazol In 10 ml 9596lgem Alkohol. Die Menge an Glucuronsäure wird durch Messung der Absorption bei 535 nm nach 2 h nach der Zugabe von Carbazollösung bestimmt.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Glucuronsäure In einer Menge von 11,0 Mol-% In dem gereinigten Polysaccharid vorhanden ist.

Aus dem Wert und den Ergebnissen der oben erwähnten gaschromatographlschen Analysen der neutralen Zucker stellt man fest, daß die Bestandteilszucker in dem gereinigten Polysaccharid wie folgt sind:

MoI-⁰/.

Allose 9,8

Galactose 55,4

Glucose 10,7

Mannose 13,1

Glucuronsäure 11,0

Die Allose-Identlflzlerung und -Bestätigung wird erfolgt durch eine gaschromatographische Analyse zusammen mit einer authentischen Probe, und man stellt fest, daß beide Retentlonszelten zusammenfallen. Weiterhin wird das folgende Verfahren durchgeführt:

Die Glucosefraktlon, die nach dem oben erwähnten SSulenchromatographleverfahren, gefolgt von der Paplerchrom&tographle, erhalten wurde, wurde einer Elektrophorese unter Verwendung von Papier (3MM, hergestellt s von Whatman) In Natriumboratlösung (0,1 M, pH 9,2) bei einem elektrischen Potentialgradienten von 15 V/cm durchgeführt. Man erhält 2Flecken. Es wurde bestätigt, daß diese die gleichen Mobilitäten besitzen wie die authentischer Proben aus Glucose und Ailose, Weiterhin wurden 40 mg der Glucosefraktlon In 19,5 ml Phosphatpufferlösung (0,05 M, pH 6,8) gelöst. In die Lösung gibt man 1,5 ml einer wäßrigen Lösung aus Glucaseoxldase (Typ V, hergestellt von Sigma Chemical Co. aus Asperglllus nlger) mit einem Proteingehalt von 5,7 mg/ml für die Umsetzung. Die Reaktion wird 10 h bei 37° C fortgeführt. Die Reaktionslosung wird dann zur Deaktivierung des Enzyms erhitzt und zur Abtrennung unlöslicher Materialien zentrifugiert. Die Lösung wird mit einem Gemisch aus einem stark sauren Katlonenaustauschharz In H⁺-Form und einem stark basischen Anlonenaustauschharz in OH--Form delonislert und der Papierchromatographie unter den oben erwähnten Bedingungen zur Isolierung der Ailose unterworfen. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Isolierten Ailose stim- >* men Im wesentlichen mit denen einer authentischen Probe von Ailose überein.

Es konnte weiterhin festgestellt werden, daß der Zuckerbestandtell In D-Form vorliegt, durch Messung der spezifischen Rotationen jedes Isolierten Zuckerbestandtells. Aus der Methyllening nach dem Hakomorl-Verfahren, der Smith-Zersetzung, der Smith-Zersetzung einschließlich einer verzögerten Hydrolyse, dem oben erwähnten Infrarotspektrum usw. konnte festgestellt werden, daß die Hauptkette des Polysaccharids Galactose, gekup- pelt in /3-1,3-Blndungen mit Seltenketten In den 4- und 6-Stellungen, enthält, wobei die Seltenketten Galactose, Mannose und Glucose wie auch Glucuronsäure In den Endstellungen enthalten.

10 ml einer wäßrigen Lösung des gereinigten Polysaccharids (2 Gew.-«) werden zusammen mit 10 ml einer wäßrigen Lösung aus Calciumchlorid (1,0 Gew.-«) In 11 Fermentationsflüssigkeit gegeben, die bei der Lyslnfermentatlon erhalten wurde, mit einem pH-Wert von 8,0 und In einer Stufe vor der Entfernung der mlkrobleüen Zellen, und dann wird der pH-Wert der Flüssigkeit auf 10 eingestellt. Die mlkroblellen Zellen werden zusammengeballt und sedlmentiert. Man erhält eine überstehende, klare Lösung.

Die so behandelte Flüssigkeit kann sehr leicht filtriert werden, und L-Lysln kann aus dem Flltrat gewonnen werden. Andererseits beobachtet man keine wesentliche Änderung In der gleichen Fermentatlonsfiüsslgkeit, wenn nur eine wäßrige Lösung aus Calciumchlorid zu der Flüssigkeit zugegeben wird und der pH-Wert der ^M li\ Flüssigkeit anschließend, wie oben beschrieben, eingestellt wird. Im letzteren Fall konnte die Flüssigkeit nicht i Il so leicht filtriert werden wie die ursprüngliche Fermentationsflüssigkeit. Man erhält Im wesentlichen die gleichen Ergebnisse, wenn man rohes Polysaccharid anstelle des gereinigten Polysaccharids verwendet.

Beispiel 2

Die Kultlvlejung erfolgt auf ähnliche Welse wie In Beispiels 1, wobei man ein Medium verwendet, das die in Tabelle I aufgeführte Zusammensetzung aufweist, mit der Ausnahme, daß es 0,05 Gew.-« Ammonlumsulfat, 0,05 Gew.-« Ammonlumchlortd und 0,05 Gew.-« Dlammonium-monohydrogenphosphat anstelle von 0,40 Gew.-« Dlammonlum-monohydrogenphosphat und keine 0,02 Gew.-« Hefeextrakt enthält. Die Kultlvlerungs- *° zelt beträgt 45 h, und Ammoniakwasser enthaltendes Methanol wird zur Kontrolle des pH-Wertes zugegeben, wobei das Ammonlak-zu-Methanol-Verhältnis 15:1 beträgt. Die verbrauchte Menge an Ammoniakwasser enthaltendem Methanol beträgt 125 ml. Man erhält ein rohes Polysaccharid In einer Menge von 30,0 g, das auf gleiche Weise, wie In Beispiel 1 beschrieben, unter Bildung des Polysaccharids gereinigt wird. .

Dieses gereinigte Polysaccharid wird den gleichen Messungen und Analysen, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen. Die Ergebnisse sind Im folgenden aufgeführt:

Elementaranalyse:

berechnet aus so

HON

C_nH_2nO_n: 40,00% 6,67% 53,33%

gefunden: 40,93% 6,30% 52,24% 0,53%

Molekulargewicht: Es verteilt sich zwischen 1,0 χ 10* und 1,0 χ 10', und der Vertellungspeak liegt bei 2,Ox 10⁵. Spezifische Drehung:

[a]% = +31,9 (C= I.Wasser). Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Mol-%

AIlose 6,2

Galactose 52,4

Glucose 17,8

Mannose 12,5

to Glucuronsäure 11,0

Die anderen Charakterlstlka sind im wesentlichen die gleichen wie bei Beispiel 1. Beispiel 3

1,01 einer Losung der gleichen Zusammensetzung, wie In Tabelle I gezeigt, mit Ausnahme von Methanol, wird Ln einen 2,01 Fermentationskessel vom Mlnl-Krugtyp gegeben. Nach dem Sterilisieren des Kessels während 15 min be! 12O⁰C werden 20 ml Methanol In den Kessel eingegeben, wobei man die Sterilität aufrechterhält. Man erhält ein Medium.

50 ml Impfkultur, die durch Kultivieren von einem Pseudomonas vlscogena TS-1004-Stamm (FERM-P Nr. 3811) In einem Medium, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben hergestellte Medium hat, bei 30°C während 24h hergestellt.worden Ist, wurden in den.Kessel gegeben.

Die Züchtung erfolgt während 16 h bei 30° C mittels einer submersen Kultur unter Verwendung einer Rotationsrate der Rührvorrichtung von 800 U/mln. Luft wurde in einer Menge von 11/mln eingeblasen. Während dieser Zeit wird Natriumhydroxid (2 N) zur Einstellung des pH-Wertes der Kultur auf 7,0, zugegeben. Ein Teil der Kultur wird dann extrahiert, so daß der Flüsslgkeltsgehalt In dem Fermentationskessel 780 ml beträgt. Nach der Extraktion wird eine neue, sterilisierte Losung der gleichen Zusammensetzung, mit der Ausnahme, daß die Methanolkonzentration 0,8 Gew.-% beträgt, In den Kessel In einer Rate von 135 ml/h gegeben, und die Kultur wird gleichzeitig bei gleicher Rate wie das Beschickungsmaterial extrahiert. Eine kontinuierliche Strömungsa> Züchtung erfolgt auf gleiche Weise. Die Kultur wurde 45 h nach Beginn der kontinuierlichen Züchtung extrahiert, und sie enthält mlkroblelle Zellen In einer Menge von 11,7 g/l und Polysaccharld In einer Menge von 17,1 g/l. ,.._ ... .

In 200 ml der extrahierten Kultur gibt man 400 ml Wasser, und das Gemisch wird 30 min bei 5° C und 10 000 U/mln zur Entfernung der mlkroblellen Zellen und der Feststoffe zentrifugiert. Das entstehende, überstehende Material wird In 1,81 Aceton unter Rühren gegossen. Die Behandlung des Gemisches auf ähnliche Welse wie In Beispiel 1 ergibt ein rohes Polysaccharld In einer Menge von 3,4 g.

Die weitere Reinigung erfolgt auf ähnliche Welse wie In Beispiel 1; man erhält gereinigtes Polysaccharld.

Das entstehende Polysaccharld wird den Messungen und Analysen auf gleiche Welse wie In Beispiel 1 unterworfen. Die Ergebnisse werden Im folgenden aufgeführt.

Elementaranalyse: berechnet aus

45 _n

HON

40,00% 6,67% 53,33% gefunden: 39,67% 6,41% 53,20% 0,72%

Molekulargewicht: Es verteilt sich zwischen 2,0 χ 10⁴ und 1,0 χ 10', und der Vertellungspeak Hegt bei 2,Ox 10'. Spezifische Drehung:

55 [«]# = +32,1 (c = l, Wasser).

Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Mol-%

Allose 10,9

Galactose 59,3

Glucose 11,0

Mannose 7,5

Glucuronsäure 11,3.

10

Die anderen Eigenschaften sind im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1. Beispiel 4

Die Kultivierung wird auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, unter Verwendugn eines Mediums der gleichen Zusammensetzung, wie in Tabelle I aufgeführt, mit der Ausnahme, daß es 0,20 Gew.-% Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid bzw. Dlammonlum-monohydrogenphosphat anstelle von 0,40 Gew.-% Dlammonium-monohydrogenhosphat enthalt. Die Kultivierungszeit betragt 48 h.

Ammoniakwasser enthaltendes Methanol, bei dem das Verhältnis von Methanol zu Ammoniak 10:1 beträgt, wird in elBäX- Menge von 103 ml verbraucht.

Die entstehende Kulturflüssigkeit wird auf gleiche Welse wie In Beispiel 1 behandelt. Man erhält 19,8 g rohes Polysaccharid. Die Reinigung des rohen Polysaccharids und die Messungen und Analysen des entstehenden, gereinigten Polysaccharids werden auf gleiche Weise wie In Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält die folgenden Ergebnisse: '

j

Elementaranalyse:
berechnet aus

CHON

40,00% 6,67% 53,33% gefunden: 40,12% 6,35% 53,08% 0,45%

	Mol-%
Allose	11,3
Galactose	51,7
Glucose	13,4
Mannose	12,9
Glucuronsäure	10,8

HON

CH_2nO_n: 40,00% 6,67% 53,33% gefunden: 39,89% 6,45% 53,15% 0,51%

Molekulargewicht:

Es verteilt sich zwischen 1,0 χ 10⁴ und 5,0 χ 10', und der Vertellungspeak liegt bei 5,0 χ 10^!.

Molekulargewicht:

Es verteilt sich zwischen 3,0 χ 10* und 2 χ 10', und der Verteilungspeak Hegt bei 5,0 χ ΙΟ⁵.

Spezifische Drehung:

[<*]# =+32,3° (c = l, Wasser).
Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

40 45

Die anderen Eigenschaften sind Im wesentlichen die gleichen wie bsi Beispiel 1. Beispiel 5

Die Züchtung und die Isolierung des rohen Polysaccharids werden durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man eine Züchtungstemperatur von 27° C und eine Züchtungszelt von 40 h verwendet. Die Menge an entstehendem, rohem Polysaccharid beträgt 12,5 g. Die Reinigung des rohen Polysaccharids und die Messungen und Analysen des entstehenden, gereinigten Polysaccharids erfolgen auf gleiche Weise wie In Beispiel 1. Man erhält die folgenden Ergebnisse:

Elementaranalyse:
berechnet aus

60

Spezifische Drehung:

[«]# = +31,8° (c=l, Wasser).

Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Mol-%

Allose 8,7

Galactose 58,6

Glucose 10,6

Mannose 11,1

Glucuronsäure 11,0

. Die anderen Elgenschaftenslnd Im wesentlichen gleich wie In Beispiel

Kurze Erläuterung der Zeichnungen:

Die Flg. 1 und 2 zeigen die Infrarot-bzw. Ultravlolett-Absorptlonsspektren des erfindungsgemäßen Polysaccharide.

²⁵ Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

12

Claims

Patentansprüche:

1. Polysaccharid mit folgenden Eigenschaften:

s 1) Zuckerbestandteile:

AUose zu etwa 6 bis etwa 12 MoI-*

Galactose zu etwa 50 bis etwa 60 Mol-%

Glucose zu etwa 10 bis etwa 20 Mol-96

Mannose zu etwa 7 bis etwa 14 Mol-%

Glucuronsaure zu etwa 10 bis etwa 12 Mol-%.

2) Molekulargewicht Im Bereich von etwa 1 χ 10* bis etwa 1 χ ΙΟ⁷.

3) Schmelzpunkt:

kein klarer Schmelzpunkt, Zersetzung über einer Temperatur von etwa 210 bis 220° C.

4) Löslichkeit:

Löslich In Wasser, jedoch unlöslich In Methanol, Äthanol, Äthern, Aceton.

5) Farbreaktionen:

Anthron-Reaktlon positiv

Nlnhydrin-Reaktlon negativ

Dische's Carbazol-Reaktlon positiv

..._ _Dische's Cystein^Schwefelsäure-Reaktlon positiv

6) Spezifische Rotation:

fa/# = etwa +30° bis etwa +35° (c= 1, Wasser)

erhältlich als extrazelluläres Produkt von Pseudomonas vlscogena, FERM-P Nr. 3811, ATCC-Nr. 31504, _ bzw, DSM-Nr. 1634. _..._. _. -