DE2915872A1

DE2915872A1 - Polysaccharide und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2915872A1
Application number: DE19792915872
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Igarashi; Hisao Takemoto
Original assignee: Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1978-04-20
Filing date: 1979-04-19
Publication date: 1979-10-31
Also published as: GB2019863A; FR2423540B1; SE443804B; AU4616479A; AU523757B2; FR2423540A1; SE7903415L; US4312979A; IT7922028A0; GB2019863B; CA1157408A; IT1165039B; DE2915872C2

Description

A. GRÜNECKER H. KINKELDEY

CR-ING.

W. STOCKMAIR OR-HMa- MEtCAUH»

K. SCHUMANN

P. H. JAKOB G. BEZOUD

8 MÜNCHEIVT 22

MAXIMIUANSTRASSe 4a

19. April 1979 P 13 734--60/CO

Polysaccharide und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharide. Polysaccharide werden taxonomisch entsprechend ihrem Ursprung als solche, die als Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen stammen,
klassifiziert.

Beispiele von aus Pflanzen stammenden Polysacchariden sind Cellulose, Pectin, Amylose-karrageenin, Agar-Agar und dergl.. Beispiele von aus Tieren stammenden Polysacchariden sind
Heparin und Condroitin-schwefelsäure.

Es ist gut bekannt, daß einige Mikroorganismen Polysaccharide ergeben. Von den Polysacchariden wurden Dextran, Xanthangummi, Pullan, Curdlan und dergl. verwendet oder werden in der Industrie verwendet. Der Hauptzuckerbestandteil dieser mikrobiologischen Polysaccharide, die verwendet werden oder

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THLBFON (OSB) 993809 TELKX OB-QOaSO TELSaRAMMC MONAPAT TELEfCOPIERER

in der Industrie verwendet werden, ist in jedem Fall Glucose. Andererseits ist Galactose in Polysacchariden, wie Gummiarabikum, Tragantgummi, Ghattigummi, Arabo-Galactan, enthalten, die aus wesentlich höheren Pflanzen stammen- Diese Polysaccharide können für einige Zwecke verwendet werden, für die sie durch die oben erwähnten, mikrobiellen Polysaccharide nicht ersetzt werden können.

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharide, die AlIose als Zuckerbestandteil enthalten. Allose gehört zu der Klasse der Aldohexosen, und man hat nicht angenommen, daß sie natürlich vorkommt.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide enthalten weiterhin Galactose als einen überwiegenden Zuckerbestandteil. Die Summe der Gehalte an Allose und Galactose beträgt mindestens 50 Mol-%.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einem Nährmedium Bakterien, die zum Genus Pseudomonas gehören und die Allose als Zuckerbestandteil enthaltende Polysaccharide bilden können, zur Akkumulierung des Polysaccharids in dem Medium und Abtrennung und Wiedergewinnung des Polysaccharids kultiviert.

Die strukturellen und physiko-chemikalischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Polysaccharide sind wie folgt:

(1) Bestandteilszucker und ihr Verhältnis im Vorhandensein; Allose etwa 6 bis etwa 12 Kol-?6 Galactose etwa 50 bis etwa 60 Mol-# Glucose etwa 10 bis etwa 20 Uoi-% Mannose etwa 7 bis etwa 14 Wol-% Glucuronsäure etwa 10 bis etwa 12 Mol-96.

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Da die Bindungen zwischen Mannose und Glucuronsäure relativ hydrolysebeständig sind, können die analytischen Werte der Mannose, abhängig von dem verwendeten analytischen Verfahren, geringer sein.

(2) Elementaranalyse

Man erhält Werte, die sehr eng an denen liegen, die man aus der allgemeinen Formel C_nH_2nO_n berechnet.

(3) Schmelzpunkt

Die Polysaccharide zeigen keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzen sich über einer Temperatur von etwa 210 bis 220⁰C.

(4) Infrarotspektrum

Die Spektren zeigen die folgenden Absorptionen:

im Bereich von 3400 cm 0-H-Dehnung im Bereich von 2890 cm C-H-Dehnung im Bereich von 1620 cm Dehnung der Carb-

oxylatanionen

im Bereich von 880 cm~ bedingt durch die

Orientierung der ß-Glucosido-Bindungen

(5) Ultraviolett-Absorptionsspektren

Die Spektren zeigen keine klare, charakteristische Absorption.

(6) ^C-kernmagnetische Resonanzspektren

Man beobachtet ein Methylsignal der Acetylgruppen und ein Carboxylsignal im Carbonylabsorptionsbereich. Jedoch konnte das Carbonylsignal der Acetylgruppen nicht bestätigt werden. Man nimmt daher an, daß, obgleich ein Teil der Hydroxylgruppen acetyliert ist, das Verhältnis der Acetylierung relativ gering ist.

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(7) Löslichkeit in Lösungsmitteln

Die Polysaccharide sind in Wasser löslich, jedoch in Methanol, Äthanol, Äthern, Aceton oder dergl. unlöslich..

(8) Farbreaktion

Anthron-Reaktion positiv

Ninhydrin-Reaktion negativ Dische's Carbazol-

Reaktion positiv

Dische's Cystein-Schwefelsäure-Reaktion positiv

(9) Azidität ' ·
Sauer.

(10) Aussehen

Es zeigt ein weißes, baumwollartiges oder ein faserartige» Aussehen in trockenem Zustand.

(11) Molekulargewicht

Es liegt zwischen etwa 1 χ 10 und etwa 1 χ 10 »

(12) Spezifische Rotation

[a]^⁵ = etwa +3CP bis etwa +35° (c = 1, Wasser)

(13) Aussehen der wäßrigen Lösung

Eine wäßrige Lösung des Polysaccharide ist farblos und transparent und viskos.

(14) Verhalten gegenüber Galciumsalzen

Das Po lys ac charid wird in alkalischer, wäßriger Lösung zu. einem Gel zusammengeballt, wenn Calciumhydroxid oder ein Calciumsalz, wie Calciumchlorid, zu der Lösung, gegeben wixtL.

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Die Polysaccharide sind nützlich als viskose Materialien, St bilisatoren, Emulgiermittel, Mittel zur Verbesserung der Qua tat und dergl., wie im Falle von Dextran, Xanthangummi, Gumm von Pflanzen u.a., und werden für die Erzeugeung von Nahrung mitteln, Pharmazeutika, Kosmetika usw. verwendet. Die Polysaccharide können ebenfalls als formbare Rohmaterialien für biozersetzbare Filntformlinge verwendet werden, da die Polysaccharide zu Filmen verarbeitet werden können· Die Polysaccharide können ebenfalls als Ausflockungshilfsmittel verwendet werden, da die Polysaccharide zu einem Gel in wäßriger . Lösung in Anwesenheit eines Calciumsalzes zusammenballen.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide können durch Kultivierung von Bakterien, die. zum Genus Pseudomonas gehören und die Polysaccharid, das AlIose als Zuckerbestandteil enthält, bilden können, in einem Nährmedium erzeugt werden, wobei das Polysaccharid in dem Medium angereichert wird und anschließend das Polysaccharid abgetrennt und gewonnen wird.

Einer der Mikroorganismen, der bei dem erfindungsgemäßen Ver fahren verwendet werden kann, ist Pseudomonas viscogena, FERM-P Nr. 3811 bzw. ATCC-Nr. 31504, der aus dem Boden von der Anmelderin isoliert worden ist.

Die taxonomischen Eigenschaften werden in der JA-OS 118585/ 1978 beschrieben und sind wie folgt:

(A) Untersuchung der Zellmorphologie nach der Inokulierung bei 30°C während 6 bis 24 Stunden auf einem Nährbrühenagar:

(1) Zellform , Stäbchen

(2) Zellgröße etwa 1,0 χ 0,7 (/u)

(3) Anordnung einzeln oder paarweise

(4) Motilität bewegliche durch polare Geißeln

(5) Endsporen (Endosporen) keine

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', GOPV
OBf

Jy.

(6) Anfärbbarkeit negativ

(7) Säurebeständigkeit negativ

(B) Kultureigenschaften

(1) Kultivierung auf einer Nährbrühenagarplatte nach der * Inokulation bei 3O⁰C während 2 Tagen:

(a) Rate für die Koloniebildung ' normal

(b) Form der Kolonien ■ ^: kreisförmig, etwa 3,5

im Durchmesser

(c) Oberfläche der Kolonien glatt

(d) Erhöhung des Wachstums konvex

(e) Kanten der Kolonien . vollständig

(f) Tühalt der Kolonien . amorph

(g) Farbe der Kolonien schwach gelb (h) Durchlässigkeit der Kolonien opak

(1) Glänzen der Kolonien , . glänzend

(j) Bildung von löslichem Färb- ,

Stoffmaterial keine

(2) Bewertung auf einer Nährbrühenagarschrägkultur nach der Inokulation bei 3O°C während 2 Tagen:

(a) Wachstum . übermäßiges Wachstum

(b) Form des Wachstums ausbreitend

(c) Querschnittsansicht der Kolonien flach

(d) Glitzern des Wachstums ' glitzernd

(e) Oberfläche der Kolonien glatt

(f) Durchlässigkeit der Kolonien opak

(g) Farbe, der Kolonien schwach gelb

(h) Theologische Eigenschaften der

Kolonien - dickflüssig

(3) Kultivierung in einer Nährbrühe nach der Inokulation bei 30°C wahrend 2 Tagen:

(a) Wachstum auf der Oberfläche membranartig

(b) Trübung mäßig trüb

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ORIGINAL INSPECTED

(c) Präzipitationsliildung

(d) Bildung von Gas

(e) Verfärbung des Mediums

kompakt keine keine

Kultivierung in einem Nährbrühenagarstich nach, der Inokulation bei 30⁰C während 2 Tagen:

(a) Ort des Wachstums

(b) Durchstie&lifiie.

am besten oben papp±lenartig

(5) Kultivierung in einem Nährbrühenge-latinestich nach der Inokulation bei 20⁰C während Z Wochen:

(a) Verflüssigung der Gelatine keine

(6) Wachstum in Milch

(a) Reaktion

(b) Gasbildung

(c) Koagulation oder Verflüssigung

(C) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion des Nitrats

(2) Denitrifikation

(3) MR-Test

(4) VP-Test

(5) Bildung von Indol

(6) Bildung von Schwefelwasserstoff

(7) Hydrolyse der Stärke

(8) Ausnutzung von Citronensäure

(9) Ausnutzung einer anorganischen Stickstoffquelle

(10) Bildung von Farbmaterial Verfärbung keine Koagulation

es findet eine Reduktion zu N₂ statt

die Stickstoffquelle in entweder der NO3- oder NH-2-Form wird ausgenutzt

es wird ein grünes» fluoreszierendes Material gebildet

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A n» » 4. »

(11) Ulease bzw. Urease ■+ ' ■

(12) Oxidase +

(13) Catalase +

(14) Wachstumsbereich 4 bis IO im pH und bei

einer Temperatur von 10 bis 42°C

(15) Sauerstofferfordernis aerob

(16) O-F-Test . Oxidation

(17) Säure- oder Gasbildung aus Zuckern

Gas

Zucker	Wachstum	Säure
L-Arabinose	+	+
D-Xylose
D-Glucose	+
D-Mannose		-
D-Fuctose	+
D-Galactose	+
Maltose	+
Saccharose		-
Lactose		-
Threpharose	+	—
D-Sorbit	+	-
D-Mannit	+	-
Inosit.	+	- —■■
Glycerin
Stärke	+

Pseudomonas viscogena kann unter Verwendung verschiedener Klassen organischer Substanzen als Kohlenstoffquelle wachsen» z.B. von Methanol, Äthanol, Isopropanol, Äthylenglykol, Propylenglykol, Glycerin, Glucose u.a.. Insbesondere können sieh die erf indungs gemäßen Polysaccharide in beachtlichem Ausmaß in Medien ansammeln, wenn der Mikroorganismus unter Verwendung von Methanol als KohlenstoffquelXe kultiviert wird. Die geeignete Menge an Methanol in-der Kultur ist; eine Konzentration unter 5 Gew.%, und besonders bevorzugt ist eine Konzentration im Bereich von 0,5 bis 3 Ge\r,% wegen

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des guten Bakterienwachstums und der Fortpflanzung.

Als Stickstoffquelle des Mediums können anorganische Stickstoff verbindungen, die bei bekannten Fermentationen verwendet werden, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniak, Diammoniumphosphat, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, und/ oder organische, Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Harnstoff, Maisquellwasser, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt, verwendet werden.

Außer den obigen können Mineralsalze, z.B. Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Phosphate, Eisensalze, Mangansalze, Zinksalze und Kupfersalze verwendet werden. Die Zugabe von organischen Materialien, wie Sojabohnenproteinhydrolysatlösung, Hefeextrakt, Vitamine oder Aminosäuren, ist für die Aktivierung des Bakterienwachstums günstig. Die Kultivierung wird aerob, normalerweise in einem Temperaturbereich von 20 bis 42⁰C und bevorzugt 25 bis 38°C und in einem pH-Bereich von 5 bis 9 und bevorzugt von 5,5 bis 7,5 mittels einer Schüttel- oder untergetauchten Kultur,durchgeführt.

Tabelle I zeigt ein Beispiel eines synthetischen Mediums, das Methanol enthält und das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.

Tabelle I	Methanol	pH 7,0	1,5 Gew
Diammonium-monohydro genpho sphat		0,40 "
Monokalium-dihydrogenphosphat	0,10 »
Dikalium-monohydrogenphosphat	0,10 «
Magnesiumsulfat-heptahydrat	0,05 *
Eis en(II)-sulfat-heptahydrat	0,001 «
Calciumchlorid-dihydrat	0,001 ⁿ
Hefeextrakt	0,02 «
Wasser	Rest

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Wahrend der Kultivierung kann sich der pH-Wert der Kultur auf einen niedrigeren Wert ändern, abhängig von dem verwendeten Medium.

In einem solchen Fall können Alkalien, wie Ammoniak, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf einem vorbestimmten Wert zugegeben werden.

Die erf indungs gemäß en Polysaccharide besitzen ein Molekulargewicht, das im Bereich von etwa 1 χ 10 bis etwa 1 x 10 , wie oben erwähnt, liegt. Die Molekulargewichtswerte können sich etwas ändern, abhängig von den Züchtungsbedingungen, z.B. dem Konzentrationsverhältnis der Kohlenstoff- und der Stickstoff quellen, Änderungen in der Konzentration der Phosphate usw. Sie können sich weiterhin geringfügig ändern in Abhängigkeit von dem Verhältnis von Methanol und Ammoniak, wenn eine Lösungsmischung aus Methanol und Ammoniak als Neutralisationsmittel verwendet wird.

Die Abtrennung der Allose als Zuckerbestandteil enthaltenden Polysaccharide aus der Kultur erfolgt z.B. wie folgt.

Nach der Kultivation wird die Kultur einer Zentrifugentrennung oder Filtration unter Verwendung eines . Pil-fcerhilf smittels zur Entfernung der Zellen unterworfen·

Die Kultur wird auf geeignete Weise verdünnt, und dann werden die Zellen, wie oben erwähnt, entfernt, wenn die Viskosität der Kultur hoch ist. Rohe Polysaccharide werden als weiße Fasern durch Zugabe eines in Wasser löslichen organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol, Äthanol oder dergl., in dem obigen, überstehenden Material erhalten.

Die rohen Polysaccharide werden erneut in. Wasser nach dem Waschen mit einem Äther und Äthanol gelöst, in der Wärme behandelt, wie 15 Minuten bei 80°C, durch Zugabe von Trichlor-

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essigsaure wird das Protein entfernt und dann wird zur Entfernung der Niederschläge zentrifugiert oder filtriert.

Das entstehende, überstehende Material wird einer Dialyse und einer Lyophilisierung unterworfen, wobei man gereinigte Polysaccharide in Form weißer Fasern erhält.

Es ist nicht erforderlich, das Polysaccharid zu einem trockenen Feststoff aufzubereiten, wenn es in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden kann.

Pseudomonas viscogena bildet das erfindungsgemäße Polysaccharid, das Allose als Bestandteilszucker enthält, in hoher Konzentration und mit sehr hoher Rate bei der Ausnutzung der Kohlenstoff quelle. Beispielsweise ist es möglich, die Polysaccharide in einer Menge von 30 g/l, bezogen auf das Kulturmedium, zu bilden ι wenn die Züchtung in einer eingetauchten Kultur unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoff quelle durchgeführt wird. Es ist weiterhin möglich, die Ausbeute an Polysaccharid auf etwa 30%, bezogen auf die Menge an verwendetem Methanol, einzustellen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1,0 1 einer Lösung, die die gleiche Zusammensetzung, wie in Tabelle I angegeben, aufweist, mit Ausnahme von Methanol, wird in einen 2,0 1 Fermentationskessel des Mini-Krugtyps gegeben. Nachdem der Kessel 15 min bei 120⁰C sterilisiert worden ist, werden 20 ml Methanol in den Kessel unter Bildung des Mediums zugegeben, wobei die Sterilität aufrechterhalten wird.

50 ml Impfkultür, die durch Kultivieren von. einem Pseudomonas viscogena TS-1OO4-Stamm (= FERM-P Nr. 3811) in einem Medium der gleichen

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ORIGINAL INSPECTED

Zusammensetzung wie das oben hergestellte Medium bei 30°C während 24 h erhalten worden ist, wurden in den Kessel ge-' pflanzt. Die Züchtung erfolgte bei 30°C während 48 h mit einer submersen Kultur, wobei die Rotationsgeschwindigkeit des Rührers 800 U/min beträgt und Luft in einer Menge von 1 l/min eingeblasen wird, wobei Methanol, das Ammoniakwasser enthält, zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Kultur bei 7,0 zugegeben wird.

Das Molyerhältnis von Methanol zu Ammoniak in dem Ammoniakwasser enthaltenden Methanol beträgt 10:1. Die Menge an. Methanol, die zu der Kultur während der Züchtung zugegeben wurde, beträgt 73 g.

Nach der Züchtung werden 2 1 Wasser zu der Kultur zugegeben, und dann wird die Kultur 30 min bei 5°C und 10 000 U/min zentrifugiert, um Bakterienzellen und feste Materialien zuentfernen. Das entstehende, überstehende Material wird unter Rühren in 9 1 Aceton gegossen. Das in Aceton unlösliche Produkt wird abfiltriert und ausreichend mit Äthanol und Äther gewaschen und lyophilisiert. Man erhält .15,3 g rohes Polysaccharid.

10 g des so entstehenden, rohen Polysaccharide werden in 1 Wasser gelöst und Trichloressigsäure wird zu der Lösung zugegeben, so daß die Lösung eine Konzentration an Trichloressigsäure von 3 Gew.% erreicht. Nach dem Stehenlassen der Lösung über Nacht wird die Lösung 20 min bei 5°C und 10 000 U/min zur Entfernung fester Materialien zentrifugiert. Das überstehende Material wird erneut in die dreifache Menge an Aceton zur erneuten Ausfällung des Polysaccharide gegossen.

Nach der Abtrennung des entstehenden Polysaccharidniederschlags wird dieser erneut in Wasser aufgelöst, und eine

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wäßrige Lösung aus Cetyltrimethyl-ammoniumbromid wird zu der Lösung zur Ausfällung des Polysaccharids als Komplex mit Cetyltrimethyl-ammoniumbromid zugegeben.

Der Komplex wird ausreichend mit Wasser und Äthanol zur Entfernung von überschüssigem Cetyltrimethyl-ammoniumbroiaid gewaschen. Dann wird eine wäßrige Lösung aus Natriumchlorid zu dem Komplex zu seiner Auflösung gegeben.

In die entstehende Lösung aus Polysaccharid wird die 3fache Menge an Äthanol zur Ausfällung des Polysaccharids gegeben· Der Niederschlag wird abgetrennt, lyophilisiert und erneut in Wasser gelöst. Die entstehende Lösung wird in ein Cellophanrohr für die Dialyse gegeben und einer Dialyse in strömendem Wasser während 3 Tagen unterworfen· Dann wird die 3fache Menge an Aceton in die Lösung für die Ausfällung gegeben. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und lyophilisiert; man erhält ein gereinigtes. Polysaccharid. Die Ausbeute beträgt 8g.

Die physiko-chemikalischen Eigenschaften des so entstehenden, gereinigten Polysaccharids sind wie folgt:

Elementaranalyse:

berechnet aus

: C 40,00% H 6,67% 0 53,33% N

gefunden: 40,25 6,06 53,02 0,67%

Schmelzpunkt:

Das Polysaccharid zeigt keinen klaren Schmelzpunkt- Der Gewichtsverlust, der bei einer Temperatur von 210 bis 22O°C beginnt und der von exothermer Wärme begleitet wird, wird in einer Differentialthermowaage beobachtet, die mit einem Aufzeichnungsgerät ausgerüstet ist, wobei man eine Rate von 10°C/min für die Temperaturerhöhung in Anwesenheit von Luft verwendet.

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ORlGlMAL INSPECTED

Infrarot-Absorptionsspektren:

Die mit einer KBr-Tablette gemessenen Spektren sind in Fig. 1 dargestellt. Aus der Figur sind die oben erwähnten» charakteristischen Absorptionen erkennbar.

Ultraviolett-Absorptionsspektreni

Die Ultraviolett-Absorptionsspektren werden in. einer wäßrigen Lösung, in der die Konzentration an Polysaccharid 0,097 GevT.% beträgt, gemessen und sind in Fig. 2 dargestellt. Aus der Figur ist erkennbar, daß die Spektren keine klare charakteristische Absorption aufzeigen, daß die Absorption jedoch etwas unter 310 nm und etwas unter 250 nm zunimmt.

^C kernmagnetische Resonanzabsorptionsspektren:

Signale, die durch chemische Verschiebungen hervorgerufen werden, werden bei 27,15 ppm und 176,97 ppm beobachtet in S -Werten in schwerer Wasserlösung. Sie können dem C der Methylgruppen in den Acetylgruppen und der Carbonylgruppen in carboxylischen Gruppen zugeordnet werden. Es wurde jedoch das Carbonylsignal der Acetylgruppen, das man im Bereich. von 169,0 ppm in S -Werten finden müßte, nicht festgestellt. Man nimmt daher an, daß, obgleich ein Teil der Hydroxylgruppen acetyliert ist, das Verhältnis der Acetylierung gering ist.

Aussehen, Löslichkeit und Farbreaktion:

Die gleichen Eigenschaften und Reaktionen, wie sie bereits erwähnt wurden, wurden beobachtet.

Molekulargewicht:

Es verteilt sich zwischen 1,0 χ 10^ und 5 χ 10 · Der Verteilungspeak beträgt 2 χ 10 .

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Die Messung erfolgt mittels Gelpermeationschromatographie an einer Lösung des Polysaccharids. Die Bedingungen sind wie folgt:

Menge der Probe 100/ul

Säule 0,96 cix 60 cm

Packmaterial hydrophiles Gel

Eluierungsmittel eine Lösungsmittelmischung aus

¹V₁₅ KH₂PO₄, ¹V₁₅ Na₂HPO₄ und

^M/io ^KC1

Detektor Differentialrefraktometer

Standard Dextran

Spezifische Drehung:

+32,2 (c=1, Wasser)

Aussehen der wäßrigen Lösung; Azidität; und Verhalten gegenüber Calciumsalzen:

Das Polysaccharid zeigt in wäßriger Lösung ein farbloses und transparentes Aussehen. Die Lösung zeigt eine Viskosität von 180 cP. bei Zimmertemperatur, bestimmt mit einem Rotationsviskometer. Die Zugabe einer wäßrigen Lösung aus Cetyltrimethyl-ammoniumbromid in die Lösung ergibt einen weißen Niederschlag. Der gleiche weiße Niederschlag wird durch. Zugabe einer Losung von Cetylpyridiniumchlorid erhalten. Dementsprechend ist das Polysaccharid sauer.

Die Zugabe einer wäßrigen Calciumchloridlösung zu einer wäßrigen Lösung des Polysaccharids, deren pH-Wert durch. Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 10 eingestellt wurde, ergibt eine Aggregation zu einem Gel.

Die Zugabe einer wäßrigen Calciumhydroxidlösung anstelle von wäßriger Calciumchloridlösung und wäßriger Natriuxahydroxidlösung ergibt das gleiche Ergebnis.

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ORiGINAL INSPECTED

Zuckerbestandteile und Zusammensetzung sowie chemische Struktu:

10 mg des gereinigten Polysaccharids werden in 0,5 ml Schwefelsäure (2N) gelöst und in einem geschlossenen Rohr 8 h "bei 100⁰C für die Hydrolyse erhitzt. Die entstehende Hydrolyselösung wird mit Bariumcarbonat neutralisiert und filtriert. Mit dem Filtrat wird eine Düimschichtchromatographie durchgeführt.

Das Filtrat wird auf eine Silikagelplatte aufgetragen und unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Pyridin und Wasser (Volumenverhältnis = 6:4:3) entwickelt. Dann wird mit Wasser gesättigtes n-Butanol, das p-Anisidinhydrochlorid in einer Menge von 3% enthält, aufgesprüht und dann wird bei 110 bis 120°C erhitzt.

Das Vorhandensein von Allose, Galactose, Glucose, Mannose und einer . IFronsäure wird beobachtet.

Für die quantitative Bestimmung der neutralen Zucker wird das Filtrat durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauschharz in H -Form gepackte Säule geleitet, und die Säule wird mit Wasser gewaschen. Die durchgelaufene Lösung wird kondensiert.

Es wird eine Alditol-Acetylierung und anschließend eine Gaschromatographie mit der köndensjörfcen Lösung durchgeführt, entsprechend dem Verfahren, das in "General Poiysaecaride Chemistry^, herausgegeben von Harada und Koizumi, veröffentlicht von Kodansha (1974), auf Seite 68 folgendermaßen beschrieben ist: 1 ml der kondensierten Lösung wird nach Zugabe von 10 mg Natriumborhydrid über Nacht stehengelassen. In die Lösung wird eine überschüssige Menge eines stark sauren Kationenaustauschharzes in H -Form gegeben, und das Gemisch wird mehrere Minuten heftig zur Zersetzung der überschüssigen Menge an Natriumborhydrid geschüttelt. Nach der Filtration

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wird das Filtrat im Vakuum getrocknet. Methanol wird zu dem entstehenden, getrockneten Produkt gegeben, das erneut bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet wird. Dann werden die Methanolzugabe und das Trocknen im Vakuum, zehnmal wiederholt.

Die Acetylierung erfolgt durch Zugabe von 0,2 ml einer Lösung aus Pyridin und Essigsäureanhydrid, wobei das Mischverhältnis 1:1 im Volumen zu dem trockenen Produkt beträgt. Man erhitzt 2 h bei 100⁰C. N_ach dem Kühlen wird eine geringe Wassermenge zu dem Reaktionsprodukt gegeben und es wird bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Die Zugabe von Wasser und das Trocknen im Vakuum v/erden viermal wiederholt. Das verbleibende Produkt wird in einer geringen Menge Chloroform gelöst und die entstehende Lösung wird als Probe für die Gaschromatographie verwendet. Die Bedingungen sind wie folgt:

Säule 0,4 cm χ 200 cm Glas säule

Packmaterial 3% ECNSS-M

auf Diatomeenerde, behandelt mit DMCS als Träger (100-120 mesh = 0,149-0,125 mm)

Säulentemperatur 190⁰C

Temperatur am

Eingang 240°C

Träger Stickstoff 40 ml/min . Detektor Wasserstoffionen-Flammenart

Der Nachweis der Uronsäure wurde wie folgi: durchgeführt: 7,0 g gereinigtes Polysaccharid werden in 900 ml Schwefelsäure (2N) gelöst und für die Hydrolyse 8 b in siedendem Wasser erhitzt. Die entstehende Hydrolyselösung wird mit Bariumcarbonat neutralisiert und filtriert. Das Piltrat wird durch eine Säule von 2,0 cm χ 13 cm, gepackt mit einem stark sauren Kationenaustauschharz in H⁺-Porm_r geleitet und die Säule wird mit Wasser gewaschen. Die entstehende, durchgelaufene Lösung wird zu einem Sirup kondensiert. 5 g Sirup

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2??$$72

werden der Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine Cellulosesäule (CF-11, 4,1 cm χ 54 cm, hergestellt von Whatman), ein Lösungsgemisch aus n-Butanol, Pyridin und Wasser in einem Verhältnis von 10:3s3 im Volumen als erstes Eluierungsmittel und eine Lösungsgemisch aus Äthanol und Wasser in einem Verhältnis von 1:2 im Volumen als zweites Eluierungsmittel verwendet werden. Die Eluierungsbedingungen sindr 27 ml/h und 17 ml/Glas. Jede Fraktion wird der Papierchromatographie nach einem absteigenden Verfahren unter Verwendung eines Papiers (3MM, hergestellt von Whaianan) und eines LS-sungsgemisches aus n^Butanol, Pyridin und Wasser als Entwicklungsmittel zur Fraktionierung und Isolierung der Fraktionen von Mannose, Glucose, Galactose und Uronsäure unterworfen. Die so fraktionierte Uronsäurefraktion wird in einer geringen Wassermenge gelöst und eine überschüssige Menge an Natriumborhydrid wird in die entstehende Lösung gegeben, die dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen wird. In die Lösung gibt man eine überschüssige Menge eines stark sauren Kationenaustauschharzes in H⁺-Fora, und das entstehende Gemisch wird zur Zersetzung des überschüssigen Natriumborhydrids heftig geschüttelt. Nach der Filtration wird das Filtra-t im Vakuum getrocknet und Methanol wird zugegeben. Das Verfahren der Methanolzugabe und des Trocknens wird zehnmal wiederholt. Dann wird das Produkt mit einem trockenen, stark sauren Kationenaus tauschharz in H -Form und was- serfreiem Methanol vermischt und 2 h bei 100⁰C erhitzt. Nach dem Kühlen und Filtrieren werden Wasser und Natriumborhydrid in die Lösung gegeben, die dann über Nacht stehengelassen wird. Mit der Lösung wird eine Alditol-Acetylierung und eine Gaschromatographie auf gleiche Weise durchgeführt;, wie bei der oben erwähnten Alditol-Acetylierung und Gaschromatographie der neutralen Zucker.

Man stellt fest, daß die Uronsäure nur eine ist und Glucuronsäure ist, da nur ein Peak, der dem von acetyliertem Alditol

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der Glucose entspricht, beobachtet wird. Die quantitative Bestimmung der Glucuronsäure wird durch das Carbasol-Schwefelsäure-Verfahren durchgeführt.

1,60 mg gereinigtes Polysaccharid werden in 0,50 ml Wasser gelöst und mit Eis gekühlt. In die Lösung gibt man 3,0 ml konzentrierte Schwefelsäure unter Kühlen mit Bis und gutem Rühren. Die Lösung wird 20 min in siedendem Wasser erhitzt und unmittelbar mit kaltem Wasser auf Zimmertemperatur abgekühlt. In die Lösung gibt man. 0,1 ml einer 0,1?Sigen Lösung; aus Carbosol, hergestellt durch Auflösen von 10 mg Carbasol in 10 ml 95%igem Alkohol. Die Menge an Glucuronsäure wird durch Messung der Absorption bei 535 mm nach. 2 3i nach der Zugabe von Carbasollösung bestimmt.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Glucuronsäure in einer Menge von 11,0 Mol-% in dem gereinigten Polysaccharid vorhanden ist.

Aus dem Wert und den Ergebnissen der oben erwähnten gaschroma to graphischen Analysen der neutralen Zucker stellt man fest, daß die Bestandteilszucker in dem gereinigten Polysaccharid wie folgt sind:

Mol-fl

Allose 9,3

Galactose 55,4

Glucose 10,7

Mannose 13,1

Glucuronsäure 11,0

Die Allose-Identifizierung und -Bestätigung wird, erfolgt durch eine gaschromatographische Analyse zusammen mit einer authentischen Probe, und man stellt fest, daß beide Retentions zeiten zusammenfallen. Weiterhin wird das folgende Verfahren durchgeführt:

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Die Glucosefraktion, die nach dem oben erwähnten Säulenchromatographieverfahren, gefolgt von dear Paprierchromatographie, erhalten wurde, wurde einer· Elektrophorese urrfcer Verwendung von Papier (3MM, hergestellt von Whatman) in Natriumboratlösung (0,1 M, pH 9,2) bei einem elektrischen Potentialgradienten von 15 V/cm durchgeführt» Man erhält 2 Flecken. Es wurde bestätigt, daß diese die gleichen Mobilitäten besitzen wie die authentischer Proben aus Glucose und Allose. Weiterhin wurden 40 mg der Glucosefraktion in 19,5 ml Phosphatpufferlösung (0,05 M, pH 6,8) gelost. In die Lösung gibt man 1,5 ml einer wäßrigen Losung aus Glucoseoxidase (Typ V, hergestellt von Sigma Chemical Co· aus Aspergillus niger) mit einem Proteingehalt von 5,7 mg/ml für die Umsetzung. Die Reaktion wird 10 & "bei 37°C fortgeführt» Die Reaktionslösung wird dann zur Deaktivierung des Enzyms erhitzt und zur Abtrennung unloslicfeer Materialien. zentrifugiert. Die Lösung wird mit einem Gemisch aus einem stark sauren Kationenaus tauschharz in H⁺-Form tmd einem stark basischen Anionenaustauschharz in. (M~—Form deionisiert und der Papierchromatographie unter den oben erwähnten Bedingungen zur Isolierung der Allose unterworfen. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Isolierten Allose stimmen im wesentlichen mit denen einer authentischen Probe von Allose überein. -

Es konnte weiterhin festgestellt werden, äaS der Zuckerbestandteil in D-Form vor liegt, durch Messung der spezifischen Rotationen jedes isolierten Zuckerbes1;and"teils· Aus der Methylierung nach dem Hakomori-Yerfahren·, der Srai-äi-Zersetzung, der Smith-Zersetzung einschließlicii einer verzögerten Hydrolyse, dem oben erwähnten Infrarotspektrum. usw. konnte festgestellt werden, daß die Hauptkette äj&s Polysaccharide aus Galactose, gekuppelt in ß-1,3-Bindungen mil; Seitenketten in den 4- und 6-Stellungen, besteht, wobei die Seitenketten Galactose, Mannose und Glucose wie auch Glucuronsäure in den Endstellungen enthalten.

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10 ml einer wäßrigen Lösung des gereinigten Polysacchariäs (2 Gew.%) werden zusammen mit 10 ml einer wäßrigen Lösung aus Calciumchlorid (1,0 Gew.%) in 1 1 Fermentationsflüssig;-keit gegeben, die bei der Lysinfermentation erhalten wurde, mit einen pH-Wert von 8,0 und in einer Stufe vor der Entfernung der mikroMeilen Zellen, und dann wird der pH-Wert der Flüssigkeit auf 10 eingestellt. Die mikrobiellen Zellen wer den zusammengeballt und sedimentiert» Man erhält eine überstehende, klase Lösung.

Die so behandelte Flüssigkeit kann sehr leicht filtriert werden, und L-Lysin kann aus dem Filtrat gewonnen werden» Andererseits beobachtet man keine wesentliche Änderung in der gleichen Fermentationsflüssigkeit, wenn nur eine wäßrige Lösung aus Calciumchlorid zu der Flüssigkeit zugegeben wird und der pH-Wert der Flüssigkeit anschließend, wie oben beschrieben, eingestellt wird. Im letzteren Fall konnte die Flüssigkeit nicht so leicht filtriert werden wie die ursprüngliche Fermentationsflüssigkeit. Man erhält im wesentlichen die gleichen Ergebnisse, wenn man rohes Polysaccharid anstelle des gereinigten Polysaccharids verwendet.

BeisOiel 2

Die Kultivierung erfolgt auf ähnliche Wei se wie in Beispiel 1, wobei man ein Medium verwendet, das die gleiche Zusammensetzung aufweist, wie in Tabelle I aufgeführt, mit der Ausnahme, daß es 0,05 Gew.% Ammoniumsulfat, 0,05 Gew.?« Jtamoniuiachlorid und 0,05 Gew.5o Diamraonium-monohydrogenphospnat anstelle von 0,40 Gew.% Diammonium-monohydrogenphosphat und keine 0,02 Gew.?S Hefe extrakt enthält. Die Kultivierungszeit beträgt 45 h, und Ammoniakwasser enthaltendes Methanol wird zur Kontrolle des pH-Werts zugegeben, wobei das Ammoniak-zuMethanol-Verhältnis 15:1 beträgt. Die verbrauchte Menge an Ammoniakwasser enthaltendem Methanol beträgt 125 ml. Man erhält ein rohes Polysaccharid in einer Menge von 30,0 g, das

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auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Bildung des Polysaccharids gereinigt wird.

Dieses gereinigtes Polysaccharid wird den gleichen Messungen und Analysen, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt:

Elementaranalyse:

berechnet aus

C 40,00% H 6,67# 0 53,33% K

4

Es verteilt sich zwischen 1,0 χ 10 und 1,0 χ 10 , und der

gefunden : 40,93 6,30 52,24 0,53%.

Molekulargewicht:

Es verteilt sich :
Verteilungspeak beträgt 2,0 χ

Spezifische Drehung:

[oc]^⁵ = +31,9 (c = 1, Wasser)

Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Mbl-tf

Allose 6,2

Galactose 52,4

Glucose 17 »8

Mannose 12.*5

Glucuronsäure 11,0

Die anderen Charakteristika "sind im wesentlichen die gleichen wie bei Beispiel 1.

Be i s Ό i e 1 3

1,0 1 einer Lösung der gleichen Zusammensetzung, wie in. Tabelle I gezeigt, mit Ausnahme von Methanol, wird in einen 2,0 1 Fermentationskessel vom Mini-Krugtyp gegeben· Nach dem Sterilisieren des Kessels während 15 min bei 120⁰C wer-

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den 20 ml Methanol in den Kessel eingegeben, wobei man die Sterilität aufrechterhält. Man erhält ein Medium.

50 ml Impfkultur, die durch Kultivieren von einem Pseudomonas viscogena TS-1 OO4-Stamm⁺ in einem Medium, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben hergestellte Medium hai;, bei 30⁰C während 24 h hergestellt worden ist, wurden in den Kessel gegeben.

Die Züchtung erfolgt während 16 h bei 30⁰C mittels einer submersen Kultur unter Verwendung einer Rotationsrate der Röhrvorrichtung von 800 U/min. Luft wurde in einer Menge von, 1 l/min eingeblasen. "Während dieser Zeit wird Hafniumhydroxid (2N) zur Einstellung des pH-Wertes der Kultur auf 7,0, zugegeben. Ein Teil der Kultur wird dann extrahiert, so daß der Flüssigkeitsgehalt in dem Fermentationskessel 780 ml "beträgt. Nach der Extraktion wird eine neue, sterilisierte Lösung der gleichen Zusammensetzung, mit der Ausnahme, daß die Methanolkonzentration 0,8 Gew.% beträgt, in den Kessel in einer Rate von 135 ml/h gegeben und die Kultur wird gleichzeitig bei gleicher Rate wie das Beschickungsmaterial extrahiert. Eine kontinuierliche StrömungsZüchtung erfolgt auf gleiche Weise. Die Kultur wurde 45 h nach Beginn der kontinuierlichen Züchtung extrahiert, und sie enthält mikrobielle Zellen in einer Menge von 11,7 g/l und Polysaccharid in einer Menge von 17,1 g/l.

In 200 ml der extrahierten Kultur gibt man 400 ml Wasser und das Gemisch wird 30 min bei 5°C und 10 000 U/min zur Entfernung der mikrobiellen Zellen und der Feststoffe zentrifugiert. Das entstehende, überstehende Material wird in 1,8 1 Aceton unter Rühren gegossen. Die Behandlung des Gemisches auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 ergibt ein rohes Polysaccharid in einer Menge von 3,4 g.

⁺FERM-P Nr. 3811

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Die weitere Reinigung erfolgt auf ähnliche ¥eise vie in Beispiel 1; man erhält gereinigtes Polysaccharid.

Das entstehende Polysaccharid wird den Messungen und Analysen auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 unterworfen. Die Ergebnisse werden im folgenden aufgeführt·

Elementaranalyse:

_n C 40,00% H 6,67% 0 53,33% N gefunden : 39,67 6,41 53,20 0,72%

Molekulargewicht;

Es verteilt sich :
Verteilungspeak beträgt 2,0 χ 10 .

Es verteilt sich zwischen 2,0 χ 10 und 1,Ox 10 , und der

Spezifische Drehung:

[α]ξ⁵ = +32,1 (c=1, Wasser).

Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Hol-%

Allose 10,9

Galactose 59,3

Glucose 11,0

Mannose 7 »5

Glucur onsäur e 11,3-

Die anderen Eigenschaften sind im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 4

Die Kultivierung wird auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, unter Verwendung eines Mediums der gleichen Zusammensetzung, wie in Tabelle I aufgeführt, mit der Aus-

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nähme, daß es 0,20 Gev/.$6 Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid "bzw. Diammonium-monohydrogenphosphat anstelle von 0,40 Gew.% Diammonium-monohydrogenphosphat enthält. Die Kultivierungszeit beträgt 48 h. ·

Ammoniakwasser enthaltendes Methanol, bei dem das Verhältnis von Methanol zu Ammoniak 10:1 beträgt, wird in einer Menge von 103 ml verbraucht.

Die entstehende Kulturflüssigkeit wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Man erhält 19,8 g rohes Polysaccharid. Die Reinigung des rohen Polysaccharids und die Messungen und Analysen des entstehenden, gereinigten Polysaccharids werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält die folgenden Ergebnisse:

Elementaranalyse:

berechnet aus

_n: C 40,0096 H 6,67% 0 53,33# N

gefunden : 40,12 6,35 53,08

Molekulargewicht:

Es verteilt sich zwischen 3,0 χ 10 und 2 χ 10 , und der Verteilungspeak beträgt 5,0 χ 10 .

Spezifische Drehung:

[a]^⁵ = +32,3° (c=1, Wasser).

Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Mol-%

Allose 11,3

Galactose 51,7

Glucose , 13,4

Mannose 12,9

Glucuronsäure 10,8

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ORIGINAL INSPECTED

-SQ-

Die anderen Eigenschaften sind im wesentlichen die gleichen wie "bei Beispiel 1.

Beispiel 5

Die Züchtung und die Isolierung des rohen Polysaccharids werden durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man eine Züchtungs temp era tür von 27°C und eine Züchtungszeit von 40 Ii verwendet. Die Menge an entstehendem, rohen Polysaccliarid beträgt 12,5 g. Die Reinigung des rohen Polysaccharids und die Messungen und Analysen des entstehenden, gereinigten Polysaccharids erfolgen aus gleiche Weise wie in Beispiel 1. Man erhält die folgenden Ergebnisse:

Elementaranalyse:

berechnet aus

C_nH_2nO_n: C 40,00% H 6,675« 0 53,33% H gefunden : 39,89 6,45 53,15 O,51#.

Molekulargewicht:

Es verteilt sich zwischen 1,0 χ 10 und 5,O x IQr., und der Verteilungspeak beträgt 5,0 χ 10 .

Spezifische Drehung:

[cc]jjp = +31,8° (c=1, Wasser)»

Zusammensetzung der Zuckerbestandteile:

Allose 8,7

Galactose 58,6

Glucose to ,6

Mannose 11,1

Glucuronsäure 11,0

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Die anderen Eigenschaften sind im wesentlichen gleich wie in Beispiel 1♦

Kurze Erläuterung der Zeichnungen:

Die Fig. 1 und 2 zeigen die Infrarot- bzw. ültraviolett- Absorptionsspektren des erfindungagemäßen Polysaccharide·

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ORK3INAL INSPECTED

Leer seife

Claims

Α. GRÜNECKER H. KINKEl-DEY OTrWG. W. STOCKMAIR K. SCHUMANN Ο« RER MAT.-DlPU-PHYa R. H. JAKOB TOYA SODA■ MAHUFACarUEHTG CO., LTD. G. bezold * OR WM NAC- DtPU-CHEM. No. 4560,OaZa-ToIIdS Shin-lTanyo-Shi 8 München 22 MAXlMIUAfWTtoASe* *· YamaKUchi-Ken, Japan ^A B— -19. April -!979 ■ . . P 13 734-60/eo Patentansprüche

1. Polysaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß es als Zuckerbestandteil Allose enthält.

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, dadurch, gekennzeichnet, daß es als Zuckerbestandteil weiterhin Galactose enthält, wobei die Summe der Gehalte an Allose und Galactose mindestens 50 Mol-% beträgt.

3. Polysaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin Galactose, Glucose, Mannose und Glucuronsäure als Zuckerbestandteile enthält.

4. Polysaccharid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gehalte an Allose, Galactose, Glucose, Mannose und Glucuronsäure in dieser Reihenfolge etwa 6 bis etwa 12 Mol-%, etwa 50 bis etwa 60 Mol-%, etwa 10 bis etwa 20 M0I-9S, etwa 7 bis etwa 14 Mol-9^ bzw. etwa 10 bis etwa 12 Mol-26 betragen.

5. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 1 χ 10 bis etwa 1 χ 10' aufweist

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und keinen klaren Schmelzpunkt zeigt und in Wasser löslich, jedoch in Methanol, Äthanol, einem Äther und Aceton unlöslich ist.

6. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ein extrazellularesProdukt von Pseudomonas viscogena, FERM-P Nr. 3811 bzw. ATCC-Nr. 31504, ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide ,dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Medium Bakterien, die zum Genus Pseudomonas gehören und die extrazellular ein Polysaccharid bilden können, das Allose als Zuckerbestandteil enthält, zur Ansammlung des Polysaccharids in dem Medium kultiviert und das Polysaccharid abtrennt und wiedergewinnt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Allose als Zuckerbestandteil enthaltende Polysaccharid weiter Galactose als Zuckerbestandteil enthält und daß die Summe der Gehalte an Allose und Galactose mindestens 50 Mol-96 beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Allose enthaltende Polysaccharid weiter Galactose, Glucose, Mannose und Glucuronsäure als Zuckerbestandteile enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gehalte an Allose, Galactose, Glucose, Mannose und Glucuronsäure in dieser Reihenfolge etwa 6 bis etwa 12 M0I-S6, etwa 50 bis etwa 60 Mol-%, etwa 10 bis etwa 20 Mol-96, etwa 7 bis etwa 14 Mol-% bzw. etwa 10 bis etwa 12 Mol-% betragen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ein Molekularge-

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4 *7

wicht im Bereich von etwa 1 χ 10 "bis etwa 1 x1O' besxtzt land keinen klaren Schmelzpunkt zeigt und in Wasser löslich, jedoch in Methanol, Äthanol, einem üther und Aceton unlöslich ist.

12« Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium Methanol als Hauptkohlenstoff quelle enthält. ■

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch; gekennzeichnet, daß das Methanol in einer Konzentration, nicht über 5%
vorhanden ist.

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ORIGINAL INSPECTED