DE2732272C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzanalyse von mehrfach gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen, im kontinuierlichen Durchfluß, bei dem die Partikel in einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmt, sodann von einem Hüllstrorn umgeben und in laminarer Strömung durch eine intensive Laser-Lichtzone hindurchgeführt werden, wobei die von den Partikeln ausgehenden Fluoreszenzlicht-Impulse detektiert und von einer Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet werden.
Methoden dieser Art sind zum Beispiel in der Veröffentlichung von H. Crissman.P. Mullaney und J. A. Steinkamp »Methods and Applications of Flow Systems for Analysis and Sorting of Mammalion Cells« Methods in Cell Biology, Vol. 9,179 bis 246 (1975), herausgegeben von D. M. Prescott, beschrieben. Der prinzipielle Aufbau der Meßanordnung ist in dem Prospekt »Laser Review« der 1ΟΟμηη0. Der sics, Mountain View, CaI. unter dem Titel »New Laser System Used in Biomedical Studies« dargestellt. Will man mehrere Komponenten einer Zelle gleichzeitig analysieren, insbesondere den Chrornosomengehalt (DNA) und den Eiweißgehalt (Protein), so muß man die Probe mit unterschiedlichen Fluoresitenzfarbstoffen einfärben, die spezifisch mit je einer Komponente, also der DNA bzw. dem Protein, reagieren. Hierzu ist es bekannt, Farbstoffe zu verwenden, die bei gleicher b> Anregungsfrequenz verschiedene Fluoreszenz-Emissionsspektren aufweisen. Dies bedeutet jedoch eine gewisse Einschränkung in der Auswahl geeigneter Farbstoffe, was sich vor allem auf die aufzuwendende Probenvorbereitungszeit und die Nachweisempfindlichkeit negativ auswirken kann, Auch die erforderliche Verwendung von halbdurchlllssigen Spiegeln und Trennfiltern hat Intensitätsverluste der von den Detektoren aufgefangenen Impulse zur Folge,
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die eingangs erörterte Meßmethode zur gleichzeitigen Analyse mehrerer Eigenschaften von Partikeln so zu verbessern, daß man keinen Einschränkungen hinsichtlich der Auswahl bzw. der Kombination geeigneter Farbstoffe unterliegt; es sollen also die für die betreffenden Komponenten jeweils optimalen Farbstoffe angewendet werden können. Außerdem soll auch die Nachweisempfindlichkeit erhöht werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe werden die im Kennzeichen des Anspruches 1 enthaltenen Maßnahmen vorgeschlagen. Die Unteransprüche beinhalten vorteilhafte konstruktive Ausbildungen zur Durchführung dieser Maßnahmen. Mit der Erfindung können vor allem die Probenvorbereitungszeiten von bisher ca. 3 Stunden auf weniger als 20 Minuten reduziert werden. Durch die freie Auswahl innerhalb eines großen Arsenals zur Verfügung stehender Farbstoffe können jeweils diejenigen ausgesucht werden, die am intensivsten mit der zu analysierenden Partikelkomponente reagieren und von anderen Probenbestandteilen, insbesondere Fremdstoffen, nicht angenommen werden. Dies und der Wegfall von Spiegeln und Filtern für das Fluoreszenzlicht hat gleichzeitig eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit zur Folge.
Ein Ausführungsbeispid der Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnungen näher erläutert
Die F i g. 1 zeigt schematisch den Aufbau der erfindungsgemäßen Meßapparatur,
die Fig.2 zeigt in vergrößertem Maßstab den Ausschnitt »A« aus F i g. 1,
die F i g. 3 zeigt ein Diagramm, aus dem die relative Häufigkeit des DNA- und Protein-Gehaltes einer krebszellenhaltigen Probe zu ersehen bt unter Verwendung von Fluorochromen unterschiedlicher Anregungsund Emissionsspektren,
die Fig.4 zeigt ein ähnliches Diagramm, bei dem ebenfalls zwei Fluorochrome unterschiedlicher Anregungsfrequenz, aber nahezu gleicher Emissionsspektren verwendet wurden.
In einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmte mehrfach gefärbte biologische Zellen werden durch das Röhrchen 1 und eine elektrolytische Hüllflüssigkeit durch das Röhrchen 2 einem Gefäß 3 zugeführt Das Gefäß 3 steht unter Druck und hat eine feine, düsenförmige öffnung 4 von ca. 50 bis 100 μΐπ 0. Der Druck in dem Röhrchen 1 ist etwas höher als der Druck in dem Röhrchen 2 bzw. dem Gefäß 3, so daß aus der Düse 4 ein laminarer, von dem Hüllstrom 5 umschlossener Probenstrom 6 austritt.
Als Bestrahlungsquellen dienen zwei Laser 7, 8 mit unterschiedlichen, auf die Farbstoffe bzw. deren Fluoreszenzspektren abgestimmten Frequenzen, der eine zum Beispiel mit 350 nm und der andere mit 488 nm.
Die beiden Laserstrahlen 9, IQ werden mit justierbaren Spiegeln 11a, b, c umgelenkt und treten annähernd parallel in eine Linse 12 ein. Dabei ist die Divergenz von der Parallelität so getroffen, daß jeder Strahl in der Mitte des Probenstromes 6 fokussiert wird, die beiden Fokussierungsstellen 13, 14 jedoch einen geringen Abstand von ca. 03 mm voneinander haben (F i g. 2).
Die von dem Probenstrom an den Fokussierungsstel-
|en ansgesanidten Fluoreszenzimpulse werden von einem lichtempfindlichen Detektor 15 aufgefangen und in einer nachgeschaUeten Auswerteelektronik 16 verstärkt und ausgewertet. Dabei werden mittels einer an sich bekannten Pseudo-Koinzidenzscbaltung nur solche Impulse ausgewertet, die — abhängig vom Abstand der Fokussierungsstellen 13, 14 und der Strömungsgeschwindigkeit des Probenstromes 6 — in einem zeitlichen Abstand entsprechend der Laufzeit der einzelnen Zellen von der Stelle 13 zur Stelle 14 aufeinanderfolgen. Dadurch können jeweils zwei aufeinanderfolgende Impulse, die diese Bedingung erfüllen, einer Zelle zugeordnet werden (Laufzeit — Kxeuzkorrelation).
Die Fig,3 zeigt eine charakteristische Häufigkeitsverteilung H von Chromosomen (DNA pro Zelle) und Eiweiß (Protein pro Zelle) einer krebszellenhaltigen Probe, Dabei wurde für das Anfärben der DNA das Fluorochrom DAPI und für das Anfärben des Proteins das Fluorochrom SR101 verwendet. Während in diesem Beispiel zwei Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren angewendet wurden, ist in F i g. 4 ein Diagramm wiedergegeben, bei dem
ίο zwei Fluorochrome (DAPI für die DNA und NBD für Protein) zwar unterschiedlicher Anregungsspektren, aber annähernd gleicher, nicht trennbarer, gründlicher Emissionsspektren verwendet wurden, was nach dem bisher bekannten Stande der Technik nicht möglich war.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    J1 Verfahren zur Fluoreszenzanailyse von mehrfach gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen, im kontinuierlichen Durchfluß, bei dem die Partikel in einer Trägerflüssigkeit imfgeschwemmt, sodann von einem Hüllstrom umgeben und in laminarer Strömung durch eine intensive Laser-Lichtzone hindurchgeführt werden,, wobei die von den Partikeln ausgehenden FIuoresienzHcht-ImpuI-se detektion und von einer Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet werden, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei Laserstrahlen (9, 10) unterschiedlicher Wellenlänge auf hintereinander und in einem vorgegebenen Abstand liegende is Stellen (13,14) entlang dem laminaren Probenstrom (6) fokussiert werden, und daß die iron den Stellen (13, 14) ausgehenden Fluoreszercnmpulse unter Berücksichtigung des Stellen-Abstandes und der Strömungsgeschwindigkeit so koirreliert werden (Kreuzkonclation), daß nur der Laufzeit der einzelnen Partikel zwischen den Siteiien (i3, 14) entsprechende Impulse ausgewertet werden.
    Z Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 2s normal zum Probenstrom (6) auf ein Fokussierungs-Linsen-System (12) gerichteten Laserstrahlen (9,10) eine leichte Divergenz zueinander haben.
    3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Divergenz — und damit der Abstand der Fokussierungsstellen (13,14) voneinander — mittels schwenkbarer, der Linse (12) vorgeschalteter Umlenkspiele -MIa, üb) einstellbar ist.
    35
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