DE2732272C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen ZellenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzanalyse von mehrfach gefärbten Partikeln, insbesondere
biologischen Zellen, im kontinuierlichen Durchfluß, bei dem die Partikel in einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmt,
sodann von einem Hüllstrorn umgeben und in laminarer Strömung durch eine intensive Laser-Lichtzone
hindurchgeführt werden, wobei die von den Partikeln ausgehenden Fluoreszenzlicht-Impulse detektiert
und von einer Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet werden.
Methoden dieser Art sind zum Beispiel in der Veröffentlichung von H. Crissman.P. Mullaney
und J. A. Steinkamp »Methods and Applications of Flow Systems for Analysis and Sorting of Mammalion
Cells« Methods in Cell Biology, Vol. 9,179 bis 246 (1975),
herausgegeben von D. M. Prescott, beschrieben. Der prinzipielle Aufbau der Meßanordnung ist in dem
Prospekt »Laser Review« der 1ΟΟμηη0. Der sics,
Mountain View, CaI. unter dem Titel »New Laser System Used in Biomedical Studies« dargestellt. Will
man mehrere Komponenten einer Zelle gleichzeitig analysieren, insbesondere den Chrornosomengehalt
(DNA) und den Eiweißgehalt (Protein), so muß man die Probe mit unterschiedlichen Fluoresitenzfarbstoffen
einfärben, die spezifisch mit je einer Komponente, also der DNA bzw. dem Protein, reagieren. Hierzu ist es
bekannt, Farbstoffe zu verwenden, die bei gleicher b>
Anregungsfrequenz verschiedene Fluoreszenz-Emissionsspektren aufweisen. Dies bedeutet jedoch eine
gewisse Einschränkung in der Auswahl geeigneter Farbstoffe, was sich vor allem auf die aufzuwendende
Probenvorbereitungszeit und die Nachweisempfindlichkeit negativ auswirken kann, Auch die erforderliche
Verwendung von halbdurchlllssigen Spiegeln und Trennfiltern hat Intensitätsverluste der von den
Detektoren aufgefangenen Impulse zur Folge,
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die eingangs erörterte Meßmethode zur gleichzeitigen
Analyse mehrerer Eigenschaften von Partikeln so zu verbessern, daß man keinen Einschränkungen hinsichtlich
der Auswahl bzw. der Kombination geeigneter Farbstoffe unterliegt; es sollen also die für die
betreffenden Komponenten jeweils optimalen Farbstoffe angewendet werden können. Außerdem soll auch die
Nachweisempfindlichkeit erhöht werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe werden die im Kennzeichen des Anspruches 1 enthaltenen Maßnahmen vorgeschlagen.
Die Unteransprüche beinhalten vorteilhafte konstruktive Ausbildungen zur Durchführung dieser
Maßnahmen. Mit der Erfindung können vor allem die Probenvorbereitungszeiten von bisher ca. 3 Stunden auf
weniger als 20 Minuten reduziert werden. Durch die freie Auswahl innerhalb eines großen Arsenals zur
Verfügung stehender Farbstoffe können jeweils diejenigen ausgesucht werden, die am intensivsten mit der zu
analysierenden Partikelkomponente reagieren und von anderen Probenbestandteilen, insbesondere Fremdstoffen,
nicht angenommen werden. Dies und der Wegfall von Spiegeln und Filtern für das Fluoreszenzlicht hat
gleichzeitig eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit zur Folge.
Ein Ausführungsbeispid der Erfindung wird im
folgenden an Hand der Zeichnungen näher erläutert
Die F i g. 1 zeigt schematisch den Aufbau der erfindungsgemäßen Meßapparatur,
die Fig.2 zeigt in vergrößertem Maßstab den
Ausschnitt »A« aus F i g. 1,
die F i g. 3 zeigt ein Diagramm, aus dem die relative Häufigkeit des DNA- und Protein-Gehaltes einer
krebszellenhaltigen Probe zu ersehen bt unter Verwendung
von Fluorochromen unterschiedlicher Anregungsund Emissionsspektren,
die Fig.4 zeigt ein ähnliches Diagramm, bei dem ebenfalls zwei Fluorochrome unterschiedlicher Anregungsfrequenz,
aber nahezu gleicher Emissionsspektren verwendet wurden.
In einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmte mehrfach gefärbte biologische Zellen werden durch das Röhrchen
1 und eine elektrolytische Hüllflüssigkeit durch das Röhrchen 2 einem Gefäß 3 zugeführt Das Gefäß 3 steht
unter Druck und hat eine feine, düsenförmige öffnung 4
von ca. 50 bis 100 μΐπ 0. Der Druck in dem Röhrchen 1
ist etwas höher als der Druck in dem Röhrchen 2 bzw. dem Gefäß 3, so daß aus der Düse 4 ein laminarer, von
dem Hüllstrom 5 umschlossener Probenstrom 6 austritt.
Als Bestrahlungsquellen dienen zwei Laser 7, 8 mit unterschiedlichen, auf die Farbstoffe bzw. deren
Fluoreszenzspektren abgestimmten Frequenzen, der eine zum Beispiel mit 350 nm und der andere mit
488 nm.
Die beiden Laserstrahlen 9, IQ werden mit justierbaren
Spiegeln 11a, b, c umgelenkt und treten annähernd parallel in eine Linse 12 ein. Dabei ist die Divergenz von
der Parallelität so getroffen, daß jeder Strahl in der Mitte des Probenstromes 6 fokussiert wird, die beiden
Fokussierungsstellen 13, 14 jedoch einen geringen Abstand von ca. 03 mm voneinander haben (F i g. 2).
Die von dem Probenstrom an den Fokussierungsstel-
|en ansgesanidten Fluoreszenzimpulse werden von
einem lichtempfindlichen Detektor 15 aufgefangen und in einer nachgeschaUeten Auswerteelektronik 16
verstärkt und ausgewertet. Dabei werden mittels einer an sich bekannten Pseudo-Koinzidenzscbaltung nur
solche Impulse ausgewertet, die — abhängig vom
Abstand der Fokussierungsstellen 13, 14 und der
Strömungsgeschwindigkeit des Probenstromes 6 — in einem zeitlichen Abstand entsprechend der Laufzeit der
einzelnen Zellen von der Stelle 13 zur Stelle 14 aufeinanderfolgen. Dadurch können jeweils zwei
aufeinanderfolgende Impulse, die diese Bedingung erfüllen, einer Zelle zugeordnet werden (Laufzeit —
Kxeuzkorrelation).
Die Fig,3 zeigt eine charakteristische Häufigkeitsverteilung
H von Chromosomen (DNA pro Zelle) und Eiweiß (Protein pro Zelle) einer krebszellenhaltigen
Probe, Dabei wurde für das Anfärben der DNA das Fluorochrom DAPI und für das Anfärben des Proteins
das Fluorochrom SR101 verwendet. Während in
diesem Beispiel zwei Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren angewendet wurden,
ist in F i g. 4 ein Diagramm wiedergegeben, bei dem
ίο zwei Fluorochrome (DAPI für die DNA und NBD für
Protein) zwar unterschiedlicher Anregungsspektren, aber annähernd gleicher, nicht trennbarer, gründlicher
Emissionsspektren verwendet wurden, was nach dem bisher bekannten Stande der Technik nicht möglich war.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentansprüche:J1 Verfahren zur Fluoreszenzanailyse von mehrfach gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen, im kontinuierlichen Durchfluß, bei dem die Partikel in einer Trägerflüssigkeit imfgeschwemmt, sodann von einem Hüllstrom umgeben und in laminarer Strömung durch eine intensive Laser-Lichtzone hindurchgeführt werden,, wobei die von den Partikeln ausgehenden FIuoresienzHcht-ImpuI-se detektion und von einer Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet werden, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei Laserstrahlen (9, 10) unterschiedlicher Wellenlänge auf hintereinander und in einem vorgegebenen Abstand liegende is Stellen (13,14) entlang dem laminaren Probenstrom (6) fokussiert werden, und daß die iron den Stellen (13, 14) ausgehenden Fluoreszercnmpulse unter Berücksichtigung des Stellen-Abstandes und der Strömungsgeschwindigkeit so koirreliert werden (Kreuzkonclation), daß nur der Laufzeit der einzelnen Partikel zwischen den Siteiien (i3, 14) entsprechende Impulse ausgewertet werden.Z Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 2s normal zum Probenstrom (6) auf ein Fokussierungs-Linsen-System (12) gerichteten Laserstrahlen (9,10) eine leichte Divergenz zueinander haben.3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Divergenz — und damit der Abstand der Fokussierungsstellen (13,14) voneinander — mittels schwenkbarer, der Linse (12) vorgeschalteter Umlenkspiele -MIa, üb) einstellbar ist.35
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