DE2732272B1 - Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von gefaerbten Partikeln,insbesondere biologischen Zellen - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzanalyse von mehrfach gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen, im kontinuierlichen Durchfluß, bei dem die Partikel in einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmt, sodann von einem Hüllstrom umgeben und in laminarer Strömung durch eine intensive Laser-Lichtzone hindurchgeführt werden, wobei die von den Partikeln ausgehenden Fluoreszenzlicht-Impulse detektiert und von einer Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet werden.

Methoden dieser Art sind zum Beispiel in der Veröffentlichung von H. Crissman.P. Mullaney so und J.A.Steinkamp »Methods and Applications of Flow Systems for Analysis and Sorting of Mammalion Cells« Methods in Cell Biology, Vol. 9,179 bis 246(1975), herausgegeben von D. M.Prescott, beschrieben. Der prinzipielle Aufbau der Meßanordnung ist in dem ss Prospekt »Laser Review« der 100 um 0. Der sics, Mountain View, CaL unter dem Titel »New Laser System Used in Biomedical Studies« dargestellt Will man mehrere Komponenten einer Zelle gleichzeitig analysieren, insbesondere den Chromosomengehalt (DNA) und den Eiweißgehalt (Protein), so muß man die Probe mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen einfärben, die spezifisch mit je einer Komponente, also der DNA bzw. dem Protein, reagierea Hierzu ist es bekannt, Farbstoffe zu verwenden, die bei gleicher Anregungsfrequenz verschiedene Fluoreszenz-Emissionsspektren aufweisen. Dies bedeutet jedoch eine gewisse Einschränkung in der Auswahl geeigneter Farbstoffe, was sich vor allem auf die aufzuwendende Probenvorbereitungszeit und die Nachweisempfindlichkeit negativ auswirken kann. Auch die erforderliche Verwendung von halbdurchlässigen Spiegeln und Trennfiltern hat Intensitätsverluste der von den Detektoren aufgefangenen Impulse zur Folge. .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die eingangs erörterte Meßmethode zur gleichzeitigen Analyse mehrerer Eigenschaften von Partikeln so zu verbessern, daß man keinen Einschränkungen hinsichtlich der Auswahl bzw. der Kombination geeigneter Farbstoffe unterliegt; es sollen also die für die betreffenden Komponenten jeweils optimalen Farbstoffe angewendet werden können. Außerdem soll auch die Nachweisempfindlichkeit erhöht werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe werden die im Kennzeichen des Anspruches 1 enthaltenen Maßnahmen vorgeschlagen. Die Unteransprüche beinhalten vorteilhafte konstruktive Ausbildungen zur Durchführung dieser Maßnahmen. Mit der Erfindung können vor allem die Probenvorbereitungszeiten von bisher ca. 3 Stunden auf weniger als 20 Minuten reduziert werden. Durch die freie Auswahl innerhalb eines großen Arsenals zur Verfügung stehender Farbstoffe können jeweils diejenigen ausgesucht werden, die am intensivsten mit der zu analysierenden Partikelkomponente reagieren und von anderen Probenbestandteilen, insbesondere Fremdstoffen, nicht angenommen werden. Dies und der Wegfall von Spiegeln und Filtern für das Fluoreszenzlicht hat gleichzeitig eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit zur Folge.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnungen näher erläutert

Die Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau der erfindungsgemäßen Meßapparatur,

die Fig.2 zeigt in vergrößertem Maßstab den Ausschnitt »A«aus F i g. 1,

die F i g. 3 zeigt ein Diagramm, aus dem die relative Häufigkeit des DNA- und Protein-Gehaltes einer krebszellenhaltigen Probe zu ersehen ist unter Verwendung von Fluorochromen unterschiedlicher Anregungsund Emissionsspektren,

die Fig.4 zeigt ein ähnliches Diagramm, bei dem ebenfalls zwei Fluorochrome unterschiedlicher Anregungsfrequenz, aber nahezu gleicher Emissionsspektren verwendet wurden.

In einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmte mehrfach gefärbte biologische Zellen werden durch das Röhrchen 1 und eine elektrolytische Hüllflüssigkeit durch das Röhrchen 2 einem Gefäß 3 zugeführt Das Gefäß 3 steht unter Druck und hat eine feine, düsenförmige öffnung 4 von ca. 50 bis 100 um 0. Der Druck in dem Röhrchen 1 ist etwas höher als der Druck in dem Röhrchen 2 bzw. dem Gefäß 3, so daß aus der Düse 4 ein laminarer, von dem Hüllstrom S umschlossener Probenstrom 6 austritt

Als Bestrahlungsquellen dienen zwei Laser 7, 8 mit unterschiedlichen, auf die Farbstoffe bzw. deren Fluoreszenzspektren abgestimmten Frequenzen, der eine zum Beispiel mit 350 nm und der andere mit 488 nm.

Die beiden Laserstrahlen 9,10 werden mit justierbaren Spiegeln Ua, b,c umgelenkt und treten annähernd parallel in eine Linse 12 ein. Dabei ist die Divergenz von der Parallelität so getroffen, daß jeder Strahl in der Mitte des Probenstromes 6 fokussiert wird, die beiden Fokussierungsstellen 13, 14 jedoch einen geringen Abstand von ca. 0,5 nun voneinander haben (F i g. 2).

Die von dem Probenstrom an den Fokussierungsstel-

len ausgesandten Fluoreszenzimpulse werden von einem lichtempfindlichen Detektor 15 aufgefangen und in einer nachgeschalteten Auswerteelektronik 16 verstärkt und ausgewertet Dabei werden mittels einer an sich bekannten Pseudo-Koinzidenzschaltung nur solche Impulse ausgewertet, die — abhängig vom Abstand der Fokussierungsstellen 13, 14 und der Strömungsgeschwindigkeit des Probenstromes 6 — in einem zeitlichen Abstand entsprechend der Laufzeit der einzelnen Zellen von der Stelle 13 zur Stelle 14 aufeinanderfolgen. Dadurch können jeweils zwei aufeinanderfolgende Impulse, die diese Bedingung erfüllen, einer Zelle zugeordnet werden (Laufzeit — Kreuzkorrelation).

Die Fig.3 zeigt eine charakteristische Häufigkeitsverteilung H von Chromosomen (DNA pro Zelle) und Eiweiß (Protein pro Zelle) einer krebszellenhaltigen Probe. Dabei wurde für das Anfärben der DNA das

s Fluorochrom DAPI und für das Anfärben des Proteins das Fluorochrom SR101 verwendet Während in diesem Beispiel zwei Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren angewendet wurden, ist in F i g. 4 ein Diagramm wiedergegeben, bei dem zwei Fluorochrome (DAPI für die DNA und NBD für Protein) zwar unterschiedlicher Anregungsspektren, aber annähernd gleicher, nicht trennbarer, gründlicher Emissionsspektren verwendet wurden, was nach dem bisher bekannten Stande der Technik nicht möglich war.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Fluoreszenzanalyse von mehrfach gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen, im kontinuierlichen Durchfluß, bei dem die Partikel in einer Trägerflüssigkeit aufgeschwemmt, sodann von einem Hüllstrom umgeben und in laminarer Strömung durch eine intensive Laser-Lichtzone hindurchgeführt werden, wobei die von den Partikeln ausgehenden Fluoreszenzlicht-Impul- to se detektiert und von einer Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet werden, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei Laserstrahlen (9, 10) unterschiedlicher Wellenlänge auf hintereinander und in einem vorgegebenen Abstand liegende Stellen (13,14) entlang dem laminaren Probenstrom (6) fokussiert werden, und daß die von den Stellen (13, 14) ausgehenden Fluoreszenzimpulse unter Berücksichtigung des Stellen-Abstandes und der Strömungsgeschwindigkeit so korreliert werden (Kreuzkorrelation), daß nur der Laufzeit der einzelnen Partikel zwischen den Stellen (13, 14) entsprechende Impulse ausgewertet werden.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die normal zum Probenstrom (6) auf ein Fokussierungs-Linsen-System (12) gerichteten Laserstrahlen (9,10) eine leichte Divergenz zueinander haben.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Divergenz — und damit der Abstand der Fokussierungsstellen (13,14) voneinander — mittels schwenkbarer, der Linse (12) vorgeschalteter Umlenkspiele (Ha, 11 ty einstellbar