DE2645553C2

DE2645553C2 - Medikamente enthaltendes Granulat von Serumalbumin

Info

Publication number: DE2645553C2
Application number: DE2645553A
Authority: DE
Inventors: Anthony F. St. Paul Minn. Yapel jun.
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1975-10-09
Filing date: 1976-10-08
Publication date: 1986-11-06
Also published as: JPH0133445B2; CH629666A5; FR2326934A1; US4147767A; JPS5247912A; AU513080B2; CA1077842A; AU1850676A; FR2326934B1; GB1567763A; SE7611064L; DE2645553A1; SE443086B

Description

In der Medizin wurde schon lang die Notwendigkeit der geregelten Freisetzung von Pharmaca erkannt, so daß ■ eine Verabreichung seltener stattfinden kann, während jedoch gleichzeitig das therapeutische Niveau im Blutkreislauf des Patienten sichergestellt ist. Diese geregelte Abgabe von Pharmaca gelingt bereits bei oraler Verabreichung. Verschiedene Überzüge und Kapseln wurden dafür entwickelt, die eine verzögerte Abgabe des Inhalts gestatten. Die geregelte Abgabe von Pharmaca bei parenteraler, insbesondere intravasculärer Verabreichung stellt größere Probleme dar. Im allgemeinen erfordern intravasculäre Injektionen eine sorgfältige Einstellung der Dosierung, weil die Medikamente unmittelbar nach der Injektion verfügbar werden, so daß es bei Überdosen und toxischen Substanzen zu schweren Komplikationen kommen kann. Der intravasculäre Weg ist auch beschränkt auf die Verabreichung löslicher Substanzen wegen der Gefahr der Embolie; langsam die wirksamen Substanzen freisetzende Präparate sind für intravasculäre Verabreichung im allgemeinen nicht verfügbar.

Die GB-PS 9 31532 betrifft ein Verfahren zurMikroeinkapselung von Medikamenten in ein gelierbares hydrophiles Koiloid durch ein Verfahren der komplexen Coacervation. Das Kolloid bildet eine Membran um das Medikament. Die Permeabilität wird so eingestellt, daß eine allmähliche Freisetzung des Medikaments stattfinden kann. Aus der US-PS 35 41 201 ist eine injizierbare Substanz bekannt, die einen aktiven Wirkstoff in einem mctaboli sierbaren »proteinartigen« Träger darstellt. Die Trägerteilchen sind als Suspension in einem nicht-wäßrigen Trä germedium injizierbar. Die metabolisierbaren Trägerteilchen werden von den Enzymen der Körpernüssigkeiten angegriffen, so daß es zu einer langsamen Freisetzung der eingeschlossenen Medikamente kommt.

Aus den US-PS 3773919 und 3887699 sind Mittel aus Polylactid und Medikamente bekannt, die parenteral verabreicht werden können und ein langsames verzögertes Freisetzen des Medikaments über eine gewisse Zeit

40 gestatten.

Das Hauptproblem der langsamen Freisetzung von bekannten injizierbaren Verabreichungsformen liegt darin, daß die Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments oft nicht korrespondiert mit dem Bedarf des Patienten. Es ist in der Medizin bekannt, daß ein Medikament, um maximalen therapeutischen Effekt zu ergeben, optimale Konzentration im Blutkreislauf des Patienten erreichen muß. Der Arzt verabreicht häufig eine hohe Anfangsdosis oder Vorratsdosis, um diese Konzentration im Blut zu erreichen. Nach dieser Vorratsdosis werden mit den folgenden Verabreichungen nur dieses Anfangsniveau gehalten.

Die Zeit zwischen der zu verabreichenden Dosen bestimmt sich aus dem Grundumsatz des Medikaments. Das ideale Arzneimittel mit verzögerter Freisetzung sollte daher eine zweiphasige oder zweistufige Freisetzung des Medikaments ermöglichen. Eine anfänglich schnelle Freisetzung ist wünschenswert, um die therapcu- tischen Konzentrationen im Blutkreislauf zu erreichen, und eine langsamere Freisetzungsphase ist notwendig, um im Blut das Niveau des Medikaments aufrechtzuerhalten und den Stoffwechsel nicht zu beeinflussen. Die bisherigen injizierbaren Mittel gestatteten keine derartige zweistufige Freisetzung, sondern die Freisetzung erfolgte einstufig oder in einer Phase, wobei das Medikament alimählich und konstant über eine gewisse Zeit freigegeben wird.

Das erfindungsgemäße Albuminpräparat gestattet nun die Eliminierung der bisherigen Schwierigkeiten und Probleme, indem ein System mit einer zweistufigen Mittelfreisetzung zur Verfugung gestellt wird. Das erfindungsgemäße System ermöglicht eine anfänglich hohe Freisetzung des Medikaments und in einer zweiten Phase eine langsame Freisetzung des Wirkstoffs einzustellen. Die Anwendung von Albumin als Träger oder komplexbildendes Mittel für Medikamente ist seit langem bekannt. Kügelchen von Serumalbumin wurden als TrügerstoiTe fur radioaktive Diagnose oder therapeutisch wirksame Mittel angewandt (US-PS 3663685,3663686 und 3663687). Bei diesen bekannten Albumingranula ten handelt es sich nicht um Kügelchen zur Freisetzung eingeschlossener Medikamente in zweistufiger Art.

Die Erfindung betrifft nun eine therapeutische Zubereitung für geregelte Freisetzung der Medikamente in Form eines Granulats von Serumalbumin, enthaltend homogen eingeschlossen 2 bis 70 Gew.-% eines niehl-

radioaktiven organischen Medikaments, welches zu zumindest 0,01% in Wasser von 37°C löslich ist. Während seiner Herstellung wird das Granul.it Temperaturen von 110 bis 180⁰C zumindest 20 rnin ausgesetzt, um ein Vernetzen des Albumins zu erreichen. Diese Vernetzung kann jedoch auch mil Hilfe chemischer Vernetzungsmittel stattfinden.

Im folgenden wird das Ausmaß des Erwärmens oder der chemischen Vernetzung des Granulats und dessen Bedeutung für ein zweiphasiges Freisetzen des Medikaments erläutert.

Außer der vorteilhafter, zweiphasigen oder zweistufigen Freisetzung des Medikaments durch die erfindungsgemäßen Albumingranulate ergeben sich aucf\noch weitere wesentliche Merkmale des Systems. Die Feinheit des Granulats läßt sich sorgfaltig einstellen während der Herstellung. Die Granulatfeinheit läßt sich heranziehen, um die Medikamente auf diese Weise in spezielle Körperteile zu dirigieren. So können Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 bis 100 μτη leicht im Kapillarsystem der Lunge abgeschieden werden durch intravenöse Injektion. Die Medikamente enthaltenden Granulate dieser Größe wendet man also an bei Lungenleidtn, wie Asthma, Tuberkulose, Lungenentzündung oder Tumor.

Ein Granulat mit einer Feinheit von 1 bis 5 um. kann in der Leber abgelagert werden. Intraarterielle Injektionen oder Katheterisierung kann direkt mit dem Granulat in das Kapillarsystem anderer Organe oder Tumore stattfinden.

Unbestritten sind Vorteile darin zu sehen, daß das Medikament direkt in den Kapillarsystemen des Organs oder Tumors eingeführt werden kann. Das Medikament wird direkt an der beabsichtigten Stelle freigesetzt und toxische Nebenefiekte auf andere Gewebe sind weitgehend reduziert. Diese Tatsache macht das erfindungsgemäße Mittel besonders geeignet für die Tumorbehandlung mit anti-neoplastischen Medikamenten, die im allgemeinen hoch toxisch sind für gesundes und malignes Gewebe.

Das erfindungsgemäße Mittel läßt sich jedoch nicht nur auf die Behandlung von Tumoren oder gestörten Organen anweetlsn, sondern auch für gesunde Lunge oder Leber zur Errichtung eines Depots oder Reservoirs für die Kügefchen, aus denen systematisch über längere Zeit ein Medikament freigesetzt werden soll.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist das völlige Fehlen der Möglichkeit zur Emboliebildung bei intravasculärer Verabreichung. Wasserunlösliche Medikamente, die früher nicht verabreicht werden konnten wegen der Gefahr der Embolie, lassen sich nunmehr sicher in dem Albumingranulat verwenden.

Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Mittels sind bei der Herstellung zu sehen; weitere in der vollständigen Ausscheidung durch Stoffwechsel, keine Antigenwirkung, erwiesene Sicherheit bei intravasculärer Verabreichung, die Anpassungsfähigkeit an die verschiedensten Medikamente in relativ unspezifischer Art und Weise.

Das in dem erfindungsgemäßen Mittel angewandte Trägermaterial ist Serumalbumin. Man wird im allgemeinen I lumanserumalbumin bzw. in der Veterinärpraxis die entsprechenden tierischen Serumalbumine anwenden.

Der BegrifT»Medikament« umfaßt hier nicht-radioaktive organische Substanzen im Sinne der Pharmazeutik zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden.

Die Wasserlöslichkeit des Medikaments ist weitgehend unwichtig innerhalb weiter Grenzen. Das Medikament sollte jedoch, wenn es ziemlicl. wasserunlöslich ist, d. h. weniger als 0,01% in Wasser von 37°C löslich ist, aus dem Albumingranulat sehr langsam freigesetzt werden., wodurch die zweistufige Freisetzung aus dem Granulat weniger offensichtlich wird.

Die Konzentration an Medikament im Granulat kann über weite Bereiche schwanken und bis hinauf zu 90% für bestimmte Mittel ausmachen. Typische Konzentration an Medikament im Granulat ist 2 bis 70 Gew.-% der Kügelchen.

Im folgenden werden einige Medikamentklassen und bestimmte Beispiele aufgeführt, die erfindungsgemäß verabreicht werden können.

Medikamentklasse Beispiele

Antiasthmatika

Mittel zur Bronchienerweiterung

Analgetika

Hustenmittel Narcotika

Schleimlösende Mittel

Intal (Dinatriumchromoglykat)

Epinephrin

Isoproterenol

Salbutamoi

Terbutalin

Ephedrin

Theophyllin-Ethylendiamin

Morphin

Codein

Natriumsalicyalt, Salicylsäure

Meperidin-Hydrochlorid

Codein
Chlophedianol-Hydroehlorid

Morphin

Codein

Cocain

Meperidinhydrochlorid

Acetylcystein

Fortsetzung

Medikamentklasse Beispiele

Bakterieide Sulfanilamid

Sulfadiazin
Tetracyclin

Tuberkulose hemmende Mittel Rifampin (rifamycin)

ίο Dihydrostreptomycin

p-Aminosalicylsäure

Mittel gegen Hypoglykämie Tolbutamid

Insulin

15 Steroide Hydrocortison

Prednison
Prednisolon
Prednisolon-m-sulfobenzoat

₂₀ Anti-Tumormitiel Chlorambucil

Busulfan

Alkaloide

Colchicin

Antimetaboliten 2₅ 6-Mercaptopurin

Thioguanin

5-FluoruraciI

Hydroxyharnstoff

Doxorubicin

³⁰ Aminosäuren Methionin

Die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel oder Medikament aus dem Granulat freigesetzt wird, hängt weitgehend ab von dem Ausmaß, in dem das Albumin während der Herstellung vernetzt wurde. Wie im folgenden noch ausführlich dargelegt werden soll, kann das Albumin entweder durch Wärmebehandlung oder mit chemischen Vernetzungsmitteln vernetzt werden.

Außerdem Ausmaß der Vernetzung des Albumins beeinflussen verschiedene Faktoren die Freisetzungsgeschwindigkeit eines bestimmten Medikaments, u. a. das Molekulargewicht des Medikaments, seine Wasscrlöslich'-eit und eventuelle elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Medikament und Albu-

40 min.

Die Konzentration der Albuminlssung für die Herstellung des Granulats hat auch einen gewissen Einfluß auf die Freisetzung des Medikaments. Das Granulat wird im allgemeinen hergestellt aus einer 20- bis 50gew.-%igcn (Gew. in VoI) wäßrigen Albuminlösung, jedoch wurden auch schon Produkte aus Lösungen mit nur 2 bis 5% Protein oder auch bis hinauf zu 70 bis 80% hergestellt. Insbesondere für die Vernetzung in der Wärme werden die Kügelchen aus höher konzentrierten Lösungen dichter sein und das eingebrachte Medikament wird damit längsamer freigesetzt als bei Lösungen niederer Konzentration, wenn alle anderen Faktoren sonst konstant gehalten werden.

Allgemein kann man sagen, daß ein bestimmtes Gewicht von sehr kleinen Kügelchen (z. B. 1 bis S ;xm), enthaltend eine bestimmte Menge an Medikament, diese schneller freisetzt als das gleiche Gewicht größerer Kügelchen (z. B. 50 bis 100am), enthaltend die gleiche Medikamentmenge, und zwar aufgrund der größeren spezifischen Oberfläche der kleineren Kügelchen. Werden alle anderen Parameter gleich gehalten, so setzen kleinere Kügelchen im allgemeinen das Medikament schneller firi als größere aufgrund der Unterschiede der spezifischen Oberfläche. Variationen in der Größe des Granulats können daher angewandt werden zusammen mit anderen Parametern zur Regelung der Freisetzungsgeschwindigkeit ν's Medikaments.

Obwohl die obigen Faktoren die Freisetzungsgeschwindigkeiten bestimmter Medikamente aus Albumii.kügelchen beeinflussen, so haben doch die Eigenschaften des Albumins selbst, vernetzt in einem bestimmten Ausmaß, in unerwarteter Weise Einfluß auf das Freisetzen in zwei Stufen.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Granulate geht man im wesentlichen nach den Maßnahmen der US-PS 36 63 687 vor, wonach ein Vorläufer für das Albumingranulat erhalten wird, jedoch können auch andere

60 Verbesserungen noch zur Anwendung gelangen.

Das bestimmte Medikament wird gelöst oder dispergiert in der wäßrigen Serumalbuniinlösung in der gewünschten Konzentration. Die Konzentrationen des Albumins liegen im allgemeinen zwischen 20 und 60% (Gew./Vol.). Die Medikamentkonzentrationen in der Albuminlösung betragen 5 bis 30 Gew.-%, bezogen auf Albumin. Um gleichmäßige homogene Verteilung von weitgehend in Wasser unlöslichen Medikamenten in der Albuminlösung zu gewährleisten, sollte man das Medikament zu besseren Verteilung in der Lösung mahlen. Nach Zugabe des Medikaments zu der Albuminlösung wird das Ganze etwa 15 bis 60 min äquilibricrt; während dieser Zeit können gewisse Anteile des Medikaments an Stelle des Albuminmoleküls gebunden werden. Die tatsächlich gebundene Medikamentmenge hängt ab von Faktoren wie Art der bindenden Stellen des Albu-

mins. Menge und Polarität der elektrostatischen Ladung des Trägermaterials und des Medikaments, Konzentration von Medikament und Trägermaterial in der zu äquilibrierenden Lösung, Gleichgewichtskonstante zwischen den Bindungsstellen des Trägermaterials und den Medikamentmolekülen, Temperatur und in gewissem Umfang auch Faktoren aus dem Massenwirkungsgesetz.

Die wäßrige Albuminlösung, enthaltend gelöst oder dispergiert das Medikament, wird mit einer 20- oder 25iger Injektionsnadel in ein Bad aus Pflanzenöl, welches heftig gerührt wird mit 500 bis 2500 UpM, eingebracht und bei weiterem Rühren das Ölbad auf eine Temperatur von 110 bis 180°C 15 bis 30 min erwärmt und dann noch zumindest 20 min bei dieser Temperatur gehalten. Eine Wärmebehandlung über 10 h ist im allgemeinen nicht erforderlich. Während dieser Wärmebehandlung zur Vernetzung und letztlich Desolubilisierung der Kügelchcn wird der Teil des unlöslichen Medikaments oder der Überschuß von löslichem Medikament, der nicht chemisch gebunden ist, eingeschlossen oder eingebaut innerhalb der Zwischenräume zwischen den Trägermaterialketten, die die dreidimensionale Kügelchenstruktur bilden. Durch dieses Rühren und Erwärmen erhält man ein in Wasser unlösliches Granulat mit einem Durchmesser von 5 bis 80;im. Die Korngröße der Kügelchen kann eingestellt werden durch Variieren der Einbringungsgeschwindigkeit der Lösung oder Dispersion in das Ölbad und/oder durch Veränderung der Rührgeschwindigkeit des Bads. Zusätzlich kleine Anteile (0,1 bis 2%) eines oberflächenaktiven Mittels zu der Albuminlösung beeinflußt auch die Größe der fertigen Albuminteilchen durch den indirekten Einfluß auf Oberflächen- und Grenzflächenspannung. Die biologische Abbaufiihigkci: und Porosität der Kügslchen läßt sich einstellen durch Variieren der Zeit ανά Temperatur des für die Wärmebehandlung angewandten Ölbads. Wenn die anderen Bedingungen gleich bleiben, führen im allgemeinen höhere Temperatur und längere Erwärmungszeiten zu härteren, weniger porösen und damit langsamcr abbaufähigen Kügelchen. Wenn das gewünschte Ausmaß der Insolubilität der Teilchen erhalten ist, wird das Ölbad entweder an der Luft oder mit Eiswasser abgekühlt und die Kügelchen aus dem Öl durch Ultrafiltration oder Absaugen auf einem mikroporösen Filter (0,45 ;im Porenweite) gewonnen. Anschließend wird mehrfach mit! Icptan und/oder Äther gewaschen zur Entfernung des restlichen Öls. Nach dem Trocknen an der Luft erhält man das Medikament enthaltende Granulat in freifließender pulveriger Form verschiedener Färbung in Übereinstimmung mit der Farbe der eingeschlossenen Medikamente. Für die intravasculäre Injektion werden die Kügelchen in einem pharmazeutisch tragbaren Medium suspend irt.

Diese ^solubilisierung durch Wärme ist besonders vorteilhaft, weil sie angewandt werden kann für wasserunlösliche wie auch wasserlösliche Medikamente. Außer diesen Vorteilen besitzt die Insolubilisierung in der Wärme einen Nachteil und das ist, daß während der Bildung des Granulats und der Einkapselung des Medikaments das Granulat oft auf Temperaturen über 110⁰C erwärmt werden muß. Obwohl hohe Temperaturen auf die Stabilität der Medikamente oft nur geringe Einwirkung haben, so kann es doch zu einem Abbau und Verlust der Wirksamkeit bei weniger stabilen Medikamenten kommen. Um dieses Problem zu überwinden, ist eine Insolubilisierung bei Raumtemperatur entwickelt worden. Dafür werden chemische Vernetzungsmittel, insbesondere Formaldehyd und Glutarsäurealdehyd, die hervorragende Härter für Albumine sind, angewandt.

Ks wurde festgestellt, daß lipophile trocknende Alkohole (Butanol, 2-Äthylhexanol) in Pflanzenölen leicht löslich sind, wie Baumwollsaatöl, ein standardisiertes Medium für die Koagulation (spheroidizing bath medium). Die vernetzenden Mittel (Formaldehyd, Glutarsäurealdehyd) werden in den trocknenden Alkoholen gelöst, insbesondere bis 25 Vol.-% wasserlösliches Vernetzungsmittel Glutarsäurealdehyd (als 25%ige wäßrige Lösung) oder Formaldehyd (als 37%ige Lösung) lassen sich in einem lipophilen trocknenden Alkohol, wie n- au Butanol, lösen. Wenn etwa 1 bis 40 Vol.-Teile einer solchen Lösung von Glutarsäurealdehyd oder Formaldehyd in Butanol gemischt werden mit 70 bis 500 Teilen Baumwollsaatöl, so erhält man ein Bad, in dem sowohl das Vernetzungsmittel als auch der trocknende Alkohol gelöst sind. Wird nun eine wäßrige Lösung von 25 bis 50% Scrumalbumin in dieses Bad unter Rühren mit etwa 1200 bis 1500 UpM eingerührt, so erhält man ein Granulat mit einer Körnchengröße von 20 bis 100 ;xm (kleinere Körnchen erhält man durch schnelleres Rühren oder geringere Konzentration an Trägermaterial in der ursprünglichen Lösung). Das Wasser innerhalb der Kügelchen geht über in den trocknenden Alkohol, während diese durch das Aldehyd vernetzt werden. Die Kügelchen werden nun nach einer Berührungszeit mit dem Vernetzungsmittel von zumindest 20 min abfiltriert. Die Freisetzung des Medikaments durch ein solches Granulat entspricht in etwa dem der Insolubilisierung durch Wärme. Das Ausmaß der Ve.netzung läßt sich einstellen durch Variieren der Berührungszeit der Kügelchen mit dem Vernetzungsmittel und der Menge an Vernetzungsmittel.

Obiges Verfahren ist besonders vorteilhaft, weil hier die Bildung des Granulats die Entwässerung und die Vernetzung in einem einzigen Verfahrensschritt erreicht wird. Wenn ohne Vernetzungsmittel gearbeitet wird, erhält man chemisch entwässerte trockne freifließende Albuminteilchen, die sich in Berührung mit Wasser auflösen.

Dieses Verfahren bei Raumtemperatur eignet sich ganz besonders fürdie Einbettung von temperaturempfindliehen wasserlöslichen oder -unlöslichen Medikamenten, obwohl es auch für wärmebeständige Medikamente anwendbar ist. Eine Variation dazu kann darin gesehen werden, daß man bis auf 105⁰C erwärmen kann.

Nach diesem modifizierten chemischen Vernetzen wird das Gemisch von Albumin und Medikament in ein Niedertemperaturbad (unter 105⁰C) eingebracht, wodurch die Kügelchen teilweise insolubilisiert werden. Es ist aber auch möglich, das Granulat zu bilden und es ohne Vernetzung chemisch zu entwässern. Das Granulat wird isoliert und in einen Trockner gegeben, woraufhin es zumindest 20 min den Dämpfen von Glutarsäurealdehyd oder Formaldehyd ausgesetzt wird. Diese Aldehyde können auf dem Boden des Trockners in handelsüblicher 37%iger bzw. 25%iger Lösung vorgesehen werden. Die Behandlung mit Aldehyddampf wird einige Tage fortgesetzt, wodurch die Kügelchen immer dichter, weniger porös und weniger wasserlöslich werden. Nach dem Vernetzen im Aldehyddampf wird überschüssiges Aldehyd leicht entfernt von den Kügelchen durch Absaugen oder Trocknen im Vakuum.

Beispiele für weitere Vernetzungsmittel sind zwei-, drei- oder vierwertige Metallkationen (Fe³⁺, AI³⁺), die leicht löslich sind in Butanol oder2-Äthy!hexanoI oder anderen lipophii trocknenden Alkoholen, die ihrerseits

löslich sind in Pflanzenölen, wie BaumwoHsaatöl. Die erhaltene Lösung dient dann als einstufiges Vernetzungsbad für die Albuminteilchen. Ander; Vernetzungsmittel für Proteine sind bekannt und können ebenfalls angewandt werden, wie:

Vernetzungsmittel

Löslichkeit Reagiert primär mil folgenden Gruppen des Proteins

ίο 3,6-Bis(mercurimethyl)-dioxan

O CH₂

⁺ Hg —CH₂-(^

CH₂-O

N,N'-(l,3-Phenyien)-bismaleinsäureimid

N.N'-Äthylen-bis-Oodacetamid) O

J-CH₂-C-NH-Ch₂-CH₂-NH-C-CH₂J

l,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol F NO₂

p,p'-Difluor-m,m'-dinitrodiphenyIsulfon

NO₂

Dimethyladipimidat ⁺NH₂

NH₂ ⁺

C —CH₂-fCH₂)5-CH₂—C

CH₃O

OCH₃

Phenol-2,4-disulfonyIchlorid CIO₂S SO,CI

OH

nein

Sulfhydryl-

nein Amino-, Tyrosin-

Amino-, Phenol-

Amino-

Fortsetzung

Vernetzungsmittel

löslichkeit Reagiert primär mit folgenden Gruppen des Proteins 5

llcxamcthylenc'iisocyanat

O = C = N-CH₂-(CH₂J₄-CH₂-N = C=O

Woodward's Reagens K

CH N ⁺ -CH₂—CH₃

CH

Bisdiazoben/idin

nein

Amino-

bindet Carboxyl-
und Aminogruppen

Tyrosin-, Histidin-

Obigo wasserunlöslichen Mittel lassen sich direkt in dem hydrophoben Öl unter Rühren lösen und können so als Vernetzungsmittel für die Albuminkügelchen dienen. Die wasserlöslichen Vernetzungsmittel werden direkt in die Albuminlösung gebracht oder in Alkohol gelöst, der als Entwässerungsmittel in dem Öl dient.

Man kann natürlich auch die Wärmebehandlung und die chemische Behandlung für die Vernetzung kombinieren.

Die Erfindung wird an folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1
(A) - (Durch Wärmevemctzcn)

0,9999 g Human-Serum-Albumin (Sigma, Fraktion V, Charge 246-16318) wurden in 2 cm³ entionisiertem Wasser unter Rühren mit einem Magnetrührer gelöst. In die Albuminlösung wurden 0,1057 g des Antitumormittels 5-Fluoruracil eingebracht und noch weitere 15 min gerührt. Da sich 5-Fluoruracil nicht vollständig in der Albuminlösung löste, wurde das wäßrige Gemisch in eine übliche Gewebemühle (10 cm³) gegeben und bis zur sicheren homogenen Verteilung dispergiert.

Das Gemisch wurde unmittelbar eingebracht in 500 cm³ Baumwollsaatöl in einem 600-cm³-Behälter aus korrosionsbeständigem Stahl bei Raumtemperatur unter Rühren von etwa 2300 UpM mit einem Propellerrührer, 038 mm. Die Rührgeschwindigkeit bestimmt in merklichem Ausmaß die Teilchengrößenverteilung des Granulats. Es wurde gerührt, während das Ölbad mit einem Tauchsieder, 500 W, innerhalb von 15 min auf 140⁰C erwärmt wurde; das Bad wurde 1 h unter Rühren bei 2300 UpM auf dieser Temperatur gehalten.

Danach wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Mikrokügelchen unter Vakuum abfiltriert. Die Reste an Öl wurden mehrere Male mit aliquoten Teilen von 300 cm³ Heptan abgewaschen. In dem erhaltenen Granulat der Uman-Serum-Albuminkügelchen (HSA) waren 9,6 Gew.-% Antitumormittel 5-Fluoruracil enthalten. Das Granulat war nicht agglomeriert, freifließend und hellbraun, die Teilchengröße lag zwischen 10 und 60um.

(B) - (chemische Vernetzung)

0,999 g H uman-Serum-Albumin wurden in 2 cm³ entionisiertem Wasser durch Rühren mit einem Magnetrührer gelöst und der Lösung dann 0,15 g L-Epinephrin (freie Base) sowie 0,0725 g L(H-) Ascorbinsäure zugefügt und noch 15 min gerührt.

Das Gemisch wurde unmittelbar eingebracht in ein Bad, enthaltend 5 cm³ Baumwollsaatöl, 13 cm³ n-ButanoI und 2,0 cm³ 25%iger Glutarsäurealdehydlösung. Das Bad wurde in einem Behälter (600 cm³, korrosionsbeständiger Stahl) bei Raumtemperatur mit obigem Propellerrührer mit etwa 1200 UpM gerührt. Es wurde 4 h gerührt, während dem die Vernetzung des Albumins und die Entwässerung durch den Alkohol stattfanden.

Die erhaltenen Kügelchen wurden im Vakuum abfiltriert und restliches Öl mit drei Portionen zu 100 cm³ Heptan abgewaschen.

Das erhaltene Granulat hatte trocken folgende Zusammensetzung: HSA 81,8%; L-Epinephrin 12,3%; L(+)-Ascorbinsäure 5,9%. Es war freifließend, nicht asglomeriert und gelb-orange bei einer Körnchengröße von 10 bis

Beispiel 2

Die Freisetzung des Medikamenis aus dem Aibumingranulat wurde in vitro nach der dynamischen Art in einer Strömungszelle ermittelt. Die Strömungszelle bestand aus einem 12,7 x 50 mm zylindrischen Rohr, enthaltend an einem Ende eine Sinterglasfritte (10 bis 20 um Porengröße). Eine Klammer und ein Dichtungsring gestatteten ein leichtes Füllen und Entleeren der Zelle mit dem Granulat. Etwa 10 mg Granulat wurden in einen Teil der auseinandergenommenen Zelle eingebracht und diese dann zusammengefügt. Ein Ende der Zelle war verbunden mit einem Polytetrafluorethylen-Rohr (3,175 mm Außendurchmesser, 2,16 mm 1. W.) mit einer Dosierpumpe, mit deren Hilfe eine auf pH-Wert 7,4 mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (137 mMol NaCl, 27 mMol KCl, 8 mMol NaH₂PO₄, 1 mMol KH₂PO₄) mit konstanter Geschwindigkeit - im allgemeinen 30 cirrVh - gedruckt wurde. Der medikamenthaltige Ablauf aus der Zelle gelangte in eine Küvette in einem UV (oder sichtbares Licht) verwendenden Spektralanalysator, abhängig von den spektrophotometrischen Absorptionseigenschaften des Medikaments, der versehen war mit einem Ausdrucker, mit dessen Hilfe die Medikamentkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit anhand der optischen Dichte ermittelt werden kann. Die Strömungszelle verblieb immer in einem Wasserbad von 37⁰C.

Der gesamte Ablaufeines Versuchs wurde in einem Meßzylinder aufgefangen und in einem Beckman-DK-2 A-Spektrophotometer analysiert, so daß aufgrund des Beer'schen Gesetzes die Bestimmung der Gesamtmenge an freigesetztem Medikament »π« dem Granulat während der Yersuchszeit möglich war. Aus dieser aufgezeichneten Kurve kann man nun die prozentuale Menge des aus dem Granulat freigesetzten Medikaments als Funktion ,kr Zeit ablesen.

Dieses Beispiel zeigt nun, wie man durch Variieren der Bedingungen des Vernetzens durch Wärme oder ein chemisches Mittel die Freisetzungsgeschwindigkeit von Bronchien erweiterndem Epinephrin aus dem Albumingranulat einstellen kann. Die Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments wurde nach obiger Methode bestimmt.

(A) Konzentration der anfänglichen wäßrigen Albuminlösung: 50% (Gew./Vol.).
Zusammensetzung des Granulats: 3,1% L(+)-Ascorbinsäure, 88,1% HSA, 8,8% Epinephrin (als freie Base).
Vernetzungsbedingungen: 115⁰C in Baumwollsaatöl innerhalb 1 h.

% Medikament freigesetzt

% Medikament Testgehalten

12

15

18

21

24

27

30

36

42

48

63

78

208

4,3 11,0 23,4 34,6 38,1 51,5 56,7 60,8 65,5 68,6 74,5 78,5 81,4 86,4 89,3 94,7

100
95,7 89,0 76,6 65,4 61,9 48,5 43,3 39,2 34,5 31,4 25,5 21,5 18,6 13,6 10,7 5,3

(B) Albuminkonzentration: 50%.

Granulatzusammensetzung: 87,5% HSA, 8,9% Epinephrin, 3,6% L(+)Ascorbinsäure.

Vernetzungsbedingungen: 120⁰C 6 h in Baumwollsaatöl.

% Medikament freigesetzt

% Medikament festgehalten

0
3
6

7,5 17,1

100
92,5 82,9

Fortsetzung

% Medikament freigesetzt % Medikament festgehalten

9
12
15
18
21
27
33
42
57
72
102
154

25,5 34,3

4M 47,4

52^ 59,1 64,2 69,2 73,6 76,0 78,9 81,6 74,5 65,7 58,7 52,6 47,8 40,9 35,8 30,8 26,4 24,0 21,1 18,4

(C) Albuminkonzentration: 50%.

Granulatzusammensetzung: 36,9% HSA, 8,7% Epinephrin, 4,4% L(+)Ascorbinsäure. Vernetzungsbindungen: 130⁰C 6 h in Baumwollsaatöl.

% Medikament freigesetzt % Medikament festgehalten

12

15

!8

21

27

33

48

66

7,8 18,0 26,2

38,4 42,1 45,8 51,2 56,2 63,5 70,8 100 92,2 82,0 73,8 66,8 61,6 57,9 54,2 48,8 43,8 36,5 29,2

(D) Aibuminkon2entration: 50%;

Granulatzusammensetzung: 87,5% HSA, 8,8% Epinephrin, 3,7% L(+)Ascorbinsäure. Vernetzungsbedingungen: 145°C 6 h in Baumwollsaatöl.

10

13

16

22

34

44

% Medikament freigesetzt

2,4

6,1 10,2 13,9 16,4 20,8 25,0 30,7 % Medikament festgehalten

100 97,6 93,9 89,8 86,1 83,6 79,2 75,0 69,3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

'.■■■•i

(E) Albuminkonzentration: 50%;

Granulatzusammensetzung: 87,8% HSA, 8,9% Epinephrin, 3,3% L(+)Ascorbinsäure. Vernetzungsbedingungen: 165°C 6 h in Baumwollsaatöl.

min

10 3

15 15

21

27 20 48

78 158

(F) Albuminkonzentration: 50%

Granulatzusammensetzung: 81,8%, 12,3% Epinephrin, 5,9% L(+)Ascorbinsäure. Vernetzungsbedingungen: 4 h in 500 ml Baumwollsaatöl, enthaltend 13 ml n-Butanol und 2,0 ml 25% Glutaraldehyd.

% Medikament	% Medikament
Freigesetzt	festgehalten
0	100
1,0	99,0
2,3	97,7
4,0	96,0
5,2	94,8
6,3	93,7
7,6	92,4
8,2	91,8
9,5	90,5
12,4	87,6
14,8	85,2
17,7	82,3

% Medikament	% Medikament
freigesetzt	Testgehalten
0	100
2,6	97,4
6,5	93,5
11,2	88,8
13,6	86,4
16,0	84,0
18,0	82,0
19,3	80,7
21,0	79,0
26,7	73,3
29,3	70,7
30,1	69,9
32,8	67,3

35 5

14

40 17

20

23

26 45 44

59

74 176

Wie man den Proben (A) bis (E) entnehmen kann, sinkt mit steigender Temperatur und Zeit der Vernetzung in der Wärme sowohl die Geschwindigkeit, mit der Epinephrin freigesetzt wird, als auch die Gesamtmenge an freigesetztem Medikament durch einfache Diffusion. Das restliche Medikament in dem Granulat wird voraussichtlich freigesetzt durch Abbau des Granulats im Körper. Probe (A) hat beispielsweise fast 50% Medikament in 1 h freigesetzt, während die Probe (E), die schärfer vernetzt wurde, in 3 h weniger als 20% frei gab. Diese Proben zeigen, wie man durch Wahl von Temperatur und Zeit der Vernetzungsbedingungen ein Granulat erhalten kann, welches das eingeschlossene Medikament in vorbestimmter Geschwindigkeit und Menge freizusetzen vermag.

Es wird noch auf Probe (F) hingewiesen, da 4 h Glutarsäurealdehyd als Vernetzungsmittel etwa äquivalent ist

einer Wärmebehandlung von 6 h bei 140 bis 150⁰C.

Die Freisetzungswerte der Proben (A) bis (F) wurden mathematisch analysiert zur Bestimmung der Geschwindigkeitskönstante (K) für das freigesetzte Medikament und der Halbwertzeit.

Nimmt man an, daß die Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments aus dem Granulat erster Ordnung ist und damit proportional der Konzentration des Medikaments verbleibend im Granulat, so ergibt sich die Geschwindigkeitskonstante aus

dt

i0

worin c die Konzentration des im Granulat bei der Zeit / verbliebenen Medikaments, K die Geschwindigkeitskonstante für die Medikamentfreisetzung, / die Zeit und c₀ die Anfangskonzentration des Medikaments bei t = 0 ist

Von dieser Gleichung läßt sich die Gleichung fur die Bestimmung der Freisetzungskonstante K erster Ordnung ableiten: .

(1)

10

(2)

(3) _IS *■'. (4)

Beide Seiten der Gleichung werden mit 100 multipliziert, um den Bruch des restlichen Medikaments clc₀ in eine Prozentangibe zu bringen.

JWL-IOOe-*-'. (5)

-de	r	= -	*■dt*	t	*= C₀*
C			I	oder c
	In C₀	*jK dt*
Inc-	o) =	0
In (de	*= -K ■*
	-K -t

Nimmt man von beiden Seiten der Gleichung den natürlichen Logarithmus

In (100 elco) = In (% rest. Medikament im Granulat) = -K ■ t +In 100 - -A: · t +B (6)

ln(100c/c₀) = -K t +B (7)

30

- B ist eine Konstante -, so beobachtet man ein Freisetzungsverhalten erster Ordnung in dem System, erhält man in einem Diagramm In (tr/c₀) oder In (100 clc₀) gegen die Zeit einer Gerade mit der Neigung -K. Bei c = 0,5 c₀ wird

In (c/c„) = In (0,5 C₀Ic₀) = 0,.· = -K ■ t_m,

so daß die Halbwertzeit

-In 0,5 _ 0,693
^1/2 K K~

wird.

Es ist also möglich, sowohl die Freisetzungskonstante K als auch die Halbwertzeit aus einem entsprechenden Diagramm des Logarithmus clc₀ gegen die Zeit zu erhalten.

Trägt man in ein solches Diagramm die Daten der Proben A bis F ein, so sieht man, daß die ersten 30 bis 50 min jeder Kurve fast linear sind und wiedergegeben werden können durch die Gleichung In (clc₀) = -K ■ t (Bruch des verbleibenden Medikaments im Granulat) oder durch In (100 elC₀) = -K t + B (% Medikament in dem Granulat).

Stehen genügend Daten zur Verfugung, so können die letzten Teile dieser Kurven durch eine andere gerade Linie mit anderer Neigung wiedergegeben werden. Die Kur fen In (clc₀) oder In (100 clc₀) gegen Zeit zeigen im Mittelteil ein Verschieben in den Freisetzungseigenschaften von schnell zu langsam mit fortschreitendem Freisetzen des Medikaments aus dem Granulat.

Die Freisetzungswerte der Proben A bis F wurden nach der Gleichung (7) analysiert unter Verwendung des Verfahrens der kleinsten Quadrate; es wurden die (am besten passendsten) geraden Linien durch Anfang- und Endteile der Kurven ermittelt. Die Werte K und t_U2 wurden ebenfalls aus den Anfangs- und Endbereichen der Kurven ermittelt. Die bestpassenden Parameter B, K-Werte und Halbwertzeiten für die Proben A bis F sind in folgender Tabelle zusammengestellt:

Probe A' (anfänglich) Halbwerts- B K (am Ende) Halbwerts- B

zeit (anföngl.) (anfangl.) zeit (am Ende) (am Ende)

π Λ 37,94 x ΙΟ"³ min"¹ 18,3 min 4,63 6,07 χ ΙΟ"³ min"¹ 114,2 min 2,92

|| B 32,67 x 10 ³ min"¹ 21,2 min 4,59 3,18 x 10"³ min"¹ 217,9 min 3,39

|S C 25,37 x 10"³ min"¹ 27,3 min 4,55 ungenügende ungenügende

§j Daten Daten

§ D 9,09 x 10 ^Λ min"¹ 76,2 min 4,60 desgl. desgl.

Fortsetzung	: K (anfanglich)	min ' min"¹	Halbwerts zeit (anfangl.)	*B K \am* (anfangl.)	Ende)	Halbwerts zeit (am Ende)	B (am Ende)
Probe	3,92 x 10"³ 9,70 X 10"³		176,7 min 71,4 min	4,60 0,55 X 4,61 0,41 X Beispiel 3	10"³ min"¹ 10"³ min"¹	1271,6 min 1686,1 min	4,49 4,28
E F

Serumalbumingranulate, enthaltend das Antitumormittel 5-Fluoruracil, wurden hergestellt und die Freisetzung nach Beispiel 2 ermittelt.

15 Probe A

Albuminkonzentration: 50%;

Granulatzusammensetzung: 90,9% HSA, 9,1% 5-FluoruraciI;

Vernetzungsbedingungen: 1 h, 100⁰C, Baumwollsaatöl.

²⁰ min % Medikament

ta freigesetzt festgehalten

I 0 0 100

I 25 1 4,4 95,6

% 4 23,2 76,8

% 7 42,7 57,3

I 10 54,7 45,3

I 30 13 63,4 36,6

I 16 70,1 29,9

f 19 75,9 24,1

j? 25 83,4 16,6

fi 35 31 88,3 11,7

ψ Probe B

^; Albuminkonzentration: 50%;

Granulatzusammensetzung: 90,4% HSA, 9,6% 5-Fluoruracil;

;i 40 Vernetzungsbedingungen: 1 h, 140⁰C, Baumwollsaatöl.

min

% Medikament	% Medikament
freigesetzt	festgehalten
0	100
2,3	97,7
9,0	91,0
15,5	84,5
20,0	80,0
22,5	77,5
24,2	75,8
25,5	74,5
31,4	68,6
Beispiel 4

^;l ⁴⁵ ο

Ϊ 2

J-:' 5

I· 8

U 11

P 14

¥ 17

^:; 20

I ⁵⁵ loo

"5 ⁶⁰ Dieses Beispiel zeigt die Freisetzung des Antitumormittels 6-Viercaptopurin aus einem Human-Serum^Albu-

:^!! min-Granulat nach der Methode des Beispiels 2.

Albuminkonzentration: 50%; Granulatzusammensetzung: 83,4% HSA, 16,6% 6-Mercaptopurin; Vernetzungsbedingungen: 1 h, 140⁰C, Baumwollsaatöl.

% Medikament	% Medikament
freigesetzt	festgehalten
0	100
2,1	97,9
5,8	94,2
9,6	90,4
12,3	87,7
14,8	85,2
16,7	83,3
20,3	79,7
26_?6	73.4
31,4	68,6
34,8	65,2
39,5	60,5
41,6	58,4
44,4	55,6
Beispiel 5

0 4 7

10

40

55

70

100

130

148

Dieses Beispiel zeigt die Freisetzung von Antitumormittel 6-Thioguanin aus Human-Serum-Albumin-Granulat nach Beispiel 2.

Albuminkonzentration: 50%; Granulatzusammensetzung: 82,2% HSA, 17,8% 6-Thioguanin; Vernetzungsbedingungen: 1 h, 123°C, Baumwollsaatöl.

% Medikament

% Medikament
festgehalten

10

13

16

19

22

25

28

34

40

55

85 115 145 175 412

0	100
1,2	98,8
2,3	97,7
3,3	96,7
4,6	95,4
6,5	93,5
7,7	92,3
9,1	90,9
10,4	89,6
13,0	87,0
15,2	84,8
20,3	79,7
29,7	70,3
37,7	62,3
43,0	57,0
<7,9	52,1
55,0	45,0
Beispiel 6
Antitumormittel

Eine Analyse der Kinetik erster Ordnung der Freisetzungswerte der Beispiele 3 bis 5 wurden im Sinne des Beispiels 2 durchgeführt. Die Geschwindigkeitsparameter sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

13

Beispiel

K (anfänglich)

Halbwertszeit (anfänglich)

B (anfanglich)

K (am Ende)

Halbwertszeit (am Ende)

3A(IOO⁰C, 1 h) 3B(HO⁰C, 1 h)

(14O⁰C, 1 h)

(123°C, 1 h)

76,64 x

19,51 X

9,66 x

4,27 X

9,0 min

35,5 min

71,7 min

162,3 min

4,61 4,61 4,61 4,62

60,17 x 10 'min"¹ 1,13 x iodinin"¹ 2,13 x lO^mm'¹ 0,78 x 10-³mhr'

11,5 min 615 min 325 min 886 min

B (am Ende)	SJ
	ON
4,32	Ui
4,34	Ui
4,33	OJ
4,13

Vergleicht man die Werte für die Konstante und die Halbwertzeit der Beispiele 3A und 3B, so zeigten die Albuminlcilchen, enthaltend 5-Fluoruracil, die I h bei 100⁰C gehalten wurde, i.ur ein sehrgeringes zweistufiges Verhalten, wogegen solche, die bei 140⁰C vernetzt wurden, stark zweistufigen Charakter hatten. Die anfängliche Halbwertszeit und der Endwert sind weitgehend erhöht mit höherer Vernetzungstemperatur.

Sowohl 6-Mercaptopurin als auch 6-Thioguanin in Albumingranulaten (Beispiele 4 und 5) zeigten zweistufiges Verhalten. Die anfänglichen und Endhalbwertszeiten für 6-Mercaptopurin sind schneller als die entsprechenden Werte für 6-Thioguanin, trotzdem 6-Mercaptopurin bei 14O⁰C und 6-Thioguanin bei 123°C vernetzt wurden. Die !ärgeren Halbwertszeiten von 6-Thioguanin zeigen ohne Zweifel die geringere Wassedösiichkeit gegenüber 6-Mercaptopurin.

Folgende Beispiele zeigen, daß das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren des Granulats nicht die Aktivität der eingeschlossenen Medikamente beeinflußt.

Beispiel 7

Etwa 20 bis 25 mg Human-Serum-Albumin-Granulat, erhalten aus 50%iger HSA-Lösung mit Epinephrin als Bronchien erweiterndes Mittel, wurden in 10 cm³ einer wäßrigen Kochsalzlösung (pH 3) dispergiert und 1 hzur Freisetzung nennenswerter Mengen an eingeschlossenem Medikament gerührt. Das Granulat wurde zentrifugiert, von überstehender Flüssigkeit befreit und spektroskopisch die Konzentration an freigesetztem Medikament ermittelt. Diese Proben aus der überstehenden Flüssigkeit wurden in vitro auf die Wirksamkeit in einem Meerschweinchen-Tracheal-Gewebe-Test untersucht. Dazu wurde Luftröhrengewebe von Meerschweinchen in einer Krebs-Lösung bei 38⁰C suspendiert und konnte äquilibrieren. Das Gewebe wurde verbunden mit einem Spannungs-Wandler (strain gauge transducer) und einem Schreiber derart, daß Änderungen in der Länge des Gewebes aufgrund Kontraktion oder Relaxation gemessen werden konnten. Die Zugabe geringer Anteile eines Agonists, wie Histamin (etwa 2 ug/cm³), bewirkte eine starke Kontraktion des Gewebes. Die Zugabe von reinem Epinephrin oder der überstehenden Lösungen, enthaltend Epinephrin aus dem Albumingranulat, führte zu einer Relaxation des Gewebes. Die Konzentration von freigesetztem Epinephrin (in _:xg/cm ) für diese Relaxation \ in histaminkontrahierten Luftröhrengeweben wurde bestimmt und mit einem Standard ähnlicher Art verglichen, um die Aktivität des freigesetzten Epinephrins sichtbar zu machen.

Medikament aus Probe

A reines 1-Epinephrin (Vergleich)

B USA = 78%, Epinephrin (epi) = 12,5%, L(+)Ascorbinsäure = 9,5% (68°C, 2,5 h)

/-■· ι ic a _ -M oo/ —: _ 11 ^a/ t / t ν * u:—χ..-., _ c no/ / ιλλογ \ u\

V^ I Ur\ — / J_tO/0, CpI — £. l _yL /O, Ι,ι^Τ //OCUl L/Il 13AUI C — _>,U/O \1W X^₁ 1 W)

D HSA = 86,9%, epi = 8,7%, L(+)Ascorbinsäure = 4,4% (100⁰C, 6 h)

E USA - 87,3%, epi = S,8%, L(+)Ascorbinsäure = 3,9% (110⁰C, 1 h)

F HSA = 87,7%, epi = 8,8%, L(+)Ascorbinsäure = 3,5% (110⁰C, 4 h)

G USA = 88,1%, epi = 8,8%, L(+)Ascorbinsäure = 3,1% (115°C, 1 h)

II I ISA = 87,5%, epi = 8,8%, L(+)Ascorbinsäure = 3,7% (12O⁰C, 6 h)

I USA = 86,9%, epi = 8,7%, L(+)Ascorbinsäure = 4,4% (130⁰C, 6 h)

Dosis	% Relaxation
(ig/cm^!)
0,1-0,2	100
0,1	100
0,1	100
0,01	25
0,02	75
0,03	100
0,01	27
0,02	53
0,03	73
0,05	82
0,10	100
0,01	6
0,02	31
0,03	53
0,05	71
0,10	100
0,01	32
0,02	72
0,03	84
0,05	91
0,10	100
0,01	25
0,02	75
0,03	92
0,05	100
0,01	0
0,02	7
0,03	22
0.04	37
0,10	67
0,20	100

Fortsetzung

Medikament uus Probe Dosis % Relaxation

(_;Jtg/cm³)

J HSA = 87,5%, epi = 8,8%, L(+)Ascorbinsäure = 3,7% (145⁰C, 6 h) 0,0? 0

0,03	7
0,04	11
0,05	19
0,10	33
0,20	67
0,30	89
0,40	100
0,01	0
0,04	10
0,10	30
0,20	50
0,30	60
0,40	80
0,50	100
0,1	100
1,4	0
2,8	0

K HSA = 87,8%, epi = 8,9%, L(+)Ascorbinsäure = 3,3% (165⁰C, 6 h)

L HSA = 81,8%, epi = 12,3% L(+)Ascorbinsäure = 5,9% (4 h in 500 cm' Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm' n-Butanol + 2,0 cm' 25% Glutaraldehyd; 25°C)

²⁵ M HSA = 67,3%. epi = 20,2%, L(+)Ascorbinsäure = 1?,5% (4 h in 500 cm' Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm³ n-Butanol und 2,0 cm' 37% Formaldehyd, 25°C)

30 Aus obiger Aufstellung ergibt sich, daß die Aktivität des Pinephrins etwas abnimmt mit steigender Vernetzungstemperatur. Kein nennenswerter Aktivitätsverlust gegenüber dem Vergleichsversuch zeigt sich bis zu Vernetzungstemperaturen von 13O⁰C. Überraschenderweise selbst nach Vernetzen bei 165⁰C während 6 h verbleibt eine merkliche Epinephrinaktivität. Selbst bei hoher Temperatur vernetztes Granulat ist wirksam und eignet sich für die parenterale Injektion bei Menschen.

35 Epinephrin in HSA-Granulaten, vernetzt mit Glutaraldehyd, behält im wesentlichen seine gesamte Aktivität. In Beispiel 2 wurde gezeigt, daß die Vernetzung mit Glutaraldehyd in 4 h etwa äquivalent ist dem Vernetzen in der Wärme während 6 h bei 140 bis 150⁰C. Da dies wenig erscheint, wenn irgend ein Aktivitätsverlust mit Glutufäidehydvemetzung stattfindet (gegenüber einem geringen Aktivitätsverlust bei 140 bis 150⁰C), so wird möglicherweise die chemische Vernetzung für Epinephrin bevorzugt, wenn höher vernetzte Granulate angestrebt

40 werden.

Formaldehyd ist nicht das Vernetzungsmittel der Wahl bei epinephrinhaltigen Granulaten.

Beispiel 8

45 Die Maßnahmen des Beispiels 7 wurden wiederholt, jedoch in diesem Fall als Medikament ein bronchienerweiterndes Salbutamol eingesetzt.

Medikament aus Probe Dosis % Relaxation

(!ig/cm³)

0,1	100
0,1	100
1,0	100

A Salbutamol (Vergl.)

B HSA = 88,5%, Salbutamol 6,3%, L(+)Ascorbinsäure = 4,6 (115°C, 1 h)

C HSA = 86,1%, Salbutamol = 7,9%, L(+)Ascorbinsäure = 6,0%; 55 (4 h in 500 cm³ Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm³ n-Butanol

und 2 cm³ 25% Glutaraldehyd; 25°C)

Ein Vernetzen in der Wärme in 1 h bei 115°C scheint die Aktivität von Salbutamol nicht zu beeinflussen, während Glutaraldehyd die Aktivität herabsetzt.

16

Beispiel 9 Die Maßnahmen des Beispiels 7 wurden mit Terburalin als die Bronchien erweiterndes Mittel wiederholt.

Medikament aus Probe Dosis % Relaxation

(ug/cm³) %

A reines Terbutalin (Vergl.) 0,1-1,0 IxK) i B HSA = 78,7%, Terbutalin = 11,7%, 0,1-1,0 100 ¹⁰ I L(+)Ascorbinsäure = 9,6% (68°C, 2,5 h) f C HSA = 82,9%, Terbutalin = 12,5%, 0,1-1,0 100 % L(+)Ascorbinsäure = 4,6% (105⁰C, 1 h) f D HSA = 81,5%, Terbutalin = 12,3%, 0,1-1,0 100 ,5 | L(+) Ascorbinsäure = 6,2% (4 h in 500 cm³ Baumwoilsaatöl, J

enthakend 13 cm³ n-Butanol und 2 cm³ 25% Glutaraldehyd, 25°C) ρ

Daraus entnimmt man, daß weder die Vernetzung in der Wärme, noch mit einem chemischen Mittel einen '*«.

nachteiligen Einfluß auf die Aktivität von Terbutalin hat. 20 ^

Beispiel 10 (⁴

Es wurde nun die Aktivität von HSA-Granulat, enthaltend 5-Fluoniracil als Antitumormittel, in einem Mäu- '-":

se-L-Zelientest geprüft 25 :J

L-676 Mäuseembryc-Fibroplaste wurden gezüchtet und in flüssigen Schüttelkulturen von Swims-67G- V Medium, verstärkt durch Zugabe von 5% fötalem Kalbsserum, ergänzt durch 1% 200 mm Glutamin, gehalten. '; Die freien Medikamente ohne Trägermaterial dienten zum Vergleich und wurden gelöst entweder in sterilem ?.·(

destilliertem Wasser oder Aceton und dann dem Wachstumsmedium zugesetzt. Wenn Aceton angewandt wird, i

sollte die Konzentration immer gering genug sein, daß sie nicht-toxisch ist für das Wachstumsmedium. 30 ■

Das Medikament enthaltende Granulat wurde im Wachstumsmedium suspendiert; ein beschalltes Wasserbad ;;

wurde zur Unterstützung der Suspension angewandt. Die mikroskopische Untersuchung zeigte keine Zerstö- ■'

rung der Kügelchen. 3

Ein 10% (Vol./Vol.) Inoculum von L-Zellen wurde in einem Endvolumen von 20 cm·' des Wachstumsmediums j ->

verwendet, enthaltend suspendiert das Granulat bzw. zum Vergleich das Medikament. Die Ergebnisse wurden 35 ' ausgezänii nach inkubaiion auf einem Schiiüeigerät 2OG Upivi bei 37⁼C 3 Tage und in % Wachstumshemmung gegenüber von nichtbehandelten Vergleichszellkulturen ausgedrückt. Es wurden jeweils Parallelversuche durchgeführt.

% Hemmung des L-Zellenwachstums nach 72 h 40

Aniitumormiitcl Konzentration des Medikaments in der L-Zellcnsuspension (ug/cm³)

1 10 50 100

Reines 5-Fluoruracil (Vergleich) 67% 88% 93% 93%

5-FU-Konzentralion % Hemmung

vig/cm³ in der

Zellkultur

Probe A

Granulatzusammensetzung: 99% HSA, 1% 5-Fluoruracil 0,3 39 55

24 h in 500 cm³ Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm³ n-Butanol 3,0 99

und 2,0 cm' 37% Formaldehyd; 25⁰C

Probe B

Granulatzusammensetzung; 86,6% HSA, 13,4% 5-Fluoruracil 4,0 98 60

24 h in 500 cm³ Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm' n-Butanol und 2,0 cm' 37% Formaldehyd; 25°C

Probe C

Granulutzusammensetzung: 98,7% HSA, 1,3% 5-Fluoruracil 0,4 47 ₆₅ I4Ü°C in Baumwollsaatölbad fur 2 h 3,9 95

17

Fortsetzung

5-FU-Konzentration ug/cm³ in der Zellkultur

% Hemmung

Probe D

Granulatzusammensetzung: 86,9% HSA, 13,1% 5-Fluoruracil 3,9 99

₁₀ (höh. Konzentration als in Beispiel C) 140⁰C in Baumwollsaatölbad für 2 h

Probe E

Granulatzusammensetzung: 83,1% HSA, 16,9% 5-Fluoruracil 5,1 100

5^ h in 500 cm³ Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm³ n-Butanol ¹⁵ und 2,0 cm³ 37% Formaldehyd, 25°C

Diese Ergebnisse zeigen, daß die hohe Aktivität von 5-Fluoruracil in dem erfindungsgemäßen Granulat sowohl bei Härtung durch Wärme als auch durch Chemikalien aufrechterhalten wird.

Beispiel 11 bis

Nach Beispiel 10 wurde ein Granulat mit weiteren Antitumormitteln hinsichtlich der Beibehaltung der Aktivität untersucht und die Ergebnisse in folgender Tabelle zusammengefaßt:

Beispiel Nr.

Granulatzusammensetzung

Konzentration

% Hemmung

Zellkultur)

11 Chiorambucil

12 Hydrocortisonacetat

13 Colchicin

14 HydroxyharnstofT

a) 95,5% HSA,

4,5% Chiorambucil

24 h in 500 cm³ Baumwollsaatöl, enthaltend

13 cm³ n-Butanol und 2,0 cm³ 37% Formaldehyd

b) Chiorambucii (Vergleich.)

a) 83,9% HSA,

16,1% Hydrocortisonacetat 120^cC, 1 h in Baumwollsaatöl

a) 86,4% HSA,

16,6% HydroxyharnstofT 125°C, 1 h in Baumwollsaatöl

b) IlydroxyharnstolT(Vergleich)

1,35

10 50

4,8

5,0

1,0 10,0

28 89

0 68 97

88

b) Hydrocortisonacetat (Vergleich)	1,0	0
	10,0	0
	50,0	73
	100,0	88
a) 83,1% HSA,	5,1	99
16,9% Colchicin
143°C, 1 h in Baumwoilsaatöl
b) 83,4% HSA,	5,0	93
16,6% Colchicin
5,5 h in 500 cm¹ Baumwollsaatöi, enthaltend
13 cm³ n-Butanol und 2 cm' 25% Glutaraldehyd
c) Colchicin (Vergleich)	1,0	91
	10,0	99

25

0 22

IS

Fortsetzung

Beispiel Granulatzusammensetzung Konzen- %

js]_r_ tration Hemmung

( ig/cm"
Zellkultur)

15 6-Thioguanin a) 82,2% HSA, 5,3 96

17,8% 6-Thioguanin 123°C, 1 h in Baumwollsaatöl b) 6-Thioguanin (Vergleich)

1,0	65
10,0	88
50,0	92

16 ßusulfan a) 83,2% HSA, 25,0 56

16,8% Busulfan
115°C, 1 h in Baumwollsaatöl
b) Busulfan (Vergleich) 25,0 69

17 6-Mercaptonerin a) 83,0% HSA, 50 95

i7,0% o-Mercaptopurin
130⁰C, 1 h in Baumwollsaatöl
b) 6-Mercaptopurin (Vergleich) 50 94

19

Claims

Patentansprüche:

1. Granulat aus Serumalbumin fur die parenterale, insbesondere intravasculäre Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Granulat von Albumin mit unterschiedlichem Vemetzungsgrad 2 bis

S 70 Gew.-% nicht-radioaktives organisches Medikament homogen eingeschlossen sind, welches zumindest zu

0,01% in Wasser von 37°C löslich ist und aus dem Granulat in zwei Phasen unterschiedlicher Geschwindigkeit freigesetzt wird.

2. Verfahren zur Herstellung des Granulats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer wäßrigen Lösung des Albumins ein nicht radioaktives organisches Medikament dispergiert oder löst, diese

!0 Mischung unter starkem Rühren in ein Bad aus Pilanzenöl einbringt und dieses unter weiterem Rühren auf

110⁰C bis 180⁰C erwärmt, die Mischung mindestens 20 min bei dieser Temperatur hält, das Ölbad nach erfolgter Vernetzung der Granulatteilchen abkühlt und die Granulatteilchen nach Entfernung des Öls trocknet

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Ölbad einen lipophilen, trocknenden Alkohol und Glutarsäurealdehyd oder Formaldehyd zusetzt.