DE2433212A1 - Verfahren und vorrichtung zur substratkonzentrationsmessung - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur substratkonzentrationsmessungInfo
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- Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
Description
Verfahren und Vorrichtung zur Substratkonzentrationsmessung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Konzentration von Substraten von Enzymreaktionen, die im intermediären
Metabolismus auftreten, insbesondere der Konzentration von Lactat und Glucose in biologischen"Flüssigkeiten, bei dem
ein durch Oxydation eines Akzeptors an einem elektrochemischen Sensor entstehender Strom mit einer Messvorrichtung gemessen
wird, die sich im wesentlichen aus einer Messzelle zur Aufnahme der Testlösung,einer mit der Testlösung in Kontakt befindlichen,
einen elektrochemischen Sensor, eine Snzymschicht und eine die Enzymschicht abdeckende semipermeable Membrane enthaltenden
Enzymelektrode und einer mit der Testlösung in Kontakt befindlichen Bezugselektrode zusammensetzt, sowie eine Vorrichtung zur
Durchführung des Verfahrens.
Die Messung der Konzentration von Substraten der eingangs genannten Art hat durch die Ergebnisse der medizinischen
Forschung an Bedeutung gewonnen. Es hat sich z.B. erwiesen,
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dass eine 3rh.oh.ung der Xactatkonzentration im Blut einen
Sauerstoffmangel im zellularen Bereich entspricht. Diese Erkenntnis ist z.B. für die Behandlung von Patienten im
Schockzustand außerordentlich wichtig, denn es hat sich
gezeigt, dass in solchen Fällen die lactatkonzentration im Blut einen nasngebenden Parameter für die Beurteilung und Verfolgung
des Zustands eines Patienten darstellt.
In einer Vielzahl von Anwendungen wie jenen, in denen eine schnelle Diagnose sehr wichtig ist, ist ein Verfahren
("bzw. eine Vorrichtung) für die Messung der Konzentration
von Substraten in biologischen Flüssigkeiten erst von ■ Nutzen, wenn dieses (bzw. diese) die schnelle Durchführung
von zuverlässigen Messungen ermöglicht. Zudem ist besonders für den Analysenlabor- und/oder den Spitalbetrieb eine
Messvorrichtung erforderlich, die eine zweckmassige Automatisierung der Kessvorgänge ermöglicht, deren Behandlung
und Wartung einfach ist und die mit sehr kleinen Probenmengen auskommt.
Unter anderen Verfahren der eingangs genannten Art hat sich bisher das in der Zeitschrift "Analytical Chemistry",
1970, Band 42, ITo. 1, Seiten 118 bis 121, beschriebene Verfahren und die Vorrichtung zu dessen Durchführung als
besonders vorteilhaft erwiesen.
Ausser der Bnzymelektrode enthält die dort beschriebene
Vorrichtung eine zweite Elektrode, die soweit wie möglich den gleichen Aufbau wie die Bnsyiselektrode - aber ohne Enzyisschichi
aufweist.
Für jede PIessung wird der Testlösung eine als Akzeptor
bezeichnete Substanz hinzugefügt. Die Kessung geht in der Weise vor sich, dass die Snzymelektrode, die zweite Elektrode
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und eine Kathode in die so vorbereitete Testlösung getaucht werden, eine niedrige Gleichspannung zwischen der Kathode
und den anderen zwei Elektroden angelegt wird und die Differenz der Ströme, die durch die Enzymelektrode und die
zweite Elektrode fliessen, gemessen wird. Die zweite Elektrode soll die unerwünschte Wirkung des
Grundstroms, der durch die Enzymelektrode fliesst, auf die Genauigkeit der Messung kompensieren. Der Grundstrom entsteht
z.B. bei der Messung der Glucosekonzentration im Blut, weil das als Akzeptor verwendete Chinon nicht nur durch die
Oxydation des reduzierten Enzyms, sondern auch durch die Oxydation von verschiedenen Plasmakomponenten reduziert wird.
Der für die Messung nützliche Strom fliesst durch die Enzymelektrode und entsteht auf folgende Weise: Das Substrat
(s) und der Akzeptor (Aox) diffundieren durch die semipermeable Membran der Enzymelektrode und gelangen in deren
Enzymschicht. Das Substrat geht eine enzymatische Reaktion ein. Das aus dieser Reaktion resultierende reduzierte Enzym
(Ered) oxydiert dann in Anwesenheit des Akzeptors (Aox). Der dadurch reduzierte Akzeptor (Ared) oxydiert an dem elektrochemischen
Sensor der Enzymelektrode wieder. Ein derartiger gekoppelter Prozess lässt sich durch folgende Bruttoreaktionsgleichungen
beschreiben:
E + S «=* ES —>
Ered + P
Ered + Aox —> E + Ared
Ared —^ A + ne"
Ered + Aox —> E + Ared
Ared —^ A + ne"
P stellt darin ein Reaktionsprodukt dar. Die Oxydation des reduzierten Akzeptors ergibt einen Strom, der durch den
elektrochemischen Sensor der Enzymelektrode fliesst und in eindeutigem Verhältnis zu der Konzentration des Substrates
in der Testlösung steht.
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Nach den bekannten Verfahren werden je nach Substrat
"folgende Enzyme und Akzeptoren verwendet:
Substrat Enzjjn Akzeptor
Glucose Glucose-Oxydase Chinon Lactat Cytochrorri bp Kaliurahexacyanoferrat (ill)
Es ist weiter bekannt, bei der Messung eine Temperaturregelung des Behälters vorzusehen, der die Testlösung enthält
(Amerikanische Patentschrift No. J5T623*960). Diese Massnahme
ist wichtig für die Genauigkeit der Messungen, da die enzyniatischen Reaktionen temperaturabhängig sind.
Das oben beschriebene Verfahren hat wie alle anderen
bisher bekannten Verfahren den !fochteil eines viel zu grossen
Arbeite- und Zeitaufwands.
Wie alle anderen bisher bekannten Vorrichtungen weist ■ die oben beschriebene Vorrichtung folgende Mängel auf:
Erstens ist die Vorbereitung der Vorrichtung zeitraubend, da keine Automatisierung der Messungen vorgesehen ist und
allein die Temperaturregelung der Testlösung viel Zeit braucht. Zweitens können die Bedienung und der Unterhalt solcher
Vorrichtungen nicht von Hilfspersonal vorgenommen werden. Drittens ist die erforderliche Menge an Testlösung zu
gross. Da die kleinsten Abmessungen des Behälters für die Testlösung durch die Einrichtung für die Temperaturregelung
der Testlösung gegeben sind, kann die Menge der Testlösung pro Eessung nicht reduziert werden. Viertens
eignet sich die bekannte Vorrichtung nicht für automatisierte Messungen, fünftens hat sich die Kompensation des
Grundstroms mit einer zweiten Elektrode als nicht genügend genau erwiesen, da es schwierig ist,
zwei identische Elektroden su bauen. Aus diesen Gründen
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sind das oben angegebene Verfahren -and die beschriebene
Vorrichtung für die Durchführung von Routinemessungen in
einem Analysenlabor oder im Spitalbetrieb ungeeignet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, welches die Bestimmung der Eonsentration von
Substraten in biologischen Flüssigkeiten mit einer vresentlicher. Reduktion des Arbeite- und Zeitaufwands err.:öglicht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zur Durchführung des erxindungsgenässen Verfahrens
anzugeben, welche schnelle Messungen ermöglicht, einfach zu
bedienen und zu warten ist, sich für automatisierte Messungen eignet und nur sehr kleine Testlösungsrüengen pro Messung
braucht.
Ed ist ferner Aufg9.be der Erfindung, eine anzugeben, die in einer Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgenässen Verfahrens verwendet werden kann, und die
Kit hohem Wirkungsgrad eine schnelle Temperaturregelung
der enzymhaltigen Schicht und damit schnelle Messungen mit
sehr kleinen Testlöcungsmengen ermöglicht.
Das erfindungs-gemässe Verfahren ist dadurch, gekennzeichnet,
daas eine Temperaturregelung der das Enzym enthaltenden Schicht auf eine vorgegebene Temperatur durchgeführt
wird, eine Gleichspannung von ca. 0,25 bis 0,50 V zwischen, der Enzyme lekt ro de und der Bezugselektrode angelegt
wird, wobei die Enzymelektrode positiv gepolt ist, die Messzelle mit einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösung
gefüllt wird, wodurch eine genügende Menge des Akzeptors
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durch die semipermeable Membrane der Enzymelektrode diffundiert und
in die das Enzym enthaltende Schicht gelangt, die Pufferlösung
aus der Messzelle abgesaugt, die Messzelle mit einer Testlösung gefüllt, und die Konzentration des in der Testlösung
enthaltenden Substrates der Enzymreaktion durch Ermittlung des Sättigungsv.-ertes des durch den elektrochemischen Sensor
fliessenden Stroms mit einer elektronischen Schaltung gemessen wird.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, Vielehe
dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine MessZeilenanordnung mit einer thermisch geregelten Enzymelektrode, einer Bezugselektrode
und einer zur Aufnahme der Testlösung bestimmten, als
rohrförmige Kammer ausgebildeten, zwischen die Kontaktflächen
der Elektroden gelegten Messzelle, eine mit der Enzymelektrode gekoppelte Temperaturregeleinheit zur Temperaturregelung der
das Enzym enthaltenden Schicht, eine hydraulische Einrichtung, um die Messzelle abwechselnd mit einer einen Akzeptor enthaltenden
Pufferlösung oder einer Testlösung zu füllen, und eine elektrische
Naehweiseinrichtung,die nach Füllung der Messzelle mit
einer Testlösung die Messung der Substratkonzentration durch Ermittlung des Sättigungswertes des durch den elektrochemischen
Sensor fliessenden Stroms ermöglicht, enthält.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Enzymelektrode
insbesondere für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgeiaässen
Verfahr ens, welche dadurch gekennzeichnet ist ,dass sie einsi
mit dem elektrochanischen Sensor thermisch gekoppelten Temperaturfühler,
der einer externen Temperaturregeleinheit die Gewinnung eines den Ist-Wert der Temperatur des elektrochemischen
Sensors darstellenden Signals ermöglicht und
509809/1005 ~
ein mit dem elektrochemischen Sensor thermisch gekoppeltes,
von der externen Temperaturregeleinheit gesteuertes Peltier-Element zur Temperaturregelung des elektrochemischen
Sensors und der mit diesem in Kontakt befindlichen ein Enzym enthaltenden Schicht, enthält.
Im folgenden wird anhand der beiliegenden Zeichnungen ein Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 ein schematisches Blockdiagramm einer selbsttätig gesteuerten Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration
eines Substrates in einer Testlösung,
Fig. 2 eine perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführung der Vorrichtung,
Pig. 3 einen Querschnitt einer thermisch geregelten Enzyme leim roe;·?.,
Fig. 4 einen Teil des in Pig. 3 gezeigten Querschnitts,
Fig. 5 eine typische Aufzeichnung des Stromverlaufs "bei der
Messung der Lactatkonzentration in verdünnten lösungen
von hepo.rinisierten menschlichen Blutproben.
Wie in den Figuren 1 und 2 gezeigt, enthält die erfindungsgemässe
Vorrichtung eine Messzellenanordnung, welche aus einer thermisch geregelten Enzymelektrode 2, einer Bezugselektrode
3 unci einer zur Aufnahme der Testlösung bestimmten, als
rohrförmige Kammer von sehr kleinen Abmessungen ausgebildeten,
zwischen die Kontaktflächen 4,5 der Elektroden gelegten Messzelle
6 besteht. Die Messzellenanordnung 1 weist die in Fig. schernatisch dargestellten Kanäle 7*8 auf, Vielehe die Messzelle
6 einerseits über eine Leitung 9 mit einem Verteiler
10, der mit der Messzellenanordnung mechanisch gekoppelt ist, und andererseits über eine Leitung 11 mit einem Behälter 12
zum Empfang der aus der Messzelle 6 abgesaugten Abfalllösungen
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verbindet. Die Messzellenanordnung 1 und der Verteiler 10 sind
teilweise aus durchsichtigem Material angefertigt. In den Verteiler 10 münden zwei Zuleitungen 13,l4. Zuleitung 13
verbindet den Verteiler mit einem Behälter 15, der eine einen Akzeptor enthaltende Pufferlösung enthält und durch
eine Oeffnung 15' stets nach aussen geöffnet ist. Zuleitung
ermöglicht die Verbindung des Verteilers mit einer Spritze l6, mit der eine Testlösung in die Messzelle eingeführt wird.
Verteiler 10 ist durch einen Elektromagnet TJ steuerbar, um die Verbindung der Zuleitung 13 oder der Zuleitung 14 mit
der Leitung 9 herzustellen. Der Behälter 12 ist nach aussen geschlossen und nur über Leitungen 18,19 mit einer Vakuumpumpe
20, bzw. mit einem Luftventil 21 verbunden. Die Vakuumpumpe ermöglicht die Bildung eines Vakuums im Behälter 12,
welches je nach Einstellung des Verteilers den Fluss der Pufferlösung vom Behälter 15 in die Messzelle 6 oder das
Absaugen der Ab f al lösungen von der Messzelle β in den
Behälter 12 verursachen kann. Das Luftventil dient zur Beseitigung des durch die Vakuumpumpe im Behälter 12 erzeugten
Vakuums und damit zur Unterbrechung des durch Druckunterschied verursachten Flusses. Sowohl die Vakuumpumpe 20 als auch das
Luftventil 21 sind elektrisch steuerbar.
Figur 3 zeigt im Detail den Aufbau der in der Messzellenanordnung
untergebrachten, thermisch geregelten Enzymelektrode 2. Ein als Halter dienender zylindrischerKunststoffblock
22 v/eist eine zylindrische Vertiefung auf, die von einem ringförmigen Vorsprung umgeben ist. In der Vertiefung
ist ein elektrochemischer Sensor 23 aus Platin oder Gold untergebracht. Dieser weist auch eine zylindrische Vertiefung
von ca. Of 2 mm Tiefe auf. Der Rand des Vorsprungs und die
äusserste ringförmige Oberfläche des elektrochemischen Sensors befinden sich auf derselben Ebene. Eine semipermeable Membran
24 aus regenerierter Cellulose wird durch einen ausserhalb
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des Vorsprungs angeordneten Haltering 25 befestigt. In dem
Raum zwischen der Oberfläche der zylindrischen Vertiefung des elektrochemischen Sensors 23 und der Membrane 24 befindet sich
eine ein Enzym enthaltende Schicht 26. Der elektrochemische
Sensor 23 ist von einem zylindrischen Ansatz eines scheibenförmigen
Aluminiumteils 27 umgeben, der die thermische Kopplung
zwischen dem elektrochemischen Sensor und einem auf dem Aluminiumteil montierten Peltier-Element 28 ermöglicht. Der
Aluminiumteil ist mittels einer Oxydschicht 29 von allen anderen Teilen elektrisch isoliert. Zur Abkühlung des Peltier-Elements
ist auf diesem eine Kühlrippe 30 montiert.
Wie in Figur 1 gezeigt, wird das Peltier-Element 28 von einer Temperaturregeleinheit 31 gesteuert, um die Temperatur
des elektrochemischen Sensors auf einem vorgegebenen Wert zviisehen 10°~20°C konstant zu halten. Durch die Temperaturregelung
des elektrochemischen Sensors 23 wird eigentlich die
Temperaturregelung der das Enzym enthaltenden Schicht 26 bezweckt, da wie bereits erwähnt, die enzymatische Reaktion, die
in dieser Schicht stattfindet temperaturabhängig ist. Die Temperaturregelung der Schicht 26 kann mit der oben beschriebenen
Anordnung am schnellsten und mit dem höchsten Wirkungsgrad erfolgen, da der thermische Widerstand zwischen dem Peltier-Element
und der Schicht 26 sehr klein ist. Ein in einer Bohrung des elektrochemischen Sensors 23 untergebrachter und mit diesem
thermisch gekoppelter Thermistor 3^ ist mit der Temperaturregeleinheit
31 verbunden, um dieser die Bildung eines Signals zu
ermöglichen, das den Ist-Wert der Temperatur des elektrochemischen Sensors darstellt.
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Wie in der Figur 3 gezeigt, dient eine Epoxydfüllung
37 zur Befestigung des Thermistors J>K in der Bohrung des
elektrochemischen Sensors. Die Temperaturregeleinheit 351
ist über Leitungen 32, 33 mit dem Peltier-Element 28 und
über Leitungen 35*36 mit dem Thermistor 3^· verbunden. Der
elektrochemische Sensor 23 ist über eine Leitung 38 mit einer Gleichspannungsquelle ho verbunden. Alle elektrischen Verbindungen werden über Anschlussklemmen 39 nach aussen
geführt.
Je nach Substrat werden in der Enzymelektrode folgende Enzyme verwendet.
Glucose Glucose-Oxydase Lactat Cytochrom b„
Die Kriterien für die Wahl der Enzym?- und Membraneigenschaften
werden zunächst für die Messung der Lactatkonzentration erläutert. Für ihre Verwendung in einer Klinik oder einem
Analysenlabor muss die Enzymelektrode folgende Bedingungen erfüllen. Erstens muss bei Anwesenheit einer genügenden Menge
des Akzeptors in der Enzym enthaltenden Schicht 26 der durch den elektrochemischen Sensor 23 fliessende Dauerstrom
proportional zur Lactatkonzentration in der Testlösung bis zu einer Konzentration von ca. 15 mM/l sein. Zweitens muss trotz
der unvermeidlichen Verminderung der Aktivität des Enzyms mit zunehmender Verwendungszeit die nach Eichung der
Enzymelektrode auftretende zeitliche Abweichung des Dauerstroms möglichst gering sein. Drittens muss die Ansprechzeit der
Enzymelektrode möglichst kurz sein (^-2 Min.). Um
diese drei Bedingungen zu erfüllen, wäre es am besten, ,Membranenmit niedriger Permeabilität und kurzen Induktionszeiten (ein Mass für die Zeit, die eine Membrane benötigt, um
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eine stationäre Diffusion des Substrats durch die Membrane
zu ermöglichen.) zu verwenden. Kommerziell erhältliche Zellophanmembranenweisen
zwar eine kurze Induktionszeit für Lactat auf, ihre hohe Permeabilität erfordert jedoch die
Verwendung von Enzymlösungen mit sehr hoher Aktivität. Mit den aktivsten Cytochrom-bp-Lösungen, die zur Zeit erhältlich
sind (ca. 2000 U/ml bei 25°C), ist es möglich, nach Eichung der Enzymelektrode eine sehr kleine zeitliche Abweichung
der Messwerte über einige Tage zu erreichen. Eine wirtschaftlich günstige Ausführung der Enzymelektrode muss über mehrere
Wochen ohne Unterhalt verwendbar sein. Dies kann durch Verwendung von Membranen niedriger Permeabilität oder durch
Verdünnung der Testlösung erreicht werden. Da zur Zeit keine zuverlässige Membranen niedriger Permeabilität vorhanden sind,
wurde die zweite Möglichkeit gewählt. Es wurde festgestellt, dass ein Verdünnungsverhältnis von 1:10, das den Messbereich
auf 0 bis 1,5 mM/l reduziert, am zweckmässigsten ist.Verdünnungsverhiiltnisse
.zwischen 1:5 und 1:20 sind jedoch, auch,
anwendbar. In der oben beschriebenen Enzymelektrode wurden Zellophanmeinbranen
PUDO-193 von Du Pont und Cytochrom-bp-Lösungen mit
einer Aktivität von ca. 2000 U/ml verwendet. Eine so präparierte Enzymelektrode kann mindestens während eines
Monats für die Messung der Lactatkonzentration in verdünnten biologischen Flüssigkeiten in einem Bereich von 0 bis 1,5
mM/l eingesetzt werden. Die Ansprechzeit dieser Enzymelektrode liegt zwischen 50 und 120 Sek., wenn die Temperatur des
elektrochemischen Sensors konstant bei 18°C gehalten wird.
Mit zunehmender Verwendungszeit nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Dadurch nimmt die Intensität des durch die
enzymatische Reaktion resultierenden Stroms ab und die Ansprechzeit der Enzymelektrode nimmt zu. Das Ende der Lebensdauer
des Enzyms ist durch den Zeitpunkt gegeben, zu dem der Dauerstrom nicht mehr proportional zur Lactatkonzentration
ist oder wenn die Ansprechzeit der Enzymelektrode zu lang
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wird (über 2 Min.).
Der Unterhalt der Enzymelektrode ist einfach. Bei Ablauf der Lebensdauer des Enzyms, werden das alte Enzym
und die Membran entfernt, die Kontaktoberfläche des elektrochemischen
Sensors sorgfältig gereinigt, eine neue Enzymlösung wird auf dieser aufgetragen, und eine neue Membrane montiert.
Diese Unterhaitsmassnahmen können von einer geübten Person
in ca. 5 Minuten 'durchgeführt werden. Die Enzymelektrode kann
daraufhin wieder für mindestens einen Monat ohne Unterhalt verwendet werden.
Die in den Figuren 1 und 2 gezeigte Bezugselektrode 3
ist z.B. eine Silberchloridelektrode. Die Lebensdauer des in der Enzjrrne-lektrode verwendeten Enzyms wird durch die Wirkung
der von der Silberchloridelektrode abgegebenen Ionen verkürzt. Um das Enzym gegen diese Ionen zu schützen, wird die Bezugselektrode
zweckmäGsig mit einer nichtgezeigten G-lasfritte oder
einer Membrane versehen, die den Ionenfluss aus der Bezugselektrode
hindern.
Wie in der Figur 1.gezeigt, ist der elektrochemische
Sensor der Enzymelektrode 2 über Leitung J>Q, die Gleichspannungsquelle
40, einea Stromverstärker 4l und eine Leitung mit der Bezugselektrode 3 verbunden. Zur Messung eines durch
diese Schleife fliessenden Stroms ist ein Strommessgerät 43
mit digitaler Anzeige an einen Ausgang des Stromverstärkers 4l angeschlossen. Ein mit dem Strommessgerät parallelgeschalteter
Fensterdiskriminator 44 dient bei jeder Substratkonzentrationsmessung
zur schnellen Ermittlung des Sättigungswertes des von dem Strommessgerät gemessenen Stroms. Im
Fensterdiskriminator werden bei zunehmendem Strom jeweils zwei nacheinander abgetastete Messwerte verglichen. Wenn ihre
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Differenz kleiner als ein vorgegebener Bezugswert ist, gibt der Pensterdiskriminator Signale ab, mit denen die digitale
Anzeige des Strommessgerätes 4j5 zur Anzeige des ermittelten Sättigungswertes blockiert und eine Anzeigelampe 45 zur
Information der Bedienungsperson bewirkt wird. Bei geeigneter Eichung der gesamten Naelweiseinrichtung mittels Potentiometer
46,47 ist es danach möglich, die Konzentration von Substraten in einer Testlösung direkt von der in mM/l geeichten
digitalen Anzeige des Strommessgerätes 4j5 abzulesen. Ein weiterer Ausgang 48 des Stromverstärkers 4l gibt
ein Signal für Registrierzwecke ab.
Wie in der Pig. 1 gezeigt, ist eine Steuereinheit 49
vorgesehen, die eine sequentielle elektrische Steuerung des Verteilers 10, der Vakuumpumpe 20, des Luftvenfcils 21 und des
Penster-diskriiBinators 44 ermöglicht. Zwei Drucktasten 30,51
sind für die Bedienung der Vorrichtung vorgesehen. Mit der Drucktaste 50 wird ein Reinigungsvorgang gestartet, durch
den die Messzelle 6 mit der Pufferlösung aus dem Behälter
gefüllt wird. Mit der Drucktaste 51 hingegen wird ein Absaugvorgang eingeleitet, durch den die Messzelle 6 und sämtliche
Leitungen zwischen dem Spritzeneingang der Leitung 14 und dem
Ausgang der Leitung 11 völlig in den Behälter 12 entleert werden. Am Ende dieses Vorgangs wird durch eine von der Steuereinheit
gesteuerte Anzeigelampe 52 die Bereitschaft der Vorrichtung
zum Empfang einer Testlösung angezeigt.
In der oben beschriebenen Vorrichtung wird Kaiiusihexacyanoferrat-(lll)
sowohl für die Lactat- als auch für die Glueosekonzentrationsrnessung als Akzeptor verwendet. Je nach
Substrat werden Pufferlösungen mit folgenden Akzeptorkonzentrat
Ionen verwendet.
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Akseptorkonzentration * Substrat (eK/I )
Lactat 1-2
Glucose 10
* Wenn das Veraünnungsverhältnis der Testlösung ca. 1:10 ist.
Als Puf ferlösung wird eine isotonische Phosphat lösung mit
pH = 7,2 verwendet. Der Behälter 15 muss täglich mit frischer
Pufferlösung gefüllt werden. Diese Unterhaltssiassnahme lässt
sich durch eine zweckisässige Anordnung der Behälter in der
"Vorrichtung leicht durchführen.
Da vor jeder Messung eine genügende Menge des Akzeptors der das Enzym enthaltenden Schicht zugefügt wird, braucht die
Testlösung keinen Akzeptor zu enthalten, ^enn verdünnte biologische
Flüssigkeiten als Testlösung verwendet werden, lässt sich die Yerdünnung der biologischen Flüssigkeiten mit im Handel erhältlichen
Einrichtungen genau und schnell durchführen. Im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Testlösungen ist es wichtig
zu beachten, dass bei der Messung der Laetatkonzentration im Blut, die Bryhtrozyten in der Blutprobe in der Zeit zwischen der
Entnahme der Blutprobe und der Einführung der Test lösung in die Messzelle eine Erhöhung der Xaetatkonzeni-ration verursachen.
Infolgedessen ist es für die Genauigkeit der Messung erforderlich,
diese Zwischenzeit auf ein Kinimum zu beschränken.
Die Eichung der Vorrichtung wird auf folgende Weise durchgeführt. Nachdem eine neue Enzymelektrode in der Messzellenanoronung
untergebracht worden ist, wird die Hesszelle mit der Pufferlösung gefüllt. Mach einer V/arte zeit von 10
bis 15 Minuten, in der der Grundstroni seinen Dauerwert erreicht
hat, wird die Nullpunkteinstellung mit dem Potentiometer 46
vorgenommen. Die Pufferlösung wird dann aus der Messzelle abgesaugt und durch Testlösungen mit bekannter Lactatkonzentration
ersetzt. Die Stromverstärkung wird jeweils mit dem
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Potentiometer 47 so eingestellt, dass die bekannte Lactatkonzentration
direkt von der digitalen Anzeige des Strommessgerätes abgelesen werden kann. Da der durch den elektrochemischen
Sensor fliessende Strom eine gute Reproduzierbarkeit und eine sehr kleine zeitliche Abweichung aufweist,
braucht man die Eichung der Vorrichtung nur in Intervallen von einigen Stunden zu prüfen. In der Tat ist es oft möglich,
eine Enzymelektrode über mehrere Tage zu verwenden, ohne eine neue Einstellung der Eichung vornehmen zu müssen. Nach
jeder Eichung oder Messung wird die Testlösung aus der Messzelle abgelassen und durch die Pufferlösung ersetzt.
Der in der Pufferlösung enthaltende Akzeptor diffundiert
darauf durch die semipermeable Membrane der Enzymelektrode und gelangt in die das Enzym enthaltende Schicht. Inzwischen
sinkt der durch den elektrochemischen Sensor fliessende Strom in 2 bis 3 Min. auf den Dauerwert des Grundstroms und eine
neue Testlösung kann dann in die Messzelle eingeführt v/erden. Um eine optimale Genauigkeit zu erreichen, ist es nötig,
ungefähr die gleiche Menge der Testlösung für die Eichung und die Messung zu verwenden.
Vor jeder Messung ist also die Messzelle bereits mit Pufferlösung gefüllt, die das Enzym enthaltende Schicht hat
dadurch eine genügende Menge des Akzeptors erhalten und durch den elektrochemischen Sensor fliesst ein für die Messung unwichtiger
Grundstrom.
Die.Durchführung einer Messung mit der oben beschriebenen
Vorrichtung erfolgt auf folgende V/eise. Nach Betätigung der Drucktaste 51 durch eine Bedienungsperson steuert die Steuereinheit
49 den Verteiler 10, die Vakuumpumpe 20 und das Luftventil 21. Der Verteiler 10 wird mit dem Elektromagnet 17
gesteuert, um die Leitungen 9 und l4 zu verbinden. Das Luft-
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ventil 21 wird geschlossen und die Vakuumpumpe 20 in
Betrieb gesetzt. Die Vakuumpumpe bildet ein Vakuum im Behälter 12, wodurch die Pufferlösung aus der Messzelle 6 in
den Behälter 12 abgesaugt wird. Nach einer bestimmten Zeit, nach der die Messzelle und die mit dieser verbundenen Leitungen
völlig entleert sind, wird die Vakuumpumpe ausser Betrieb gesetzt, das Luftventil geöffnet, der Fensterdiskriminator
in Betrieb gesetzt und die Bereitschaft der Vorrichtung zum Empfang einer Testlösung mit der Anzeigelampe 52
angekündigt. Dann wird die Testlösung mit Hilfe einer Spritze durch Leitung 14, Verteiler 10 und Leitungen 9 und 7 in die
Messzelle 6 eingeführt. Darauf nimmt der durch den elektrochemischen Sensor fliessende. Strom zuerst schnell zu, erreicht
nach 50 bis 120 Sek. einen Sättigungswert und nimmt zuletzt
langsam ab, da die Konzentration des Akzeptors in der Enzym enthaltenden Schicht durch Diffusion des Akzeptors in die
Messzelle kleiner wird. Die anfängliche Stromzunahme kann mit Hilfe der digitalen Anzeige des Strommessgerätes K$
beobachtet werden. Die relative Stromzunahme wird dabei im Fensterdiskriminator mit einem vorgegebenen Bezugswert verglichen.
Der Sättigungswert des Stroms ist erreicht, wenn die relative Stromzunahme kleiner als der vorgegebene Bezugswert
ist . Sobald der Sättigungswert des Stroms ermittelt worden ist, gibt der Fensterdiskriminator 44 ein Signal zur Blockierung
der digitalen Anzeige des Strommessgerätes 43 ab, damit
die Substratkonzentration aus dieser Anzeige abgelesen werden kann. Um die Bedienungsperson auf den angezeigten Konzentrationswert aufmerksam zu machen, schaltet der Fensterdiskriminator
gleichzeitig die Anzeigelampe 45. Nachdem die Bedienungs- ..
person den angezeigten Substratkonzentrationswert abgelesen hat, betätigt sie die Drucktaste 50, worauf die Steuereinheit
49 den Verteiler 10, die Vakuumpumpe 20 und das Luftventil steuert und den Fensterdiskriminator 44 ausser Betrieb setzt,
wodurch die Blockierung der digitalen Anzeige aufgehoben wird.
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Die Leitungen 9 und 13 werden durch d&n Verteiler verbunden, das
Luftventil wird geschlossen und die Vakuumpumpe in Betrieb gesetzt. Das von der Vakuumpumpe im Behälter 15 hergestellte
Vakuum verursacht dieses Hai das Absaugen der Testlösung aus der Messzelle 6 in den Behälter 12 und den Fluss der Pufferlösung
vom Behälter 15 in die Messzelle 6. Nach einer bestimmten Zeit, nämlich nachdem die Messzelle und die mit dieser verbundenen
Leitungen mit Pufferlösung gefüllt sind, wird die Pumpe ausser Betrieb gesetzt und das Luftventil geöffnet. !lach
2 bis 3 Min. ist der durch 'den elektrochemischen Sensor fliessende Strom wieder auf den Dauerwert des Grundstroms gesunken
und eine neue Messung kann begonnen werden.
Wie in dem Stromverlauf der Figur 5 gezeigt, sind die
Eichkurven 55 und 56, die vor bzw. nach einer Reihe von Messungen aufgezeichnet wurden, praktisch gleich, obwohl im
Zeitpunkt des Versuches die Enzymelektrode bereits 28 Tage
in Betrieb war. Diese Messergebnisse zeigen die ausgezeichnete zeitliche Stabilität und Reprodusierbarkeit der Messungen, die
mit der erfindungsgemassen Enzymelektrode durchgeführt werden können.
Die mit dem erfindungsgernässen Verfahren erzielten
Vorteile bestehen insbesondere darin, dass die erforderliche Temperaturregelung schneller und mit höchstem Wirkungsgrad
durchgeführt wird, indem das temperaturgeregelte Flüssigkeitsvolumen
auf das Volumen der das Enzym enthaltenden Schicht reduziert wird, dass der Akzeptor nicht zu jeder Testlösung
hinzugefügt werden muss, was eine Reduktion des Arbeitsaufwandes bedeutet, und dass der Sättigungswert des durch den
elektrochemischen Sensor fliessenden Stroms mit einer elektronischen
Schaltung ermittelt wird, wodurch der Zeitaufwand pro Messung wesentlich verkürzt wird«
Mit der erfinduiigsgemassen Vorrichtung können ausserderr. folgende Vorteile erzielt werden. Durch die Automatisierung
509809/1005
aller Messvorgänge, mit Ausnahme der Einführung der Testlösung in die Messzelle, und die Verwendung eines Fensterdiskriminators,
können die Messungen bedeutend-schneller (bis ca. 20 Messungen in der Stunde) als mit den bisher
verwendeten Vorrichtungen durchgeführt werden. Die Bedienung und der Unterhalt der Vorrichtung sind- sehr einfach, so dass
beide vom Hilfspersonal vorgenommen werden können. Da die Messzelle sehr kleine Abmessungen hat, kann man die
Messungen mit entsprechenden kleinen Mengen der Testlösung (ca. 100 μΐ) durchführen. Es ist ausserdem anzunehmen, dass
das Vorhandensein einer solchen Vorrichtung die Verbreitung der Messung verschiedener Substrate von Enzymreaktionen für
Diagnosezwecke fördern wird. So kann z.B. die Ueberwachung
der Lactatkonzentration im Blut von Neugeborenen in Intervallen von einigen Minuten durchgeführt werden, was mit den
bisher bekannten Verfahren und Vorrichtungen nicht möglich war.
Die erfindungsgemasse Enzymelektrode bietet hauptsächlich zwei Vorteile. Einerseits kann die Temperaturregelung
der das Enzym enthaltenden Schicht sehr schnell und mit hohem Wirkungsgrad durchgeführt werden, denn der thermische Widerstand
zwischen dem Peltier-Element und der das Enzym enthaltenden Schicht ist sehr klein. Andererseits konnten, da das
Peltier-Element und der Thermistor in der Enzymelektrode eingebaut wurden, die Abmessungen der
Messzelle in der Messvorrichtung und dadurch die benötigte Menge der Testlösung pro Messung auf ein Minimum von ca. 100 μΐ
reduziert vier den.
509809/1005
Claims (12)
- PatentansprücheVerfahren zur Messung der Konzentration von Substraten von Enzyrreaktionen, die im intermediären Metabolismus auftreten, insbesondere der Konzentration von Lactat und Glucose in biologischen Flüssigkeiten, bei dem ein durch Oxydation eines Akzeptors an einem elektrochemischen Sensor entstehender Strom mit einer Messvorrichtung gemessen wird, die sich im wesentlichen aus einer Messzelle zur Aufnahme der Testlösung, einer mit der Testlösung in Kontakt befindlichen, einen elektrochemischen Sensor, eine Enzymschicht und eine die Enzymschicht abdeckende semipermeable Membrane enthaltenden Enzymelektrode und einer mit der Testlösung in Kontakt befindlichen Bezugselektrode zusammensetzt, dadurch gekennzeichnet, dass eine Temperaturregelung der das Enzym enthaltenden Schicht auf eine vorgegebene Temperatur durchgeführt wird, eine Gleichspannung von ca. 0,25 bis 0,50 V zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode angelegt wird, wobei die Enzymelektrode positiv gepolt ist, die Messzelle mit einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösung gefüllt wird, wodurch eine genügende Menge des Akzeptors durch die semipermeable Membrane der Enzymelektrode diffundiert und in die das Enzym enthaltende Schicht gelangt, die Pufferlösung aus der Messzelle abgesaugt, die Messzelle mit einer Testlösung gefüllt, und die Konzentration des in der Testlösung enthaltenen Substrates der Enzymreaktion durch Ermittlung des Sättigungswertes des durch den elektrochemischen Sensor fliessenden Stroms mit einer elektronischen Schaltung gemessen wird.509809/10052C -
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Messung der Konzentration \>-on Glucose in biologischen Flüssigkeiten Kaliumhexacyanoferrat-ClII) als Akzeptor verwendet wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Testlösungen verdünnte biologische Flüssigkeiten sind.
- 4. Verfahren nach Anspruch J>, dadurch gekennzeichnet, dass das Verdünnungsverhältnis zwischen 1:5 und 1:20 liegt.
- 5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch Ij gekennzeichnet durch eine Messzellenanordnung (l), mit einer thermisch geregelten .Enzymelektrode (2), einer Bezugselektrode (j5) und einer zur Aufnahme der Testlösung bestimmten, als rohrfarmige Kammer ausgebildeten, zwischen die Kontaktflächen (4,5) der Elektroden (5,2) gelegten Messzelle (6), eine mit der Enzymelektrode gekoppelte Temperaturregeleinheit (31) zur Temperaturregelung dor das Enzym enthaltenden Schicht (26), eine hydraulische Einrichtung, um die Messzelle (6) abwechselnd mit einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösung oder einer Testlösung zu füllen, und eine elektrische Nachweiseinrichtung, die nach Füllung der Messzelle (6) mit einer Testlösung die Messung der Substratkonzentration durch Ermittlung des Sättigungswertes des durch den elektrochemischen Sensor (23) fliessenden Stroms ermöglicht.509809/1005
- 6. Vorrichtung nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, dass die thermisch geregelte Enzym-elektrode (2) einen mit de;:: elektrochemischen Sensor thermisch gekoppelten Temperaturfühler (j>k), der der Temperaturregeleinheit die Gewinnung eines den Ist-Wert der Temperatur des elektrochemischen Sensors darstellenden Signals ermöglicht, und ein mit dem elektrochemischen Sensor thermisch gekoppeltes, von der1 Temperaturregeleiniieit gesteuertes Peltier-Element (28) zur Temperaturregelung des elektrochemischen Sensors (23) und der mit diesem in Kontakt befindlichen, ein Enzym enthaltenden Schicht (26) enthält.
- 7. Vorrichtung nach Anspruch.5* dadurch gekennzeichnet, dass die in der Messzellenanordnung untergebrachte Bezugselektrode (3) Bauteile enthält, die den lonenfluss von der Bezugselektrode zur Enzymelektrode (2) hindern.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass die hydraulische Einrichtung einen ersten Behälter (15) für die Aufbewahrung einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösung, einen mit dem ersten Behälter und der Messzellenanordnung (l) verbundenen Verteiler (10) s der die Einführung der Pufferlösung vom ersten Behälter in die Messzelle (6) oder die Einführung einer Testlösung in die Messzelle ermöglicht, einen zweiten Behälter (12) zum Empfang der aus der Messzelle (6) abgesaugten Abfalllösungen, eine mit dem zweiten Behälter (12) verbundene Vakuumpumpe (20) zur Herstellung eines Vakuums im zweiten Behälter, so dass die Pufferlösung vom ersten Behälter (15) in die Messzelle (6) oder von der Messzelle in den zweiten Behälter (12) fliessen kann, und ein mit dem zweiten Behälter (12) verbundenes Luftventil (21) zur Beseitigung des durch die Vakuumpumpe hergestellten Vakuums im zweiten Behälter (12), wodurch der durch Druckunterschied bewirkte Fluss unterbrochen wird, enthält.509809/1005
- 9. Vorrichtung nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, dass die elektrische Nachweiseinrichtung einen mit der Bezugselektrode (^) und der Enzymelektrode (2) verbundenen Stromverstärker (4l), eine zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode geschaltete Gleichspannungsquelle (4o), ein an einem Ausgang des Stromverstärkers angeschlossenes Strommessgerät (4^)* das einen Stromwert abgibt, der dem durch den elektrochemischen Sensor (2j5) fliessenden Strom entspricht, und einen mit dem Strommessgerät paralleigeschalteten Fensterdiskriminator (44), der die Ermittlung des Sättigungswertes des durch den elektrochemischen Sensors fliessenden Stroms erniöglicht, enthält.
- 10. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine von dem fensterdiskriminator gesteuerte Anzeigeeinrichtung (45) zur Anzeige des Zeitpunktes der Ermittlung des Sättigungswertes des durch die Enzymelektrode fliessenden Stroms.
- 11. Vorrichtung nach Anspruch 5* gekennzeichnet durch eine automatische Steuereinheit (49), Vielehe die sequentielle Steuerung der hydraulis dien Einrichtung ermöglicht.
- 12. Vorrichtung nach den Anbrüchen 5 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die automatische Steuereinheit (49) die elektrische llachtreiseiririclitung steuert.13· Vorrichtung nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch eine von der autoniatisciien Steuereinheit (49) gesteuerte Anzeigeeinrichtung (52) aar Anzeige der Bereitschaft der Vorrichtung· zum Empfang einer Testlösung.14« Ensymelektrode, insbesondere für eine Vorrichtung zur Durchfüiirar.g des Verfahrens nach Anspruch 1, welche Ensyiaelektrode einen elektrochenischen Sensor, eine mit diesem in509809/1005Kontakt befindliche, ein Enzym enthaltende Schicht und eine diese Schicht abdeckende semipermeable Ilembrane enthält, gekennzeichnet durch einen mit dem elektrochemischen Sensor (23) thermisch gekoppelten Temperaturfühler (34), der einer externen Temperaturregeleinheit (31) die Gewinnung eines den Ist-Wert der Temperatur des elektrochemischen Sensors darstellenden Signals ermöglicht, und ein mit dem elektrochemischen Sensor thermisch gekoppeltes, von der externen Temperaturregeleinheit gesteuertes Peltier-Blement (28) zur Temperaturregelung des elektrochemischen Sensors und der mit diesem in Eontakt befindlichen, ein Enzym enthaltenden Schicht (26).509809/1005L ee r s e i t e
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Legal Events
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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