DE2316943A1

DE2316943A1 - Verfahren und vorrichtung zur erzeugung eines reliefartigen kontrastes im mikroskopischen bild eines durchsichtigen phasenobjektes

Info

Publication number: DE2316943A1
Application number: DE2316943A
Authority: DE
Inventors: Guenter Dipl Albrecht-Buehler
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1973-03-01
Filing date: 1973-04-04
Publication date: 1974-09-05
Also published as: GB1464974A; CH564786A5; JPS5026559A; US3971621A

Description

Anwaltsakte 23 I¹H 4. April 1973

Case 67-8663

Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung eines reliefartigen Kontrastes im mikroskopischen Bild eines durchsichtigen Phasenobjekts.

Bei der Betrachtung eines durchsichtigen, nicht kontrastierten Phasenobjektes, insbesondere lebenden Zellgewebes, ist es zur Erzeugung eines reliefähnlichen Kontrastes im mikroskopischen Bild dieses Objektes bekannt, dasselbe einseitig von der Unterseite des Objektträgers her schräg zur Objektebene zu beleuchten. Unter Phasenobjekt ist hier und im folgenden ein mikroskopisches Objekt zu verstehen, bei welchem die optische Weglänge lokal inhomogen ist.

Mit dieser an sich einfachen Methode ist jedoch nur eine verhältnismässig geringe Auflösung zu erreichen. Die Ursache der schlechten Auflösung liegt in den bei den herkömmlichen Beleuchtungsmethoden unvermeidbaren Beugungserscheinungen, die die Betrachtung kleinerer Strukturen praktisch unmöglich macht.

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Einen Ausweg aus dieser Situation hat man" mit der Entwicklung der Interferenzmikroskope gefunden. Bekanntlich arbeiten die gebräuchlichsten Interferenzmikroskope, beispielsweise, das nach Jamin· Lebedeff. und das nach Nomarski, mit linear polarisiertem Licht·, welches in einem sogenannten Wollaston-Prisma in zwei zu einan-.der senkrecht polarisierte und räumlich·parallelversetzte Lichtbündel aufgespalten wird. Nachdem die beiden Strahlenbündel das Phasen/
'objekt und das Objektiv durchsetzt haben, werden sie in einem zweiten Wollaston-Prisma wieder vereinigt und mit Hilfe eines Analysators zur Interferenz gebracht. Das so entstehende Zwischenbild wird dann in üblicher Weise über ein Okular betrachtet. Das Interferenzbild/weist einen charakteristischen plastischen Effekt auf, das dem bei der einseitig schiefen Hellfeldbeleuchtung ähnelt.

Leider hat sich aber herausgestellt, dass das Funktionsprinzip eines Interferenzmikroskops zwar relativ einfach ist, dass jedoch die praktische Ausführung eines solchen Mikroskops auf ziemliche Schwierigkeiten stö'sst. Dazu trägt insbesondere der Umstand bei, dass man mit polarisiertem Licht arbeitet. Bekanntlich ist es kaum zu vermeiden, dass die optischen Linsen im Mikroskop spannungsfrei gefasst werden, wodurch aber unerwünschte Doppelbrechungseffekte auftreten, die wiederum in recht mühsamer Weise vermieden werden müssen. Auch ist es recht schwierig ein Wollaston-Prisma herzustellen^ aus dem der ordentliche und der ausserordentliche Lichtstrahl mit der gleichen Intensität austreten. Es treten also bei der Konstruktion eines Interferenzmikroskops technische Schwierigkeiten auf, die beim

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heutigen Stand der-Technik zwar » { überwunden werden

können, die aber den Preis eines solchen Mikroskops sehr hoch steigen lassen.

Die flir wis sens chaf liehe Zwecke verwendeten Mikroskope haben meistens eine Beleuchtungseinrichtung, die das Licht von einer Lichtquelle über einen Kondensor auf das zu betrachtende Objekt wirft. Es hat sich im Laufe der Entwicklung der Mikroskope gezeigt, dass viele Bildfehler dem Kondensor zuzuschreiben waren. Man war dann natürlich bestrebt, die Kondensoren immer weiter zu verbessern und hat dadurch tatsächlich auch zahlreiche störende Effekte beseitigen körinen. Allerdings kann kein bisher entwickelter Kondensor vermeiden, dass in der Bildebene Beugungs· erscheinungen von Objektstrukturen sichtbar werden, die nicht auf die Bildebene fokussiert sind. Diese Beugungsmuster überlagern sich dem Bild des Phasenobjekts und erschweren die

[Interpretation des Bildes.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren anzugeben, welches es unter Vermeidung der Nachteile der bekannten Verfahren ermöglicht, einen reliefartigen Kontrast im

Phasen., mikroskopischen Bild eines durchsichtigen 'objektes zu erzeugen.

Die Erfindung betrifft nun ein solches Verfahren, bei welchem

dieses
man Objekt einseitig schräg zur Objektebene beleuchtet und im Durchlicht betrachtet. Bei diesem Verfahren wird die gestellte Aufgabe erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass man zur Objektbeleuchtung untereinander inkohärente Strahlenbüschel mit zueinander im wesentlichen parallelen Achsen verwendet.

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Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass der Einfluss der störenden Beugungserscheinungen im mikroskopischen Bild mit zunehmender Inkohärenz des das Objekt beleuchtenden Lichtes stark in den Hintergrund tritt.

Gemä'ss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens können die Achsen der Strahlenbüschel mit der Objektivachse einen Winkel zwischen 40 und 50 Grad einschliessen. Der Oeffnungswinkel, unter welchem jedes StrahlenbUschel divergiert, sollte vorzugsweise nicht grosser als 65 Grad sein. Die Anzahl der StrahlenbUschel pro Quadratmillimeter kann etwa zwischen 1.00 und I¹OOO liegen. Die StrahlenbUschel können alle aus einer Ebene austreten, deren Fläche vorteilhaft zwischen

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0,80 und 80mm beträgt. Zur Erzeugung der inkohärenten StrahlenbUschel verwendet man zweckmässigerweise einen aus einem Glasfaserbündel bestehenden Lichtleiter.

Die Erfindung betrifft auch ein Mikroskop zur Durchführung des neuen Verfahrens. Es ist gekennzeichnet durch eine Objektbeleuchtungsvorrichtung, welche eine Lichtquelle und einen Lichtleiter aus einem Glasfaserbündel umfasst, dessen lichtabstrahlendes Ende in unmittelbarer Nähe des Durchstoss-

punktes der optischen Achse des Objektivs durch den. Objektträger angeordnet ist und mit dieser Achse einen Winkel von vorzugsweise etwa 40°bis 50° einschliesst. Zur Verstärkung des durch die Er fin dung y

'erzielten Effekts kann es zweckmässig sein_s dass Glasfaserbündel an seinem der Lichtquelle zugewandten Ende aufzuspleissen. Es ist vorteilhaft, wenn der Winkel zwischen der Objektivachse und der Richtung des lichtabstrahlenden Lichtleiterendes verstellbar ist. Weiter kann es zweckmässig sein, wenn das -lieht -

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abstrahlende Lichtleiterende parallel zur Objektebene verstellbar und sein Abstand zu der letzteren verstellbar ist. Es kann auch vorteilhaft sein, wenn die Lichtquelle, der Lichtleiter und die Verstellmittel zu einer konstruktiven Einheit zusammengefasst sind, welche mit den optischen Teilen des Mikroskops lösbar verbunden ist.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausfuhrungsbeispiels eines erfindungsgemäss adaptierten Mikroskops näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 eine Seitenansicht des Mikroskops und Fig. 2 einen Schnitt nach der Linie ΙΓ-ΙΙ der Fig. 1.

Das in der Zeichnung dargestellte Mikroskop ist der Uebersichtlichkeit halber nur in seinen wesentlichen Zügen gezeigt. Mit 1 ist eine Fussplatte bezeichnet, auf der ein Ständer 2 befestigt ist. Am oberen Ende des Ständers ist der Tubus 3 des Mikroskops in bekannter Art und Weise angeordnet. Ein

ebenfalls mit dem Ständer 2 verbundener Objekttisch 4 verPhasen,

läuft horizontal, wobei seine zum Auflegen des Objektes bestimmte Fläche knapp unterhalb des Objektivs 3a des Mikroskops liegt. Der Objekttisch 4 weist im Bereich unterhalb des Tubus 3 eine durchgehende Ausnehmung 4a auf, durch die das zu betrachtende. Objekt beleuchtet werden kann. Das Objekt ist auf einem Objektträger 5 aufgebracht und mittels eines

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Deckglases 5a in bekannter Weise geschlitzt. Der Objektträger 5 ist derart auf dem Objekttisch 4 angeordnet, dass das zu betrachtende Objekt in einen engen Bereich um den Durchstosspuhkt der optischen Achse 6 des Mikroskops mit der Objektebene zu ·

[liegen kotma-t.

Zwischen der Fussplatte 1 des Mikroskops "und dem Objekttisch 4 ist eine Beleuchtungsvorrichtung angeordnet. Diese besteht im wesentlichen aus einer Lampe 7, einem Lichtleiter 8 und Mitteln, um die Lage des Lichtleiters bezüglich des Objekttisches 4 bzw. des Objekts zu verstellen.

An dem zwischen dem Objekttisch 4 und der Fussplatte 1 verlaufenden vorderen Quersteg 2a des Ständers 2 ist Über vier Verschlusshebel 9a ein Kupplungsteil 9 angeflanscht. Dieses besitzt an seiner dem Ständer abgewandten Seite eine vertikal verlaufende Schwalbenschwanzführung 9b, in welcher ein entsprechendes Profil 10b verschiebbar gelagert ist. Das Profil 10b ist ein Teil eines vertikalen Schenkels 10a .einer sonst horizontalen Platine 10, auf der die übrigen Teile der Beleuchtungsvorrichtung montiert sind. Im Kupplungsteil 9 sind noch Mittel angeordnet, die es in an sich in der Optik und Feinmechanik bekannter Weise gestatten, über das Rändelrad 9c den Schenkel 10a und damit die ganze Platine 10 vertikal zu verstellen.

Die Platine 10 ist mit zwei parallelen im Querschnitt schwalbenschwanzfö'rmigen Führungsnuten 11 für einen Schlitten 12 versehen, der mit zwei nicht dargestellten Profilschienen in den Nuten 11 horizontal verschiebbar gelagert ist. Zur Be-

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wegung des Schlittens 12 dient ein RMndelrad 12a, das mit einem in der Feinmechanik übIichen, in der Zeichnung der Einfachheit halber nicht dargestellten Vorschubmechanismus zusammenarbeitet.

Auf dem Schlitten 12 Ist eine zylindrische Scheibe 13 um eine horizontale Achse über ein veiteres Rändelrad 13a verdrehbar und in jeder Winkelstellung fixierbar gelagert. Die Scheibe 13 ist mit einer durchgehenden', diametralen Bohrung 13b versehen und dient als Halterung für das objektseitige Ende 8a des Lichtleiters 8. Letzterer besteht aus einem Bündel von Glasfasern, welche alle einen optisch dichteren Kern und einen optisch dünneren Mantel aufweisen, sodass einmal durch die Faserenden in die Glasfasern eingetretenes Licht in deren Innerem nach dem bekannten Prinzip der Totalreflexion weitergeleitet wird.

Das Ende 8a des Glasfaserbündels ist durch die Bohrung 13b der Scheibe 13 hindurchgeführt undreicht mit einem Teil des Randes seiner Stirnfläche bis an den Objektträger 5 heran, auf welchem sich das zu betrachtende Objekt befindet. Zur Fixierung des Glasfaserbündels in der Bohrung 13b dient eine Klemmschraube 13c, "'

Auf der dem Schlitten 12 gegenüberliegenden Seite der Platine 10 ist eine Lampe 7 mit einer Sammellinse 7a befestigt. Das lampenseitlge Ende 8b des Glasfaserbündels 8 ist mittels einer Halterung 14 derart vor der Sammellinse 7a positioniert, dass das aus der Lampe austretende Licht einigermassen auf die Enden der Fasern fokussiert wird.

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Bei dem Glasfaserbündel kann es sich beispielsi/t/<z'.ie w» et

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solches von 0,80 bis 80mm Querschnittsfläche handeln, was bei einem Faserdurchmesser von 50yum bzw. bei einer Fasern- fsj

CO dichte von 375 Fasern pro Quadratmillimeter etwa 300 bis —* 30'0OO Einzelfasern im Lichtleiter entspricht. Der Oeffnungs- ^

winkel, unter welchem das aus jeder Glasfaser austretende Licht divergiert, beträgt bei solchen Fasern etwa 60 bis 65°. Im allgemeinen sollte die Anzahl der Einzelfasern pro Quadratmillimeter zwischen 100 und I¹OOO betragen.

Das lampenseitige Ende des Glasfaserbündels ist nicht glatt abgeschnitten, sondern vollkommen unregelmässig abgebrochen und aufgespleisst. Durch die ungleich langen und divergierenden Faserenden kann eine besonders hohe Inkohärenz des durch die Fasern geleiteten Lichts erreicht werden.

Zur Erzielung eines optimalen R.eliefeffektes wird der Winkel α, den das objektseitige Glasfaserbündelende 8a mit der opti-

„ Brechungsindex des Objekts

sehen Achse 15 des Mikroskops einschliesst, je nach dem mittleren^ auf etwa 40 bis 50/
^Grad eingestellt und dabei mittels der Rändelräder 13a, 12a und 9c auf optimale Bildausleuchtung, Kontrastwirkung und Bildplastizität feinjustiert.

Das aus der Lampe austretende Licht wird über die Sammellinse auf das vollkommen unregelmässig abgebrochene und zudem aufgespleisste Ende des Glasfaserbündels fokussiert und tritt dort in die einzelnen Glasfasern ein. Jede Faser "holt" sich ihren Lichtanteil aber aus einem völlig willkürlichen Raumwinkel, sodass die in den einzelnen Fasern x^eiterge leite ten Lichtstrahlen und die an den objektseitigen Faserenden austretenden Strahlenbüschel untereinander keine feste Phasenbe-

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ORIGINAL INSPECTED

ziehung mehr besitzen. Die parallel aus den Glasfasern aus-, tretenden StrahlenbUschel sind also untereinander inkohärent.

Beleuchtet man nun das Objekt unter einem Einfallswinkel von etwa 45° mit diesen inkohärenten Strahlenbüsdieln, so verschwinden die bei herkömmlicher Beleuchtung so störenden Beugungserscheinungen und man erreicht ein kontrastreiches, scharfes und plastisch wirkendes mikroskopisches Bild des zu betrachtenden Phasenobjekts,

Es hat sich herausgestellt, dass nach dem erfindungsgemässen Verfahren Bilder mit Reliefeindruck erzeugbar sind, die den
mittels eines Interferenzkontrastmikroskops erzeugten Bildern nicht nur ebenbürtig sind, sondern diese an Qualität noch bei weitem übertreffen.

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Claims

-JTO-

Ansprüche ^fjfyo /^3ΐ|

fly Verfahren zur Erzeugung eines reliefähnlichen Kontrastes im mikroskopischen Bild eines durchsichtigen Phasen- · Objektes,wobei man dieses Objekt einseitig schräg zur Objektebene beleuchtet und im Durchlicht betrachtet, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Objektbeleuchtung untereinander inkohärente Strahlenbiischel mit zueinander im wesentlichen parallelen Achsen verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Achsen der Strahlenbiischel mit der Objektivachse einen Winkel zwischen 40 und 50 Grad einschliessen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Oeffnungswinkel, unter welchem jedes Strahlenbiischel divergiert, nicht grosser als 65 Grad ist.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Strahlenbiischel pro Quadratmillimeter zwischen etwa 100 und l'OOO liegt.
5. · Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass alle Strahlenbüschel aus einer Ebene austreten und die Fläche dieser Ebene nicht grosser

ist als 80mm .
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

2 2 dass die Fläche zwischen 0,80mm und 80mm liegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die inkohärenten StrahlenbUschel

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mittels eines aus einem Glasfaserbündel bestehenden Lichtleiters erzeugt.
8. Mikroskop zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Objektbeleuchtungsvorrichtung, die eine Lichtquelle und einen Lichtleiter aus einem Glasfaserbündel umfasst, dessen lichtabstrählendes Ende in unmittelbarer Nähe des Durchstosspunktes der optischen

Achse des Objektivs durch den Objektträger angeordnet ist und mit dieser Achse einen Winkel von vorzugsweise etwa 40° bis einschliesst.
9. Mikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Winkel zwischen der Objektivachse und der Richtung des lichtabstrahlenden LichtIeiterendes verstellbar ist.
10. Mikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem lichtabstrahlenden Lichtleiterende und der Objektebene verstellbar ist.
11. Mikroskop nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das lichtabstrahlende Lichtleiterende parallel zur Objektebene verstellbar ist.
12. . Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Glasfaserbündel an seinem der Lichtquelle zugewandten Ende aufgespieisst ist.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle, der Lichtleiter und die Mittel zur Einstellung der relativen Lage des lichtabstrahlenden Lichtleiterendes zur Objektebene eine

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Einheit bilden, die als Ganzes mit den Übrigen Mikroskopteilen lösbar verbunden ist.

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