DE19937512A1 - For the rapid sequencing of genomes the DNA is linearized automatically and at reduced costs with a mixture of proteases - Google Patents

For the rapid sequencing of genomes the DNA is linearized automatically and at reduced costs with a mixture of proteases

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

Rapid sequencing of genomes by linearizing DNA, isolated genome DNA or un-isolated DNA sequence is placed on a longitudinal plate in a mixture of anaphase-, telophase-, G phase- or mitosis- or interphase chromosomes (10), broken down by proteases. It can also be laid on a rule or in a straight line along a rod or linearized. The DNA sequence is sequenced by laser scanning microscopy, weak ultra violet radiation absorbed by the DNA, screen tunnel microscopy, electron microscopy (EM), nuclear magnetic resonance (NMR) or other spectrographic analysis, circular dichroic (CD), and the like. The substrates can be moved on the long plate in opposite directions. Both ends of the genome sequence (7) are spliced with the free ends of the sequences immobilized in the recesses on the substrate, by the addition of DNA ligates and androstane triphosphate (ATP). As the movement of the substrate is in opposite directions, the sequences on the long plate are linearized on its surface or along the grooves. The sequences are immobilized on the substrate. The interphase are spliced by acting on the telome to release telome DNA sequences. The chromosome proteins are reduced or degraded in a mixture of proteases (11), without damage to the DNA. The surface of the long plate can be coated with a mixture of helicase such as 3'-5' E. Coli Rep helicase and ATP so that a double-strand DNA is divided into two single strands. The long plate can be elastic or rigid. During de condensation and linearizing the chromosome DNA is irradiated with bio photons, the photons are then detected by photo-sensors such as photo-multipliers. The detection signals are stored and/or processed. The long plate has the groove and/or recess or reagent glass. The long plate or only the recess can be heated to release hydrogen bridges or DNA-DNA interactions. They can also be released by the addition of a denaturing material. A number of fragments of genome or chromosome DNA sequences (7) can be sequenced on the long plate simultaneously, in a multi-parallel sequencing action, in an automatic process. The movement of the substrate along the long plate is controlled automatically.

Description

Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und Genomik. Zwei prinzipiell verschiedene Sequenzierungsverfahren werden heute praktisch ausnahmslos angewendet.The invention relates to the field of molecular biology and genomics. Two fundamentally different sequencing methods are becoming practical today applied without exception.

Das erste Verfahren beruht auf einer basenspezifischen chemischen Spaltung am Ende radioaktiv markierter DNA-Fragmente (Maxam- und Gilbert- Methode). In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen werden die DNA- Fragmente an den 4 Basen partiell basenspezifisch modifiziert. Danach wird die modifizierte Base von der Desoxyribose entfernt und die Phosphordiesterbindung an dieser Stelle im DNA-Rückgrat hydrolysiert. Die entstandenen Fragmente werden dann auf sehr dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Grösse getrennt. Nach Autoradiographie sind nur die Fragmente sichtbar, die noch ein intaktes Ende besitzen, da die DNA nur dort radioaktiv markiert wurde.The first method is based on a base-specific chemical Cleavage at the end of radioactively labeled DNA fragments (Maxam and Gilbert Method). In 4 different reaction approaches, the DNA Fragments at the 4 bases partially modified in a base-specific manner. After that the modified base removed from the deoxyribose and the Phosphorodiester bond hydrolyzed at this point in the DNA backbone. The The resulting fragments are then placed on very thin polyacrylamide gels electric field separated by size. According to autoradiography, only those are Fragments visible that still have an intact end because the DNA is only there was radioactively marked.

Das zweite, heute wesentlich verbreitete Verfahren basiert auf der enzymatischen Neusynthese der zu sequenzierenden DNA in Gegenwart nukleotidspezifischer Inhibitoren (Sanger-Methode). Ausgehend von einem kurzen Oligonukleotid (Primer) wird in 4 getrennten Ansätzen an der zu sequenzierenden DNA ein DNA-Strang neusynthetisiert. Gleichzeitig wird die neusynthetisierte DNA unter Einbau von [32P] dATP radioaktiv markiert. Jedem Ansatz wird jedoch neben den für die DNA-Synthese notwendige Substraten (dNTP) einer von 4 nukleotidspezifischen Inhibitoren zugesetzt. Hierbei handelt es sich um Didesoxynukleotidtriphosphate (ddNTP), denen nicht nur die 2'-OH- Gruppe, sondern auch die 3'-OH-Gruppe der Ribose fehlt. Didesoxynukleotidtriphosphate werden ebenso wie Desoxynukleotidtriphospha­ te von der DNA-Polymerase als Substrate verwendet. Werden sie jedoch statt eines Desoxynukleotidtriphosphats statistisch in die DNA eingebaut, so kann dieser Stelle die DNA-Kette nicht mehr verlängert werden, da ja die 3'-OH- Gruppe fehlt. In jedem der 4 Reaktionsansätze befindet sich also eine Population von DNA-Molekülen, die zum einen alle radioaktiv markiert sind, die zum anderen alle in Form des Primers ein identisches 5'-Ende tragen, die sich schließlich aber in der Länge bis zum jeweils basenspezifischen 3'-Ende hin unterscheiden. Diese Fragmente werden wiederum auf dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Grösse getrennt und durch Autoradiographie dargestellt.The second method, which is widely used today, is based on the enzymatic resynthesis of the DNA to be sequenced in the presence of nucleotide-specific inhibitors (Sanger method). Starting from a short oligonucleotide (primer), a DNA strand is re-synthesized in 4 separate batches on the DNA to be sequenced. At the same time, the newly synthesized DNA is radioactively labeled with the incorporation of [ 32 P] dATP. However, in addition to the substrates (dNTP) required for DNA synthesis, one of 4 nucleotide-specific inhibitors is added to each batch. These are dideoxynucleotide triphosphates (ddNTP), which not only lack the 2'-OH group, but also the 3'-OH group of the ribose. Dideoxynucleotide triphosphates, like deoxynucleotide triphosphates, are used as substrates by the DNA polymerase. However, if they are incorporated statistically into the DNA instead of a deoxynucleotide triphosphate, the DNA chain can no longer be extended at this point, since the 3'-OH group is missing. In each of the 4 reaction batches there is a population of DNA molecules, all of which are radioactively labeled on the one hand, and on the other hand all have an identical 5 'end in the form of the primer, but ultimately differ in length up to the base-specific one Distinguish 3 'end. These fragments are again separated by size on thin polyacrylamide gels in an electric field and displayed by autoradiography.

Der Hauptnachteil dieser Sequenzanalysen besteht im grossen Zeit- und Finanzaufwand.The main disadvantage of these sequence analyzes is the large time and Financial expense.

Vom Anfang an bis zu dem Punkt, wo ein Genom komplett sequenziert wird, können Jahre und sogar Jahrzehnte dauern, z. B. das "Human Genome Projekt" wurde im Jahre 1973 angefangen und wird voraussichtlich im 2003 beendet. From the beginning to the point where a genome is completely sequenced will take years and even decades, e.g. B. the "Human Genome Project "started in 1973 and is expected to begin in 2003 completed.  

Die Aufgabe der Erfindung ist eine schnellere und billigere Sequenzierung von Genomen zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro- oder eukaryotischen z. B. eines menschlichen Chromosoms soll z. B. innerhalb eines Monats oder einer Woche gelingen und möglichst automatisch ablaufen.The object of the invention is faster and cheaper To achieve genome sequencing. Sequencing a pro- or eukaryotic z. B. a human chromosome z. B. within one Succeed every month or a week and run automatically if possible.

Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, dass eine gereinigte genomische DNA-Sequenz oder eine ungereinigte DNA-Sequenz eines, in einem Gemisch von Proteasen zersetzten Anaphase-, Telophase, G1-Phase- bzw. Mitose- oder Interphase-Chromosoms auf einer langen Platte (LP), auf einem Lineal oder auf bzw. entlang eines langen Stabs geradlinig gelegt bzw. linearisiert und dann mit solchen Verfahren wie z. B. Laser-Scanning- Mikroskopie z. B. unter schwacher UV-Bestrahlung (260-280 nm oder 200-250 nm), welche von der DNA absorbiert wird, Raster-Tunnel-Mikroskopie, Elektronen-Mikroskopie (EM), NMR- oder eine andere spektroskopische Analyse, CD (Circular Dichroism) oder mit einem anderen Verfahren sequenziert wird.The object of the invention is achieved in that a cleaned genomic DNA sequence or an unpurified DNA sequence of one in a mixture of proteases decomposed anaphase, telophase, G1 phase or mitosis or interphase chromosomes on a long plate (LP) laid straight on a ruler or on or along a long stick or linearized and then with such methods as. B. Laser Scanning Microscopy e.g. B. under weak UV radiation (260-280 nm or 200-250 nm), which is absorbed by the DNA, scanning tunneling microscopy, Electron microscopy (EM), NMR or another spectroscopic Analysis, CD (Circular Dichroism) or other method is sequenced.

VORBEREITUNGPREPARATION a. Reinigung der genomischen z. B. chromosomalen DNA-Sequenza. Purification of the genomic z. B. chromosomal DNA sequence

Die DNA-Sequenz eines aus dem Nukleus isolierten Chromosoms, einer aus der Plasma isolierten Organelle eine virale oder eine bakterielle DNA oder anderer Herkunft wird durch Degradation chromosomaler bzw. Organellen Proteine abgesondert und dann z. B. durch Zentrifugation gereinigt.The DNA sequence of a chromosome isolated from the nucleus, one from the plasma isolated organelle a viral or a bacterial DNA or other origin is caused by degradation of chromosomal or organelles Secreted proteins and then z. B. cleaned by centrifugation.

Um eine Degradation chromosomaler Proteine zu erreichen wird mindestens ein Chromosom in ein Gemisch von Proteasen gelegt. Das Gemisch von Proteasen enthält z. B. Chymotrypsin, Streptomyces-griseus-Protease (Pronase), Aspergillus-oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Papain, Proteinase K, Bromealin u. a. Proteasen und Dithioreitol, welches Disulfidbrücken in Proteine reduziert.To achieve a degradation of chromosomal proteins put at least one chromosome in a mixture of proteases. The mixture of proteases contains e.g. B. Chymotrypsin, Streptomyces griseus protease (Pronase), Aspergillus oryzae protease, subtilisin, elastase, pepsin, papain, Proteinase K, bromealin and the like. a. Proteases and dithioreitol, which Disulfide bridges in proteins reduced.

Durch diese Proteasen werden die chromosomalen Proteine zersetzt, wobei die DNA-Sequenz nicht beeinträchtigt und zu einer freien Masse wird. Diese DNA-Sequenz wird z. B. durch Zentrifugation z. B. im Cäsiumchlorid- Gradient oder Gelelektroforese gereinigt.These proteases break down the chromosomal proteins, whereby the DNA sequence is not affected and becomes a free mass. This DNA sequence is e.g. B. by centrifugation e.g. B. in cesium chloride Gradient or gel electrophoresis cleaned.

b. Präparation der Substrateb. Preparation of the substrates

Für die Sequenzierung ist eine Immobilisierung der beiden Enden von der genomischen DNA-Sequenz an bestimmte Substrate notwendig. Diese Substrate können z. B. eck- oder kreisförmig sein, wobei eine Seite bzw. Oberfläche z. B. eines Vierecks oder Kreises mit einem Glasstab verbunden ist und an der anderen Oberfläche ist eine kurze synthetische DNA-Sequenz, wie z. B. Poly( G|C)n-Sequenz immobilisiert. Die viereckigen Substrate können sich entlang einer langen Platte (LP) bzw. auf der Oberfläche der LP oder über einen Nut in der LP bewegen. Die kreisförmigen Substrate können sich auch entlang der LP bzw. über oder im Nut in der LP bewegen. Die kurze synthetische DNA- Sequenz z. B. in einem DNA-Synthetisierer hergestellt werden und entweder durch ein Sauerstoffatom oder z. B. durch Polylysin-Polyhistidin- Fusionspeptide, die auf einer Nickel-haltigen Oberfläche beschichtet sind, an die Substrate immobilisiert werden. Die LP enthält mindestens eine Vertiefung, die entweder klein oder wie ein Reagenzglas sein kann. Die lange Platte (LP) besteht z. B. aus Glas, Silizium oder einem Metall wie z. B. Gold oder Kupfer. Die LP kann fest oder elastisch bzw. biegsam sein. Die Oberfläche der LP kann gut bzw. präzise oder nicht gut geschleift sein. Auf der LP können sich ein, zwei oder mehrere Substrate bewegen, die sich über dem Niveau der Vertiefung und des Nuts befinden. Die beiden freien Enden der an zwei Substrate inmobilisierten synthetischen DNA-Sequenzen befinden sich in der Vertiefung, aber sind relativ weit voneinander entfernt, um die Ligation zwischen diesen freien Enden zu verhindern. Die Immobilisierung der genomischen oder chromosomalen DNA-Sequenz wird durch die Ligation vom einem oder der beiden Enden von dieser genomischen DNA-Sequenz mit den freien Enden der kurzen synthetischen DNA-Sequenzen z. B. Poly( G|C)n, die jeweils mit einem Ende an beweglichen Substraten immobilisiert sind, in der Vertiefung der LP und unter Zugabe von DNA-Ligasen und ATP erreicht.For sequencing, immobilization of both ends of the genomic DNA sequence necessary on certain substrates. This Substrates can e.g. B. be angular or circular, with one side or Surface z. B. a square or circle is connected to a glass rod and on the other surface is a short synthetic DNA sequence, like e.g. B. Poly (G | C) n sequence immobilized. The square substrates can along a long plate (LP) or on the surface of the LP or over one  Move the groove in the LP. The circular substrates can also run along move the PCB or over or in the groove in the PCB. The short synthetic DNA Sequence z. B. in a DNA synthesizer and either through an oxygen atom or e.g. B. by polylysine-polyhistidine Fusion peptides coated on a nickel-containing surface the substrates are immobilized. The LP contains at least one specialization, which can be either small or like a test tube. The long record (LP) z. B. made of glass, silicon or a metal such as. B. gold or copper. The LP can be firm or elastic or flexible. The surface of the LP can be good, precise or not well ground. One or two can be on the LP or move several substrates that are above the level of the well and of the groove. The two free ends of the on two substrates immobilized synthetic DNA sequences are in the Deepening, but are relatively far apart from each other to make the ligation to prevent between these free ends. Immobilization of the genomic or chromosomal DNA sequence is through the ligation from one or both ends of this genomic DNA sequence the free ends of the short synthetic DNA sequences e.g. B. Poly (G | C) n, the are each immobilized with one end on movable substrates in which Deepening of the LP and achieved with the addition of DNA ligases and ATP.

c. Ligation der beiden Enden von der gereinigten oder ungereinigten genomischen oder chromosomalen DNA-Sequenz mit den freien Enden der synthetischen DNA-Sequenzen von den Substratenc. Ligation of the two ends of the cleaned or unpurified genomic or chromosomal DNA sequence with the free ends of the synthetic DNA sequences from the substrates

Die gereinigte genomische z. B. chromosomale DNA-Sequenz wird in die Vertiefung in der oder auf der Oberfläche der langen Platte (LP) oder ihres Nuts gelegt. Danach gibt man ein Gemisch mit DNA-Ligasen z. B. T4- Ligasen und ATP in diese Vertiefung, damit die beiden Enden der gereinigten genomischen DNA-Sequenz mit den beiden freien Enden der synthetischen DNA-Sequenzen wie z. B. Poly( G|C) von den Substraten ligiert werden. In der Vertiefung kann auch ein G1-Phase- bzw. ein Interphase ein Mitose- Chromatin gelegt werden. In diesem Fall gibt zuerst man ein Gemisch mit Proteasen wie z. B. Chymotrypsin, Streptomyces grisens-Protease, Aspergillus oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Papain u. a. Proteasen, damit die chromosomalen Proteine ohne Beeinträchtigung der DNA zersetzt werden, und danach einen Gemisch mit T4-Ligasen, ATP und Inhibitoren der Proteasen in die Vertiefung auf der LP.The purified genomic z. B. chromosomal DNA sequence is in the recess in or on the surface of the long plate (LP) or hers Laid nuts. Then you give a mixture with DNA ligases z. B. T4- Ligases and ATP into this well so that the two ends of the cleaned genomic DNA sequence with the two free ends of the synthetic DNA sequences such as B. Poly (G | C) ligated from the substrates. In the Deepening can also be a G1 phase or an interphase a mitosis Chromatin can be placed. In this case, you first add a mixture Proteases such as B. Chymotrypsin, Streptomyces grisens protease, Aspergillus oryzae protease, subtilisin, elastase, pepsin, papain u. a. Proteases so that chromosomal proteins are degraded without affecting DNA, and then a mixture with T4 ligases, ATP and protease inhibitors in the deepening on the LP.

Man kann mehrere miteinander ligierte Chromosomen oder chromosomale DNA-Sequenzen in die Vertiefung auf der LP einführen, damit die Sequenzierung des gesamten Genoms ununterbrochen verlaufen kann.One can have multiple chromosomes or ligated together Insert chromosomal DNA sequences into the well on the LP so that sequencing of the entire genome can proceed continuously.

Für die Ligation der Chromosomen nimmt man z. B. G1-Phase- Chromosomen und beeinträchtigt ihre Telomere, so dass die telomerischen Sequenzen frei werden. Danach mischt man diese Chromosomen, deren telomerischen Sequenzen frei sind, mit DNA-Ligasen und ATP. Dabei werden die telomerischen Sequenzen von verschieden Chromosomen miteinander ligiert. Man führt diese ligierte Chromosomem in ein Gemisch von Proteasen ein, wonach die chromosomale Proteine ohne Beeinträchtigung der DNA zersetzt werden und die DNA-Sequenz wird zu einer freien Masse bzw. entschraubt.For the ligation of the chromosomes one takes z. B. G1 phase Chromosomes and affects their telomeres, making the telomeric Sequences become free. Then you mix these chromosomes, their  telomeric sequences are free, with DNA ligases and ATP. In doing so the telomeric sequences of different chromosomes with each other ligated. This ligated chromosome is introduced into a mixture of proteases, after which the chromosomal proteins decompose without affecting the DNA and the DNA sequence is unscrewed to a free mass.

LinearisierungLinearization

Nach der Ligation der beiden Enden von der gereinigten oder ungereinigten genomischen z. B. chromosomalen DNA-Sequenz mit den freien Enden der kurzen synthetischen DNA-Sequenzer z. B. Poly( G|C)n die jeweils mit einem Ende an die beweglichen Substrate immobilisiert sind, werden diese Substrate auf der langen Platte (LP) in entgegengesetzten Richtungen langsam bewegt. Die DNA-Sequenz in Form einer freien Masse wird auseinander gezogen. Dabei wird diese DNA-Sequenz auf der Oberfläche der in einem Nut der LP gestreckt oder geradlinig gelegt bzw. linearisiert.After the ligation of the two ends of the cleaned or unpurified genomic z. B. chromosomal DNA sequence with the free Ends of the short synthetic DNA sequencers e.g. B. Poly (G | C) n each with are immobilized at one end on the movable substrates, these become Substrates on the long plate (LP) slow in opposite directions emotional. The DNA sequence in the form of a free mass is separated drawn. This DNA sequence is on the surface of the in a groove the LP stretched or laid straight or linearized.

SequenzierungSequencing

Nach der Linearisierung der genomischen oder chromosomalen DNA- Sequenz auf der langen Platte (LP) wird diese DNA-Sequenz mit solchen Verfahren wie z. B. Laser-Scanning-, -Elektronen- oder Raster-Tunnel Mikroskopie, NMR- oder eine andere spektroskopische Analyse oder anderen Verfahren sequenziert. Dabei kann die Sequenzierung automatisch ablaufen.After linearizing the genomic or chromosomal DNA Sequence on the long plate (LP), this DNA sequence with such Methods such as B. laser scanning, electron or raster tunnel Microscopy, NMR or other spectroscopic analysis or other Procedure sequenced. The sequencing can run automatically.

Die linearisierte DNA-Sequenz kann durch mehrere Sequenzierer und auch an verschiedenen Fragmenten sequenziert werden. Dieser Vorgang wird vom Erfinder als eine "multiparallele Sequenzierung" (MS) bezeichnet. Um die Sequenzierung relativ zu vereinfachen, kann man die Oberfläche der LP bzw. der Nuts mit einem Gemisch von Helicasen wie z. B. 3'-5' E. Coli Rep Helicasen und ATP beschichten, damit die linearisierte doppelsträngige oder dsDNA auf zwei komplementären einzelsträngigen (ssDNA)-Sequenzen geteilt wird. Man kann die ganze LP oder nur die Vertiefung erhitzen damit alle Wasserstoffbrücken und DNA-DNA-Interaktionen gelöst werden.The linearized DNA sequence can be divided by several sequencers and can also be sequenced on different fragments. This process will termed "multiparallel sequencing" (MS) by the inventor. To the To simplify sequencing relatively, the surface of the LP or the nuts with a mixture of helicases such. B. 3'-5 'E. Coli Rep helicases and ATP to coat the linearized double stranded or dsDNA two complementary single-stranded (ssDNA) sequences is shared. Man can heat the whole LP or just the deepening so that everyone Hydrogen bonds and DNA-DNA interactions are solved.

In der Fig. 1 ist ein Interphase z. B. G1-Phase, ein Mitose-Chromosom oder ein Anaphase-Chromatin 10, welches in ein Gemisch von Proteasen 11 im Reagenzglas 9 gelegt wird, und Pipette 20 mit der gereinigten genomischen oder chromosomalen DNA-Sequenz 7 schematisch dargestellt. Die drei Pfeile vom Reagenzglas 9 zur Pipette 20 bedeuten die Absonderung, Reinigung der Sequenz 7 und die Einführung in die Pipette 20, nachdem die chromosomalen Proteine im Gemisch von Proteasen 11 degradiert werden. In Fig. 1, an interphase z. B. G1 phase, a mitotic chromosome or an anaphase chromatin 10 , which is placed in a mixture of proteases 11 in the test tube 9 , and pipette 20 with the purified genomic or chromosomal DNA sequence 7 is shown schematically. The three arrows from the test tube 9 to the pipette 20 indicate the separation, purification of the sequence 7 and the introduction into the pipette 20 after the chromosomal proteins in the mixture of proteases 11 are degraded.

In der Fig. 2 ist eine lange Platte (LP) 2, und die Vertiefung 3 in der LP 2 dargestellt.In Fig. 2, a long plate (LP) 2 , and the recess 3 in the LP 2 is shown.

In der Fig. 2a ist die LP 2 ohne Nut die Vertiefung 3 dargestellt. Die Sicht A zeigt die LP 2 von der Seite. Die Sicht B zeigt LP 2 von oben und die Sicht C zeigt die LP 2 von vorne. Die Sicht D ist eine Raumsicht der LP 2.In Fig. 2a, the LP 2 without groove, the recess 3 is shown. View A shows the LP 2 from the side. View B shows LP 2 from above and view C shows LP 2 from the front. View D is a spatial view of LP 2 .

In der Fig. 2b ist die LP 2 mit dem Nut 5 und der Vertiefung 3 dargestellt. Die Sicht A zeigt die LP 2 mit dem Nut 5 und die Vertiefung 2 von oben. Die Sicht B ist eine Raumsicht der LP 2 mit dem Nut 5 aber ohne die Vertiefung 3. Die Sicht C zeigt auch eine Raumsicht der LP 2 mit dem Nut 5 und der Vertiefung 3.In FIG. 2b, the LP 2 is shown with the groove 5 and the recess 3. View A shows the LP 2 with the groove 5 and the recess 2 from above. View B is a spatial view of the LP 2 with the groove 5 but without the recess 3 . View C also shows a spatial view of the LP 2 with the groove 5 and the depression 3 .

In der Fig. 2c ist ein langer Stab als eine Konfiguration der LP 2, mit dem Nut 5 und der Vertiefung 3 von oben dargestellt (Sicht A).In FIG. 2c is a long rod as a configuration of the LP 2, with the groove 5 and the recess 3 shown from the top (view A).

Die Sicht B zeigt den Nut 5 und die Vertiefung 3 in diesem Stab schematisch von vorne.View B shows the groove 5 and the recess 3 in this rod schematically from the front.

In der Fig. 3a und 3b sind kreis- und eckförmige Substrate 17, die mit den Glasstäben 16 verbunden bzw. auf diese Stäbe befestigt sind, dargestellt.In Fig. 3a and 3b are circular and corner-shaped substrates 17 are connected to glass rods 16 and secured to these rods is illustrated.

In der Fig. 3a ist ein Substrat 17 mit dem Glasstab 16 und der synthetischen DNA-Sequenz 4 dargestellt (Sicht A). Die Sicht B1 zeigt ein kreisförmiges Substrat 17 mit der in der Mitte immobilisierten Sequenz 4, von unten. Die Sicht B2 zeigt einen viereckigen Substrat 17 mit der in der Mitte immobilisierten Sequenz 4 von unten. Die Sequenz 4 ist durch einen Sauerstoffatomen an den Substrat 17 immobilisiert.In Fig. 3a, a substrate 17 with the glass rod 16 and the synthetic DNA sequence is shown 4 (view A). The view B1 shows a circular substrate 17 with the sequence 4 immobilized in the middle, from below. The view B2 shows a square substrate 17 with the sequence 4 immobilized in the middle from below. Sequence 4 is immobilized on substrate 17 by an oxygen atom.

In der Fig. 3b ist ein Substrat 17, welches auf einem Stab befestigt und unten mit Nickel oder Ni-NTA (Nickel-Nitrilloacetische Säure (acid)) Schicht 15 beschichtet ist, und die Sequenz 4 schematisch dargestellt. Der Ni- NTA-Schicht 15 interagiert mit einem Schicht aus gereinigten Polyhistidin- Polylysin-Fusionspeptide 14, an welchem die Sequenz 4 immobilisiert ist. Polyhistidin bindet sich an Nickel- bzw. Ni-NTA und Polylysin bindet sich eine DNA-Sequenz (Sicht A). So kann auf diesem Substrat die synthetische Sequenz 4 mit einem Ende immobilisiert werden. Das andere Ende bleibt frei.In Fig. 3b a substrate 17, which is mounted on a rod and coated with nickel or below Ni-NTA (nickel-Nitrilloacetische acid (acid)) layer 15, and the sequence 4 is represented schematically. The Ni-NTA layer 15 interacts with a layer of purified polyhistidine-polylysine fusion peptides 14 on which the sequence 4 is immobilized. Polyhistidine binds to nickel or Ni-NTA and polylysine binds a DNA sequence (view A). One end of the synthetic sequence 4 can thus be immobilized on this substrate. The other end remains free.

Der Sicht B1 zeigt einen kreisförmigen Substrat 17 mit der in der Mitte immobilisierten Sequenz 4, und den Ni-NTA-Schicht von unten. Der Sicht B2 zeigt einen viereckigen Substrat 17 mit der in der Mitte immobilisierten Sequenz 4 und den Ni-NTA-Schicht von unten.The view B1 shows a circular substrate 17 with the sequence 4 immobilized in the middle and the Ni-NTA layer from below. The view B2 shows a square substrate 17 with the sequence 4 immobilized in the middle and the Ni-NTA layer from below.

In der Fig. 3c ist ein viereckiger Substrat 6, welches an keinen Stab befestigt ist, sondern sich entlang der LP 2 bewegen kann, dargestellt. Der Substrat 6 enthält den Ni-NTP-Schicht 15 und den Polyhistidin-Polylysin- Fusionspeptid-Schicht 14, an welchen die Sequenz 4 immobilisiert ist. FIG. 3c shows a square substrate 6 , which is not attached to a rod but can move along the LP 2 . The substrate 6 contains the Ni-NTP layer 15 and the polyhistidine-polylysine fusion peptide layer 14 , on which the sequence 4 is immobilized.

Der Sicht A zeigt den Substrat 6 mit dem Ni-NTA-Schicht 15, dem Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptid-Schicht 14 und der Sequenz 4 von der Seite. Der Sicht B zeigt den Sustrat 6 von oben, der Sicht C zeigt den Substrat 6 von rechts bzw. links, und der Sicht D ist eine Raumsicht des Substrats 6, mit den Schichten 14 und 15 und der Sequenz 4. View A shows the substrate 6 with the Ni-NTA layer 15 , the polyhistidine-polylysine fusion peptide layer 14 and the sequence 4 from the side. View B shows the substrate 6 from above, view C shows the substrate 6 from the right or left, and view D is a spatial view of the substrate 6 , with the layers 14 and 15 and the sequence 4 .

In der Fig. 4 sind Substrate 6 mit den Ni-NTA-Schichten 15 und Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptid-Schicht 14, die Deckel 13 der Substrate 6, die Pipette 20 und die LP 2 mit dem Nut 5, in welchem ein Chromosom 10 bzw. eine Sequenz 7 liegt und ist durch die Ligationsstellen 8 mit den Sequenzen 4 verbunden dargestellt. Die Pfeile zeigen das Legen der Deckel 13 auf die Substrate 6. Durch die Pipette 20 wird das Chromosom 20 bzw. die Sequenz 7 auf den Nut 5 der LP 2 gelegt.In FIG. 4 substrates 6 are connected to the Ni-NTA layers 15 and polyhistidine polylysine fusion peptide layer 14, the cover 13 of the substrates 6, the pipette 20 and the LP 2 with the groove 5 in which a chromosome 10 or a sequence 7 is located and is shown connected to the sequences 4 by the ligation sites 8 . The arrows show the placement of the covers 13 on the substrates 6 . The pipette 20 places the chromosome 20 or the sequence 7 on the groove 5 of the LP 2 .

In der Fig. 5a und b sind Substrate 6, die sich in entgegengesetzten Richtungen entlang der LP 2 mit dem Nut 5 bewegen, und dabei das Chromosom 10 bzw. die Sequenz 7 auseinanderziehen oder linearisieren, dargestellt. Die Pfeile zeigen die Bewegung der Substrate in entgegengesetzte Richtungen.In the Fig. 5a and b are substrates 6 that move in opposite directions along the LP 2 with the groove 5, while the chromosome 10 and pull apart or the sequence 7 linearize represented. The arrows show the movement of the substrates in opposite directions.

In der Fig. 6a und b sind Sequenzierer 1a, b und c und die LP 2 dargestellt. Die Pfeile zeigen die Bewegung der Sequenzierer 1a, b und c. Die auf der LP 2 linearisierte DNA-Sequenz (7) wird an mehrere Fragmenten gleichzeitig sequenziert. Dieser Vorgang ist die multiparallele Sequenzierung (MS). Die Sequenzierer können sich über der LP 2 bewegen, aber auch die LP 2 kann sich unter der Sequenzierer bewegen.In Fig. 6a and b sequencer 1, a, b and c and the LP 2. The arrows show the movement of the sequencers 1 a, b and c. The DNA sequence ( 7 ) linearized on the LP 2 is sequenced on several fragments simultaneously. This process is multiparallel sequencing (MS). The sequencers can move over the LP 2 , but the LP 2 can also move under the sequencer.

In der Fig. 7a ist die LP 2 mit der Vertiefung 3 der Sequenz 7 und dem Erhitzer 18 dargestellt. Die Kapazität der Vertiefung 3 ist ähnlich der Kapazität vom Reagenzglas 3. Der Erhitzer 18 erhitzt die Vertiefung 3 und folglich die Sequenz 7, wobei Wasserstoffbrücken und DNA-DNA-Interaktionen in dieser Sequenz gebrochen werden.In FIG. 7a, the LP 2 is shown with the recess 3 of the sequence 7 and the heater 18. The capacity of the recess 3 is similar to the capacity of the test tube 3 . The heater 18 heats the well 3 and consequently the sequence 7 , whereby hydrogen bonds and DNA-DNA interactions are broken in this sequence.

Die Vertiefung 3 befindet sich in der Mitte der LP 2.The recess 3 is in the middle of the LP 2 .

In der Fig. 7b ist die LP 2 mit der Vertiefung 3, der Sequenz 7 und dem Erhitzer 18 dargestellt. Auf der LP 2 befindet sich das Substrat 6 mit der Sequenz 4, oder derer freies Ende sich in der Vertiefung 3 befindet. Nach der Ligation von einem Ende der Sequenz 7 mit dem freien Ende der Sequenz 4 in der Vertiefung 3, wird diese Vertiefung durch den Erhitzer 18 erwärmt. Dabei werden Wasserstoffbrücken und DNA-DNA-Interaktionen gebrochen und dann wird der Substrat 6 bewegt welcher die Sequenz aus der Vertiefung heraus zieht und auf der LP 2 linearisiert. Die Vertiefung 3 befindet sich auf einem Ende der LP 2.In FIG. 7b, the LP 2 with the recess 3, the sequence 7 and the heater 18 is shown. The substrate 6 with the sequence 4 is located on the LP 2 , or its free end is located in the recess 3 . After ligation from one end of sequence 7 to the free end of sequence 4 in the recess 3 , this recess is heated by the heater 18 . In the process, hydrogen bonds and DNA-DNA interactions are broken and then the substrate 6 is moved which pulls the sequence out of the well and linearizes it on the LP 2 . The recess 3 is located on one end of the PCB 2 .

In der Fig. 8 ist die Reaktion der Ligation von Chromosomen 10 im Gemisch von DNA-Ligasen und ATP 12 schematisch dargestellt. Die Chromosomen sind stark vergrössert. Die Telomere werden beeinträchtigt, so dass die telomerischen Sequenzen (TS) [engl. telomeric repeat sequences TRS] bzw. ihre Enden frei werden. The reaction of the ligation of chromosomes 10 in a mixture of DNA ligases and ATP 12 is shown schematically in FIG. 8. The chromosomes are greatly enlarged. The telomeres are affected, so that the telomeric sequences (TS). telomeric repeat sequences TRS] or their ends become free.

Im Gemisch von DNA-Ligasen und ATP 12 werden die freien Enden der Chromosomen 10 miteinander ligiert. Die miteinander ligierte Chromosomen 10 werden dann z. B. in der Vertiefung oder im Nut der LP durch Proteasen degradiert und die DNA-Sequenz wird linearisiert. Somit können z. B. drei oder mehrere Chromosomale DNA-Sequenzen auf einer LP linearisiert und sequenziert werden.In a mixture of DNA ligases and ATP 12 , the free ends of chromosomes 10 are ligated together. The chromosomes 10 ligated together are then z. B. degraded in the well or in the groove of the LP by proteases and the DNA sequence is linearized. Thus, e.g. B. three or more chromosomal DNA sequences are linearized and sequenced on an LP.

Ein Anaphase,- Telophase-, G1-Phase- bzw. Mitose- oder Interphase- Chromosom 10, welches schematisch in der Fig. 1 dargestellt ist, wird in das Gemisch von Proteasen 11 im Reagenzglas 9 gelegt. Dabei werden die chromosomalen Proteine zersetzt und die chromosomale DNA-Sequenz wird nicht beeinträchtigt aber entfaltet und entschraubt. Danach wird diese DNA- Senquenz abgesondert bzw. isoliert, gereinigt und dann eine Pipette 20 eingeführt. Die Isolierung der DNA aus einer Zelle kann z. B. durch Zentrifugation erfolgen oder man nimmt eine Zelle z. B. ein weißes Blutkörperchen (ein Leukozyt) und legt die in ein Gemisch von CHAPS/CHAPSO, welches Lipidmembrane löst ohne Proteine zu denaturieren, Natriumdodecylsulfat, welches die Lyse der Zellnuclei erreicht, Proteinase K, die die Nucleosome degradiert u. a. Proteasen und Dithioreitol, welches Disulfidbrücken in Proteine reduziert. Die Zelle wird dabei zersetzt und aus der Zellflüssigkeit wird die DNA isoliert und in die Pipette 20 eingeführt. In der Pipette 20 befindet sich nicht das oder die Chromosomen 10 sondern die genomische oder chromosomale DNA-Sequenz 7.An anaphase, telophase, G1 phase or mitosis or interphase chromosome 10 , which is shown schematically in FIG. 1, is placed in the mixture of proteases 11 in test tube 9 . The chromosomal proteins are decomposed and the chromosomal DNA sequence is not affected but unfolded and unscrewed. This DNA sequence is then separated or isolated, purified and then a pipette 20 is inserted. The isolation of the DNA from a cell can e.g. B. done by centrifugation or you take a cell z. B. a white blood cell (a leukocyte) and puts it in a mixture of CHAPS / CHAPSO, which dissolves lipid membrane without denaturing proteins, sodium dodecyl sulfate, which achieves cell nucleus lysis, proteinase K, which degrades the nucleosomes, including proteases and dithioreitol, which Disulfide bridges in proteins reduced. The cell is decomposed and the DNA is isolated from the cell fluid and introduced into the pipette 20 . The pipette 20 does not contain the chromosome (s) 10 but the genomic or chromosomal DNA sequence 7 .

Die lange Platte (LP)2 in der Fig. 2 enthält die Vertiefung 3, in welche die Sequenz 7 durch Pipette 20 gelegt bzw. eingeführt wird.The long plate (LP) 2 in FIG. 2 contains the recess 3 , into which the sequence 7 is inserted or introduced by pipette 20 .

Die Sequenz 7 in der Vertiefung 3 muss auf der LP 2 linearisiert und dann durch mehrere Sequenzierer 1 (a, b und c) sequenziert werden. Die Linearisierung der Sequenz 7 wird dadurch erreicht, dass die beiden Enden dieser Sequenz (7) mit den freien Enden der Sequenz 4 ligiert werden.The sequence 7 in the well 3 must be linearized on the LP 2 and then sequenced by several sequencers 1 (a, b and c). The linearization of sequence 7 is achieved by ligating the two ends of this sequence ( 7 ) with the free ends of sequence 4 .

Die synthetischen Sequenzen 4 in der Fig. 3 sind mit einem Ende an oder kreisförmige Substrate 17 oder 6 immobilisiert. Das andere Ende bleibt frei. Die Immobilisierung eines Ende der Sequenz 4 an einen bestimmten Substrat (17 oder 6) wird z. B. Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptide auf einer Nickel- haltigen Oberfläche erreicht. Polyhistidin z. B. HIS(10AS) bindet sich an Nickel- haltige Stoffe wie z. B. Ni-NTA (Nickel-Nitrillo-acetische Säure (acid)) und Polylysin z. B. Lys(10AS) bindet sich an die DNA.The synthetic sequences 4 in FIG. 3 are immobilized at one end on or circular substrates 17 or 6 . The other end remains free. The immobilization of one end of sequence 4 to a specific substrate ( 17 or 6 ) is carried out e.g. B. polyhistidine-polylysine fusion peptides achieved on a nickel-containing surface. Polyhistidine e.g. B. HIS (10AS) binds to nickel-containing substances such as B. Ni-NTA (nickel-nitrillo-acetic acid (acid)) and polylysine z. B. Lys (10AS) binds to the DNA.

Der Substrat 6 in der Fig. 4 enthält einen Ni-NTA-Schicht 15 und ein Polyhistidin-Polylsin-Fusionspeptid-Schicht 14, an welchem die Sequenz 4 mit einem Ende immobilisiert ist und das andere freie Ende befindet sich im Nut 5 der langen Platte (LP) 2.The substrate 6 in FIG. 4 contains a Ni-NTA layer 15 and a polyhistidine-polysin fusion peptide layer 14 , on which the sequence 4 is immobilized at one end and the other free end is in the groove 5 of the long plate (LP) 2 .

Der Substrat 6 wird mit dem Deckel 13 gedeckt, um die immobilisierte Sequenz 4 noch mal zu befestigen. Die beiden Substraten 6 mit dem Deckel 13 (Fig. 4) können sich in entgegengesetzte Richtungen auf der LP 2 bewegen. Bevor die Substrate 6 anfangen, sich in entgegengesetzte Richtungen zu bewegen, wird entweder ein Chromosom oder Chromotin 10 oder gereinigte chromosomale oder genomische Sequenz 7 in den Nut 5 in den Raum zwischen den Substrate 6 durch die Pipette 20 gelegt. Danach gibt man einem Gemisch von Proteasen oder einen Gemisch von Proteinase K und Dithioreitol zum Chromosom 10, welches im Nut 5 der LP 2 liegt, um die chromosomalen Proteine ohne Beeinträchtigung der DNA zu zersetzen. Dann gibt man einen Gemisch aus Inhibitoren der Protease, um Proteasen zu hemmen, DNA- Ligasen und ATP in den Nut 5 zum zersetzten Chromosom 10. Dabei werden die beiden Enden der Chromosomen DNA - 10/7 mit den freien Enden, der an den Substraten 6 immobilisierten DNA-Sequenzen 4, ligiert. Wenn man eine gereinigte genomische oder chromosomale Sequenz 7 auf den Nut 5 zwischen den Substraten 6 durch die Pipette 20 tut, so gibt man nur den Gemisch von DNA-Ligasen und ATP zur Sequenz 7, damit die beiden Enden dieser Sequenz (7) mit den freien Enden der Sequenzen 4 ligiert werden. Nach der Ligation der beiden Enden von der Sequenz 7 mit den freien Enden der Sequenz 4 fangen die Substrate 6 an, sich in entgegengesetzte Richtungen auf der LP 2 zu bewegen (Fig. 5). Durch diese Bewegung der Substrate 6 in entgegengesetzte Richtungen wird die chromosomale oder genomische Sequenz 7 auseinander gezogen, so dass je weiter sich die Substrate von einander entfernen, desto geradliniger die Sequenz 7 wird. Die Sequenz 7 wird linear und der Vorgang heißt die Linearisierung der DNA-Sequenz (7). Die Substrate 6 bewegen sich langsam, aber um die Linearisierung zu beschleunigen kann die LP 2, der Nut 5 oder nur die Vertiefung 3 erwärmt z. B. bis 90°C oder erhitzt werden, damit Wasserstoffbrücken und DNA-Interaktionen der Nanomasse der Sequenz 7 gebrochen werden.The substrate 6 is covered with the lid 13 in order to reattach the immobilized sequence 4 . The two substrates 6 with the lid 13 ( FIG. 4) can move in opposite directions on the LP 2 . Before the substrates 6 begin to move in opposite directions, either a chromosome or chromotin 10 or purified chromosomal or genomic sequence 7 is placed in the groove 5 in the space between the substrates 6 by the pipette 20 . A mixture of proteases or a mixture of proteinase K and dithioreitol is then added to chromosome 10 , which is located in slot 5 of LP 2 , in order to decompose the chromosomal proteins without impairing the DNA. A mixture of protease inhibitors to inhibit proteases, DNA ligases and ATP are then added to groove 5 to decompose chromosome 10 . The two ends of the chromosomes DNA - 10/7 are ligated to the free ends of the DNA sequences 4 immobilized on the substrates 6 . If you do a purified genomic or chromosomal sequence 7 on the groove 5 between the substrates 6 through the pipette 20 , you only add the mixture of DNA ligases and ATP to sequence 7 , so that the two ends of this sequence ( 7 ) with the free ends of the sequences 4 are ligated. After the ligation of the two ends of sequence 7 with the free ends of sequence 4 , the substrates 6 begin to move in opposite directions on the LP 2 ( FIG. 5). This movement of the substrates 6 in opposite directions pulls the chromosomal or genomic sequence 7 apart, so that the further the substrates move away from one another, the more straightforward the sequence 7 becomes. Sequence 7 becomes linear and the process is called the linearization of the DNA sequence ( 7 ). The substrates 6 move slowly, but in order to accelerate the linearization, the PCB 2 , the groove 5 or only the depression 3 can be heated, e.g. B. to 90 ° C or heated so that hydrogen bonds and DNA interactions of the nanomass of sequence 7 are broken.

Nach der Linearisierung der genomischen oder chromosomalen DNA- Sequenz 7 wird sie durch ein oder mehrere Sequenzierer 1 sequenziert (Fig. 6). Die linearisierte Sequenz 7 kann an mehreren Fragmenten gleichzeitig sequenziert werden. Dieser Vorgang heißt die multiparallele Sequenzierung der linearisierten DNA-Sequenz 7. Die auf der LP 2 linearisierte DNA-Sequenz 7 kann ein Doppelhelix (dsDNA) sein, oder z. B. durch Erwärmung oder Helicasen auf zwei einzelsträngige Sequenzen (ssDNA) geteilt werden. Die eine oder zwei komplementären ssDNA-Sequenzen kann man genauer sequenzieren.After the linearization of the genomic or chromosomal DNA sequence 7 , it is sequenced by one or more sequencers 1 ( FIG. 6). The linearized sequence 7 can be sequenced on several fragments at the same time. This process is called the multiparallel sequencing of the linearized DNA sequence 7 . The DNA sequence 7 linearized on the LP 2 can be a double helix (dsDNA), or z. B. divided by heating or helicases into two single-stranded sequences (ssDNA). One or two complementary ssDNA sequences can be sequenced more precisely.

Die LP 2 in der Fig. 7 enthält eine Vertiefung 3, derer Kapazität dem Reagenzglas 9 ähnlich ist. Diese Vertiefung und folglich ihr Inhalt wird durch den Erhitzer 18 erhitzt. Wobei Wasserstoffbrücken und DNA-DNA- Interaktionen in der Sequenz 7 gebrochen werden.The LP 2 in FIG. 7 contains a depression 3 , the capacity of which is similar to the test tube 9 . This depression and consequently its contents are heated by the heater 18 . Whereby hydrogen bonds and DNA-DNA interactions are broken in sequence 7 .

Die Erhitzung erfolgt aber nach der Ligation von einem der beiden Enden von der Sequenz 7 mit dem freien Ende der Sequenz 4. Das andere Ende der Sequenz 4 ist an den Substrat 6 immobilisiert. Also wird die Vertiefung 3 durch den Erhitzer 18 nach der Ligation von einem Ende der Sequenz 7 mit dem Ende der Sequenz 3 erhitzt. Die DNA-DNA-Interaktionen und die Wasserstoffbrücken werden gebrochen und der Substrat 6 (Fig. 7b) fängt an sich zu bewegen. Durch die Bewegung des Substrats 6 wird die DNA-Sequenz 7 aus der Vertiefung 3 gezogen und auf der LP 2 geradlinig gelegt bzw. linearisiert. Die Sequenzierung jedes einzelnen Chromosoms kann auf verschiedenen LP 2 parallel ablaufen, oder man kann mehrere Chromosome 10 oder DNA-Sequenz 7 miteinander ligieren, damit die Linearisierung und Sequenzierung von mehreren Chromosomen-DNAs 7/10 auf einer LP erfolgen kann.However, the heating takes place after the ligation of one of the two ends of sequence 7 with the free end of sequence 4 . The other end of the sequence 4 is immobilized on the substrate 6 . Thus, the well 3 is heated by the heater 18 after ligation from one end of the sequence 7 to the end of the sequence 3 . The DNA-DNA interactions and hydrogen bonds are broken and the substrate 6 ( Fig. 7b) begins to move. The movement of the substrate 6 pulls the DNA sequence 7 out of the recess 3 and places it linearly or linearized on the LP 2 . The sequencing of each single chromosome 2 can run in parallel on different LP or one can more or chromosome 10 DNA sequence 7 ligate to one another, so that the linearization and sequencing of a plurality of chromosome DNAs 7/10 may be carried on a LP.

In der Fig. 8 ist der Vorgang der Ligation von mehreren Chromosomen 10 durch DNA-Ligasen und ATP im Gemisch 12 schematisch dargestellt. Um die Ligation zu erreichen, beeinträchtigt man Telomere, so dass telomerische Sequenzen LTS (oder engl. telomeric repeat sequences TRS) frei werden. Die Enden dieser telomerischen Sequenzen werden auch frei und wenn man mehrere Chromosomen mit freien telomerischen Enden in das Gemisch 12 von DNA- Ligasen z. B. T4-Ligasen und ATP zugibt werden die freien telomerischen und folglich die Chromosomen miteinander liiert.The process of ligation of several chromosomes 10 by DNA ligases and ATP in the mixture 12 is shown schematically in FIG. 8. To achieve the ligation, telomeres are impaired so that telomeric sequences LTS (or telomeric repeat sequences TRS) are released. The ends of these telomeric sequences also become free and if you insert several chromosomes with free telomeric ends into the mixture 12 of DNA ligases z. B. T4 ligases and ATP admits the free telomeric and consequently the chromosomes are linked.

Bei der Linearisierung einer Chromosomen-DNA werden Biophotonen abgestrahlt, die durch Photosensoren z. B. Photomultipliern, welche unabhängig von den Sequenzierern funktionieren, aufgenommen werden. Die registrierten Lichtsignale werden in einem Computer gespeichert und/oder verarbeitet. When a chromosome DNA is linearized, it becomes biophotons emitted by z. B. photomultipliers, which are independent function by the sequencers. The registered Light signals are stored and / or processed in a computer.  

Liste der ZahlenList of numbers

11

Sequenzierer
Sequencer

22nd

Lange Platte (LP)
Long record (LP)

33rd

Vertiefung
deepening

44th

(kurze) synthetische DNA-Sequenz
(short) synthetic DNA sequence

55

Nut auf der LP Nut on the LP

22nd

66

Eckiger Substrat ohne Glasstab Square substrate without glass rod

1616

77

Eine genomische oder chromosomale DNA-Sequenz
A genomic or chromosomal DNA sequence

88th

Ligationsstelle zwischen der Sequenz Ligation site between the sequence

44th

und der Sequenz and the sequence

77

99

Reagenzglas
Test tube

1010th

Ein Interphase-, z. B. G1-Phase- oder Mitose-Chromosom oder Anaphase- Chromatin
An interphase, e.g. B. G1 phase or mitosis chromosome or anaphase chromatin

1111

Gemisch mit Proteasen
Mixture with proteases

1212th

Gemisch mit DNA-Ligasen und ATP
Mixture with DNA ligases and ATP

1313

Deckel des Substrats Cover the substrate

66

1414

Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptid-Schicht
Polyhistidine-polylysine fusion peptide layer

1515

Ni-NTA-Schicht
Ni-NTA layer

1616

Glasstab
Glass rod

1717th

Substrat des Glasstabs
Glass rod substrate

1818th

Erhitzer
Heater

1919th

Verbindungsfaser zwischen dem Glasstab Connecting fiber between the glass rod

1616

und der Rolle and the role

1818th

2020th

Pipette
pipette

Claims (18)

1. Verfahren und Gerät zur rapiden Sequenzierung von Genomen durch Linearisierung der DNA dadurch gekennzeichnet, dass eine gereinigte genomische DNA-Sequenz oder eine ungereinigte DNA-Sequenz eines, in einem Gemisch von Proteasen zersetzten Anaphase-, Telophase-, G1-Phase- bzw. Mitose- oder Interphase-Chromosoms auf einer langen Platte (LP), auf einem Lineal oder auf bzw. entlang eines langen Stabs geradlinig gelegt bzw. linearisiert wird.1. The method and device for the rapid sequencing of genomes by linearizing the DNA, characterized in that a purified genomic DNA sequence or an unpurified DNA sequence of an anaphase, telophase, G1 phase or G1 phase decomposed in a mixture of proteases. Mitosis or interphase chromosomes are laid or linearized on a long plate (LP), on a ruler or on or along a long rod. 2. Verfahren und Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die linearisierte genomische oder chromosomale DNA-Sequenz mit solchen Verfahren, wie z. B. Laser-Scanning-Mikroskopie, z. B. unter schwacher UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, Raster-Tunnel-Mikroskopie, Elektronen-Mikroskopie (EM), NMR- oder eine andere spektroskopische Analyse, CD (Circular Dichroism) oder mit einem anderen Verfahren sequenziert wird.2. The method and device according to claim 1, characterized in that the linearized genomic or chromosomal DNA sequence with such Methods such as B. laser scanning microscopy, e.g. More colorful weak UV radiation, which is absorbed by the DNA, Scanning tunnel microscopy, electron microscopy (EM), NMR or another spectroscopic analysis, CD (Circular Dichroism) or is sequenced using another method. 3. Verfahren und Gerät nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate 6 sich auf der langen Platte (LP) in entgegengesetzte Richtungen bewegen können.3. The method and apparatus according to claims 1 and 2, characterized in that the substrates 6 can move in opposite directions on the long plate (LP). 4. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Enden der genomischen Sequenz 7 mit den freien Enden der Sequenzen 4, die an Substrate 6 immobilisiert sind, in der Vertiefung 3 unter Zugabe von DNA-Ligasen und ATP ligiert werden.4. The method and apparatus according to claims 1-3, characterized in that the two ends of the genomic sequence 7 with the free ends of the sequences 4 , which are immobilized on substrates 6 , ligated in the well 3 with the addition of DNA ligases and ATP become. 5. Verfahren und Gerät nach Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bewegung der Substrate 6 in entgegengesetzte Richtungen die Sequenz 7 auf der LP 2 bzw. auf ihrer Oberfläche oder entlang des Nuts 5 linearisiert wird.5. The method and apparatus according to claims 1-4, characterized in that when the substrates 6 are moved in opposite directions, the sequence 7 is linearized on the PCB 2 or on its surface or along the groove 5 . 6. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen 4 an den Substrate 6 immobilisiert wird.6. The method and device according to claims 1-5, characterized in that the sequences 4 is immobilized on the substrates 6 . 7. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass Interphase- z. B. G1-Phase- oder Mitose-Chromosomen durch Beeinträchtigung der Telomere, so dass die telomerische DNA- Sequenzen frei werden, in der Vertiefung 3 unter Zugabe von DNA- Ligasen und ATP miteinander ligiert werden können.7. The method and device according to claims 1-6, characterized in that Interphase- z. B. G1 phase or mitose chromosomes by impairing the telomeres, so that the telomeric DNA sequences are free, can be ligated together in the well 3 with the addition of DNA ligases and ATP. 8. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass die chromosomalen Proteine in einem Gemisch von Proteasen ohne Beeinträchtigung der DNA zersetzt oder degradiert werden.8. The method and device according to claims 1-7, characterized in that the chromosomal proteins in a mixture of proteases without DNA degradation can be degraded or degraded. 9. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass man entweder die Oberfläche der LP 2 mit einem Gemisch von Helikasen wie z. B. 3'-5' E. Coli Rep Helikasen und ATP beschichten kann. Dabei wird die doppelsträngige linearisierte DNA-Sequenz (dsDNA) durch Helikasen auf zwei einzelsträngige Sequenzen (ssDNA) geteilt.9. The method and device according to claims 1-8, characterized in that either the surface of the LP 2 with a mixture of helicases such as. B. 3'-5 'E. Coli Rep helicases and ATP can coat. The double-stranded linearized DNA sequence (dsDNA) is divided into two single-stranded sequences (ssDNA) by helicases. 10. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die LP 2 elastisch oder fest sein kann.10. The method and apparatus according to claims 1-9, characterized in that the LP 2 can be elastic or firm. 11. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Chromosomen-DNA z. B. eines G1-Phase-Chromosoms bei der Dekondensation und Linearisierung Biophotonen abstrahlt, die durch Photosensoren wie z. B. Photomultipliern aufgenommen, bzw. registriert werden.11. The method and device according to claims 1-10, characterized in that a chromosome DNA e.g. B. a G1 phase chromosome of decondensation and linearization that emits biophotons Photosensors such as B. added or registered photomultipliers become. 12. Verfahren und Gerät nach dem Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale von den Photomultipliern, die sich über die LP befinden, gespeichert und/oder verarbeitet werden.12. The method and device according to claim 11, characterized in that that the signals from the photomultipliers that are above the LP saved and / or processed. 13. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass die LP 2 den Nut 5 und/oder die Vertiefung oder Reagenzglas enthält.13. The method and device according to claims 1-12, characterized in that the LP 2 contains the groove 5 and / or the recess or test tube. 14. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die LP 2 oder nur die Vertiefung 3 erhitzt werden kann, damit Wasserstoffbrücken und DNA-DNA-Interaktionen gelöst werden.14. The method and apparatus according to claims 1-13, characterized in that the LP 2 or only the well 3 can be heated so that hydrogen bonds and DNA-DNA interactions are released. 15. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wasserstoffbrücken und DNA-DNA-Interaktionen auch unter Zugabe von Denaturierungsstoffe gelöst werden.15. The method and device according to claims 1-14, characterized in that the hydrogen bonds and DNA-DNA interactions also under The addition of denaturants can be solved. 16. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass auf der LP 2 gleichzeitig mehrere Fragmente der genomischen oder chromosomalen DNA-Sequenz 7 durch mehrere Sequenzierer sequenziert werden können. Dieser Vorgang wird vom Erfinder als eine "multiparallele Sequenzierung" bezeichnet.16. The method and apparatus according to claims 1-15, characterized in that on the LP 2 several fragments of the genomic or chromosomal DNA sequence 7 can be sequenced simultaneously by several sequencers. This process is called "multiparallel sequencing" by the inventor. 17. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Linearisierung und die multiparallele Sequenzierung automatisch ablaufen können.17. The method and device according to claims 1-16, characterized in that linearization and multiparallel sequencing are automatic can expire. 18. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung der Substrate 6 entlang der LP 2 automatisch regulierbar ist.18. The method and apparatus according to claims 1-17, characterized in that the movement of the substrates 6 along the LP 2 is automatically adjustable.
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