DE19924643B4

DE19924643B4 - Process for the preparation of protein-loaded microparticles

Info

Publication number: DE19924643B4
Application number: DE19924643.2A
Authority: DE
Inventors: Franz Schmid; Dr. Kleekamm Claus-Dieter
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2017-02-23
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: DE19924643A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von proteinbeladenen Mikropartikeln umfassend die Schritte (a) Inkontaktbringen von Mikropartikeln, welche nicht funktionalisiert sind und eine hydrophobe Oberfläche aufweisen, mit Proteinmaterial, welches ein polymerisiertes Protein ist und eine hydrophobe Oberfläche aufweist, in einer Suspension, (b) gleichmäßiges Erwärmen der Suspension auf 35 bis 65°C über einen Zeitraum von 10 bis 90 min, wobei der Temperaturanstieg bei 0,03°C/min bis 5°C/min liegt, (c) Aufrechterhalten der in (b) erreichten Temperatur über einen Zeitraum von 0 bis 50 h, (d) Bestrahlen der Suspension mit UV-Licht in Abwesenheit eines Photolinkers.A method of producing protein loaded microparticles comprising the steps of (a) contacting microparticles which are not functionalized and have a hydrophobic surface with protein material which is a polymerized protein and has a hydrophobic surface in a suspension, (b) uniformly heating the Suspension at 35 to 65 ° C over a period of 10 to 90 minutes, wherein the temperature rise at 0.03 ° C / min to 5 ° C / min, (c) maintaining the temperature reached in (b) over a period of 0 to 50 h, (d) irradiating the suspension with UV light in the absence of a photolinker.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Protein-beladenen Mikropartikeln durch Wärmebehandlung der Protein-beladenen Mikropartikel in Suspension. Weiterhin sind hierin eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens und die mit diesem Verfahren herstellbaren Mikropartikel beschrieben.The present invention relates to a method for the production of protein-loaded microparticles by heat treatment of the protein-loaded microparticles in suspension. Furthermore, an apparatus for carrying out this method and the microparticles that can be produced by this method are described herein.

Protein-beladene Mikropartikel (auch ”Beads” genannt) sind bekannt und werden vielfach in medizinischen, immunologischen und diagnostischen Nachweisverfahren als Testphase verwendet. Die unbeladenen Ausgangspartikel bestehen vorwiegend aus Latex, beispielsweise Polystyrol-Latex, und sind oft durch einen Anteil an Magnetit magnetisierbar. Die Kopplung von Protein an die Latexpartikel erfolgt bekanntermaßen in der Regel durch chemische Linker (kovalente Bindung) oder durch Adsorption (nicht kovalente Bindung), die thermisch durchgeführt werden kann.Protein-loaded microparticles (also called "beads") are known and are widely used in medical, immunological and diagnostic detection methods as a test phase. The unloaded starting particles consist predominantly of latex, for example polystyrene latex, and are often magnetizable by a proportion of magnetite. The coupling of protein to the latex particles is known to be usually by chemical linker (covalent bond) or by adsorption (non-covalent bond), which can be carried out thermally.

Die im Stand der Technik beschriebenen kovalenten Kopplungsverfahren gehen von verschiedenen, funktionelle Gruppen (-COOH, -Tosyl, etc.) aufweisenden Mikropartikeln (funktionalisierte Partikel) aus und nutzen diese Funktionen zur Ausbildung der kovalenten Bindungen mit den Proteinen.The covalent coupling methods described in the prior art start from various microparticles (functionalized particles) containing functional groups (-COOH, tosyl, etc.) and use these functions to form the covalent bonds with the proteins.

Kovalente Kopplungsverfahren unterscheiden sich von adsorptiven Kopplungsverfahren dadurch, daß die bei ersterem verwendeten funktionalisierten Partikel deutlich hydrophilere Oberflächen besitzen als nicht funktionalisierte Partikel. Dadurch wird der Anteil an adsorptiv gebundenen, Blutung verursachenden Proteinmolekülen reduziert. ”Blutung” bedeutet, daß sich nicht oder schwach gebundenes Protein wieder ablöst. Dauerhaft wird nur Protein gebunden, welches mit den funktionellen Gruppen auf der Partikeloberfläche kovalent reagiert hat. Allerdings weisen die Ausgangspartikel eine hohe Chargenvarianz und geringe Lagerstabilität der funktionellen Gruppen auf der Oberfläche auf, was nach der Beladung zu niedrigen und/oder stark schwankenden Ergebnissen führt. Daher war eine großtechnische Herstellung bisher nicht möglich. Der Grund ist, daß die auf der Oberfläche vorhandene Anzahl der zugänglichen funktionellen Gruppen (Chargenabhängigkeit) und die Größe (räumliche Ausdehnung) des zu koppelnden Proteins limitierend sind. Daraus ergibt sich der zusätzliche Nachteil geringer Bindekapazität bei kovalenten Kopplungsverfahren.Covalent coupling methods differ from adsorptive coupling methods in that the functionalized particles used in the former have significantly more hydrophilic surfaces than non-functionalized particles. This reduces the proportion of adsorptively bound, bleeding-causing protein molecules. "Bleeding" means that undeleted or weakly bound protein dissolves again. Permanently only protein is bound, which has covalently reacted with the functional groups on the particle surface. However, the starting particles have a high batch variance and low storage stability of the functional groups on the surface, resulting in low and / or highly fluctuating results after loading. Therefore, a large-scale production has not been possible. The reason is that the number of accessible functional groups present on the surface (batch dependence) and the size (spatial extent) of the protein to be coupled are limiting. This results in the additional disadvantage of low binding capacity in covalent coupling processes.

Giese offenbart in US 4,478,914 A und US 4,656,252 A Kopplungsverfahren, durch die eine mehrschichtige Beladung (Multi-layer) von Oberflächen mit funktionellem Protein erreicht wird. Hierbei wurde Biotin kovalent an die Oberfläche gebunden und anschließend wiederholt Avidin und ein Biotingekoppelter Extender an das zu beladene Material gebunden, wobei ungebundene Substanz jeweils durch Waschen entfernt wurde. Bei einem solchen Mehrschicht-Verfahren kann es durch verzögerte Desorption zu einer verspäteten Blutung kommen.Giese reveals in US 4,478,914 A and US 4,656,252 A Coupling method by which a multi-layered loading of functional protein surfaces is achieved. Here, biotin was covalently bound to the surface and then repeatedly bound avidin and a Biotingekoppelter extender to the material to be loaded, wherein unbound substance was removed by washing each. In such a multi-layer process delayed deletion may result in delayed bleeding.

Bei herkömmlichen Waschschritten werden die beladenen Teilchen durch Zentrifugieren oder magnetische Abtrennung pelletiert und resuspendiert, was ebenfalls zu einer Reduktion der Stabilität der beladenden Mikropartikel führt.In conventional washing steps, the loaded particles are pelleted by centrifugation or magnetic separation and resuspended, which also leads to a reduction in the stability of the loading microparticles.

WO 96/22533 A1 beschreibt ein Verfahren zur Immobilisierung eines Hapten-Trägermolekül-Konjugats an eine Festphasenoberfläche. US 4,039,413 A beschreibt ein Verfahren zur Bindung eines Polypeptids an einen makromolekularen polymeren Träger durch Bestrahlung mit Licht. WO 97/48421 A2 beschreibt eine Vorrichtung und Verfahren zur Desinfektion von Flüssigkeiten. M. Nemat-Gorgani et. al., Eur. J. Biochem. 123 (1982) 601–610 beschreibt eine nicht ionische adsorptive Immobilisierung von Proteinen an Palmityl-substituierter Sepharose 4B. US 5,061,640 A beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines in Immunoassays einsetzbaren Trägers durch Aufbringen eines Komplexes einer spezifisch bindenden Substanz mit einem hydrophoben Protein. WO 96/22533 A1 describes a method for immobilizing a hapten-carrier molecule conjugate to a solid phase surface. US 4,039,413 A describes a method for binding a polypeptide to a macromolecular polymeric carrier by irradiation with light. WO 97/48421 A2 describes a device and method for disinfecting liquids. M. Nemat-Gorgani et. al., Eur. J. Biochem. 123 (1982) 601-610 describes a non-ionic adsorptive immobilization of proteins on palmityl-substituted Sepharose 4B. US 5,061,640 A describes a method for preparing a carrier employable in immunoassays by applying a complex of a specific binding substance with a hydrophobic protein.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es demnach, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die großtechnische Herstellung von Protein-beladenen Mikropartikeln ermöglicht wird, wobei vor allem chargenunabhängige, gleichbleibende Produktqualität Ziel der Erfindung ist.It is an object of the present invention to provide a process which makes possible the large-scale production of protein-loaded microparticles, with the object of the invention being above all batch-independent, consistent product quality.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von proteinbeladenen Mikropartikeln umfassen die Schritte

(a) Inkontaktbringen von Mikropartikeln, welche nicht funktionalisiert sind und eine hydrophobe Oberfläche aufweisen, mit Proteinmaterial, welches ein polymerisiertes Protein ist und eine hydrophobe Oberfläche aufweist, in einer Suspension,
(b) gleichmäßiges Erwärmen der Suspension auf 35 bis 65°C über einen Zeitraum von 10 bis 90 min, wobei der Temperaturanstieg bei 0,03°C/min bis 5°C/min liegt,
(c) Aufrechterhalten der in (b) erreichten Temperatur über einen Zeitraum von 0 bis 50 h,
(d) Bestrahlen der Suspension mit UV-Licht in Abwesenheit eines Photolinkers.

According to the invention, this object is achieved by a method for producing protein-loaded microparticles comprising the steps

(a) contacting microparticles, which are not functionalized and have a hydrophobic surface, with protein material, which is a polymerized protein and has a hydrophobic surface, in a suspension,
(b) uniformly heating the suspension to 35 to 65 ° C over a period of 10 to 90 minutes, with the temperature increase being 0.03 ° C / min to 5 ° C / min,
(c) maintaining the temperature reached in (b) over a period of 0 to 50 hours,
(d) irradiating the suspension with UV light in the absence of a photolinker.

Die zu beladenen Mikropartikel oder Beads, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind mikrodispers und werden in Suspensionen mit Konzentrationen von unter 20%, bevorzugt unter 10% Gewicht pro Volumen verwendet, wobei ein Bereich von 0,1 bis 10% Gew./Vol. insbesondere von 0,2 bis 2% Gew./Vol. bevorzugt ist. Im Gegensatz zu bei kovalenten Verfahren benötigten funktionalisierten Partikeln, werden für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht funktionalisierte Partikel als Ausgangsmaterial verwendet, die sich in wäßriger Phase hydrophob verhalten, d. h. sie weisen keine hydrophilen Funktionen auf der Oberfläche auf, welche die Hydrophobität merklich herabsetzen können. Sie können aus Latex und ähnlichen Materialien bestehen, bevorzugt aus Polystyrol-Latex und gebenenfalls magnetisierbares Material wie etwa Magnetit enthalten. Die Partikelgröße der unbeladenen Teilchen liegt bevorzugt im Bereich von 50 nm bis 25 μm. Im Falle von Magnetpartikeln liegt die bevorzugte Größe im Bereich von 0,5 μm bis 25 μm, da in diesem Bereich die Magnetseparation günstig funktioniert. Geeignet sind beispielsweise Dynabeads der Firma Dynal mit einer Größe von 2,8 μm, bestehend aus 88% Polystyrol und 12% Magnetit oder magnetische und nichtmagnetische Partikel der Marke Estapor der Firma Merck.The microparticles or beads to be loaded that can be used in the process of the present invention are microdispersed and are used in suspensions at concentrations below 20%, preferably below 10% weight by volume, with a range of 0.1 to 10%. Gew./Vol. in particular from 0.2 to 2% w / v. is preferred. In contrast to functionalized particles required in covalent processes, the process of the present invention uses as starting material non-functionalized particles which are hydrophobic in the aqueous phase, ie they have no hydrophilic functions on the surface which can markedly reduce the hydrophobicity. They may be latex and similar materials, preferably polystyrene latex and optionally containing magnetizable material such as magnetite. The particle size of the unloaded particles is preferably in the range of 50 nm to 25 microns. In the case of magnetic particles, the preferred size is in the range of 0.5 microns to 25 microns, since in this area, the magnetic separation works well. Suitable examples are Dynabeads Dynal with a size of 2.8 microns, consisting of 88% polystyrene and 12% magnetite or magnetic and non-magnetic particles of the brand Estapor Merck.

Das auf die Partikel zu bindende, polymerisierte Proteinmaterial besitzt ebenfalls eine hydrophobe Oberfläche und hat eine Größe von mindestens 20 nm bis 300 nm, bestimmt durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), wobei ein Größenbereich von 50 nm bis 200 nm bevorzugt ist. Bevorzugte Größenkorrelationen zwischen Partikel und polymerisiertem Protein liegen im Bereich von > 10:1, bevorzugt > 15:1 und besonders bevorzugt > 20:1 (Partikeldurchmesser:Proteindurchmesser). Für die vorliegende Erfindung geeignete Materialien sind polymerisierte Proteine, wie etwa polymerisiertes Streptavidin (SA-Poly). Es wurde gefunden, daß polymerisierte Proteine stärker auf Oberflächen adsorbieren. Der Grund ist wahrscheinlich, daß polymerisierte Proteine eine größere Anzahl an Kontaktstellen aufweisen. Somit wäre immer noch eine ausreichende Bindung an die Oberfläche gewährleistet, auch wenn sich einzelne Kontaktstellen lösen. Bei Monomeren mit wenigen bis einer einzigen Kontaktstelle löst sich das ganze Monomer ab, sobald sich die Kontaktstelle löst. Polymerisierung kann in bekannter Weise bei Streptavidin durch chemische Behandlung erreicht werden. Ebenfalls besonders geeignet sind polymerisierte Antikörper.The polymerized protein material to be bound to the particles also has a hydrophobic surface and has a size of at least 20 nm to 300 nm, as determined by photon correlation spectroscopy (PCS), with a size range of 50 nm to 200 nm being preferred. Preferred size correlations between particles and polymerized protein are in the range of> 10: 1, preferably> 15: 1 and more preferably> 20: 1 (particle diameter: protein diameter). Materials suitable for the present invention are polymerized proteins such as polymerized streptavidin (SA-poly). It has been found that polymerized proteins adsorb more strongly to surfaces. The reason is likely that polymerized proteins have a larger number of contact sites. Thus, a sufficient bond to the surface would still be guaranteed, even if solving individual contact points. For monomers with few to a single contact site, the whole monomer dissolves as soon as the contact point dissolves. Polymerization can be achieved in a known manner in streptavidin by chemical treatment. Also particularly suitable are polymerized antibodies.

Die Blutungsneigung wird in Nanogramm (Biotin-bindefähiges SA-Monoäquivalent) pro Milligramm (Mikropartikel) angegeben. Das heißt, daß abgeblutetes (Biotin-bindefähiges) SA-Poly mittels einer SA-Mono-Eichkurve bestimmt wird (”Sandwich-Test” mit Biotin-Tube und Biotin-POD). Hier liegen die Werte bei Raumtemperatur bevorzugt bei < 250 ng/mg, stärker bevorzugt bei < 100 ng/mg, noch stärker bevorzugt bei < 80 ng/mg und am meisten bevorzugt bei < 40 ng/mg. Nach Methoden des Stands der Technik werden Blutungen von ca. 400 ng/mg erreicht.The bleeding tendency is expressed in nanograms (biotin-binding SA mono-equivalent) per milligram (microparticles). That is, bleed (biotin-bondable) SA-poly is determined by an SA mono calibration curve (sandwich test with biotin tube and biotin-POD). Here, the values at room temperature are preferably <250 ng / mg, more preferably <100 ng / mg, even more preferably <80 ng / mg and most preferably <40 ng / mg. By methods of the prior art, bleeding of about 400 ng / mg is achieved.

Das Inkontaktbringen der Mikropartikelsuspension mit dem hochmolekularen Proteinmaterial im Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgt bevorzugt bei Normaltemperatur (normalerweise Raumtemperatur, ca. 20 bis 23°C), d. h. das Proteinmaterial wird nicht vortemperiert. Während des Inkontaktbringens, bevor mit der Erwärmung begonnen wird, erfolgt im allgemeinen bereits eine adsorptive Beladung der Mikropartikel mit dem Proteinmaterial. Die anschließende Erwärmung muß nicht sofort erfolgen, sondern kann mit beliebiger Verzögerung vorgenommen werden. Bevorzugt beträgt der Zeitraum vor dem Temperaturanstieg 1 bis 60 Miunuten. Die Temperatur wird dann gleichmäßig innerhalb von 10 bis 90, bevorzugt 10 bis 60 Minuten auf eine Temperatur von 35 bis 65°C erhöht. Theoretisch kann bis auf eine Temperatur erhitzt werden, bei der die Proteine ihre Funktion einbüßen. Die so erreichte Beladungstemperatur von 35°C bis 65°C wird dann für einen für die gewünschte Beladung ausreichend langen Zeitraum aufrechterhalten. Dieser kann von 0 bis 50, bevorzugt bis 20 Stunden betragen. Besonders bevorzugt beträgt er von 1 bis 20 Stunden.The contacting of the microparticle suspension with the high molecular weight protein material in the method of the present invention is preferably carried out at normal temperature (usually room temperature, about 20 to 23 ° C), d. H. the protein material is not preheated. During the contacting, before the heating is started, an adsorptive loading of the microparticles with the protein material is generally already carried out. The subsequent heating must not be done immediately, but can be done with any delay. Preferably, the period before the temperature rise is 1 to 60 minutes. The temperature is then increased uniformly within 10 to 90, preferably 10 to 60 minutes to a temperature of 35 to 65 ° C. Theoretically, it can be heated to a temperature at which proteins lose their function. The thus achieved loading temperature of 35 ° C to 65 ° C is then maintained for a sufficiently long for the desired loading period. This can be from 0 to 50, preferably up to 20 hours. It is particularly preferably from 1 to 20 hours.

Es wird angenommen, daß hierbei die innerhalb der ersten Minuten bereits an der Oberfläche angelagerten Proteinpartikel weiteren Veränderungen unterliegen, die einer Art Weiterpolymerisation oder Weitervernetzung entsprechen, wobei weitere Hydrophobisierung erreicht wird. Wird nämlich die Erwärmung von polymerem Streptavidin (SA-Poly) vor der Beladung durchgeführt, so wird keine signifikante Beladung erreicht. Die oben beschriebene Temperaturführung hat auch den Vorteil, daß auf diese Weise die Beladungsmenge gesteuert werden kann. Entscheidend ist hierbei die Temperaturanstiegskurve. Die für eine gewünschte Beladung nötige Temperaturkurve kann durch den Fachmann empirisch ermittelt werden. Für die beschriebenen Bindekapazitäten/Blutungsneigungen erwies sich ein Temperaturanstieg von 10 bis 90 Minuten auf 35 bis 65°C als geeignet. Dabei liegt der Temperaturanstieg bei 0,03°C/min bis 5°C/min, bevorzugt 0,5°C/min bis 2°C/min. Vor der UV-Bestrahlung oder/und der Abtrennung von nicht gebundenem Proteinmaterial kann die Suspension wieder auf eine niedrigere Temperatur als die bei der Beladung verwendete abgekühlt werden.It is assumed that the protein particles already attached to the surface within the first few minutes are subject to further changes which correspond to a type of further polymerization or further crosslinking, with further hydrophobization being achieved. Namely, when the heating of polymeric streptavidin (SA-poly) is carried out before loading, no significant loading is achieved. The temperature control described above also has the advantage that in this way the loading amount can be controlled. Decisive here is the temperature rise curve. The temperature curve necessary for a desired loading can be determined empirically by the person skilled in the art. For the binding capacities / bleeding tendencies described, a temperature increase of 10 to 90 minutes to 35 to 65 ° C proved to be suitable. The temperature increase is 0.03 ° C / min to 5 ° C / min, preferably 0.5 ° C / min to 2 ° C / min. Prior to UV irradiation or / and separation of unbound protein material, the suspension may be cooled back to a lower temperature than that used in the loading.

Nach der Beladung und der Wärmebehandlung können bevorzugt bereits ein erster oder mehrere erste Abtrennschritt(e) folgen, die dazu dienen, schwach oder nicht adsorbiertes Protein zu entfernen. Dies kann von Vorteil sein, da bei der anschließenden UV-Fixierung ungebundenes Protein verändert wird und eine mögliche weitere Quervernetzung zu größeren Strukturen führen kann, welche das Abtrennen von den Mikropartikeln erschweren. Wesentlich ist jedoch eine Abtrennung des nicht gebundenen Proteins nach der weiter unten näher beschriebenen UV-Licht-Fixierung. Die folgende Erläuterung der Abtrennung gilt daher sowohl wenn nur nach der UV-Fixierung als auch wenn vor derselben abgetrennt wird.After the loading and the heat treatment, preferably already a first or several first separation step (s) may follow, which serve to remove weakly or unadsorbed protein. This may be advantageous because in the subsequent UV fixation unbound protein is altered and possible further cross-linking can lead to larger structures that make separation from the microparticles more difficult. However, it is essential to separate the unbound protein according to the further described below UV light fixation. The following explanation of the separation therefore applies both only after the UV fixation and when it is separated from it.

Die Abtrennung kann durch herkömmliche Verfahren, wie beispielsweise magnetische Trennung im Falle von Magnetit enthaltenden Mikropartikeln, durchgeführt werden. Bevorzugt ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Abtrennung in einer Mikrofiltrationseinheit durch Siebe, Filter oder Membranen. Diese können sowohl hydrophil als auch hydrophob sein, es ist jedoch im letzteren Fall bevorzugt, sie vor dem Einsatz in einen hydrophilen Zustand zu überführen, was auf herkömmlich Art und Weise geschehen kann. Sie weisen bevorzugt eine Porengröße auf, welche zwischen der Größe der Mikropartikel und der Größe des hochmolekularen Proteinmaterials liegt. Besonders geeignete Porengrößen liegen im Bereich von etwa 50% über der Größe des abzutrennenden Proteins, d. h. ca. 50 nm bis 2,5 μm. Membranen mit Porengrößen von 0,4 μm, bevorzugt 0,45 μm bis 2,5 μm, bevorzugt bis 2 μm sind besonders geeignet.The separation can be carried out by conventional methods such as magnetic separation in the case of magnetite-containing microparticles. Preferred for the process of the present invention is separation in a microfiltration unit through sieves, filters or membranes. These may be both hydrophilic and hydrophobic, but in the latter case it is preferred to convert them to a hydrophilic state prior to use, which may be done in a conventional manner. They preferably have a pore size which is between the size of the microparticles and the size of the high molecular weight protein material. Particularly suitable pore sizes are in the range of about 50% greater than the size of the protein to be separated, i. H. about 50 nm to 2.5 microns. Membranes with pore sizes of 0.4 microns, preferably 0.45 microns to 2.5 microns, preferably up to 2 microns are particularly suitable.

Die Abtrennung kann einmal oder mehrmals durchgeführt werden, wobei ein Puffer oder ein Puffersystem, bestehend aus unterschiedlichen Puffern, verwendet werden kann. Die Puffer enthalten bevorzugt Salze und waschaktive Substanzen zur Verdrängung/Solubilisierung nicht- oder schwachgebundener Proteine sowie sogenannte ”blocking agents” (z. B. Serumalbumin) zum Auffüllen noch freier Partikeloberfläche. Bevorzugt wird der Abtrennschritt mehrmals, vorzugsweise dreimal, mit unterschiedlichen Puffern durchgeführt, die sich jeweils im Salz- und Detergenzgehalt voneinander unterscheiden. Die Abtrennung erfolgt unter einem Volumenaustausch von dem 5- bis 15-fachen des Ansatzvolumens. Wichtig für die Effektivität der Abtrennung ist sowohl die Abtrennzeit (Zeitspanne, in der die Partikel in einer bestimmten Pufferlösung suspendiert sind) als auch der Fluss und Druck und deren Kombination im Abtrennsystem. Fluß und Druck sind abhängig von der jeweils verwendeten Anlage und können vom Fachmann ermittelt werden. Abgetrennter Puffer kann durch Messung der Füllstandshöhe festgestellt und entsprechend durch frischen Puffer ersetzt werden.The separation can be carried out once or several times, whereby a buffer or a buffer system consisting of different buffers can be used. The buffers preferably contain salts and detergent substances for the displacement / solubilization of proteins which are not bound or weakly bound, and so-called blocking agents (for example serum albumin) for filling up still free particle surfaces. Preferably, the separation step is carried out several times, preferably three times, with different buffers, each differing in salt and detergent content. The separation is carried out under a volume exchange of 5 to 15 times the batch volume. Important for the effectiveness of the separation is both the separation time (time in which the particles are suspended in a particular buffer solution) and the flow and pressure and their combination in the separation system. Flow and pressure depend on the particular system used and can be determined by a specialist. Separated buffer can be detected by measuring the level height and replaced accordingly with fresh buffer.

Nach der thermischen Adsorption und gegebenenfalls Abtrennschritten wird das an die Oberfläche der Mikropartikel adsorbierte Protein durch UV-Bestrahlung fixiert. Diese Fixierung setzt die spätere Blutungsneigung deutlich herab. Der Grund ist vermutlich eine weitere, durch das UV-Licht hervorgerufene unspezifische Vernetzung der auf der Oberfläche der Mikropartikel adsorbierten Proteine. Die verwendete Wellenlänge des UV-Lichts liegt im Bereich von 220 bis 460 nm und beträgt für SA-Poly bevorzugt 300 bis 420 nm, stärker bevorzugt mindestens 340 nm. Wichtig ist hierbei, daß die Wellenlänge so gewählt wird, daß unerwünschte Veränderungen des Proteins vermieden werden, wie etwa solche, die das Bindungsvermögen des Proteins beeinträchtigen. Sie kann durch einfache Vorversuche vom Fachmann leicht optimiert werden. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß bessere Ergebnisse bei der Beladung erzielt werden, wenn dabei kein Photolinker verwendet wird.After thermal adsorption and optionally separation steps, the protein adsorbed onto the surface of the microparticles is fixed by UV irradiation. This fixation significantly reduces the tendency to bleed later on. The reason is probably another unspecific crosslinking of the proteins adsorbed on the surface of the microparticles caused by the UV light. The wavelength of UV light used is in the range of 220 to 460 nm and for SA-poly is preferably 300 to 420 nm, more preferably at least 340 nm. It is important here that the wavelength is chosen so that undesired changes in the protein are avoided such as those that affect the binding capacity of the protein. It can easily be optimized by simple preliminary tests by a specialist. It has surprisingly been found that better loading results are achieved when no photolinker is used.

Als nächster Verfahrensschritt erfolgt bevorzugt nach der UV-Bestrahlung die ggf. zweite Abtrennung des nicht fest an die Oberfläche der Partikel gebundenen Proteins durch das oben bereits beschriebene Verfahren. Es können natürlich auch zwei Abtrennungen (mit jeweils 1 bis 5 Schritten) jeweils vor und nach der Bestrahlung erfolgen.The next step in the process, preferably after UV irradiation, is preferably the second separation of the protein which is not firmly bound to the surface of the particles by the method already described above. Of course, two separations (each with 1 to 5 steps) can be made before and after the irradiation.

Es wird bevorzugt während des gesamten Verfahrens darauf geachtet, daß eine Sedimentation der Mikropartikel verhindert wird. Besonders vorteilhaft ist es, zudem eine Sedimentation während der Abtrennung zu vermeiden. Zu diesem Zweck muss die Suspension in geeigneter Weise bewegt werden, was beispielsweise durch Rühren, Umpumpen, Einleitung von Dispergierenergie oder jedwede Kombination solcher Maßnahmen oder durch andere geeignete physikalische Methoden erreicht werden kann.It is preferably ensured throughout the process that sedimentation of the microparticles is prevented. It is also particularly advantageous to avoid sedimentation during the separation. For this purpose, the suspension must be agitated in a suitable manner, which can be achieved for example by stirring, pumping over, introduction of dispersing energy or any combination of such measures or by other suitable physical methods.

Die Abfüllung der beladenen Partikel erfolgt ebenfalls auf bevorzugt sterile Art und Weise in einem dafür vorgesehenen Abfüllmodul.The filling of the loaded particles also takes place in a preferably sterile manner in a dedicated filling module.

Weiterhin beschrieben wird eine Vorrichtung zur Durchführung des obigen Verfahrens.Further described is an apparatus for carrying out the above method.

Eine solche Vorrichtung ist bevorzugt in Modulbauweise angelegt, wobei die Module durch Leitungen miteinander verknüpft sind, durch welche die Mikropartikelsuspension von einem Modul oder Gefäß in ein anderes gelangen kann. Die wichtigsten Module sind ein Beladereaktor, ein Belichtungsmodul, ein Abtrennmodul und ein Abfüllmodul, sowie Vorratsgefäße für Pufferlösungen. Eine Vorrichtung zur Beladung von Mikropartikeln ist in der Lage, bei normalem Betrieb eine Sedimentation der Mikropartikel weitgehend zu verhindern. Dazu dient bevorzugt eine Pumpe, die einzelnen Module können jedoch auch mit Rührvorrichtungen versehen sein. Durch die Modulbauweise ist es möglich, auch während des Betriebes einzelne Module zu sterilisieren, indem sie durch Ventile in den Leitungen vom Fluß durch die übrigen Komponenten der Anlage abgetrennt werden.Such a device is preferably applied in modular construction, the modules being linked together by conduits through which the microparticle suspension can pass from one module or vessel to another. The most important modules are a loading reactor, an exposure module, a separation module and a filling module, as well as reservoirs for buffer solutions. A device for loading microparticles is capable of largely preventing sedimentation of the microparticles during normal operation. For this purpose, a pump is preferably used, but the individual modules can also be provided with stirring devices. The modular design makes it possible to sterilize individual modules during operation by being separated from the flow through the other components of the system by valves in the lines.

Zum Betrieb werden zunächst die Mikropartikel in den Beladereaktor gefüllt, wobei Puffer aus einem der Vorlagegefäße zugegeben werden kann. Als nächstes erfolgt die Proteinzugabe, was bereits unter sterilen Bedingungen geschehen kann. Anschließend wird dann die Temperatur des Reaktorinhalts erhöht, um die Beladung zu erreichen. Für die Abtrennung nicht oder schwach adsorbierten Proteins wird der Inhalt des Reaktors in die Mikrofiltrationseinheit (Abtrennmodul) weitergepumpt. Diese kann z. B. aus einem Hohlfaserfilter bestehen, der ein rohrförmiges Filterelement enthält, welches von der Suspension durchströmt wird. Das Filterelement enthält die oben genannten Membranen, welche vorzugsweise aus Keramik und/oder Polypropylen bestehen. Jedoch eignen sich auch andere Filtermaterialien, die eine hydrophile Oberfläche und geeignete Porendurchmesser zwischen der Proteingröße und dem Partikeldurchmesser aufweisen. Bevorzugt ist ein mehrmaliger Durchlauf der Mikrofiltrationseinheit vorgesehen, wobei die Suspension in einem Kreislauf über den Reaktor wieder in die Filtrationseinheit gepumpt wird. Auf diese Weise können verschiedene Puffer eingesetzt werden, die jeweils von den Vorlagegefäßen in den Reaktor eingeleitet werden. Abgetrennter Puffer kann dabei durch Messung der Füllstandshöhe im Reaktor festgestellt und entsprechend im Reaktor durch frischen Puffer ersetzt werden.For operation, the microparticles are first filled into the loading reactor, it being possible to add buffer from one of the feed containers. Next comes the protein addition, which can already happen under sterile conditions. Subsequently, then the temperature of the reactor contents increased to reach the loading. For the separation of non-adsorbed or weakly adsorbed protein, the contents of the reactor in the microfiltration unit (separation module) is pumped on. This can, for. B. consist of a hollow fiber filter containing a tubular filter element, which is flowed through by the suspension. The filter element contains the above-mentioned membranes, which preferably consist of ceramic and / or polypropylene. However, other filter materials which have a hydrophilic surface and suitable pore diameters between the protein size and the particle diameter are also suitable. Preference is given to a repeated passage of the microfiltration unit, wherein the suspension is pumped back into the filtration unit in a cycle through the reactor. In this way, various buffers can be used, which are respectively introduced from the receiver vessels in the reactor. Separated buffer can be determined by measuring the level height in the reactor and be replaced accordingly in the reactor by fresh buffer.

Nach der Abtrennung oder auch vor einer ersten Abtrennung des ungebundenen Proteins wird die Suspension in das Belichtungsmodul gepumpt, wo sie unter den oben beschriebenen Bedingungen mit UV-Licht bestrahlt wird. Hierbei besteht das Problem, daß es sich um konzentrierte und daher häufig trübe Suspensionen handelt, die nur begrenzt für UV-Licht durchlässig sind. Um diese Schwierigkeit auszuschalten, werden extrem dünne Schichten der Suspension bestrahlt. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß man einen äußeren UV-Licht-durchlässigen Hohlkörper, z. B. ein Quarzglasrohr verwendet, in welchem sich ein rohrförmiger, geschlossener Körper mit einem Durchmesser befindet, der mit dem UV-durchlässigen Rohr einen rohrförmigen Spalt von etwa 0,5 bis 10 mm Dicke bildet. Der innere Körper ist vorzugsweise nicht befestigt, sondern wird freischwimmend gehalten. Dabei kann der Fluss durch die Einheit so geregelt werden, daß der innere Schwimmer tatsächlich immer schwebend vorliegt. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, daß der Schwimmer einzeln durch Erhitzen sterilisierbar ist. Besonders bevorzugt ist der Schwimmerkörper in der Lage, UV-Licht zu reflektieren, z. B. durch eine polierte Oberfläche. Besonders bevorzugt wird daher als Material für den Schwimmer polierter Edelstahl verwendet. Beispielsweise kann der Schwimmer einen Durchmesser von 75 mm aufweisen und zum Quarzrohr einen Spaltabstand von 2 mm aufweisen, durch den die zu bestrahlende Suspension strömt.After separation or even before a first separation of the unbound protein, the suspension is pumped into the exposure module, where it is irradiated with UV light under the conditions described above. Here, the problem is that it is concentrated and therefore often cloudy suspensions, which are limited to UV light permeable. To eliminate this difficulty, extremely thin layers of the suspension are irradiated. This is preferably achieved by applying an outer UV light-transmissive hollow body, for. Example, a quartz glass tube is used, in which there is a tubular, closed body with a diameter which forms a tubular gap of about 0.5 to 10 mm thickness with the UV-transmitting tube. The inner body is preferably not attached, but is kept free floating. In this case, the flow through the unit can be controlled so that the inner float is actually always floating. This embodiment has the advantage that the float can be sterilized individually by heating. More preferably, the float body is capable of reflecting UV light, e.g. B. by a polished surface. It is therefore particularly preferred to use polished stainless steel as the material for the float. For example, the float may have a diameter of 75 mm and the quartz tube have a gap distance of 2 mm, through which flows the suspension to be irradiated.

Die UV-Lichtquelle ist um das Quarzrohr herum angebracht. Sie kann z. B. ein aus mehreren (z. B. sechs) Lichtröhren bestehender Käfig sein, wobei die Wellenlänge durch einen folienförmigen Filter geregelt wird, der um das Quarzrohr gewickelt wird. Ein weiterer Vorteil dieses Moduls ist, daß das Totvolumen äußerst gering gehalten wird. Die Totvolumina der Leitungen, welche die verschiedenen Einheiten miteinander verbinden, sind zweckmäßig so gewählt, daß ein Rückspülen einer Einheit möglich ist, ohne daß dadurch die anfangs angegebenen Konzentrationsgrenzen unter- bzw. überschritten werden.The UV light source is mounted around the quartz tube. You can z. Example, be composed of a plurality of (eg, six) light tubes cage, wherein the wavelength is controlled by a foil-shaped filter, which is wound around the quartz tube. Another advantage of this module is that the dead volume is kept extremely low. The dead volumes of the lines which connect the various units with each other are suitably chosen so that a backwashing of a unit is possible, without thereby exceeding or exceeding the initially indicated concentration limits.

Weiterhin weist die Vorrichtung ein Abfüllmodul auf, durch das die fertigen beladenen Mikropartikel steril abgefüllt werden können.Furthermore, the device has a filling module, through which the finished loaded microparticles can be filled sterile.

Die gesamte Vorrichtung stellt ein geschlossenes System dar und kann unter sterilen Bedingungen im Dauerbetrieb gehalten werden, da alle Module durch die erfindungsgemäße Anordnung einzeln sterilisierbar sind. Sie ist gleichermaßen für Dauer- oder Batch-Betrieb geeigntet.The entire device is a closed system and can be kept under sterile conditions in continuous operation, since all modules are individually sterilized by the inventive arrangement. It is equally suitable for continuous or batch operation.

Figurenbeschreibungfigure description

1 zeigt eine schematische Darstellung einer Bead-Coating-Anlage mit den einzelnen Modulen, die durch Leitungen verbunden sind. 1 shows a schematic representation of a bead coating system with the individual modules that are connected by cables.

2 zeigt eine schematische Darstellung des Belichtungsmoduls. 2 shows a schematic representation of the exposure module.

Eine spezielle Ausführungsform der hierin beschriebenen Vorrichtung ist in den 1 und 2 dargestellt. Sie besteht aus verschiedenen Anlagekomponenten (Modulen). 1 zeigt als Einzelkomponenten einen heizbaren Beladereaktor 1, ein Belichtungsmodul 2, ein Abtrennmodul 3 und ein Abfüllmodul 4. Außerdem sind drei Vorlagegefäße 5, 6 und 7 dargestellt, welche als Vorratsgefäße für Puffer dienen. Alle Module und die Vorlagegefäße sind mit Leitungen 8 miteinander verbunden, welche mit Ventilen versehen sind. Desweiteren enthält diese bevorzugte Ausführungsform der Bead-Coating-Anlage eine Pumpe 9, welche den gewünschten Fluß durch die einzelnen Module gewährleistet. Die zentrale Einheit ist ein mit einer Rührvorrichtung 10 versehener Beladereaktor 1 mit Heizmantel 11, in den die Partikel eingebracht werden. Zusätzlich kann aus einem der Vorlagegefäße 5, 6 oder 7 Puffer in den Beladerektor geleitet werden, um die Partikel weiter zu suspendieren. Da die verwendbaren Mikropartikel meist nicht in sterilem Zustand erhältlich sind, kann anschließend eine Sterilisation mittels Erwärmung durch den Heizmantel 11 erfolgen. Nach der Sterilisation wird der Reaktor wieder auf die Ausgangstemperatur abgekühlt, und es erfolgt, falls nötig eine Umpufferung der Mikropartikel in den sogenannten Beladepuffer (enthaltend 40 bis 60 mM Kaliumphosphat) aus einem der Vorlagegefäße 5, 6 oder 7, welcher die Lösung, in der die Partikel suspendiert sind, ersetzt. Die Anordnung der Leitungen 8 macht deutlich, daß die Mikropartikelsuspension aus dem Beladereaktor direkt in das Belichtungsmodul 2 oder auch erst in das Abtrennmodul 3 geleitet werden kann. Somit sind auch mehrere Durchlaufe der einzelnen Module möglich.A specific embodiment of the device described herein is disclosed in U.S. Patent Nos. 4,149,355 1 and 2 shown. It consists of various system components (modules). 1 shows as individual components a heatable loading reactor 1 , an exposure module 2 , a separation module 3 and a filling module 4 , There are also three reservoirs 5 . 6 and 7 represented, which serve as storage containers for buffers. All modules and the jars are with pipes 8th connected to each other, which are provided with valves. Furthermore, this preferred embodiment of the bead-coating system includes a pump 9 , which ensures the desired flow through the individual modules. The central unit is one with a stirring device 10 provided loading reactor 1 with heating jacket 11 into which the particles are introduced. In addition, from one of the original containers 5 . 6 or 7 Buffer be passed into the loading rector to further suspend the particles. Since the usable microparticles are usually not available in a sterile state, then sterilization by heating through the heating jacket 11 respectively. After sterilization, the reactor is again cooled to the starting temperature, and, if necessary, reprecipitation of the microparticles in the so-called loading buffer (containing 40 to 60 mM potassium phosphate) from one of the receiving vessels 5 . 6 or 7 which replaces the solution in which the particles are suspended. The arrangement of the lines 8th makes it clear that the microparticle suspension from the loading reactor directly into the exposure module 2 or even in the separation module 3 can be directed. Thus, several passes of the individual modules are possible.

Das Belichtungsmodul 2 ist detaillierter in 2 dargestellt. Die Pfeile zeigen den Fluß der Mikropartikelsuspension durch das Modul an. Zu sehen ist das äußere Rohr 12, der innere Körper 13, welcher nicht befestigt ist, sondern freischwimmend vorliegen kann, sowie die UV-Lichtquelle 14. Diese bestrahlt die Flüssigkeit im Zwischenraum 15.The exposure module 2 is more detailed in 2 shown. The arrows indicate the flow of microparticle suspension through the module. You can see the outer tube 12 , the inner body 13 , which is not fixed, but may be free floating, as well as the UV light source 14 , This irradiates the liquid in the space 15 ,

Weiterhin beschrieben werden Protein-beladene Mikropartikel, die durch das obige Verfahren unter Verwendung der dazugehörigen Vorrichtung erhalten werden können und die sich dadurch auszeichnen, daß sie eine geringere Blutungsneigung aufweisen als herkömmliche, mit Hilfe von bekannten adsorptiven Kopplungsverfahren hergestellte Protein-beladene Mikropartikel. Bevorzugt wird als Proteinmaterial SA-Poly verwendet. Die Blutungsneigung wird in Nanogramm (Biotin-bindefähiges SA-Monoäquivalent) pro Milligramm (Mikropartikel) angegeben. Das heißt, daß abgeblutetes (Biotin-bindefähiges) SA-Poly mittels einer SA-Mono-Eichkurve bestimmt wird (”Sandwich-Test” mit Biotin-Tube und Biotin-POD). Hier liegen die Werte bei Raumtemperatur bevorzugt bei < 250 ng/mg, stärker bevorzugt bei < 100 ng/mg, noch stärker bevorzugt bei < 80 ng/mg und am meisten bevorzugt bei < 40 ng/mg. Nach Methoden des Stands der Technik werden Blutungen von ca. 400 ng/mg erreicht. Nach Modellbelastung (3 Wochen, 35°C bei permanentem Mischen) wurde bei erfindungsgemäßen Mikropartikeln eine Blutung von < 240 ng/mg gemessen. Die Bindekapazität der beladenen Mikropartikel wird in Nanogramm (gebundenes ¹⁴C-Biotin) pro Milligramm (Mikropartikel) angegeben. Bevorzugt beträgt die Bindekapazität ≥ 250 ng/mg, stärker bevorzugt > 400 ng/mg, noch stärker bevorzugt > 500 ng/mg. Die Bindekapazität kann bis zu 1000 ng/mg betragen. Der bevorzugte Bereich liegt bei 400 bis 600 ng/mg. Bei Verwendung von größerem SA-Poly bis zu 200 nm sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren noch höhere Werte erreichbar.Also described are protein-loaded microparticles which can be obtained by the above method using the associated device and which are characterized by having a lower bleeding tendency than conventional protein-loaded microparticles prepared by known adsorptive coupling methods. Preferably, the protein material used is SA-poly. The bleeding tendency is expressed in nanograms (biotin-binding SA mono-equivalent) per milligram (microparticles). That is, bleed (biotin-bondable) SA-poly is determined by an SA mono calibration curve (sandwich test with biotin tube and biotin-POD). Here, the values at room temperature are preferably <250 ng / mg, more preferably <100 ng / mg, even more preferably <80 ng / mg and most preferably <40 ng / mg. By methods of the prior art, bleeding of about 400 ng / mg is achieved. After model loading (3 weeks, 35 ° C. with permanent mixing), a bleeding of <240 ng / mg was measured with microparticles according to the invention. The binding capacity of the loaded microparticles is expressed in nanograms (bound ¹⁴ C-biotin) per milligram (microparticles). Preferably, the binding capacity is ≥ 250 ng / mg, more preferably> 400 ng / mg, even more preferably> 500 ng / mg. The binding capacity can be up to 1000 ng / mg. The preferred range is 400 to 600 ng / mg. When using larger SA-poly up to 200 nm even higher values can be achieved with the method according to the invention.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter.The following example further illustrates the invention.

Beispielexample

Herstellung von Streptavidin-beladenen BeadsPreparation of streptavidin-loaded beads

Streptavidin (Roche Diagnostics) wurde in einer Konzentration von 2 mg/ml in 50 mM K₂HPO₄, pH 7,0 zu einer 1%-igen Beadsuspension von unbeladenen Mikropartikeln (Uncoated Beads M-270, Fa. Dynal) bei 20°C hinzugegeben. Anschließend wurde die erhaltene Suspension über einen Zeitraum von 40 Minuten auf 50°C erwärmt und für 10 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Danach wurde die Suspension wieder auf 20°C abgekühlt. Im Anschluß daran wurde nicht gebundenes Straptavidin durch Filtration durch eine Membran mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm gegen 5 Volumen des Beladepuffers entfernt. Zur Fixierung des gebundenen Streptavidins wurde die 1%-ige Suspension mit UV-Licht bestrahlt. Die Streptavidinbeads wurden anschließend mit 10 Volumen 50 mM K₂HP-O₄, pH 7,0 gewaschen. Das Material wurde nach Zugabe eines Biozids bei 4°C gelagert.Streptavidin (Roche Diagnostics) was added at 2 mg / ml in 50 mM K ₂ HPO ₄ pH 7.0 to a 1% bead suspension of unloaded microparticles (Uncoated Beads M-270, Dynal) at 20 ° C added. Subsequently, the resulting suspension was heated to 50 ° C over a period of 40 minutes and held at this temperature for 10 hours. Thereafter, the suspension was cooled again to 20 ° C. Subsequently, unbound streptavidin was removed by filtration through a membrane having a pore diameter of 0.45 μm against 5 volumes of the loading buffer. To fix the bound streptavidin, the 1% suspension was irradiated with UV light. The streptavidin beads were then washed with 10 volumes of 50 mM K ₂ HP-O ₄ , pH 7.0. The material was stored at 4 ° C after addition of a biocide.

Claims

A method for producing protein loaded microparticles comprising the steps (a) contacting microparticles, which are not functionalized and have a hydrophobic surface, with protein material, which is a polymerized protein and has a hydrophobic surface, in a suspension, (b) uniformly heating the suspension to 35 to 65 ° C over a period of 10 to 90 minutes, with the temperature increase being 0.03 ° C / min to 5 ° C / min, (c) maintaining the temperature reached in (b) over a period of 0 to 50 hours, (d) irradiating the suspension with UV light in the absence of a photolinker.

A method according to claim 1, characterized in that the temperature rise in step (b) at 0.5 ° C / min to 2 ° C / min.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that a microparticle suspension of less than 20% by weight per volume is used.

A method according to claim 1, characterized in that the microparticles have a size of 50 nm to 25 microns.

A method according to claim 4, characterized in that the microparticles consist of polystyrene latex and optionally contain magnetite.

A method according to claim 1, characterized in that the protein material has a size of 20 nm to 0.3 microns.

A method according to claim 6, characterized in that the protein material is polymerized streptavidin.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a sedimentation of the microparticles is avoided.

A method according to claim 8, characterized in that the sedimentation by stirring, Recirculation, dispersion of dispersing energy or any combination of such measures or other suitable physical methods is prevented.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that prior to and / or after the irradiation with UV light, a separation of not or only weakly adsorbed protein material.

A method according to claim 10, characterized in that several successive separation steps are carried out.

A method according to claim 11, characterized in that after each separation step, the buffer is changed.

The method of claim 10, 11 or 12, characterized in that the separation is effected by membrane filtration.

A method according to claim 13, characterized in that a membrane with a pore diameter of 0.4 .mu.m to 2.5 .mu.m is used.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the wavelength of the UV light used is at least 340 nm.