DE19829981A1

DE19829981A1 - Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie

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Publication number: DE19829981A1
Application number: DE19829981A
Authority: DE
Inventors: Sebastian Tille; Ulrich Simon; Gunter Moehler; Stefan Wilhelm; Ulrich Meisel
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 1998-07-04
Filing date: 1998-07-04
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2018-07-05
Also published as: JP4500378B2; HK1029177A1; EP0977069A3; DE59913847D1; EP0977069B1; US6462345B1; USRE41666E1; JP2000035400A; EP0977069A2; EP0977069B2; DE19829981C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie, bei dem Laserlicht in einen Mikroskopstrahlengang eingekoppelt, zeitlich nacheinander auf verschiedene Orte einer Probe gerichtet und aus dem von den beaufschlagten Orten reflektierten und/oder emittierten Licht ein Bild der abgetasteten Ebene generiert wird. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß während der Ablenkung des Laserstrahles von Ort zu Ort eine Veränderung der spektralen Zusammensetzung und/oder der Intensität des Lichtes vorgenommen wird, während die Ablenkung ununterbrochen fortgesetzt wird. DOLLAR A Dadurch wird erreicht, daß mindestens zwei nebeneinanderliegende Orte der Probe mit Licht unterschiedlicher Spektraleigenschaften und/oder mit Laserstrahlung unterschiedlicher Intensität beaufschlagt werden. Durch zeitweise Unterbrechung der Einkopplung des Laserlichtes während der Ablenkung des Mikroskopstrahlenganges ist es möglich, nur ausgewählte Abschnitte des Bildfeldes mit der Laserstrahlung zu beaufschlagen. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin ein Laser-Scan-Mikroskop zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie, bei dem Laserlicht verschiedener Spektralbe reiche in einen in mindestens zwei Koordinaten abgelenkten Mikroskopstrahlengang eingekoppelt und zeitlich nacheinan der auf Orte einer Probe gerichtet wird, wobei die Probe in mindestens einer Ebene Ort für Ort und Zeile für Zeile mit dem Laserlicht beaufschlagt und aus dem von den beauf schlagten Orten reflektierten und/oder emittierten Licht ein Bild der abgetasten Ebene generiert wird. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Laser-Scan-Mikroskop zur Durchführung dieses Verfahrens.

Während mit der konventionellen Lichtmikroskopie lediglich die optische Erfassung einer Abbildungsebene möglich ist, bietet die Konfokalmikroskopie als spezielle Weiterentwick lung der Lichtmikroskopie die Möglichkeit, Mikrostrukturen auch in der Z-Achse des Raumes abzubilden und zu vermessen. Mit dem Lichtmikroskop ist es beispielsweise nicht möglich, bei hoher Vergrößerung einen Eindruck von der räumlichen Struktur der rauhen Oberfläche einer Probe zu erhalten, da jeweils nur ein kleiner Bereich der Probe scharf darge stellt werden kann, während in der Tiefe liegende Details der Oberfläche durch den hohen Streulichtanteil und die fehlende axiale Auflösung unscharf abgebildet werden.

Beim konfokalen Laser-Scan-Mikroskop dagegen wird das Streulicht weitestgehend eliminiert und nur die Strukturen werden abgebildet, die sich in der Fokusebene des Objektivs befinden. Wird die Strahlung auf unterschiedliche Ebenen fokussiert, so können aus der Abtastung dieser in Richtung der Z-Achse gestaffelten Ebenen dreidimensionale Bilder ei ner Probe berechnet werden.

Dazu wird eine erste Lochblende punktförmig verkleinert in die Objektebene abgebildet, wobei als Beleuchtungsquelle Laser dienen. Der punktförmige Laserstrahl wird mit Hilfe von Ablenkspiegeln rasterförmig Ort für Ort und Zeile für Zeile über die Probe bewegt. Durch das Mikroskopobjektiv hindurch wird das von der Probe reflektierte und/oder emit tierte Licht auf eine zweite Lochblende fokussiert, die konjugiert zur ersten Lochblende angeordnet ist. Die Anord nung dieser beiden Lochblenden hat zur Folge, daß nur In formationen aus der Fokusebene zu einem oder mehreren De tektoren gelangen, die der zweiten Lochblende nachgeordnet sind.

Das Streulicht, das oberhalb und unterhalb des Fokus ent steht, wird durch die zweite Lochblende eliminiert. Die mit einer zweidimensionalen Ablenkung ermittelten Informationen aus mehreren übereinanderliegenden Abbildungsebenen werden gespeichert und zu Bildern weiterverarbeitet.

Dieses Prinzip der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie ist beispielsweise beschrieben in Schroth: "Konfokale Laser- Scaning-Mikroskopie, eine neue Untersuchungsmethode in der Materialprüfung", Zeitschrift Materialprüfung Jg. 39 (1997), Heft 6, Seiten 264 ff.

Weiterhin ist aus den "Mitteilungen für Wissenschaft und Technik", Band II, Nr. 1, Seiten 9-19, Juni 1995 bekannt, als Beleuchtungsquelle in Laser-Scan-Mikroskopen entweder einzelne Laser mit jeweils einer Wellenlänge oder auch "Multi-Line"-Mischgas-Laser mit einer Vielzahl von nutzba ren Wellenlängen zu verwenden. Damit wird die Möglichkeit eröffnet, neben den klassischen Kontrastierverfahren Hell feld, Phasenkontrast und Interferenzkontrast die Konfokal mikroskopie für die Fluoreszenztechnik zu nutzen. Dabei wird davon ausgegangen, daß unterschiedliche Fluorochrome, deren Anregungs- und Emissionswellenlängen in verschiedenen spektralen Bändern liegen, die Darstellung von Strukturen gleichzeitig in mehreren Floreszenzfärbungen erlauben. So können in Abhängigkeit von den spektralen Eigenschaften verschiedener Farbstoffmoleküle neben morphologischen In formationen auch Aussagen über physiologische Parameter ge wonnen werden. Nutzt man das Konfokalmikroskop für fluoro metrische Verfahren, lassen sich Aufschlüsse über Verände rungen der Konzentration von Ionen und Molekülen ableiten. Hierbei sind auch Indikatoren von Bedeutung, die zusätzlich zur Intensitätsabhängigkeit eine Verschiebung des Anre gungs- oder Emissionsspektrums zeigen und insofern eine Quantifizierung von Ionenkonzentrationen ermöglichen. Wei terhin wird in diesem Zusammenhang das Photo-Bleich- Verfahren vorgeschlagen, bei dem eine definierte Inhomoge nität erzeugt wird, um über die Dynamik des sich anschlie ßend einstellenden Gleichgewichtes Objektinformationen wie Fluidität und Diffusion erhalten zu können.

Aus der vorgenannten Veröffentlichung ist es bekannt, Ar- Kr-Laser zur Fluoreszenzanregung im sichtbaren Spektralbe reich mit den Linien 488 nm, 568 nm und 647 nm einzusetzen. Diese Linien werden in einem Laserstrahl vereinigt und über Lichtleitfasern der Scan-Einrichtung zugeführt. Zur Anre gung im DV-Bereich wird ein Ar-Laser der Wellenlängen 351 nm und 364 nm vorgeschlagen. Auch hierfür erfolgt die Einkopp lung in die Scan-Einrichtung über Lichtleitfasern.

Die hier beschriebenen Verfahren und Anordnungen lassen sich zur Aufnahme von 3D-Datensätzen nutzen, die z. B. eine zuverlässige Zuordnung von räumlichen Zell- oder Gewebe strukturen innerhalb einer Mikroarchitektur oder die Loka lisation mehrerer Genorte in den Chromosomen bei FISH-Experimenten erlauben.

Allerdings besteht dabei der Nachteil, daß die jeweilige Probe über den gesamten Scan-Bereich mit der im Lasermodul erzeugten und in die Scan-Einrichtung eingekoppelten Laser strahlung beaufschlagt wird. Damit ist der gesamte Scan- Bereich einer relativ hohen Strahlenbelastung ausgesetzt, was insbesondere bei der Untersuchung lebender Organismen zu unerwünschten Effekten und unzureichenden Ergebnissen führt.

Weiterhin besteht der Nachteil, daß bei Anregung der Probe mit unterschiedlichen Wellenlängen, etwa der vorgenannten Laserlinien, keine eindeutige Detektion und Bewertung der von einem bestimmten Ort einer Probe emittierten und/oder reflektierten Strahlung möglich ist, da der Effekt des ge genseitigen "Durchblutens" der einzelnen Spektrallinien auftritt.

Ausgehend davon liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Laser-San-Mikroskopie der vorbeschriebe nen Art derart weiterzubilden, daß sowohl eine geringere Strahlenbelastung der Probe als auch eine präzisere Bild- Auswertung erzielt werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß wäh rend der Ablenkung des Laserstrahles von Ort zu Ort eine Veränderung der spektralen Zusammensetzung und/oder der In tensität des Lichtes vorgenommen wird. Das erfolgt, indem entweder die Einkopplung einzelner oder mehrerer Spek tralanteile oder auch die Einstrahlung des Lichtes insge samt zeitweise unterbrochen wird oder indem zeitweise ein zelne oder mehrere Spektralanteile zusätzlich in den Mikro skopstrahlengang eingekoppelt werden, während die Ablenkung des Mikroskopstrahlenganges ununterbrochen fortgesetzt wird.

Dadurch wird erreicht, daß mindestens zwei nebeneinander liegende Orte der Probe mit Licht unterschiedlicher Spek traleigenschaften und/oder mit Laserstrahlung unterschied licher Intensität beaufschlagt werden. Durch zeitweise Un terbrechung der Einkopplung des Laserlichtes während der Ablenkung des Mikroskopstrahlenganges ist es möglich, nur ausgewählte Abschnitte des Bildfeldes mit der Laserstrah lung zu beaufschlagen.

Eine Schonung der Probe wird insofern erreicht, als ledig lich die für die Bildauswertung relevanten Bereiche einer Probe mit Laserstrahlung höherer Intensität beaufschlagt werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante des erfindungs gemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß die spektrale Zusam mensetzung und/oder die Intensität des Laserlichtes während der Abtastung mehrerer nebeneinanderliegender Orte, die so eine Abtastzeile bilden, geändert wird. Dabei kann die Ab lenkung über die Orte dieser Zeile hinweg sowohl mehrfach in gleicher Richtung oder auch bidirektional erfolgen. Er findungsgemäß ist beispielhaft vorgesehen, bei jedem Scan über die Orte dieser Zeile hinweg, unabhängig davon, ob dieser in gleicher Richtung oder entgegengesetzt erfolgt, die Veränderung der spektralen Zusammensetzung bzw. der In tensität immer in Bezug auf dieselben nebeneinander liegen den Orte dieser Zeile vorzunehmen, wodurch die Qualität der Bildauswertung erhöht wird, während der Energieeintrag in die grobe begrenzt bleibt. Hierdurch erreicht man zugleich, daß einzelne aneinandergrenzende Orte der Probe ohne den Effekt des gegenseitigen "Durchblutens" einzelner Spektral bereiche betrachtet werden können.

Die unterschiedliche spektrale Zusammensetzung der in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelten Laserstrahlung er reicht man beispielsweise, indem die von mehreren Linienla sern etwa mit den Wellenlängen 633 nm, 568 nm, 543 nm, 514 nm, 488 nm und 458 nm bereitgestellte Strahlung nach Bedarf bzw. in Abhängigkeit von den Eigenschaften der auszuwertenden Probe mit einer einzelnen Wellenlänge, mit einer Auswahl mehrerer Einzelwellenlängen oder mit allen verfügbaren Ein zelwellenlängen eingekoppelt wird. Neben dieser Strahlung im VIS-Bereich können weiter Wellenlängen im UV-Bereich, etwa 351 nm und 364 nm, zur Einkopplung bereitgestellt wer den.

In bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung erfolgt die Einkopplung der Laserstrahlung in den Mikroskopstrahlengang polarisationserhaltend über Single-Mode-Fasern. Die Ein stellung der jeweils zur Einstrahlung vorgesehenen Laserli nien auf eine gewünschte Helligkeit wird vorteilhafterweise mit einem akusto-optisch durchstimmbaren Filter (AOTF) vor genommen, dem auch noch ein akusto-optischer Modulator (AOM) nachgeordnet sein kann. Die Anpassung der jeweiligen Laserwellenlänge an das jeweils in den Strahlengang ge stellte Mikroskopobjektiv erfolgt sowohl für den UV- als auch für den VIS-Bereich durch variable Strahlkollimation.

Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß das von jedem einzelnen be aufschlagten Ort der Probe reflektierte und/oder emittierte Licht im Hinblick auf seine spektralen Eigenschaften und seine Intensität bewertet wird, wobei die Bewertung syn chron zur Beaufschlagung desselben Ortes und unter Berück sichtigung der spektralen Zusammensetzung und/oder der In tensität des Laserlichtes erfolgt, mit dem dieser Ort be aufschlagt wurde. Damit bietet sich die Möglichkeit, den abgetasteten Abschnitt der Probe bezogen auf die einzelnen Orte auszuwerten, was zu einer sehr hohen Auflösung und zu einer höchstmöglichen Genauigkeit bei der Bildauswertung führt.

Im Rahmen der Erfindung liegt es ebenfalls, daß das von je dem einzelnen beaufschlagten Ort reflektierte und/oder emittierte Laserlicht mit mehreren Detektionskanälen detek tiert wird, wobei die einzelnen Detektionskanäle zum Emp fang unterschiedlicher Spektralanteile ausgelegt sind. Da mit sind sehr gute Bedingungen für die Untersuchung von Multifluoreszenzpräparaten gegeben, und es können über je den Detektionskanal identische optische Schnitte bei er si multanen Aufnahme von Mehrfachfluoreszenzpräparaten erzeugt werden.

In diesem Zusammenhang ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß die spektrale Zusammensetzung und/oder die Intensität des in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelten Laserlichtes der Anregungsstrahlung eines in der Probe enthaltenen oder auf die Probe aufgebrachten Fluoreszenzfarbstoffes ent spricht und die einzelnen Detektionskanäle für den Empfang der vom Fluoreszenzfarbstoff ausgehenden Emissionsstrahlung ausgelegt sind. Damit ist es möglich, Laserlicht zur Anre gung unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoff zu erzeugen und aus der Detektion Rückschlüsse auf die Verteilung dieser Fluoreszenzfarbstoffe auf bzw. in der Probe zu ziehen.

Eine weitere sehr bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß permanent eine Bewertung der spektralen Zusammensetzung und/oder der Intensität des eingekoppelten Laserlichtes vorgenommen wird und eine mathematische Ver knüpfung der Bewertungsergebnisse der auf einen bestimmten Ort gerichteten Laserstrahlung mit den Bewertungsergebnis sen des von diesem Ort reflektierten und/oder emittierten Lichtes erfolgt. Im Ergebnis dieser Verknüpfung kann bei spielsweise die Ablenkposition des Mikroskopstrahlenganges für zwei nebeneinanderliegende Orte ermittelt nach den Ko ordinaten x,y,z bestimmt werden, für die bei der Auswertung über einen vorgegebenen Schwellwert hinausgehende Unter schiede der spektralen Eigenschaften des Lichtes nachweis bar sind, das von diesen Orten reflektiert und/oder emit tiert wird, woraus auf das Vorhandensein einer optischen Grenzschicht zwischen diesen beiden Orten zu schließen ist. Diese Ablenkpositionen werden erfindungsgemäß gespeichert und der Berechnung von Flächen und/oder Volumina zugrunde gelegt, die von optischen Grenzschichten innerhalb der Pro be umschlossen sind.

Mit den so gewonnenen und gespeicherten Ablenkpositionen ist es außerdem möglich, Stellsignale für die spektrale Zu sammensetzung und/oder der Intensität des Laserlichtes für die Beaufschlagung dieser Orte bei einem nachfolgenden Ab tastzyklus zu ermitteln und vorzugeben, womit eine selbst tätige Optimierung bei der Bildauswertung unter Berücksich tigung der optischen Eigenschaften der Probe bzw. des Fluo reszenzfarbstoffes erzielt wird.

Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft für das sogenannte Photobleichen nutzbar. Dabei wird wäh rend der Abtastung ein ausgewähltes Areal einer Probe zu nächst mit einer verhältnismäßig hohen Strahlungsintensität beaufschlagt und dadurch ein Bleichvorgang ausgelöst. Mit den unmittelbar nachfolgenden Abtastzyklen werden die ein setzenden Reaktionen optisch erfaßt und ausgewertet, woraus Informationen über die sofort nach dem Bleichvorgang in der Probensubstanz ablaufenden dynamischen Prozesse, wie Diffu sion und Transportprozesse, gewonnen werden können.

Hierzu muß die Abtastung mit sehr hoher Zeitauflösung er folgen, was erfindungsgemäß mit der hinreichend schnellen, synchron zur Strahlablenkung erfolgenden Umschaltung zwi schen unterschiedlichen Intensitäten und unterschiedlichen spektralen Zusammensetzungen des auf einzelne Orte der Pro be treffenden Lichtes erreicht wird.

Die schnelle Umschaltung zwischen unterschiedlichen Inten sitäten und unterschiedlichen spektralen Zusammensetzungen der Laserstrahlung wird mit einem akusto-optisch durch stimmbaren Filter (AOTF) vorgenommen, der sinngemäß, jedoch wesentlich schneller, die Funktion verschiedener im Strah lengang gegeneinander austauschbarer Filter übernimmt und darüberhinaus auch noch einzelne Laser-Linien bzw. beliebi ge Kombinationen von Linien mit hoher zeitlicher Dynamik in der Intensität modulieren kann.

Funktionsweise und Anwendung des AOTF sind beispielsweise ausführlich beschrieben in: String, Kenneth, R.: "Wave length Selection for Illuminaton in Fluorescence Microsco py", NIH, LKEM, Building 10/6N309, Bethexda, MD 20892, April 1993. Weiterhin sind konkrete Anwendungsbeispiele für AOTF in den US-Patenten US 5,444,528, US 5,3777,003 und US 5,216,484 dargelegt.

Die Zeitsynchronität zwischen der Ansteuerung des AOTF zur Modulation der Laserstrahlung und der Ansteuerung der Scan- Einrichtung zur Strahlablenkung wird dadurch erzielt, daß den von der Ansteuereinrichtung an die Scan-Einrichtung ausgegebenen Steuersignalen jeweils bestimmte Steuersignale für den AOTF zugeordnet werden. So erfolgen die Ansteuerung der San-Einrichtung und die Ansteuerung des AOTF stets syn chron, d. h. der Ausgabe eines Steuerimpulses für die Scan- Einrichtung sind zeitlich stets auch Steuerimpulse für den AOTF angefügt.

Das bedeutet andererseits, daß jeder Ablenkposition und da mit jedem Ort der Probe eine charakteristische Intensität und/oder spektrale Zusammensetzung des Lichtes zugeordnet werden kann.

Dazu sind die Schaltungsanordnungen zur Ausübung des Ver fahrens im Hinblick auf sehr kurze Laufzeiten der Steuerim pulse von der Ausgabe bis zur Umschaltung der Strahlmodula tion durch den AOTF optimiert. Diese liegen im Bereich von < 10 ms. Eine Verfahrensvariante besteht darin, bei der An steuerung des AOTF bzw. der Scan-Einrichtung Vorhalte- bzw. Vorlaufzeiten für die Umschaltung der Intensität und Spek tralzusammensetzung und/oder für die Ablenkung vorauszube rechnen, damit genau der vorgesehene Ort auch mit der vor gesehenen Strahlungsintensität und spektralen Zusammenset zung beaufschlagt wird.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Laser-Scan- Mikroskop zur Durchführung der vorgenannten Verfahrens schritte, mit einem Lasermodul zur Erzeugung von Laserlicht mit verschiedenen auswählbaren Spektralanteilen, mit Sin gle-Mode-Fasern zur Einkopplung des Laserlichtes in den Mi kroskopstrahlengang, mit einer mindestens zweidimensional ablenkenden Scan-Einrichtung, mit einem Mikroskopobjektiv, welches das Laserlicht auf eine Probe fokussiert, mit meh reren Detektoren für den Empfang verschiedener Spektralan teile des von der Probe reflektierten und/oder emittierten Lichtes und mit einer Auswerteschaltung, die den Ausgängen der Detektoren nachgeschaltet ist.

Erfindungsgemäß sind in einem solchen Laser-Scan-Mikroskop im Lasermodul mehrere einzeln ansteuerbare Einzel- und/oder Multiwellenlängenlaser vorgesehen, dem Lasermodul ist ein Strahlvereiniger, ein akusto-optisch durchstimmbarer Filter (AOTF) und/oder ein akusto-optischer Modulator (AOM) nach geschaltet, den Single-Model-Fasern sind Kollimationsopti ken nachgeordnet, deren Abstände zum jeweiligen Faserende veränderbar sind und die mit ansteuerbaren Stelleinrichtun gen gekoppelt sind. Als Detektoren sind Photomultiplier (PMT) vorgesehen, von denen jeweils einer einem Reflexions- oder Emissionsband und somit einem Detektionskanal zugeord net ist. Zur Aufzweigung der von der Probe ausgehenden Strahlung in die einzelnen Detektionskanäle sind auf Tei lerrädern angeordnete und durch Drehung der Teilerräder ge geneinander austauschbare Filter und/oder Farbteiler vor handen, wobei jedes Teilerrad ebenfalls mit einer ansteuer baren Stelleinrichtung gekoppelt ist. Des weiteren sind die Steuereingänge des Lasermoduls, des AOTF, des AOM, der Scan-Einrichtung sowie der Stelleinrichtungen für die Tei lerräder und die Kollimationsoptiken mit den Ausgängen der Auswerteschaltung verbunden.

In einer Ausgestaltungsvariante des Laser-Scan-Mikroskops ist der auf die Probe gerichtete Mikroskopstrahlengang auf gezweigt und einer der Zweige auf einen optoelektronischen Empfänger gerichtet, dessen Ausgang ebenfalls mit der An steuereinheit verbunden ist.

Weiterhin ist in einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante vorgesehen, daß in der Auswerteschaltung eine mathematische Verknüpfung der Ausgangssignale des optoelektronischen Emp fängers mit den Ausgangssignalen der PMT und/oder mit den Ablenksignalen für die Scan-Einrichtung erfolgt, wobei am Ausgang der Auswerteschaltung optimierte Stellsignale für das Lasermodul, das AOTF, dem AOM, die Scan-Einrichtung und für die Stelleinrichtung zur Verfügung gestellt werden.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbei spieles näher erläutert werden. In den dazugehörigen Zeich nungen zeigen

Fig. 1 den prinzipiellen Aufbau eines Laser-Scan- Mikroskops

Fig. 2 das Prinzip der Ablenkung des Laserlichtes über die einzelnen Orte einer Probe.

In Fig. 1 ist ein Lasermodul 1 dargestellt, das mit den La sern 2, 3 und 4 zur Erzeugung von Laserlicht im sichtbaren Bereich mit den Wellenlängen 633 nm, 543 nm und 458 nm ausge stattet ist. Die von diesen Lasern ausgehende Strahlung wird über mehrere Strahlvereiniger 5, ein AOTF 6 und eine Faser 7 in eine Scan-Einrichtung 8 eingekoppelt, die mit einer in den Koordinaten x und y strahlablenkenden Einheit 9 ausgestattet ist.

In einem zweiten Lasermodul 10 ist ein UV-Laser vorgesehen, dessen Licht über ein AOTF 11 und eine Lichtleitfaser 12 in die Scan-Einrichtung 8 eingekoppelt wird.

In beiden Strahlengängen sind den Lichtleitfasern 7 und 12 Kollimationsoptiken 13 nachgeordnet, deren Abstände zum je weiligen Faserende veränderbar sind und die zu diesem Zweck mit einer ansteuerbaren Stelleinrichtung (zeichnerisch nicht dargestellt) gekoppelt sind.

Von der strahlablenkenden Einrichtung 9 wird die Laser strahlung durch ein Scan-Objektiv 14 in den Strahlengang des vereinfacht dargestellten Mikroskops 15 eingekoppelt und hier auf eine Probe 16 gerichtet. Dabei passiert die Laserstrahlung eine Tubuslinse 17, einen Strahlteiler 18 und das Mikroskopobjektiv 19.

Das von dem jeweils beaufschlagten Ort der Probe reflek tierte und/oder emittierte Licht gelangt durch das Mikro skopobjektiv 19 zurück zur strahlablenkenden Einrichtung 9, passiert danach einen Strahlteiler 20 und wird mit Hilfe der Abbildungsoptik 21 nach Aufzweigung in mehrere Detekti onskanäle 22 auf Photomultiplier 23 gerichtet, von denen jeweils einer einem der Detektionskanäle 22 zugeordnet ist. Zum Zweck der Aufzweigung in die einzelnen Detektionskanäle 22 wird das Licht von einem Umlenkprisma 24 auf dichroiti sche Strahlteiler 25 gerichtet. In jedem Detektionskanal 22 sind sowohl in Richtung als auch senkrecht zur Strahlungs richtung verstellbare und in ihren Durchmessern veränderba re Pinholes 26 sowie Emissionsfilter 27 vorgesehen.

Die Ausgänge der Photomultiplier 23 führen zu den Signaleingängen einer Auswerteschaltung 28, die ihrerseits mit einer Ansteuereinrichtung 29 verbunden ist. Die Ausgän ge der Ansteuereinrichtung 29 sind mit den Signaleingängen der Lasermodule 1 und 10 sowie mit Signaleingängen der Stelleinrichtungen zur Beeinflussung der Position von opti schen Elementen bzw. Baugruppen, wie beispielsweise der Po sition der Kollimationsoptiken 13, der Pinholes 26 u. a. verbunden (im Detail nicht dargestellt).

Beispielhaft ist die in die Scan-Einrichtung 8 eingekoppel te Laserstrahlung durch einen Strahlteiler 30 verzweigt, wobei einer der Zweige auf einen optoelektronischen Empfän ger 31 gerichtet ist, dem mehrere auf Filterrädern angeord nete und durch Drehung der Filterräder gegeneinander aus tauschbare Linienfilter 32 und ebenso gegeneinander aus tauschbare Neutralfilter 33 vorgeordnet sind. Der Ausgang des Empfängers 31 liegt ebenfalls an einem Signaleingang der Auswerteschaltung 28. Die Filterräder, auf denen die Linienfilter 32 und die Neutralfilter 33 angeordnet sind, sind mit Stelleinrichtungen gekoppelt, deren Steuereingänge mit Signalausgängen der Ansteuereinrichtung 29 verbunden sind (zeichnerisch nicht dargestellt).

Beim Betreiben des Laser-Scan-Mikroskops wird die optische Achse 38 des Mikroskopstrahlenganges durch die Scan- Einrichtung 8, wie in Fig. 2 symbolisch dargestellt, in Richtung der Koordinate X von Ort zu Ort und in Richtung der Koordinate Y von Zeile zu Zeile rasterförmig über eine zu scannende Objektebene 34 geführt, in der das auszuwer tende Detail 35 einer Probe liegt.

Nach dem Stand der Technik wurde bisher Laserlicht mit wäh rend des Scannens gleichbleibender spektraler Zusammenset zung bzw. Intensität in den Mikroskopstrahlengang eingekop pelt, was dazu geführt hat, daß insbesondere bei hochauflö senden Strukturuntersuchungen an extrem kontrastarmen Ob jekten, beispielsweise einzelnen Zellen, Organellen, Orga nismen oder Parasiten, durchgängig eine hohe Strahlenbela stung erforderlich war, um Bilder mit ausreichendem Hell feld- oder Phasenkontrast zu erhalten.

Um nun die Strahlenbelastung reduzieren und die Qualität der Bildauswertung trotzdem erhöhen zu können, ist erfin dungsgemäß vorgesehen, daß während der Abtastung einer Zei le und/oder der Objektebene 34 die Einkopplung einzelner oder mehrerer Spektralanteile, gegebenenfalls auch des ge samten Spektrums, zeitweise unterbrochen wird oder, alter nativ hierzu, einzelne bzw. mehrere Spektralanteile zeit weise zusätzlich eingekoppelt werden.

Während der Änderung der spektralen Zusammensetzung bzw. der Intensität des Laserlichtes bleibt die strahlablenkende Einrichtung 9 ununterbrochen in Tätigkeit. Auf diese Weise wird erreicht, daß beispielsweise die Orte 36 und 37 inner halb einer Abtastzeile bzw. innerhalb der abzutastenden Probe unterschiedlich beaufschlagt werden. Damit ist es möglich, die Orte 37, die sich innerhalb des auszuwertenden Details 35, beispielsweise einer Zelle, befinden, einer ge ringeren Strahlung auszusetzen.

Umgekehrt wird bei der Abtastung der Orte 37 eine Erhöhung der Intensität und/oder eine Veränderung des Spektrums der Laserstrahlung vorgenommen, sofern das wünschenswert ist, wie beispielsweise bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Zweck des Photobleichens, wobei es darauf ankommt, ausgewählte Areale der Probe mit einer sehr hohen Strahlungsintensität zu beleuchten, um unmittelbar danach die dann einsetzenden dynamischen Prozesse verfolgen zu können.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit der erfindungs gemäßen Anordnung ist es weiterhin möglich, das von jedem einzelnen der beaufschlagten Orte 36 und 37 reflektierte und/oder emittierte Licht in den einzelnen Detektionskanä len 22 zu empfangen, wobei die einzelnen Detektionskanäle 22 jeweils zum Empfang unterschiedlicher Spektralanteile des vom jeweiligen Ort ausgehenden Lichtes modifiziert sind.

Eine Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Detektion und die Auswertung des von jedem beaufschlagten Ort ausgehenden Lichtes synchron zur Beauf schlagung des betreffenden Ortes erfolgt. Insofern kann für jeden einzelnen der Orte 36 und 37 der Probe die Anregungs wellenlänge und die Emissionswellenlänge bewertet werden, woraus Schlußfolgerungen auf die Eigenschaften der Probe genau an dem betrachteten Ort herleitbar sind.

Mit der erfindungsgemäßen Anordnung ist es weiterhin mög lich, anhand der von dem optoelektronischen Empfänger 31 abgegebenen Signale permanent die Zusammensetzung und die Intensität des Laserlichtes zu kontrollieren, das auf die Probe gerichtet ist und diese Signale zum Ausgleich selbst kleinster Intensitätsschwankungen über die Ansteuereinrich tung 29 zu nutzen.

Mit einer in die Auswerteschaltung 28 integrierten Rechen schaltung wird jeweils die Anregungsstrahlung und Emissi onsstrahlung bewertet, die auf ein und denselben Ort bezo gen ist. Auf diese Weise ist exakt feststellbar, ob bei der Ablenkung der Laserstrahlung von einem Ort zum anderen, beispielsweise von unmittelbar benachbarten Orten 36 und 37, eine Änderung der Emissionswellenlänge oder der Inten sität der emittierten Strahlung zu verzeichnen ist, die in ihrem Ausmaß über einen vorgegebenen Schwellwert hinaus geht. Sofern das der Fall ist, kann auf das Vorhandensein einer optischen Grenzschicht bei den benachbarten Orten 36 und 37 geschlossen werden.

Da für diese Orte 36, 37 wie für jeden anderen abgetasteten Ort der Probe auch die Daten der Ablenkpositionen in der Ansteuereinrichtung 29 und/oder der Auswerteschaltung 28 verfügbar sind, läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfah ren anhand relevanter Ablenkpositionen der Verlauf derarti ger optischer Grenzschichten ermitteln und unter Zugrunde legung dieser Ablenkpositionen schließlich die Fläche bzw. das Volumen berechnen, das von den optischen Grenzschichten eingeschlossen ist.

Es sei der Vollständigkeit halber darauf hingewiesen, daß die in Fig. 2 dargestellte Objektebene 34 sich lediglich auf eine Abtastebene der Probe bezieht. Selbstverständlich ist es möglich, mehrere Ebenen der Probe abzutasten, indem die Laserstrahlung auf unterschiedliche Koordinaten in z-Richtung, d. h. senkrecht zur dargestellten Fläche, fokus siert wird.

Bezugszeichenliste

1

Lasermodul

2-4

Laser

5

Strahlvereiniger

6

AOTF

7

Lichtleitfaser

8

Scan-Einrichtung

9

Strahlablenkende Einrichtung

10

Lasermodul

11

AOTF

12

Fasern

13

Kollimationsoptik

14

Scanobjektiv

15

Mikroskop

16

Probe

17

Tubuslinse

18

,

20

Strahlteiler

19

Mikroskopobjektiv

21

Abbildungsoptik

22

Detektionskanäle

23

Photo-Multiplier (PMT)

24

Umlenkprisma

25

dichroitische Strahlteiler

26

Pinholes

27

Emissionsfilter

28

Auswerteeinheit

29

Ansteuereinrichtung

30

Strahlteiler

31

optoelektronischer Empfänger

32

Linienfilter

33

Neutralfilter

34

Objektfeld

35

Detail

36

,

37

Orte

38

Optische Achse des abgelenkten Mikroskopstrahlenganges

Claims

1. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie, bei dem Laser licht verschiedener Spektralbereiche in einen in minde stens zwei Koordinaten abgelenkten Mikroskopstrahlen gang eingekoppelt und zeitlich nacheinander auf Orte einer Probe gerichtet wird, wobei die Probe in minde stens einer Ebene Ort für Ort und Zeile für Zeile mit dem Laserlicht beaufschlagt und aus dem von den beauf schlagten Orten reflektierten und/oder emittierten Licht ein Bild der abgetasten Ebene generiert wird, da durch gekennzeichnet, daß die spektrale Zusammensetzung und/oder die Intensität des in den Mikroskopstrahlen gang eingekoppelt Laserlichtes verändert wird, während die Ablenkung ununterbrochen fortgesetzt wird, wodurch mindestens zwei nebeneinanderliegende Orte der Probe mit Licht unterschiedlicher Spektraleigenschaften und/oder unterschiedlicher Intensität beaufschlagt wer den.

2. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spektrale Zusammenset zung und/oder die Intensität des Laserlichtes während der Ablenkung durch zeitweise zusätzliche Einkopplung einzelner oder mehrerer Spektralanteile oder durch zeitweises Unterbrechen der Einkopplung einzelner oder mehrerer Spektralanteile verändert wird.

3. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einkopplung des Laserlichtes während der Ablenkung zeitweise unterbro chen wird.

4. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung der spektralen Zusammensetzung und/oder der Intensität des Laserlichtes während der Ablenkung auf Orte erfolgt, die in einer Zeile nebeneinanderliegen, wodurch mindestens Orte dieser Zeile mit Laserstrahlung unterschiedlicher Spektraleigenschaften und/oder unter schiedlicher Intensität beaufschlagt werden.

5. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in einer Zeile neben einanderliegenden Orte mehrfach mit dem eingekoppelten Laserlicht beaufschlagt und dabei stets dieselben Orte Laserlicht mit unterschiedlicher spektraler Zusammen setzung und/oder mit unterschiedlicher Intensität aus gesetzt werden.

6. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Spektralanteile mit den Wellenlängen λ_A1 = 633 nm, λ_A2 = 568 nm, λ_A3 = 543 nm, λ_A4 = 514 nm, λ_A5 = 488 nm und/oder λ_A6 = 458 nm im VIS-Bereich sowie mit den Wellenlängen λ_A7 = 351 nm und/oder λ_A8 = 364 nm im UV-Bereich zeitweise zu sätzlich eingekoppelt werden oder deren Einkopplung zeitweise unterbrochen wird.

7. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das von jedem einzelnen beaufschlagten Ort der Probe re flektierte und/oder emittierte Licht im Hinblick auf seine spektralen Eigenschaften und seine Intensität be wertet wird, wobei die Bewertung zeitlich synchron zur Beaufschlagung desselben Ortes und unter Berücksichti gung der spektralen Zusammensetzung und/oder der Inten sität des Laserlichtes erfolgt, mit dem dieser Ort be aufschlagt wurde.

8. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das von jedem einzelnen be aufschlagten Ort reflektierte und/oder emittierte La serlicht mit mehreren Detektionskanälen detektiert wird, wobei die einzelnen Detektionskanäle zum Empfang unterschiedlicher Spektralanteile ausgelegt sind.

9. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die spektrale Zusammensetzung und/oder die Intensität des in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelten Laserlich tes der Anregungsstrahlung eines in der Probe enthalte nen oder auf die Probe aufgebrachten Fluoreszenzfarb stoffes entspricht und die einzelnen Detektionskanäle zum Empfang der vom Fluoreszenzfarbstoff ausgehenden Emissionsstrahlung ausgelegt sind.

10. Verfahren zur konfokalen Mikroskopie nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ei ne mathematische Verknüpfung von Daten, die die spek trale Zusammensetzung und/oder die Intensität des auf einen Ort gerichteten Laserlichtes charakterisieren, von Daten der Bewertungsergebnisse des von demselben Ort reflektierten und/oder emittierten Lichtes und der diesem Ort entsprechenden Ablenkpositionen zum Zweck der Bestimmung der von ausgewählten Orten eingegrenzten Flächen und/oder Volumina und/oder zur Ermittlung von Stellsignalen für die Änderung der spektralen Zusammen setzung und/oder der Intensität des auf diesen Ort zu richtenden Laserlichtes vorgenommen wird.

11. Laser-Scan-Mikroskop zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorgenannten Ansprüche, mit einem Laser modul zur Erzeugung von Laserlicht mit verschiedenen auswählbaren Spektralanteilen, mit Single-Mode-Fasern zur Einkopplung des Laserlichtes in den Mikroskopstrah lengang, mit einer mindestens zweidimensional ablenken den Scan-Einrichtung, mit einem Mikroskopobjektiv, wel ches das Laserlicht auf eine Probe fokussiert, mit meh reren Detektoren für den Empfang verschiedener Spek tralanteile des von der Probe reflektierten und/oder emittierten Lichtes und mit einer Auswerteschaltung, die den Ausgängen der Detektoren nachgeschaltet ist, dadurch gekennzeichnet,

- daß im Lasermodul mehrere einzeln ansteuerbare Einzel- und/oder Multiwellenlängenlaser, ein akusto-optisch be einflußbarer Filter (AOTF) und/oder ein akusto optischer Modulator (AOM) vorgesehen sind,
- daß als Detektoren Photomultiplier (PMT) und zur Auf zweigung der von der Probe ausgehenden Reflexions- und/oder Emissionsstrahlung in einzelne Detektionskanä le auf ansteuerbaren Wechseleinrichtungen angeordnete und gegeneinander austauschbare Farbteiler vorgesehen sind und
- daß die Steuereingänge des Lasermodules, der Scan- Einrichtung sowie der Wechseleinrichtungen mit den Aus gängen der Auswerteschaltung verbunden sind.

12. Laser-Scan-Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet, daß ein Strahlungsanteil des in den Mikros kopstrahlengang eingekoppelten Laserlichtes auf einen optoelektronischen Empfänger gerichtet ist, dessen Aus gang mit der Auswerteschaltung in Verbindung steht.

13. Laser-Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß in der Auswerteschal tung eine mathematische Verknüpfung der Ausgangssignale des optoelektronischen Empfängers mit den Ausgangs signalen der PMT und/oder mit den Ablenksignalen für die Scan-Einrichtung vorgesehen ist.