DE19715504C2 - PMMA-Membranen mit Polyethylenglykol-gekoppelten Wirksubstanzen - Google Patents

PMMA-Membranen mit Polyethylenglykol-gekoppelten Wirksubstanzen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von PMMA- Membranen als funktionelles Antidot für Polyethylenglykol- gekoppelte Wirksubstanzen.
Die Erfindung betrifft ferner Membranvorrichtungen zur therapeutischen extrakorporalen Blutbehandlung, welche eine PMMA-Membran, an die eine physiologisch oder pharmakologisch wirksame PEG-gekoppelte Substanz gebunden ist, umfassen.
Zur Erhöhung des Molekulargewichts und damit zur Verbesse­ rung der Pharmakokinetik im Körper werden häufig physiologi­ sche Wirksubstanzen mit Polyethylenglykol gekoppelt (vgl. z. B. Thrombosis and Haemostasis, 77 (1), 168-73 (1977), Pep­ tide Research, Vol. 8, No. 2 (1995)). Derartige Substanzen finden mittlerweile eine breite therapeutische Anwendung. Bisher stehen für derartige Substanzen keine wirksamen funk­ tionellen Antidote bzw. die Wirkung neutralisierende Systeme zur Verfügung.
Zelluläre Signal-Substanzen einer gestörten Funktion werden bei schweren Erkrankungen sehr häufig in das Blut abgegeben, wodurch sich diese zellulären Signalfaktoren an jede Stelle des Körpers rasch verteilen können. Dadurch können sowohl sinnvolle, häufig aber auch pathologische Antworten des Or­ ganismus auf derartige Signale entstehen. Durch Neutralisie­ rung oder Blockierung dieser pathogenetischen Faktoren kann eine Krankheit unterbrochen werden, bzw. ein Fortschreiten aufgehalten werden, so daß körpereigenen Repairmechanismen die Gelegenheit gegeben wird, ursächlich einzugreifen.
Typische Beispiele für solche Signalstoffe sind die zellulä­ ren Boten der endothelialen und zirkulierenden Zellen des Blutes wie z. B. CD1, CD6, CD8, CD16, Tumornekrosefaktor (TNF) etc.
Auch pathogenetisch bedeutsame, induzierte Proteine wie z. B. das Lipoprotein-bindende Protein LBP sind für die Entwick­ lung von schwersten Komplikationen bei septischen Schockpa­ tienten verantwortlich.
Es wäre wichtig, derartige Substanzen über ein extrakorpora­ les therapeutisches System schonend entfernen zu können, ohne den Organismus mit weiteren Substanzen zu belasten. Weiterhin wäre die Therapie von bestimmten Erkrankungen mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern bzw. Fragmenten dieser monoklonalen Antikörper vorteilhaft. Augenblicklich ist eine derartige Therapie nur kurzfristig anwendbar, weil die im­ munkompetenten Zellen des Organismus sehr rasch humane Anti­ körper gegen diese Fremdproteine produzieren. Eine lokale Präsentation derartiger monoklonaler Antikörper in der Blut­ zirkulation kann ohne Immunreaktivität lange Zeit zur Neu­ tralisierung von Antigenen im Blut verwendet werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstel­ lung eines universellen und schnell verfügbaren Antidots für PEG-gekoppelte Wirksubstanzen. Das funktionelle Antidot soll schnell und einfach anwendbar, physiologisch verträglich und kostengünstig sein. Ferner soll ein gut dosierbares und kurzfristig anwendbares Antidot für Substanzen mit physiolo­ gischer Wirkung bereitgestellt werden. Mit diesem Antidot sollen schonend und ohne den Körper zu belasten physiolo­ gisch aktive, aber unerwünschte Substanzen aus dem Blut ent­ fernt werden. Ferner sollen pegylierte Wirksubstanzen in den Organismus eingebracht werden und nach Ablaufen einer ent­ sprechenden Reaktion schonend wieder aus dem Blut entfernt werden.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch die Verwen­ dung einer Membran aus Polymethylmethacrylat oder einem Po­ lymethylmethacrylat-Mischpolymeren zur Bindung von Polyethy­ lenglykol-gekoppelten Substanzen (PEG-Substanzen), insbeson­ dere als funktionelles Antidot für PEG-Wirksubstanzen. Diese Membranen werden bevorzugt in einem Kapillardialysator ein­ gesetzt. Ferner betrifft die Erfindung Membranvorrichtungen zur therapeutischen extrakorporalen Blutbehandlung umfassend eine Membran aus Polymethylmethacrylat oder einem Polymethyl­ methacrylat-Mischpolymeren, an die physiologisch wirksame Polyethylenglykol-gekoppelte Substanzen (PEG-Substanzen ge­ bunden sind.
Überraschenderweise wurde bei Untersuchungen zur Bindungsfä­ higkeit von Dialysatoren gefunden, daß Dialysatoren aus Po­ lymethylmethacrylat bzw. einem Polymethylmethacrylat-Misch­ polymeren in der Lage sind, sehr spezifisch und sehr fest Polyethylenglykol-gekoppelte Strukturen zu binden. Es konnte gezeigt werden, daß diese Polyethylenglykol-PMMA-Bindung die Funktionalität der pegylierten Enzyme, Proteine und anderer Reaktanten nicht beeinflußt. Dadurch stehen diese speziellen Bindungspartner dem Blut, das extern durch derartig vorbe­ handelte Dialysatoren geleitet wird, für spezielle Bin­ dungs-, Enzym- oder Einfangreaktionen zur Verfügung.
Das aufgefundene Prinzip der überraschenden Bindung von PEG- gekoppelten Wirksubstanzen an PMMA-Membranen läßt nun ver­ schiedene Anwendungsmöglichkeiten zu. Zum einen können PMMA- Membranen als funktionelles Antidot für diese Wirksubstanzen eingesetzt werden. Zum anderen können PMMA-Membranen mit PEG-gekoppelten Wirksubstanzen beschichtet werden und somit zur in-vivo-Plasmareinigung und Plasmabehandlung verwendet werden. Diese Membranen können Bestandteil eines extrakorpo­ ralen therapeutischen Systems sein. Ferner können PEG-gekop­ pelte Wirksubstanzen nach ihrer Reaktion im Organismus, be­ vorzugt im Blut, mit Hilfe einer PMMA-Membran schonend wie­ der aus dem Organismus entfernt werden. Dadurch können ins­ besondere gefährlich hohe Blutspiegel von PEG-Hirudin anta­ gonisiert werden, aber auch pegylierte Antikörper oder pegy­ lierte Proteinwirkstoffe, die für eine definierte Zeit im Blut zur Anwendung kamen, wieder quantitativ entfernt werden (zeitlimitierte Wirkstoffanwendung). Weiterhin können PMMA- Kapillardialysatoren mittels Polyethylen-gekoppeltem Hirudin lokal antikoaguliert werden (die Patienten brauchen dann kein systemisches Antikoagulans), aber auch durch Coatierung von PMMA-Kapillardialysatoren mit PEG-Antigenen oder PEG-An­ tikörpern bzw. PEG-Wirksubstanzen zur spezifischen Interak­ tion mit toxischen oder krankheitsauslösenden bzw. krank­ heitsunterhaltenden Blutbestandteilen oder Stoffwechselpro­ dukten befähigt werden.
Es können beliebige PEG-gekoppelte Wirksubstanzen eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind insbesondere Proteine, wie z. B. Enzyme, Antikörper, Antikoagulantien, Tumormarker, En­ zyminhibitoren, aber auch jede andere physiologische Wirk­ substanz, die sich mit PEG koppeln läßt.
So kann beispielsweise an PMMA-gebundenes PEG-Hirudin auf der Membran Thrombin inaktiviert werden. Mit ausreichender Spezifität und Effektivität wird von den PEG-Hirudin-coa­ tierten Oberflächen Thrombin gebunden, so daß es nicht mehr für Gerinnungsaktivierungs-Mechanismen zur Verfügung steht. Dies läßt sich beispielsweise über eine nicht mehr stattfin­ dende Spaltungsreaktion von angebotenem, natürlichem Throm­ binsubstrat, dem Fibrinogen, nachweisen. Ebenso lassen sich auch synthetische Thrombininhibitoren auf PMMA binden.
Eine weitere spezielle Anwendung ist beispielsweise die Ver­ wendung pegylierter monoklonaler Antikörper gegen den Tumor­ nekrosefaktor (TNF). Der monoklonale Antikörper gegen den Tumornekrosefaktor (MAK-195) ist ein Versuchspräparat der Firma Knoll und wird augenblicklich in klinischen Studien bei Schockpatienten auf seine klinische Effizienz hin evalu­ iert. Dieser monoklonale Antikörper läßt sich problemlos mit PEG koppeln und auf eine entsprechende PMMA-Membran aufbrin­ gen. Dadurch ist der monoklonale Antikörper festphasengebun­ den und bindet hochspezifisch an ein Epitop des Tumornekro­ sefaktors. So können hohe und pathophysiologisch für den weiteren Verlauf einer Schockreaktion schädliche TNF-Spiegel gesenkt werden. In entsprechender Weise lassen sich monoklo­ nale bzw. polyklonale Antikörper gegen Lipopolysaccharid­ bindendes Protein (LBP) koppeln. Dieses Protein dient dem Transport bakterieller Stoffwechselprodukte der Lipopolysac­ charide (Endotoxine, Lipid A) im Blut und ihrer Präsentation an die Zellen. Wird der Spiegel des Lipopolysaccharid-bin­ denden Proteins gesenkt, kann dadurch die Aufnahme von Endo­ toxinen aus dem Magen-Darm-Kanal, aber auch aus septischen Herden vollständig blockiert werden.
Weiterhin können beispielsweise pegylierte Enzyme auf die Membranen aufgebracht werden, und damit lassen sich dann pa­ thogene Strukturen, z. B. von Cholesterin und hochmolekularen Lipoproteinen und anderen pathogenetisch bedeutsamen Blutbe­ standteilen, in inaktive Metabolite gezielt spalten.
Ferner ist es beispielsweise auch möglich, spezifische hu­ mane γ-Globulinfraktionen zu pegylieren und auf die PMMA- Membran zu coatieren, um Bakterien bzw. Viren direkt zu hem­ men und über das temporäre extrakorporale therapeutische Sy­ stem aus dem Organismus zu entfernen.
Ferner können auch Inhibitoren für aktivierte Gerinnungsfak­ toren, z. B. der rekombinante TFPI, ein natürlicher Inhibitor des Faktor VII-Tissuefaktor-Komplexes, des wichtigsten Startmechanismus der Blutgerinnung, eingesetzt werden. Diese können in entsprechend pegylierter Form auf der Membran ge­ bunden werden, um damit die Blutgerinnung in den ersten Ak­ tivierungsmechanismen vollständig zu hemmen, ohne dabei das normale Gerinnungspotential des Organismus zu beeinflussen. Prinzipiell läßt sich jede pathologische Größe des Organis­ mus, die zu ihrer Signalübertragung den Blutweg benützt, durch ein derartiges extrakorporales therapeutisches System modifizieren.
Die Bindungsfähigkeit derartiger oberflächendotierter Kapil­ lardialysatoren ist erstaunlich groß; es können bis zu 1 g pegylierte Strukturen auf 1 m2 Oberfläche gebunden werden. Mit Hilfe von Auswaschversuchen konnte zweifelsfrei belegt werden, daß die physikochemisch erklärbare Verbindung zwi­ schen dem pegylierten Protein und der PMMA-Membran sehr sta­ bil ist und ein Ablösen von der Membran sowohl durch Koch­ salzspülung als auch bei Spülen mit Plasma bzw. mit Vollblut nicht möglich ist.
Aus der molekularen Immunologie ist eine Reihe spezifischer Tumorantigene an Zelloberflächen von Tumorzellen bekannt, für die zu diagnostischen Zwecken auch entsprechende Anti­ körper für in-vitro-Untersuchungen zur Verfügung stehen. De­ ren Fremdeiweißstrukturen verbieten jedoch eine Anwendung beim Patienten. Erfindungsgemäß können nun diese Antikörper, an PEG-Linker an der Oberfläche einer PMMA-Membran gebunden, eine spezifische Interaktion mit Tumorzellen des Blutes ein­ gehen und diese ähnlich der Hämofiltration spezifisch aus der Zirkulation entfernen. Damit wird erstmalig eine Anord­ nung bereitgestellt, in der mit vorhandenem Oberflächenmate­ rial, das bioverträglich und zugelassen ist, eine spezifi­ sche Interaktion im Blut zwischen Zellen bzw. Zellanteilen des Organismus und festphasengebundenen spezifischen Gegen­ spielern möglich ist.
Dieses Prinzip läßt sich auf viele weitere therapeutische Anwendungen, insbesondere auf die in-vivo-Plasmareinigung, anwenden. Beispielsweise können Ultrafiltrationsmembranen vom Typ PMMA, auf denen spezielle PEG-gekoppelte Enzyme an­ gebracht sind, zur Entgiftung bei nierenkranken Patienten eingesetzt werden. Ferner können durch Aufbringen von PEG- gekoppelter Urease auf PMMA-Membranen erhöhte Harnstoffwerte im Blut abgebaut werden oder durch Aufbringen PEG-gekoppel­ ter Kreatinin metabolisierender Enzyme eine Senkung weiterer harnpflichtiger Stickstoffprodukte veranlaßt werden.
Es können alle Membranen aus Polymethylmethacrylat oder einem Polymethylmethacrylat-Mischpolymeren eingesetzt wer­ den, die biologisch verträglich sind. Es können Mischungen aus beliebigen Anteilen Polymethylmethacrylat und einem oder mehreren weiteren Polymerkomponenten angewendet werden, bei­ spielsweise mit Polyacrylnitril, Polycarbonat oder Polysul­ fon. Beispiele für Mischungen sind Polymethylmethacrylat + Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat + Polyacrylnitril + Methacrylat, Polymethylmethacrylat + Polyacrylnitril + Meth­ allylsulfonat, Polymethylmethacrylat + Polyethylenpolyvinyl­ alkohol, Polymethylmethacrylat + Polyamid, Polymethylmeth­ acrylat + Polysulfon. Bevorzugt beträgt der Anteil an Poly­ methylmethacrylat in den Mischpolymeren mindestens 20%. Diese Mischpolymeren können nach auf dem Fachgebiet bekann­ ten Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt wird bei dem er­ findungsgemäßen Verfahren eine Polymethylmethacrylatmembran verwendet.
Die benutzten PMMA-Membranen werden in Kapillardialysatoren verwendet. Der alleinige Hersteller von PMMA-Kapillardialy­ satoren ist die Firma Toray, Japan. Vor ihrer Anwendung am Menschen werden die Kapillardialysatormodule sowohl auf der Dialysatseite als auch auf der Blutseite intensiv gespült, auf der Blutseite mit physiologischer Kochsalzlösung, auf der Dialysatseite mit Dialysatflüssigkeit (Salzlösung), um toxische Produkte und Substanzen, die während des Produk­ tionsprozesses mit dem System in Kontakt gekommen sind, aus dem Kapillardialysator herauszuspülen. Am Ende dieses konti­ nuierlichen Spülvorgangs, bei dem die Spülflüssigkeit auf beiden Seiten verworfen wird, wird für die Vorbereitung des externen therapeutischen Systems die Dialysatseite durch Blindstopfen verschlossen; auf der Blutseite wird eine Re­ zirkulation angeschaltet, wobei in der Vorlage von etwa 200 ml die pegylierte Auftragungssubstanz gelöst ist. Durch einen einfachen Rezyklisierungsvorgang, bei dem an dem Aus­ gang des Dialysators über eine Rollerpumpe die Lösung in das Lösungsreservoir zurückgepumpt wird, wird die Membran inner­ halb von 5-10 min mit der pegylierten Substanz coatiert. Die PMMA-Membranen nehmen unabhängig von ihrem Cutoff (Maßzahl für die Größe der Poren in der Membran) bis zu 200 mg der aufzutragenden Substanz (= 1 g der pegylierten Wirksubstanz) pro m2 Kapillaroberfläche auf. Es ist wichtig, daß die ent­ sprechenden Bindungsstellen auf der PMMA-Membran vollständig von den pegylierten Wirksubstanzen besetzt sind. Falls nur geringere Mengen dieser Wirksubstanzen aufgebracht werden, sollte man am Ende des Spülprozesses eine Nachspülung mit PEG-Kochsalzlösung nachlaufen lassen, um alle PEG-Bindungs­ stellen der Membran abzusättigen. Dadurch ist gewährleistet, daß eine zusätzliche Coatierung mit Plasmaproteinen des Blu­ tes an den Bindungsstellen nicht mehr auftritt und damit keine Interaktion zwischen Plasmaproteinen und den präsen­ tierten Wirksubstanzen zustandekommt (Priming).
Die Kopplung von Polyethylenglykol an Wirksubstanzen erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise gemäß Miron, T. und Wilchek, M.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569 u. a. Das Prinzip der Kopplung von Polyethylenglykol-mono­ aliphatischen Ketten mit Proteinen ist derart, daß die Pro­ teine sowohl basische als auch saure Aminosäurereste in gro­ ßer Zahl an der Oberfläche präsentieren (aliphatische Pro­ teine). Die Kopplung wird dann durch eine Kondensationsreak­ tion vollzogen, indem Amino-PEG-Ketten oder Hydroxy-PEG-Ket­ ten geeigneter Kettenlänge durch eine chemische Kondensa­ tionsreaktion an die Proteine gebunden werden.
Obwohl das molekulare Prinzip der Bindung von Polyethylen­ glykol auf der Polymethylmethacrylatmembran bisher noch nicht untersucht ist, wird folgender hypothetischer Bin­ dungsmechanismus vorgeschlagen, der jedoch die Erfindung in keiner Weise beschränken soll. Der ketonisch gebundene Sau­ erstoff an den PMMA-Ketten ist aufgrund der Ladungsvertei­ lung in den Methylknoten der Kohlenwasserstoffkettenstruktu­ ren stark negativ geladen. Dieser Sauerstoff kann also ent­ sprechende elektrostatische Interaktionen mit der Polyethy­ lenglykolkette herstellen. Die Interaktionen sind derge­ stalt, daß der Sauerstoff des Polyethylenglykols durch die C-C-Konfiguration leicht elektronenpositiv geladen ist. Es kommt mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer Interaktion zwischen diesen beiden unterschiedlich geladenen Sauerstoff­ spezies im PMMA und PEG, so daß die PEG-Kette über eine ge­ wisse Strecke von mehreren C-C-O-C-C-O-Kettengliedern an die PMMA-Oberfläche gebunden wird. Derselbe Bindungsmechanismus an diesem negativ geladenen ketonischen Sauerstoff des PMMA ist für die basale, geringe Proteinbindung dieser Membran ebenfalls verantwortlich.
Das erfindungsgemäß aufgefundene Prinzip der Bindung von PEG-gekoppelten Substanzen an PMMA-Membranen bzw. Membranen aus PMMA-Mischpolymeren kann nun zur Herstellung von Kapil­ lardialysatoren genutzt werden. Dadurch lassen sich PEG-ge­ koppelte Strukturen, die für eine limitierte Zeit zur Thera­ pie beim Menschen eingesetzt werden, quantitativ aus dem Or­ ganismus entfernen. Es ist möglich, daß man für eine gewisse Zeit großmolekulare, mit PEG-Ketten versehene Wirkstoffe in den Organismus instilliert und, nachdem dort eine in-vivo- Reaktion mit Antigenen, Antikörpern etc. stattgefunden hat, diese dann über diesen erfindungsgemäßen Bindungsmechanismus aus dem Organismus durch eine Behandlung in einem extrakor­ poralen therapeutischen System, welches eine entsprechende Membran enthält, entfernt. Ebenso können mit einem großen PEG-Molekül versehene monoklonale Antikörper einem Organis­ mus zugesetzt werden und dann mit Hilfe eines entsprechenden Dialysators wieder aus dem Organismus entfernt werden.
Die Erfindung wird nun anhand von Polyethylenglykol-gekop­ peltem Hirudin näher erläutert.
Hirudin stellt in der rekombinanten, naturidentischen Form ein hochspezifisches und effektives antithrombotisches Prin­ zip dar, welches in den nächsten Jahren für die suffiziente Therapie thromboembolischer Erkrankungen und deren Folgezu­ stände zunehmendes Interesse gewinnen wird.
Erste klinische Untersuchungen bis hin zu großen Phase III- Studien haben die Effektivität dieser neuartigen, therapeu­ tisch wertvollen Substanz bewiesen.
Rekombinantes Hirudin kann natürlich auch zu Intoxikationen führen, entweder durch die Art des durchgeführten Therapie­ schemas, durch Überdosierung oder durch objektive Elimina­ tionsschwierigkeiten, die durch plötzliche oder passagere Niereninsuffizienzen gegeben sind.
Für die Entfernung von Hirudin aus dem Organismus stehen augenblicklich in der klinischen Medizin zwei Wege offen, nämlich die Applikation eines Antidots (vgl. die deutschen Patentschriften P 42 03 965.7 und 196 25 642.9), sowie die rasche Entfernung des Hirudins mittels High-Flux-Dialysemem­ branen.
In der Klinik hat sich vor allem ein großmolekulares Derivat des Hirudins für die praktische Anwendung als geeignet er­ wiesen. Es handelt sich um ein Hirudin, bei dem das Moleku­ largewicht durch zwei 5000-D-Polyethylenglykol-Ketten ver­ größert ist. Dadurch ist eine bis zu 4-5 mal größere Stoff­ menge im Organismus und eine noch stärkere verlängerte Plas­ maverweilzeit des Hirudins gegeben.
Die Möglichkeiten, dieses PEG-Hirudin bei Überdosierungen oder toxischen Blutspiegeln zu antagonisieren, stellt sich als schwierig heraus. Zwar ist für das PEG-Hirudin ebenfalls das universelle Antidotprinzip gegen Hirudine und gegen syn­ thetische Thrombin-Inhibitoren wie oben beschrieben verwend­ bar, aber eine generelle Dialysierbarkeit von PEG-Hirudin ist nicht gegeben. Selbst Hämofiltrationssysteme mit extrem großem Cutoff werden von PEG-Hirudin nicht passiert. Dement­ sprechend ist bisher eine schnell verfügbare funktionelle Antidotformulierung nicht möglich.
Beim Vergleich zwischen rekombinantem Hirudin und PEG-mole­ kulargewichtsvergrößertem Hirudin bei entsprechenden in- vitro-, aber auch in-vivo-Zirkulationen durch PMMA-Membranen wurde ein gänzlich unterschiedliches Verhalten festgestellt. Während natives oder rekombinantes Hirudin sehr rasch von der Blutseite in die Dialysatseite übertritt und aus der Zirkulation verschwindet, verhält sich PEG-Hirudin gänzlich anders. Es wurde nachgewiesen, daß bei einem Kapillardialy­ sator-Rezirkulationsmodell nach kurzer Zeit sowohl auf der Blut- als auch auf der Dialysatseite kein PEG-Hirudin in freier Form mehr vorkommt, obwohl relativ hohe Mengen von PEG-Hirudin auf der Blutseite entweder in antikoaguliertes Rinderblut oder auch in Eiweißkochsalzlösung appliziert wur­ den. Damit wurde nachgewiesen, daß in diesem Rezirkulations­ modell PEG-Hirudin mit hoher Geschwindigkeit aus Vollblut, Plasma oder albuminischer Rezirkulationslösung auf der PMMA- Membranoberfläche fest gebunden wird. Ein Versuch, nach Ent­ fernung der untersuchten Zirkulationslösung mit Hilfe von Kochsalzlösungen ein Ausbluten bzw. Auswaschen des PEG-Hiru­ dins von der Membran zu erreichen, war nicht möglich; die Bindung erwies sich durchaus als stabil und fest.
Aus diesen Untersuchungen ergibt sich eindeutig, daß damit ein funktionelles Antidotprinzip für PEG-Hirudin möglich ist. Derartige Dialysatoren können auf verschiedene Weise genutzt werden:
Man kann beispielsweise einen PMMA-Dialysator an eine nor­ male Dialyse-Einheit anschließen und als funktionelles Anti­ dotprinzip für PEG-Hirudin bei entsprechenden klinischen Einsätzen verwenden, oder man kann auch mit einfachen Hämo­ filtrationspumpsystemen, wie sie in der Intensivmedizin zur kontinuierlichen Hämoperfusion angewendet werden (siehe Bei­ spiel), die PMMA-Dialysatoren betreiben, so daß eine relativ problemlose, gering volumenbelastende Dialyse des betroffe­ nen Patienten vorgenommen werden kann. Die benötigte Hämo­ filtrationszeit selbst für hohe Konzentrationen von PEG- Hirudin im Blut wäre in diesen Fällen mit weniger als 2 h, vorzugsweise 30-45 min. anzugeben.
Zur extrakorporalen Therapie des Blutes mit Hilfe der effek­ tiven Dialyse harnpflichtiger Stoffwechselprodukte werden möglichst gut biokompatible Membranmaterialien entwickelt, die über eine lange Zeit konstante Filterleistungen haben. Polymethylmethacrylat (PMMA) bietet eine exzellente Clea­ rance von mittleren Molekülen und Ultrafiltrationsleistun­ gen, die durch den Transmembrandruck exakt kontrolliert wer­ den können.
Polymethylmethacrylat ist ein Polymerprodukt, das zu symme­ trischen Hohlmembranen versponnen wird. PMMA ist leicht kat­ ionisch geladen, mit der Eigenschaft, daß eine Reihe von Proteinen des Blutes mit der Membranoberfläche in Wechsel­ wirkung treten.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Bei­ spiele näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung von PEG-modifiziertem Hirudin-Ziegenantikörpern 1) Präparation von SC-PEG
Methode nach Talia Miron und Meir Wilchek (Lit.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569)
Materialien
Aceton: wasserfrei
Diethylether wasserfrei
1,4-Dioxan wasserfrei
Molekularsieb 4A, Perlen 8-12 mesh
Phosphat-Puffer 0,05 mol/1; pH 7,0
Polyethylenglykol 6000 MG 5000-7000; 1 mmol
N,N'-Disuccinimidylcarbonat 5 mmol
4-(Dimethylamino)pyridin 5 mmol
Ausführung
In 25 ml wasserfreiem Dioxan (über Molekularsieb) werden 1 mmol PEG im heißen Wasserbad gelöst. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird das N,N'-Disuccinimidylcarbonat, gelöst in 10 ml Aceton, zugegeben. Anschließend läßt man langsam die 10 ml Aceton mit 5 mmol 4-(Dimethylamino)pyridin unter Rühren zufließen. Bei Raumtemperatur wird die Mischung 6 Stunden aktiviert (Magnetrührwerk). Das aktivierte PEG wird aus dieser Lösung direkt mit Diethylether gefällt. Durch eine G3-Fritte wird der voluminöse weiße Niederschlag abge­ saugt. Die völlige Entfernung des Ethers erfolgt im evaku­ ierten Exsiccator. Aufbewahrung: trocken bei 4°C. Effizienz: 85% (bezogen auf PEG)
2) Kopplung von SC-PEG mit Protein a) Präparation von PEG-modifiziertem Hirudin Materialien
Borat-Puffer pH 9,5
Phosphat-Puffer pH 7,0; 0,05 mol/l
Hirudin; rekombinant
SC-PEG
Ausführung
150 mg PEG und 27 mg Hirudin wurden zusammen in 25 ml Borat- Puffer gelöst und 3 Stunden bei 4°C unter Rühren inkubiert. Ungebundenes PEG und Hirudin werden durch Ultrafiltration (AMICON; Membran YM 10) mit dem 6- bis 10-fachen Volumen Phosphat-Puffer entfernt. Das Retentat wird lyophilisiert und im Exsiccator bei 4°C aufbewahrt. Die einzelnen Präpara­ tionsschritte wurden durch SDS-PAGE, Gerinnungsteste (ECT), PEG-Bestimmung und Tierversuch belegt.
b) Präparation von PEG-modifiziertem Hirudin-ZAK Materialien
Phosphat-Puffer pH 7,0; 0,05 mol/l
SC-PEG
Hirudin-Ziegenantikörper (Hi-ZAK)
Ausführung
500 mg PEG werden in 20 ml Hi-ZAK (in Phosphat-Puffer vor­ liegend) gelöst und 48 Stunden bei 4°C unter Rühren inku­ biert. Ungebundenes PEG und Hi-ZAK werden durch Ultrafiltra­ tion (AMICON; Membran YM 10) mit dem 6- bis 10-fachen Volu­ men Phosphat-Puffer entfernt. Die Aufbewahrung des Präparats erfolgte als Lösung bei 4°C.
Diese PEG-modifizierten Hirudin-Ziegenantikörper können auf eine PMMA-Membran aufgebracht werden, und damit lassen sich bei Verwendung in einem extrakorporalen therapeutischen System schonend hohe Hirudinspiegel im Blut senken.
Beispiel 2 "Dialyse" von PEG-Hirudin
In dem folgenden Versuchsbeispiel soll die Effizienz der Entfernung von PEG-Hirudin aus dem Blut dargestellt werden. Zu diesem Zweck wird 250 bzw. 300 ml Rindervollblut mit 36 µg/ml PEG-Hirudin antikoaguliert und in entsprechend auf­ bereitete und für die Anwendung zur Verfügung stehende PMMA- Dialyse-Rezirkulationssysteme eingebracht. Zu diesem Rezir­ kulationsmodell wird folgender Versuchsaufbau benutzt:
Eine Hämodialyse-Einheit vom Typ Fresenius A2008C wird zur Vorspülung der Blut- und Dialysatseite der Dialysatoren be­ nutzt. Die PMMA-Dialysatoren werden nach der Vorschrift des Herstellers für die Dialyse vorbereitet. Am Ende der Vorspü­ lung der PMMA-Dialysemembran wird der Zu- und Abfluß der Dialysatseite mit Schlauchklemmen total verschlossen, so daß kein Wechsel der Dialysatflüssigkeit während des Versuchs vorgenommen werden kann. Die an der Dialyse-Einheit vorhan­ dene Schlauchpumpe wird mit einem Vorratsgefäß und mit der arteriovenösen Seite verbunden. In das silikonisierte Glas- Vorratsgefäß wird das abgenommene und PEG-Hirudin-antikoagu­ lierte Rinderblut eingefüllt und unmittelbar danach mit der Rezirkulation der Blutseite begonnen. In kurzen Abständen werden Proben aus dem Blutreservoir entnommen und mit Hilfe der Ecarin-Gerinnungszeit (vgl. deutsche Patentanmeldung P 42 03 965.7) die Hirudinkonzentration im Rezirkulations­ system gemessen. Wie aus Fig. 1 hervorgeht, kommt es mit dem Beginn der Zirkulation der PMMA-Membran zu einem raschen Abfall der Hirudinkonzentration im Blut, innerhalb der er­ sten 40 Minuten.
Die Fig. 2 zeigt die Oberflächenbindung von PEG-NAPAP (NAPAP = β-Naphthylsulfonyl-Gly-D,L-4-amidinophenylalanin­ piperidin). Die Fig. 3 zeigt die Thrombinbindung an NAPAPPEG10000-beladenen PMMA-Membran-Dialysator.
Aus den hier dargestellten PEG-Hirudinkonzentrationen auf der Blut- und Dialysatseite ist erkennbar, daß auf beiden Seiten des Rezirkulationssystems kein meßbares PEG-Hirudin mehr vorhanden ist.
Zu Vergleichszwecken ist das Verhalten von rekombinantem Hirudin bei Verwendung von PMMA-Dialysatoren dargestellt. Es wurde mit 30-50 µg/ml r-Hirudin antikoaguliertes Rinderblut verwendet. Aus der Abbildung ist ersichtlich, daß es eben­ falls zu einer Verminderung der Hirudinkonzentration auf der Blutseite kommt, die aber sehr rasch in einen steady-state hinübergeht. Bei der Untersuchung nach der zweistündigen Hä­ modialyse sind im Dialysatraum entsprechend hohe Konzentra­ tionen von r-Hirudin wie auf der Blutseite vorhanden, d. h. es kommt zu einem typischen totalen r-Hirudin-Konzentra­ tionsausgleich auf beiden Seiten. Eine adsorptive Bindung (Verlust von r-Hirudin) ist vernachlässigbar klein. Aus den hier vorgestellten Untersuchungen geht eindeutig hervor, daß PEG-Hirudin mit hoher Spezifität an PMMA-Kapillardialysato­ ren gebunden wird. Der direkte Vergleich mit dem ungebunde­ nen r-Hirudin läßt zweifelsfrei den Schluß zu, daß der PEG- Anteil des Hirudins für die Kopplung an der PMMA-Oberfläche verantwortlich ist.
Beispiel 3 Herstellung und Verwendung eines Polyethylenglykol (20000)- gekoppelten monoklonalen Antikörpers gegen Tumornekrosefak­ tor (MAK 195)
100 mg MAK 195 werden in 50 ml 0,1-Mol Boratpuffer (pH 8) gelöst und mit 200 mg Methoxypolyethylenglykol (20000)-4-Ni­ trophenylcarbonat versetzt und für 3 h bei 25°C inkubiert. Die Kopplungsreaktion wird mit einem 500fachen molaren Über­ schuß an TRIS gestoppt, gegen 20 mMol TRIS-HCl dialysiert und auf einer HP-Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) mit einem li­ nearen NaCl-Gradienten (von 0-400 mMol NaCl) in 20 mMol TRIS-HCl (pH 8) aufgetragen. Das PEG-MAK 195-Konjugat elu­ iert etwa bei 200-250 mMol NaCl. Die Bindungsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers wird an einem rekombinanten humanen TNF mit Hilfe eines TNF-ELISA's getestet. Ein Wirkungsver­ lust des monoklonalen Antikörpers kann nicht festgestellt werden. Der pegylierte monoklonale Antikörper gegen TNF wird auf ein experimentelles PMMA-Kapillardialysatormodul mit 50 cm2 Oberfläche aufgebracht. Die Bindungsfähigkeit betrug für 50 cm2 Oberfläche 4 mg, bezogen auf den Proteingehalt des PEG-MAK 195. In Humanplasma, welches mit TNF (100 mg/ml) gespikt wurde, ließ sich bereits nach 10 min in der Rezirku­ lationsflüssigkeit kein Tumornekrosefaktor mehr im Dialysa­ toreluat feststellen.
Eine weitere Versuchsserie wurde durchgeführt, indem 50 ml Humanblut PEG-MAK 195 in einer Konzentration von 1 mg pro ml zugegeben wurde. Diese PEG-MAK-Blutmenge wurde mittels Re­ zirkulation einem experimentellen PMMA-Kapillardialysator von 50 cm2 Oberfläche zugeführt und mittels einer Schlauch­ pumpe rezyklisiert. Nach 30 min Perfusion war im vorgelegten Blut kein MAK-Antikörper mehr nachweisbar. Der Nachweis wur­ de mit Hilfe eines TNF-inhibitorischen Assays auf der Meßba­ sis eines TNF-ELISA's durchgeführt. Aus diesen beiden Versu­ chen kann zweifelsfrei nachgewiesen werden, daß sich pegy­ lierter monoklonaler Antikörper, hier der TNF-Antikörper MAK 195 (Knoll), spezifisch auf der PMMA-Kapillardialysatormem­ bran coatieren läßt. Er ist dort in der Lage, Human-TNFα quantitativ zu binden. Im zweiten Versuch wurde nachgewie­ sen, daß ein im Blut vorhandener pegylierter monoklonaler Antikörper von der PMMA-Membran spezifisch aus der Zirkula­ tion entfernt wird. Dieser Versuch beweist das "Fischen" eines für eine begrenzte Zeit im Blut zur Anwendung gekomme­ nen pegylierten Wirkstoffs.
Beispiel 4 Verwendung eines PEG-gekoppelten Enzyms
Als Modellenzym wird die Urease (EC 3.5.1.5., zu beziehen von Sigma, Best.-Nr. U 1500) verwendet. Herstellung eines PEG-gekoppelten Ureasepräparats: 100 mg Urease (Typ III, spezifische Aktivität 20.000 bis 30.000 U/g) werden in 80 ml 0,1-Mol Boratpuffer (pH 8) gelöst und mit 250 mg Methoxy­ polyethylenglykol (25.000)-4-Nitrophenylcarbonat versetzt und für 24 h bei 5°C inkubiert. Die Reaktion wird mit einem mehrfach höheren molaren Überschuß an TRIS gestoppt, gegen TRIS-HCl (pH 8) dialysiert und in einer HP-Q-Sepharose-Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (pH 8) entwickelt. Das PEG-Urease-Konjugat eluiert bei 180 bis 200 mMol NaCl. Die Ausbeute des PEG-Urease-Konjugats liegt bei 30-40%. Die Enzymaktivität wird mit einem Harnstoff-Assay gemessen. Die Spaltungsaktivität wird mittels pH-Titration messend ver­ folgt und mit nicht konjugierter Urease verglichen. Die Pe­ gylierung der Urease hat einen leichten aktivitätserhöhenden Einfluß auf die harnstoffspaltende Aktivität des Enzyms. Die mit 25 kD-Polyethylenglykol gekoppelte Urease wird in einer Konzentration von 2 mg (bezogen auf den Proteingehalt des Konjugats) auf einen miniaturisierten experimentellen Kapil­ lardialysator mit 50 cm2 Oberfläche aufgetragen. Bereits nach der ersten Zirkulation sind mehr als 90% der Urease oberflächenfixiert. Bis zum fünften Rezirkulationszyklus ist die PEG-Urease fest auf der Oberfläche der Membran instal­ liert. Eine Auswaschung mittels halbstündiger Spülung mit einer Albumin-Kochsalzlösung ergab keinen Aktivitätsverlust bzw. Auftreten von freier Ureaseaktivität in der Spülflüs­ sigkeit. Auf das Urease-dotierte PMMA-Kapillardialysator- System wird eine Blutplasmalösung (50 ml enthaltend 30 mg Harnstoff) aufgetragen. Im Eluat der experimentellen PEG- Urease-PMMA-Membran werden nach 5, 10, 20 und 30 min die verbliebenen Harnstoffmengen mittels eines Enzymassays nach­ gewiesen. Es kann gezeigt werden, daß sehr rasch innerhalb der ersten 10 min die Harnstoffkonzentration im Blutplasma abfällt. Nach 30 min ist freier Harnstoff nicht mehr nach­ weisbar. Die Ammoniakprobe im Blut ist während der letzten 25 min des Versuchs positiv. Aus den Untersuchungen kann zweifelsfrei geschlossen werden, daß ein pegyliertes Enzym, auf die PMMA-Membran gebunden, eine lokale Enzymaktivität entfaltet und entsprechende spezifische Interaktionen mit seinem Substrat im zirkulierenden Blut erzeugen kann.

Claims (10)

1. Verwendung einer Membran aus Polymethylmethacrylat oder einem Polymethylmethacrylat-Mischpolymeren zur Bindung von Polyethylenglykol-gekoppelten Substanzen (PEG-Substanzen).
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Membran der funktionellen Anti­ dotierung einer PEG-gekoppelten Wirksubstanz dient.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die PEG-gekoppelte Wirkstubstanz ein PEG-gekoppeltes Protein ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das PEG-gekoppelte Protein ein Enzym, ein Antikörper, ein Antikoagulans oder ein Tumormarker ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Antikoagulans Hirudin ist.
6. Verwendung einer Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem Kapillardialysator.
7. Membranvorrichtung zur therapeutischen extrakorporalen Blutbehandlung, umfassend eine Membran aus Polymethylmeth­ acrylat oder einem Polymethylmethacrylat-Mischpolymeren, da­ durch gekennzeichnet, dass an die Membran eine physiologisch wirksame Polyethylenglykol-gekoppelte Substanz (PEG-Substanz) gebunden ist.
8. Membranvorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die physiologisch wirksame Substanz ein Protein ist.
9. Membranvorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, dass das Protein ein Enzym, ein Antikörper, ein Antikoagulans oder ein Tumormarker ist.
10. Membranvorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, dass das Antikoagulans Hirudin ist.
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