DE10350243A1 - Exposure for an in situ microscope by induced emission with reduced diffraction patterns - Google Patents
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Abstract
Ein In situ-Mikroskop zur Videomikroskopie bewegter Partikeldispersionen wird beschrieben, das mit Hilfe der induzierten Emission eines Lasers oder einer Superlumineszenzdiode (SLD) belichtet wird. DOLLAR A Durch die Kohärenz induzierten Lichtes entstehen störende Interferenzartefakte (Beugung, Speckles) im Mikroskopbild, die erfindungsgemäß durch eine Maßnahme zur Kohärenzverminderung reduziert werden. Die Abschwächung der Interferenzkontraste wird dadurch bewirkt, daß das Licht eine oder mehrere Multimode-Lichtfasern durchläuft. Divergierende Lichtwege innerhalb einer Multimodefaser und Inhomogenitäten ihres Brechungsindexes bewirken ein Auseinanderlaufen und eine Neudurchmischung der relativen Wellenphasen. Die Kohärenz des Lichtes schwächt sich daher beim Durchlauf der Multimodefaser proportional zu ihrer Länge ab, und die störenden Beugungsartefakte im Bild des In situ-Mikroskops werden vernachlässigbar.An in situ microscope for video microscopy of moving particle dispersions is described, which is exposed using the induced emission of a laser or a superluminescent diode (SLD). DOLLAR A by the coherence induced light arise interfering interference artefacts (diffraction, speckles) in the microscope image, which are inventively reduced by a measure to reduce the coherence. The attenuation of the interference contrasts is effected by the light passing through one or more multimode optical fibers. Diverging light paths within a multimode fiber and inhomogeneities in their refractive index cause divergence and re-mixing of the relative wave phases. The coherence of the light therefore weakens as the multimode fiber passes in proportion to its length, and the interfering diffraction artifacts in the image of the in situ microscope become negligible.
Description
In vielen technischen und industriellen Prozesse muß man disperse Verteilungen mikroskopischer Partikel meßtechnisch erfassen. Beispielsweise gerührte Zell-Suspensionen in Bioreaktoren, Kristall-Suspensionen, Emulsionen, und Aerosole sind hinsichtlich der Größe und Konzentration ihrer Partikel zu kontrollieren.In Many technical and industrial processes require disperse distributions microscopic particle by measurement to capture. For example, stirred Cell suspensions in bioreactors, crystal suspensions, emulsions, and aerosols are in terms of size and concentration to control their particles.
Eine bekannte Technik zur Bestimmung bewegter disperser Partikel ist die in Situ Mikroskopie (synonym mit in situ microscopy oder inline-mycroscopy oder in process mycroscopy).A known technique for the determination of moving disperse particles in situ microscopy (synonymous with in situ microscopy or inline mycscopy or in process mycroscopy).
Dies
Verfahren wird unter der Bezeichnung „In situ Mikroskopsonde" dargestellt in der
Patentschrift
- – In Situ Microscopy for Online Characterization of Cell-Populations in Bioreactors, Including Cell- Concentration Measurements by Depth from Focus von Hajo Suhr et al in der Zeitschrift „Biotechnology & Bioengineering" (Jahrgang 1995, Band 47, Seiten 106 – 116)
- – Inline Characterisation of Cell-Concentration and Cell-Volume in Agitated Bioreactors using In Situ Microscopy. Application to Volume Variation induced by Osmotic Stress von Veronique Camisard et al in der Zeitschrift „Biotechnology & Bioengineering" Jahrgang 2002 Band 78, Seiten 73–80
- – in Situ Mikroskopie von Hajo Suhr et al in der Zeitschrift „BIOforum" ( Heft 21 (1998), Seiten 595–600).
- - In Situ Microscopy for Online Characterization of Cell Populations in Bioreactors, Including Cell Concentration Measurements by Depth from Focus by Hajo Suhr et al in the journal "Biotechnology &Bioengineering" (born 1995, volume 47, pages 106-116)
- - Inline Characterization of Cell Concentration and Cell Volume in Agitated Bioreactors using In Situ Microscopy. Application to Volume Variation induced by Osmotic Stress by Veronique Camisard et al in the journal "Biotechnology &Bioengineering" Volume 2002 Volume 78, pages 73-80
- In situ microscopy by Hajo Suhr et al in the journal "BIOforum" (Issue 21 (1998), pages 595-600).
Die für die vorliegende Erfindung relevante Version des In Situ Mikroskops besteht aus einem Videomikroskop, das durch ein Sichtfenster mit dem Objekiv direkt in die bewegte Partikel-Dispersion hineinsieht. Mit Hilfe gepulster Belichtung werden scharfe mikroskopische Bilder bewegter Partikel in einem schmalen Probevolumen erzeugt. Dieses Probevolumen bildet sich infolge des Sichtauschnitts und der begrenzten Schärfentiefe des Mikroskops von selbst als virtuelles Probevolumen direkt vor dem Sichtfenster heraus. Es ist dabei entscheidend, daß auf mechanische Begrenzungen oder Beruhigung des strömenden Mediums ganz verzichtet wird und nur die optische Schärfentiefe die begrenzte Probenzone aus der Suspension optisch herausprägt.The for the present invention relevant version of the in situ microscope from a video microscope, through a viewing window with the objekiv looks directly into the moving particle dispersion. With help pulsed exposure, sharp microscopic images become more agitated Particles generated in a narrow sample volume. This sample volume Forms as a result of the visual excision and the limited depth of field of the microscope itself as a virtual sample volume directly in front of out of the viewing window. It is crucial that on mechanical limitations or calming the streaming Medium is dispensed with and only the optical depth of field visually distinguishing the limited sample zone from the suspension.
Wegen der fehlenden mechanischen Eingrenzung des Probevolumen kommt es zur ungebremsten schnellen Bewegung der Partikel durch das Probevolumen hindurch, und das Problem einer enormen photographischen Bewegungsunschärfe tritt auf. Die Kontur eines Partikels beispielsweise, welches sich mit einer Geschwindigkeit von 0,5m/s fortbewegt, verwischt sich in einer Mikrosekunde bereits um 0,5μm, was für die hochauflösende Mikroskopie mit Sub-Mikrometer-Auflösung bereits grenzwertig wäre. Um also die Bewegungsunschärfe zu vermeiden, sind sehr kurze Belichtungszeiten von etwa einer Mikrosekunde notwendig.Because of the lack of mechanical limitation of the sample volume occurs for unrestrained rapid movement of the particles through the sample volume through, and the problem of a tremendous photographic motion blur occurs on. The contour of a particle, for example, which coincides with moving at a speed of 0.5m / s, blurs in one Microsecond already by 0.5μm, what kind of the high-resolution Microscopy with sub-micron resolution would already be borderline. So, um the motion blur to avoid very short exposure times of about one microsecond necessary.
Die hierfür notwendigen hohen Pulsintensitäten der Belichtungsblitze konnten bisher nur auf zwei Arten realisiert werden, mit jeweils spezifischen Nachteilen:
- – Erstens wurden Stickstofflaserpulse mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert. Die fundamentalen und störenden Beugungseffekte des stark kohärenten Laserlichtes wurden vermieden durch die Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie. Abgebildet werden dabei nicht die direkt und kohärent gestreuten Photonen der Original-Laserwellenlänge sondern die spontan emittierten Fluoreszenzphotonen niedriger Wellenlänge, die die Kohärenzbeziehung untereinander verloren haben. Dies Verfahren erzwingt jedoch wegen der sehr geringen Intensität des Fluoreszenzsignals den sehr nachteiligen weil aufwendigen Einsatz von Lichtverstärkern.
- – Zweitens wurden Lumineszenzdioden (LED) verwendet, die in der Suspension dicht an der Probezone positioniert werden und mit extrem hohen Strompulsen betrieben werden. Nachteilig sind hier die elektrischen Durchführungen in die Suspension zur Ansteuerung der LED, die verringerte Lebensdauer der LED durch intensive Strompulse, sowie die wegen mangelnder LED-Helligkeit gegebene Begrenzung der Meßdynamik auf typisch unter 109 Hefezellen pro Milliliter (Hefezellen mit Duchmesser von ca 3μm).
- - First, nitrogen laser pulses were combined with fluorescence microscopy. The fundamental and disturbing diffraction effects of the highly coherent laser light were avoided by the use of fluorescence microscopy. Not the direct and coherently scattered photons of the original laser wavelength but the spontaneously emitted low-wavelength fluorescence photons, which have lost their coherence relationship, are not shown. However, because of the very low intensity of the fluorescence signal, this method forces the very disadvantageous because expensive use of light amplifiers.
- Secondly, LED's were used, which are positioned in the suspension close to the sample zone and operated with extremely high current pulses. Disadvantages here are the electrical feedthroughs into the suspension for controlling the LED, the reduced lifetime of the LED due to intensive current pulses, and the limitation of the measuring dynamics due to a lack of LED brightness to typically less than 10 9 yeast cells per milliliter (yeast cells with diameters of about 3 μm). ,
Alle diese Schwierigkeiten der bisherigen In Situ Mikroskope würden entfallen, wenn der Mikroskoptubus nur eine dünne Lichtfaser von ca 0,5mm Durchmesser zur Belichtung aufnehmen müsste. An geeigneter Stelle außerhalb des beobachteten Prozesses müßte dann ein intensiver Lichtblitz zur Bilderzeugung mit der Primärwellenlänge – also ohne Fluoreszenz – eingekoppelt werden.All these difficulties of the previous in situ microscopes would be eliminated, if the microscope tube only a thin light fiber of about 0.5mm diameter would need to record for exposure. In a suitable place outside then the observed process would have to an intense flash of light for imaging with the primary wavelength - that is, without fluorescence - coupled become.
Bereits in der oben erwähnten Europäischen Patentanmeldung 98118540.8-2217 wurde die Strahlführung durch Lichtfaser beschrieben. Diese Belichtungstechnik blieb aber im Versuchsstadium stecken, weil die Einkopplung ausreichend intensiver Pulse in die dünne Faser mit konventionellen Blitzlampen praktisch schwierig und für den Dauerbetrieb ungeeignet war.Already in the above mentioned European patent application 98118540.8-2217 the beam guidance by light fiber was described. This exposure technique remained stuck in the experimental stage, because the coupling of sufficiently intense pulses into the thin fiber with conventional flash lamps practically difficult and unsuitable for continuous operation was.
Eigentlich sind Halbleiterlaser und Superlumineszenzdioden (SLD) die natürlichen Wunschkandidaten für den Lichttransport durch eine Faser, da sie ausreichend intensiv und gut gebündelt und zudem kompakt und einfach handzuhaben sind. Gemeinsam ist aber beiden Lichtquellen, daß sie im Gegensatz zu konventionellen Lichtquellen auf induzierter statt spontaner Lichtemission beruhen, daß sie also kohärentes Licht aussenden, dessen Teilwellen in einer mehr oder weniger festen Pahsenbeziehung stehen. Diese Eigenschaft war ein Ausschlußkriterium für die direkte Bilderzeugung (ohne Fluoreszenz), denn sie führt im Mikroskop zu kontrastreichen Bildartefakten durch Interferenz von Teilstrahlen (Beugung, Speckles). Die Bilder enthalten also kontrastreiche Strukturen aufgrund von Beugungseffekten, die sich den echten Objekten überlagern und ihre Detektion extrem aufwendig oder unmöglich machen. Daher war bisher die Anwendung induzierter Lichtstrahlung von Laser oder SLD nicht geeignet zur Belichtung eines In Situ Mikroskops – trotz ihrer vorteilhaft hohen Intensität und guten Bündelung.Actually, semiconductor lasers and superlu Mining Diodes (SLD) are the natural candidates for the transport of light through a fiber, because they are sufficiently intense and well bundled and also compact and easy to handle. Common to both sources of light, however, is that, unlike conventional light sources, they are based on induced rather than spontaneous light emission, so that they emit coherent light whose partial waves are in a more or less fixed pseudo-relation. This property was an exclusion criterion for the direct image generation (without fluorescence), because it leads in the microscope to high-contrast image artifacts by interference of partial beams (diffraction, speckles). The images thus contain high-contrast structures due to diffraction effects, which are superimposed on the real objects and make their detection extremely complicated or impossible. Therefore, the application of induced light radiation from laser or SLD has hitherto not been suitable for the exposure of an in situ microscope, despite its advantageously high intensity and good bundling.
Die neue Erfindung ermöglicht nun erstmals die Wunschkombination von Lichtfaserbelichtung mit intensiver induzierter Emission durch Laser oder SLD, indem sie durch einen technischen Kunstgriff die Strahlungskohärenz schwächt und dadurch die Interferenzkontraste so stark verringert, daß sie die Bilder nicht mehr stören können.The new invention allows now for the first time the desired combination of light fiber exposure with intensive Induced emission by laser or SLD, passing through a technical artifice weakens the radiation coherence and thereby the interference contrasts reduced so much that she no longer disturb the pictures can.
Um trotz der Kohärenz induzierter Strahlung ungestörte mikroskopische Bilder zu erhalten, wird in dieser Erfindung das von der Lichtquelle abgestrahlte Licht zunächst durch eine oder mehrere Multimode-Lichtfasern geleitet. In Multimodefasern existieren je nach Einkopplungswinkel unterschiedliche Lichtwege mit unterschiedlichen Vielfachreflexionen für die eingekoppelten Teilstrahlen. Weiter gibt es Schwankungen des Brechungsindexes, die durch mechanische Spannungen oder Temperaturgradienten ausgelöst und verstärkt werden können. Alle diese Effekte führen zu unterschiedlichen Laufzeiten der Teilstrahlen in der Faser, so daß die Phasen der Teilstrahlen sich relativ zueinander verschieben und neu mischen. Die ursprünglich vorhandene Kohärenz (= konstante Phasenbeziehung) geht dadurch teilweise verloren. Eine Polymer-Lichtfaser mit etwa ein Meter Faserlänge genügt, um die Kohärenz einer SLD soweit zu schwächen, daß die verbleibende Strahlung gute Mikroskopbilder erzeugen kann.Around despite the coherence induced radiation undisturbed To obtain microscopic images is in this invention the light emitted by the light source first through one or more Multimode optical fibers passed. In multimode fibers exist ever after Einkopplungswinkel different light paths with different Multiple Reflections for the coupled partial beams. Furthermore, there are fluctuations in the refractive index, which are triggered and amplified by mechanical stresses or temperature gradients can. All these effects lead at different maturities of the partial beams in the fiber, so that the Phases of the partial beams shift relative to each other and remix. The original existing coherence (= constant phase relationship) is partially lost. A Polymer fiber with about one meter of fiber length is sufficient to ensure the coherence of a To weaken SLD so far that the remaining radiation can produce good microscope images.
Eine Lichtquelle mit besonders günstiger Ausgangsposition für die Kohärenzschwächung ist die SLD. Im Gegensatz zum Laser gibt es in der SLD keine Rückkopplung des induzierten Lichtes durch Spiegel, wodurch die Phasen des emittierten Lichtes von vorneherein stärker differieren können. Daher ist die induzierte SLD-Strahlung bereits in ihrer Entstehung breitbandiger und weniger kohärent als Laserstrahlung, und ihre Interferenzeffekte lassen sich durch den Einsatz der Multimodefaser problemlos so reduzieren, daß keine Interferenzeffekte mehr das Mikroskopbild stören.A Light source with a particularly favorable starting position for the Coherence weakening is the SLD. Unlike the laser, there is no feedback in the SLD of the induced light by mirrors, whereby the phases of the emitted Light from the beginning stronger can differ. Therefore, the induced SLD radiation is already in its formation broadband and less coherent as laser radiation, and their interference effects can be through the use of multimode fiber easily reduce so that no Interference effects more disturb the microscope image.
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