DE10261468A1 - Test kit for detecting Brucella species, potential biological warfare agents, in the environment, comprises primers for specific amplification, optionally also hybridization probe - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

Test kit for detecting Brucella melitensis and B. abortus in environmental samples by PCR amplification, using two primers to generate detectable amplicons from a specific DNA sequence. Test kit for detecting Brucella melitensis and B. abortus in environmental samples by PCR amplification, using two primers to generate detectable amplicons from a specific DNA sequence. The primers have the base sequences 5'-GCACAGCCGGAACCTATTAT-3' (P1), 5'-CCTTACGCGCAACGATATGG-3' (P2) or a part of these sequences containing at least 16 nucleotides, or longer sequences that contain the base sequences.

Description

Die Erfindung betrifft ein Testkit zum Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus in Umweltproben durch spezifische PCR-Amplifikation.The invention relates to a test kit for the detection of Brucella melitensis and Brucella abortus in environmental samples by specific PCR amplification.

Aus der DE 44 11 594 C1 ist ein Testkit zum Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz in DNA-Proben durch PCR-Amplifikation bekannt. Mit Hilfe eines ersten Primers und eines zweiten Primers werden nachweisbare Amplicone der spezifischen DNA-Sequenz erzeugt.From the DE 44 11 594 C1 a test kit for the detection of a specific DNA sequence in DNA samples by PCR amplification is known. Detectable amplicons of the specific DNA sequence are generated with the aid of a first primer and a second primer.

Brucella melitensis und Brucella abortus werden üblicherweise mittels mikrobiologischer Kulturverfahren, ELISA oder PCR nachgewiesen. Für den spezifischen PCR-Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus eignet sich das für die Zelloberflächenmembran codierende 31kDa Gen. Ein unspezifischer Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus ist aus einem Artikel (Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1992, Seite 271-275) bekannt.Brucella melitensis and Brucella abortus are common detected using microbiological culture methods, ELISA or PCR. For the specific PCR detection of Brucella melitensis and Brucella abortus is that suitable for the cell surface membrane coding 31kDa gen. An unspecific detection of Brucella melitensis and Brucella abortus is from an article (Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1992, pages 271-275).

Ausgehend von der bekannten PCR-Amplifikation liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, im Rahmen der Ausbildung eines Testkits einen ersten Primer und einen zweiten Primer zu schaffen, um nachweisbare Amplicone einer spezifischen DNA-Sequenz von Brucella melitensis und Brucella abortus zu erzeugen.Based on the well-known PCR amplification the invention is based, in the context of training of a test kit to create a first primer and a second primer, for detectable amplicones of a specific DNA sequence from Brucella to produce melitensis and Brucella abortus.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Testkit zum Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus in Umwelt-Proben durch PCR-Amplifikation gelöst, wobei mit Hilfe eines ersten Primers und eines zweiten Primers nachzuweisende Amplicone einer spezifischen DNA-Sequenz erzeugbar sind, aufweisend

  • – den ersten Primer einer Grundsequenz 5'- gca cag ccg gaa cct att at -3', oder einer aus mindestens 16 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz hieraus oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst, und
  • – den zweiten Primer einer Grundsequenz 5'- cct tac gcg caa cga tat gg -3' oder einer aus mindestens 16 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz hieraus oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst.
This object is achieved according to the invention by a test kit for the detection of Brucella melitensis and Brucella abortus in environmental samples by PCR amplification, amplicons of a specific DNA sequence to be detected being able to be generated with the aid of a first primer and a second primer
  • The first primer of a basic sequence 5'- gca cag ccg gaa cct att at -3 ', or a partial sequence consisting of at least 16 nucleotides thereof or a longer sequence which comprises the basic sequence, and
  • - the second primer of a basic sequence 5'- cct tac gcg caa cga tat gg -3 'or a partial sequence consisting of at least 16 nucleotides therefrom or a longer sequence which comprises the basic sequence.

Der Vorteil der Erfindung liegt darin, dass der erste und der zweite Primer so ausgewählt sind, dass bei Vorhandensein einer DNA von Brucella melitensis oder Brucella abortus eine spezifische Sequenz hieraus amplifiziert wird. Die Amplicone der spezifischen Sequenz der DNA von Brucella melitensis und Brucella abortus bieten die Basis für einen sicheren Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus.The advantage of the invention is that the first and second primers are selected so that when present a specific DNA from Brucella melitensis or Brucella abortus Sequence is amplified from this. The amplicone of the specific Provide sequence of Brucella melitensis and Brucella abortus DNA the basis for reliable detection of Brucella melitensis and Brucella abortus.

Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung umfasst das Testkit ferner eine Detektionssonde zum Nachweis der Ampliconen. Die Detektionssonde weist eine Grundsequenz 5'-Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C-3' auf oder ist eine aus mindestens 20 Nukleotiden bestehende Teilsequenz oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst. Die Vorteile der zuvor dargelegten Detektionssonde liegen darin, dass die amplifizierte DNA-Sequenz von Brucella melitensis und Brucella abortus spezifisch und sicher nachgewiesen werden kann.According to an embodiment of the invention the test kit further comprises a detection probe for detecting the Amplicons. The detection probe has a basic sequence 5'-Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C-3 ' or is a partial sequence consisting of at least 20 nucleotides or a longer one Sequence that includes the basic sequence. The advantages of before Detected probe are that the amplified DNA sequence of Brucella melitensis and Brucella abortus specific and can be reliably proven.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind bei dem Testkit der erste Primer, der zweite Primer und die Detektionssonde zusammen in einem Testmix enthalten, der darüber hinaus auch eine Polymerase, Nukleotide und einen Puffer aufweist. Die Vorteile liegen darin, dass in dem vorgenannten Testmix alle Reaktionskomponenten enthalten sind, um nach Zugabe der DNA-Proben die PCR-Amplifikation und den Nachweis der Amplicone durchzuführen. Hierdurch erreicht man eine einfache und sichere Handhabung.According to a further embodiment of the invention are the first primer, the second primer in the test kit and the detection probe together in a test mix that about that also has a polymerase, nucleotides and a buffer. The advantages are that in the aforementioned test mix, all reaction components are included for PCR amplification and detection after addition of the DNA samples the Amplicone. This enables simple and safe handling.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung ist der Testmix auf einer Testplatte enthalten, der bis zum Einsatz tiefgekühlt ist. Die Vorteile liegen darin, dass mit dem Tiefkühlen eine lange Haltbarkeit des Testkits sichergestellt ist.According to a further embodiment the test mix is contained on a test plate that is frozen until use. The advantages are that with the freezer a long shelf life of the test kit is ensured.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist auf der Testplatte noch mindestens ein weiterer Testmix enthalten, um ein Mitglied oder mehrere Mitglieder der Gruppe bestehend aus Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Coxiella burnetii, Vibrio cholerae und Orthopocken nachzuweisen. Damit ist der gleichzeitige Nachweis von biologischen Agenzien möglich, die als B-Waffe eingesetzt werden können.According to a further embodiment of the invention is at least one further test mix on the test plate included to consist of one or more members of the group from Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Detect Coxiella burnetii, Vibrio cholerae and orthopox. This enables the simultaneous detection of biological agents that can be used as a B-weapon.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachfolgend beschrieben:An embodiment of the invention is described below:

Ein Testkit zum Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus in Umweltproben durch spezifische PCR-Amplifikation, wobei mit Hilfe eines ersten Primers und eines zweiten Primers nachzuweisende Amplicone einer spezifischen DNA-Sequenz erzeugbar sind, weist auf

  • – den ersten Primer einer Grundsequenz 5'- gca cag ccg gaa cct att at -3', oder einer aus mindestens 16 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz hieraus oder und
  • – den zweiten Primer einer Grundsequenz 5'- cct tac gcg caa cga tat gg -3' oder einer aus mindestens 16 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz hieraus oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst.
A test kit for the detection of Brucella melitensis and Brucella abortus in environmental samples by specific PCR amplification, wherein amplicones of a specific DNA sequence to be detected can be generated with the aid of a first primer and a second primer
  • - the first primer of a basic sequence 5'- gca cag ccg gaa cct att at -3 ', or a partial sequence consisting of at least 16 nucleotides therefrom or and
  • - the second primer of a basic sequence 5'- cct tac gcg caa cga tat gg -3 'or a partial sequence consisting of at least 16 nucleotides therefrom or a longer sequence which comprises the basic sequence.

Die Primer wurden so aus der Gensequenz ausgewählt, dass das entstehende Amplicon eine geeignete Sequenz für die Detektionssonde aufweist und sich mit einem bestehenden Temperaturprotokoll amplifizieren und nachweisen läßt. Das Testkit weist eine Detektionssonde zum Nachweis der Ampliconen auf. Die Detektionssonde weist eine Grundsequenz 5'-Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C-3' auf oder ist eine aus mindestens 20 Nukleotiden bestehende Teilsequenz oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst. Bei dem Testkit sind der erste Primer, der zweite Primer und die Detektionssonde zusammen in einem Testmix enthalten, der darüber hinaus auch eine Polymerase, Nukleotide und einen Puffer aufweist.The primers were selected from the gene sequence so that the resulting amplicon has a suitable sequence for the detection probe and amplifies using an existing temperature protocol adorn and prove. The test kit has a detection probe to detect the amplicons. The detection probe has a basic sequence 5'-Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C-3 'or is a partial sequence consisting of at least 20 nucleotides or a longer sequence which comprises the basic sequence. In the test kit, the first primer, the second primer and the detection probe are contained together in a test mix, which also has a polymerase, nucleotides and a buffer.

Als Testmix eignet sich folgende Zusammensetzung:
In einem 20 μl Reaktionsmix sind je 16 pmol pro Primer, Firma MWG AG BIOTECH; 220 nM Detektionssonde, Firma QIAGEN OPERON; 0,6 U Taq-Polymerase, Firma QIAGEN; 0,4 mM je Nukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Firma ROCHE; 4mM Magnesiumchlorid, Firma QIAGEN; 1 × PCR-Puffer (Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2, pH 8,7), Firma QIAGEN; destilliertes Wasser und 2 μl der zu untersuchenden DNA enthalten. Die Detektionssonde ist eine Tagman®-Sonde mit einem Reporterfarbstoff FAM am 5'- Ende und einem Quencherfarbstoff TAMRA am 3'- Ende.The following composition is suitable as a test mix:
In a 20 μl reaction mix, 16 pmol per primer, MWG AG BIOTECH; 220 nM detection probe, company QIAGEN OPERON; 0.6 U Taq polymerase, company QIAGEN; 0.4 mM per nucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), company ROCHE; 4mM magnesium chloride, company QIAGEN; 1 × PCR buffer (Tris-Cl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , MgCl 2 , pH 8.7), company QIAGEN; distilled water and 2 μl of the DNA to be examined. The detection probe is a Tagman ® probe with a FAM reporter dye at the 5 'end and a TAMRA quencher dye at the 3' end.

Ferner sind der Testmix auf einer Testplatte enthalten, der bis zum Einsatz tiefgekühlt ist. Als Testplatte kommt eine Mikrotiterplatte in Frage. In einer Kavität sind 18 μl Testmix enthalten.Furthermore, the test mix is on one Test plate included, which is frozen until use. A microtiter plate can be used as a test plate. There are 18 μl test mix in one cavity contain.

Auf der Testplatte sind noch weiterere Testmixe enthalten, um gleichzeitig in einem gemeinsamen PCR-Ablauf auch Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Coxiella burnetii, Vibrio cholerae und Orthopocken nachzuweisen.There are more on the test plate Test mixes included to run simultaneously in a common PCR procedure also Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Detect Coxiella burnetii, Vibrio cholerae and orthopox.

Die Handhabung dieser Mikrotiterplatte läuft wie folgt ab: Zu dem Testmix in der unaufgetauten Mikrotiterplatte werden je 2 μl der zu untersuchenden DNA pipettiert. Die DNA-Probe kann aus dem Boden, dem Wasser oder der Luft stammen und kann mit einem DNA-Isolierungs-Kit der Firma QIAGEN aufgearbeitet worden sein. Dann wird die Mikrotiterplatte in einen Mikrotiterplatten-Realtime-PCR-Thermocycler eingesetzt und die DNA vervielfältigt. Hierzu eignen sich beispielsweise folgende Geräte: OPTICON, Firma MJ Research; ABI 7000, Firma Applied Biosystems.The handling of this microtiter plate runs like follows from: Become the test mix in the thawed microtiter plate 2 μl each pipetted the DNA to be examined. The DNA sample can be obtained from the Soil, water or air and can come with a DNA isolation kit the QIAGEN company. Then the microtiter plate used in a microtiter plate real-time PCR thermal cycler and duplicated the DNA. The following devices are suitable for this, for example: OPTICON, company MJ Research; ABI 7000, Applied Biosystems.

An dem PCR-Gerät wird folgender Ablauf einprogrammiert:

  • – 15 Minuten bei 95°C (Aktivierung der Polymerase) dann 35 Zyklen
  • – 2 Sekunden bei 94°C (Aufschmelzen des Doppelstranges)
  • – 10 Sekunden bei 55°C (Anlagerung der Primer und der Detektionssonde)
  • – 40 Sekunden bei 60°C (Wiederherstellen eines Doppelstranges mit Freisetzung des Reporterfarbstoffes in Anwesenheit von Brucella melitensis oder Brucella abortus)
The following sequence is programmed into the PCR device:
  • - 15 minutes at 95 ° C (activation of the polymerase) then 35 cycles
  • - 2 seconds at 94 ° C (melting of the double strand)
  • - 10 seconds at 55 ° C (attachment of the primers and the detection probe)
  • - 40 seconds at 60 ° C (restoration of a double strand with release of the reporter dye in the presence of Brucella melitensis or Brucella abortus)

Im Anschluss eines jeden Zyklus wird eine automatische Fluoreszenzmessung der Platte durchgeführt.At the end of each cycle an automatic fluorescence measurement of the plate was carried out.

Die Detektionssonde ist eine Tagman®-Sonde, bestehend aus dem Reporterfarbstoff FAM am 5'- Ende der Sequenz: Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C und des Quencherfarbstoffes TAMRA am 3'- Ende. Sie arbeitet wie folgt:
Während der Amplifikation von Brucella melitensis oder Brucella abortus kommt es zur Hybridisierung der Sonde an der spezifischen Stelle in der Zielsequenz. Die Polymerase stößt während der Amplifikation auf die hybridisierte Sonde. Durch ihre Exonucleaseaktivität ist sie in der Lage, die Nucleotide der Sonde vom 5'- Ende her nach und nach abzuspalten und sie somit von dem Strang wieder zu lösen. Dies hat zur Folge, dass der Reporterfarbstoff FAM nicht mehr durch die räumliche Nähe des Quencherfarbstoffes TAMRA am fluoreszieren gehindert werden kann. Bei Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge strahlt der Farbstoff mit seiner spezifischen Wellenlänge sein Signal aus. Dieses Signal wird mit einer optischen Detektionseinheit im Gerät gemessen und dokumentiert. Befindet sich die gesuchte DNA nicht in der zu untersuchenden Probe, dann kann kein Signal entstehen, da die Sonde nicht hybridisiert und der Farbstoff von der Polymerase nicht freigesetzt werden kann. Je mehr von der Ausgangs-DNA vervielfältigt wird, um so mehr nimmt die Fluoreszenzintensität zu.The detection probe is a Tagman ® probe, consisting of the reporter dye FAM at the 5 'end of the sequence: Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C and the quencher dye TAMRA at the 3' end. It works as follows:
During the amplification of Brucella melitensis or Brucella abortus, the probe hybridizes at the specific point in the target sequence. The polymerase encounters the hybridized probe during amplification. Due to its exonuclease activity, it is able to gradually cleave the nucleotides of the probe from the 5 'end and thus release them from the strand again. As a result, the reporter dye FAM can no longer be prevented from fluorescing due to the spatial proximity of the quencher dye TAMRA. When excited with light of a certain wavelength, the dye emits its signal with its specific wavelength. This signal is measured and documented with an optical detection unit in the device. If the DNA sought is not in the sample to be examined, then no signal can be generated since the probe does not hybridize and the dye cannot be released by the polymerase. The more of the starting DNA is reproduced, the more the fluorescence intensity increases.

SEQUENCE LISTING

Figure 00070001
SEQUENCE LISTING
Figure 00070001

Claims (5)

Testkit zum Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus in Umweltproben mittels PCR-Amplifikation, wobei mit Hilfe eines ersten Primers und eines zweiten Primers nachzuweisende Amplicone einer spezifischen DNA-Sequenz erzeugbar sind, aufweisend – den ersten Primer einer Grundsequenz 5'-gca cag ccg gaa cct att at -3', oder einer aus mindestens 16 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz hieraus oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst, und – den zweiten Primer einer Grundsequenz 5'-cct tac gcg caa cga tat gg -3' oder einer aus mindestens 16 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz hieraus oder eine längere Sequenz, welche die Grundsequenz umfasst.Test kit for the detection of Brucella melitensis and Brucella abortus in environmental samples using PCR amplification, being detected using a first primer and a second primer Amplicones of a specific DNA sequence can be generated - the first Primer of a basic sequence 5'-gca cag ccg gaa cct att at -3 ', or a partial sequence consisting of at least 16 nucleotides out of this or a longer one Sequence comprising the basic sequence, and - the second Primer of a basic sequence 5'-cct tac gcg caa cga tat gg -3 'or a partial sequence consisting of at least 16 nucleotides therefrom or a longer one Sequence that includes the basic sequence. Testkit nach Anspruch 1, mit einer Detektionssonde zum Nachweis der Ampliconen , bei der die Detektionssonde eine Grundsequenz von 5'-Agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C-3' aufweist oder eine aus mindestens 20 Nukleotiden bestehenden Teilsequenz oder eine längere Sequenz ist, welche die Grundsequenz umfasst.Test kit according to claim 1, with a detection probe for the detection of the amplicons in which the detection probe has a basic sequence of 5'-agg CAA CgT CTg ACT gCg TAA AgC C-3 ' or a partial sequence consisting of at least 20 nucleotides or a longer one Is sequence that includes the basic sequence. Testkit nach Anspruch 2, bei dem der erste Primer, der zweite Primer und die Detektionssonde zusammen in einem Testmix enthalten sind, der darüber hinaus auch eine Polymerase, Nukleotide und einen Puffer aufweist.The test kit of claim 2, wherein the first primer, the second primer and the detection probe together in a test mix are included, of that also has a polymerase, nucleotides and a buffer. Testkit nach Anspruch 3, bei dem der Testmix auf einer Testplatte enthalten ist, der bis zum Einsatz tiefgekühlt ist.Test kit according to claim 3, wherein the test mix on a test plate is included, which is frozen until use. Testkit nach Anspruch 4, bei dem auf der Testplatte noch mindestens ein weiterer Testmix enthalten ist, um ein Mitglied oder mehrere Mitglieder der Gruppe bestehend aus Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Coxiella burnetii, Vibrio cholerae und Orthopocken nachzuweisen.Test kit according to claim 4, in which on the test plate At least one more test mix is included to be a member one or more members of the group consisting of Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Coxiella burnetii, Vibrio to demonstrate cholerae and orthopox.
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