DE102015216558A1 - METHOD AND TESTKIT FOR THE QUICK INSULATION OF NUCLEIC ACIDS FROM SMOKING SURFACES - Google Patents

METHOD AND TESTKIT FOR THE QUICK INSULATION OF NUCLEIC ACIDS FROM SMOKING SURFACES Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betriff ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren – in Anwesenheit von organischen Substanzen sowie mindestens einem Bestandteil eines Lysepuffers – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden. Bei der rauen Oberfläche handelt es sich vorzugsweise um eine nicht-glatte Kunststoff- oder Gummi-Oberfläche. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testkit und ein entsprechendes Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren.The invention relates to a method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing samples, characterized in that free or liberated by lysis nucleic acids - in the presence of organic substances and at least one component of a lysis buffer - are attached to a solid phase with a rough surface, then washed and be eluted. The rough surface is preferably a non-smooth plastic or rubber surface. The invention also provides a test kit and a corresponding device for isolating nucleic acids.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein völlig neuartiges, universelles, stark vereinfachtes sowie extrem schnelles Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien, welches sowohl eine sehr hohe Qualität der zu isolierenden Nukleinsäuren garantiert als auch die Isolierung extrem hoher Nukleinsäure-Ausbeuten ermöglicht. Das Verfahren kann sowohl manuell im Labor, unter Feldbedingungen als auch vollständig automatisiert durchgeführt werden. Es basiert auf der Anbindung von Nukleinsäuren an eine nicht-glatte Oberfläche.The invention relates to a completely novel, universal, greatly simplified and extremely rapid method for isolating nucleic acids from nucleic acids containing a wide variety of starting materials, which guarantees both a very high quality of the nucleic acids to be isolated as well as the isolation of extremely high nucleic acid yields. The procedure can be carried out either manually in the laboratory, under field conditions or completely automated. It is based on the binding of nucleic acids to a non-smooth surface.

Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden ( Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).Under classical conditions, the isolation of DNA from cells and tissues by the nucleic acids containing starting materials under strongly denaturing and reducing conditions, partially digested using protein degrading enzymes, purified the exiting nucleic acid fractions via phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids by means of Dialysis or ethanol precipitation can be obtained from the aqueous phase ( Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).

Diese "klassischen Verfahren“ zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.These "classical methods" for the isolation of nucleic acids from cells and especially from tissues are very time-consuming (sometimes longer than 48 h), require a considerable amount of equipment and are also not feasible under field conditions, and such methods are due to the chemicals used such as phenol and chloroform in a not insignificant health hazard.

Die nächste Verfahrensgeneration zur Isolierung von Nukleinsäuren basiert auf einer von Vogelstein und Gillespie ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 ) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst. Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet und ist letztlich die Basis für fast alle kommerziell verfügbaren Kits zur manuellen wie auch automatisierten Isolierung von Nukleinsäuren. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Patenten und Veröffentlichungen, die sich auf das Basisprinzip der Isolierung von Nukleinsäuren beziehen, welches von Vogelstein und Gillespie erstmals publiziert wurde und ggf. weitere Vorteile innehaben. Diese Varianten betreffen sowohl die Verwendung unterschiedlicher mineralischer Trägermaterialien als auch die Art der für die Bindung der Nukleinsäuren eingesetzten Puffer. Beispiele sind u.a. die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, bei welchen als Trägermaterial feingemahlene Glaspulver (BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele bzw. Silcasuspensionen oder Glasfaserfilter oder mineralische Erden ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) zum Einsatz kommen. All diese Patente basieren auf der Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silizium unter Anwesenheit chaotroper Salzlösungen. In neueren Patentschriften wird offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten mineralischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/Bindungspuffer-Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können ( EP 1135479 ). Zusammenfassend kann man den Stand der Technik also dahingehend beschreiben, dass Nukleinsäuren an mineralische Materialien in Anwesenheit von Puffern, die chaotrope oder antichaotrope Salze enthalten oder auch in Anwesenheit von Puffern die Mischungen chaotroper und antichaotroper Salze enthalten, binden und auf diesem Wege dann auch isoliert werden können. Dabei gibt es auch Vorzugsvarianten, bei denen zusätzlich aliphatische Alkohole zur Bindungsvermittlung eingesetzt werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass alle gängigen kommerziellen Produkte zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren auf dieser Grundlage basieren. Die eingesetzten mineralischen Träger liegen dabei in Form von losen Schüttungen, in Form von Filtermembranen oder auch in Form von Suspensionen vor. Für die Durchführung von automatisierten Extraktionsabläufen werden häufig paramagnetische oder magnetische Partikel eingesetzt. Dabei handelt es sich z.B. um silikatische Materialien, die einen magnetischen oder paramagnetischen Kern besitzen oder aber auch um Eisenoxydpartikel, deren Oberfläche so modifiziert wird, dass diese die für die Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Funktionalitäten tragen. Die Extraktionsabläufe zur Isolierung von Nukleinsäuren basieren dabei auch nach prinzipiell gleichen Schemata: Lyse der Ausgangsprobe zur Freisetzung der Nukleinsäure, binden der Nukleinsäure an das entsprechende mineralische Trägermaterial, waschen der gebundenen Nukleinsäure, Trocknung des Trägermaterials und finale Elution der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial. Auch wenn sich diese Verfahren bewährt haben, gibt es doch auch eine Reihe von Nachteilen. So ist die Bindungskapazität der eingesetzten Materialien begrenzt, insbesondere bei der Verwendung von Spinfiltermembranen. Wenn die Ausgangsprobe zu viel Nukleinsäure enthält, verstopfen Membranen auch oftmals. Die automatisierten Prozessabläufe unter Verwendung von magnetischen Partikeln sind relativ aufwendig und benötigen je nach Anwendung auch einen relativ hohen Zeitaufwand. Die einfache Durchführung einer Nukleinsäure-Isolierung unter Feldbedingungen ist nicht gegeben.The next generation of procedures for the isolation of nucleic acids is based on a von Vogelstein and Gillespie ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619 ) and first described method for the preparative and analytical purification of DNA fragments from agarose gels. The method combines the dissolution of the agarose containing the DNA band to be isolated in a saturated solution of a chaotropic salt (NaJ) with a binding of the DNA to glass particles. The DNA fixed to the glass particles is then washed with a washing solution (20 mM Tris HCl [pH 7.2], 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50% v / v ethanol) and then removed from the carrier particles. To date, this method has undergone a number of modifications and is currently being applied to different methods of extracting and purifying nucleic acids from different sources and is ultimately the basis for almost all commercially available kits for both manual and automated isolation of nucleic acids. In addition, there are a large number of patents and publications which refer to the basic principle of the isolation of nucleic acids, which was first published by Vogelstein and Gillespie and possibly have further advantages. These variants relate both to the use of different mineral carrier materials and to the type of buffer used for the binding of the nucleic acids. Examples include the binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts, in which as carrier material finely ground glass powder (BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Fa. Sigma) or silica gels or Silcasuspensionen or glass fiber filters or mineral Earth ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) are used. All of these patents are based on the binding of nucleic acids to a mineral carrier material based on glass or silicon in the presence of chaotropic salt solutions. It is disclosed in more recent patents that also so-called antichaotropic salts can be used very efficiently and successfully for the adsorption of nucleic acids on the mineral materials known and used by the person skilled in the art as a component of lysis / binding buffer systems ( EP 1135479 ). In summary, the state of the art can thus be described in such a way that nucleic acids bind to mineral materials in the presence of buffers which contain chaotropic or antichaotropic salts or even in the presence of buffers contain mixtures of chaotropic and antichaotropic salts, and then also be isolated in this way can. There are also preferred variants in which additional aliphatic alcohols are used for binding mediation. It is also known to the person skilled in the art that all common commercial products for the isolation and purification of nucleic acids are based on this basis. The mineral carriers used are present in the form of loose beds, in the form of filter membranes or in the form of suspensions. Paramagnetic or magnetic particles are often used to perform automated extraction operations. These are, for example, silicate materials which have a magnetic or paramagnetic core or else iron oxide particles whose surface is modified such that they carry the functionalities necessary for the binding of the nucleic acids. The extraction procedures for the isolation of nucleic acids are also based on basically the same schemes: lysis of the starting sample to release the nucleic acid, binding of the nucleic acid to the corresponding mineral carrier material, washing of the bound nucleic acid, drying of the carrier material and final elution of the bound nucleic acid from the carrier material. Even if If these procedures have proven successful, there are also a number of disadvantages. Thus, the binding capacity of the materials used is limited, especially when using spin filter membranes. If the parent sample contains too much nucleic acid, membranes often clog. The automated processes using magnetic particles are relatively complicated and require a relatively high amount of time depending on the application. The simple implementation of a nucleic acid isolation under field conditions is not given.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen technischen Lösungen zu beseitigen. The invention was therefore based on the object to eliminate the disadvantages of the technical solutions described in the prior art.

Lösung der AufgabeSolution of the task

Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren bereitgestellt, welches deutlich einfacher in der Durchführung ist als die bekannten Verfahren; welches es erlaubt, eine Nukleinsäure-Isolierung auch unter Feldbedingungen (und durch Nichtspezialisten) durchführen zu können, welches extrem schnell in der Durchführung ist – insbesondere im Kontext mit einer automatisierten Extraktion – und welches es erlaubt, extrem hohe Ausbeuten an Nukleinsäuren mit hoher Qualität zu isolieren. Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben in all den definierten Punkten. Der Kern der Erfindung ist, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren, die mindestens einen Bestandteil eines Lysepuffers enthalten, vorzugsweise Salze – in Anwesenheit von organischen Substanzen – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden. De Begriff „raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist.The problem has been solved according to the features of the claims. According to the invention, a method for the isolation of nucleic acids has been provided which is considerably simpler to carry out than the known methods; which allows nucleic acid isolation to be carried out under field conditions (and by non-specialists) which is extremely fast to perform - especially in the context of automated extraction - and which allows extremely high yields of high quality nucleic acids isolate. The present invention solves these problems in all the defined points. The essence of the invention is that free or lysed nucleic acids containing at least one component of a lysis buffer, preferably salts - in the presence of organic substances - are attached to a solid phase with a rough surface, then washed and eluted. The term "rough surface" is to be understood that by touching the surface can be seen that this is not smooth.

Der Erfindung lag folgende Beobachtung zu Grunde. Wenn man eine Nukleinsäure enthaltende Proben mit Extraktionsreagenzien von kommerziell verfügbaren Kits (z.B. innuPREP Blood DNA Kit/IPC16, Analytik Jena AG; DNeasy Blood & Tissue Kit; Fa. Qiagen) bearbeitet und man anstelle eines mineralischen Trägermaterials ein beliebiges nicht-glattes Plastikmaterial (beispielsweise angerautes Polypropylen) einsetzt und dieses in Kontakt mit der in Bearbeitung befindlichen Probe bringt, bindet Nukleinsäure an das Plastikmaterial. Die nachfolgenden Schritte des Waschens können mit bekannten alkoholhaltigen Waschpuffern oder auch nur mit einem Alkohol durchgeführt werden, ebenso können für die Elution bekannte Niedrigsalzpuffer oder auch Wasser eingesetzt werden. Der einzige Unterschied ist, dass anstelle des mineralischen Trägermaterials ein Plastikmaterial eingesetzt wird. Es zeigte sich schon nach den ersten Experimenten, dass damit alle Prozessschritte viel einfacher und schneller umgesetzt werden können. Es zeigt sich auch, dass dieser Effekt mit allen eingesetzten Plastikmaterialien zu beobachten war. Die Besonderheit bei all den durchgeführten Versuchen bestand aber anfangs darin, dass die verwendeten Plastikmaterialien auf einem 3D-Drucker gefertigt wurden. Dadurch wird die Oberfläche nicht glatt, sondern geriffelt – also rau, da sich beim 3D-Druck ein Körper bildet, der schichtförmig aufgebaut ist. Durchgeführt wurden die ersten Experimente dabei unter Nutzung eines Extraktionsautomaten (Thermo Electron), dem sog. Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Es handelt sich dabei um ein Gerät zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel. Das Gerät verwendet dabei Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen und in die für eine Standardextraktion notwendigen Puffer eintauchen. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt. Dazu wurden mittels eines 3D-Druckers Hülsen aus verschiedenen Materialien gedruckt, welche dann auf die Plastikkämme aufgesteckt wurden. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzten Reagenzien wurden dabei z.B. teilweise aus dem kommerziell verfügbaren Extraktionskit (innuPREP Blood DNA Mini Kit/IPC16; Analytik Jena AG) genommen. Der Ablauf der Extraktion folgte folgendem workflow. Unter Verwendung des Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min. lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen vorbefüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)
The invention was based on the following observation. If samples containing nucleic acid are processed with extraction reagents from commercially available kits (eg innuPREP Blood DNA Kit / IPC16, Analytik Jena AG, DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) and any non-smooth plastic material (for example roughened polypropylene) and brings this into contact with the sample being processed, binds nucleic acid to the plastic material. The subsequent steps of washing can be carried out with known alcohol-containing washing buffers or even with only one alcohol, likewise low-salt buffers or water known for the elution can be used. The only difference is that a plastic material is used instead of the mineral carrier material. It became clear after the first experiments that all process steps can be implemented much easier and faster. It also shows that this effect was observed with all plastic materials used. The peculiarity of all the experiments carried out initially was that the plastic materials used were made on a 3D printer. As a result, the surface is not smooth, but rippled - so rough, because in 3D printing, a body is formed, the layered structure. The first experiments were carried out using an extraction machine (Thermo Electron), the so-called magnetic particles processor KingFisher ml. It is a device for the extraction of nucleic acids using magnetic particles. The device uses plastic combs, in which magnetic rods retract, which then move in a walk-away process magnetic particles and immersed in the necessary for a standard extraction buffer. These plastic combs were used for the inventive method misused. For this purpose, sleeves of different materials were printed by means of a 3D printer, which were then attached to the plastic combs. Approximately 1 × 10 6 NIH 3T3 cells were used as a sample. For example, the reagents used for the isolation of the nucleic acids were partially taken from the commercially available extraction kit (innuPREP Blood DNA Mini Kit / IPC16, Analytik Jena AG). The process of extraction followed the following workflow. Using the Lysis Solution CBV and proteinase K, the cells were incubated at 60 ° C for 15 min. lysed. During the lysis, the reaction plastic of the KingFisher ml was pre-filled with the following solutions:
  • Well 1: 400 μl isopropanol
  • Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit)
  • Well 3: 800 μl 80% ethanol
  • Well 4: 800 μl 80% ethanol
  • Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the extraction kit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Bei diesem Prozess bewegen sich die Plastikkämme sukzessive von Kavität 1 bis Kavität 5. Dabei erfolgt in jeder Kavität eine vertikale Bewegung der Plastikkämme in die jeweils vorliegende Pufferlösung. Der Extraktionsprozess basiert dabei auf den klassischen Prinzipien der Nukleinsäure-Isolierung unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Es werden aber keine Partikel eingesetzt. In der Kavität 1 erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren an den Plastikkamm mit den aufgesteckten Hülsen. Die gebundene Nukleinsäure wird sukzessive durch die Kavitäten 2–4 bewegt. Hier erfolgen die Waschschritte. Danach folgt ein kurzer Trocknungsschritt zur Entfernung von Ethanol. Final wird die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen mit Hülsen abgelöst. Der Ablauf ist dabei deutlich vereinfacht, da keine Magnetpartikel prozessiert wurden. Das notwendige Sammeln der Magnetpartikel entfällt als Schritt, da ja keine Partikel für die Extraktion eingesetzt wurden. Dadurch war das Verfahren in ca. 15 min beendet. Wie schon aufgeführt, zeigte sich, dass mit allen eingesetzten Plastikmaterialien unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren Extraktionschemie und unter Anwendung eines Standard-Extraktionsprotokolls Nukleinsäuren über die Anbindung an das eingesetzte Plastikmaterial isoliert werden können. Diese Beobachtungen waren überraschend. Es war zwar bekannt, dass Biomoleküle unspezifisch an Plastikmaterialien adsorbieren, dies aber aus wässrigen Lösungen, in denen sie vorliegen und dies auch nur in extrem geringen Mengen. Auch gibt es Beschreibungen, Plastikmaterialien für die Isolierung von Nukleinsäuren einzusetzen. Dies aber dadurch, dass man Plastikmaterialien chemisch an ihren Oberflächen so modifiziert, dass sie dieselben funktionalen Gruppen wie silikatische Materialien tragen (OH-Gruppen) oder auch andere funktionale Gruppen an Plastikoberflächen synthetisiert wurden (COOH-Gruppen). Dies ist z.B. in der Patentschrift EP 1135479 aufgeführt. Dem Fachmann ist aber auch bekannt, dass sich solche Mittel zur Isolierung von Nukleinsäuren nicht in der Praxis bewährt haben, da insbesondere die Bindungskapazität viel zu gering ist. Nach diesen ersten Experimenten konnte damit gezeigt werden, dass es möglich ist, mit den gedruckten Plastikhülsen Nukleinsäuren zu isolieren. Allerdings war nicht ersichtlich, warum dies möglich ist. Überraschenderweise konnte die Erklärung mit einem ganz einfachen Experiment gefunden werden. Verwendet wurde wiederum der KingFisher ml. Allerdings wurden bei diesem Versuch keine gedruckten Plastikhülsen eingesetzt. Die Standard-Plastikkämme, welche für die Magnetpartikelprozessierung eingesetzt werden, wurden eingesetzt. Dabei wurden einige Plastikkämme so verwendet, wie sie vorlagen und andere Kämme wurden mittels eines Graviergerätes an der Oberfläche aufgeraut. Es wurde – wie schon beschrieben – eine Extraktion aus Zellen mit denselben beschriebenen Reagenzien und demselben Ablauf durchgeführt. Die detaillierten Ergebnisse sind im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Das Experiment zeigt eindrucksvoll, dass an die unbehandelten Kämme keine Nukleinsäure bindet. Im Gegensatz dazu bindet Nukleinsäure hocheffizient an den aufgerauten Kämmen. Damit konnte der Beweis erbracht werden, dass man lediglich die Oberfläche von Plastikmaterialien aufrauen muss, um hocheffizient und unter Verwendung von Standard-Extraktionsreagenzien Nukleinsäuren zu isolieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht damit in idealster Weise die Umsetzung der schon aufgeführten Zielstellung. Für die Extraktion benötigt man lediglich ein Plastikmaterial, dessen Oberfläche aufgeraut ist. Als Extraktionsreagenzien können klassische Kitreagenzien unterschiedlicher Art verwendet werden. Ebenso arbeitet das Extraktionsprotokoll nach dem bekanntem Schema Lysieren-Binden-Waschen-Eluieren. Das Verfahren ist aber nunmehr extrem einfach und schnell in der Durchführung. Folgende Schritte sind notwendig:

  • 1. Lysieren einer Nukleinsäure enthaltenden Probe (oder Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Probe). Dazu wird die Probe mit einem klassischen Lysepuffer oder einem Puffer versetzt, die man bisher aus Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren kennt. Diese Puffer können chaotrope Salze oder nichtchaotrope Salze oder Mischungen dieser beiden Gruppen enthalten. Darüber hinaus können diese Puffer weitere Komponenten enthalten wie Chealtbildner, Trispuffer, Netz- und Dispergiermittel etc. Das Verfahren funktioniert aber auch mit Puffern, welche keine Salze enthalten und z.B. nur aus einem Detergenz, Tris und EDTA bestehen. Zusätzlich können auch noch proteolytische Enzyme eingesetzt werden.
  • 2. Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine alkoholische Komponente und weitere Zusätze enthält oder Zugabe eines Alkohols allein oder auch Zugabe von Aceton oder Benzin.
  • 3. Inkontaktbringen dieser Mischung mit einem Plastikmaterial, dessen Oberfläche angeraut ist.
  • 4. Entfernen des Plastikmaterials aus der Mischung oder Entfernen der Mischung vom Plastikmaterial.
  • 5. Ggf. Waschen des Plastikmaterials.
  • 6. Ggf. Trocknung des Plastikmaterials.
  • 7. Ablösen der Nukleinsäure vom Plastikmaterial mit einem Elutionspuffer (Niedrigsalzpuffer oder Wasser).
After lysis, the lysate (400 .mu.l) was added to the cavity 1 for already present there isopropanol and started the extraction process. During this process, the plastic combs move successively from cavity 1 to cavity 5. In each cavity, a vertical movement of the plastic combs into the respective buffer solution is carried out. The extraction process is based on the classical principles of nucleic acid isolation using magnetic particles. But no particles are used. In the cavity 1, the binding of the nucleic acids to the plastic comb with the attached sleeves takes place. The bound nucleic acid is successively moved through the cavities 2-4. Here are the washing steps. This is followed by a short drying step to remove ethanol. Finally, the nucleic acid in the cavity 5 is detached from the plastic crests with sleeves. The process is significantly simplified, since no magnetic particles were processed. The necessary collection of the magnetic particles is omitted as a step, since no particles were used for the extraction. As a result, the process was completed in about 15 minutes. As already mentioned, it was found that with all the plastic materials used, it was possible to isolate nucleic acids via the connection to the plastic material used using a commercially available extraction chemistry and using a standard extraction protocol. These observations were surprising. Although it was known that biomolecules adsorb unspecifically to plastic materials, but from aqueous solutions in which they are present and only in extremely small amounts. There are also descriptions of using plastic materials for the isolation of nucleic acids. This is done by chemically modifying plastic materials on their surfaces in such a way that they carry the same functional groups as silicate materials (OH groups) or synthesize other functional groups on plastic surfaces (COOH groups). This is for example in the patent EP 1135479 listed. However, it is also known to the person skilled in the art that such agents for the isolation of nucleic acids have not proven useful in practice, since in particular the binding capacity is much too low. After these first experiments it could be shown that it is possible to isolate nucleic acids with the printed plastic sleeves. However, it was not clear why this is possible. Surprisingly, the explanation could be found with a very simple experiment. The KingFisher ml was again used. However, no printed plastic sleeves were used in this experiment. The standard plastic combs used for magnetic particle processing were used. Some plastic combs were used as they were and other combs were roughened on the surface using an engraver. As already described, an extraction from cells was carried out with the same reagents described and the same procedure. The detailed results are described in Embodiment 1. The experiment shows impressively that no nucleic acid binds to the untreated combs. In contrast, nucleic acid binds highly efficiently to the roughened combs. Thus, it could be proved that one only has to roughen the surface of plastic materials in order to isolate nucleic acids highly efficiently and using standard extraction reagents. The present invention thus makes it possible in the ideal way to implement the already listed objective. For the extraction, all you need is a plastic material whose surface is roughened. As extraction reagents classical Kitreagenzien of different kind can be used. Likewise, the extraction protocol works according to the known scheme lysing-binding-washing-elution. However, the process is now extremely simple and fast to carry out. The following steps are necessary:
  • 1. Lysing a sample containing nucleic acid (or providing a sample containing nucleic acid). For this purpose, the sample is mixed with a classical lysis buffer or a buffer which has hitherto been known from methods for isolating nucleic acids. These buffers may contain chaotropic salts or non-chaotropic salts or mixtures of these two groups. In addition, these buffers may contain other components such as chelating agents, Tris buffer, wetting and dispersing agents, etc. The method also works with buffers which contain no salts and consist for example only of a detergent, Tris and EDTA. In addition, proteolytic enzymes can also be used.
  • 2. Addition of a binding buffer which contains an alcoholic component and further additives or addition of an alcohol alone or else addition of acetone or gasoline.
  • 3. Contact this mixture with a plastic material whose surface is roughened.
  • 4. Remove the plastic material from the mixture or remove the mixture from the plastic material.
  • 5. If necessary Washing the plastic material.
  • 6. If necessary Drying of the plastic material.
  • 7. Remove the nucleic acid from the plastic material with an elution buffer (low salt buffer or water).

Das Verfahren ist universell einsetzbar und kann sowohl automatisiert als auch manuell durchgeführt werden. Damit ist es auch in idealster Weise für den Einsatz einer Nukleinsäure-Extraktion unter Feldbedingungen nutzbar, da die notwendigen Schritte einfach durchführbar sind. Die einzusetzenden Plastikmaterialien sind ebenfalls nicht limitierend. Eingesetzt werden können auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten oder metallischen Komponenten darstellen. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten Oberfläche. Die Architektur des Plastikmaterials ist ebenfalls nicht limitierend. Beispielsweise kann auch eine Standardpipettenspitze an ihrer Innenseite gemäß der Erfindung aufgeraut werden und für die Extraktion von Nukleinsäuren manuell oder automatisiert eingesetzt werden. Dazu wird entsprechend des beschriebenen Extraktions-workflows mittels multipler Pipettierschritte das Extraktionsprotokoll sukzessive abgearbeitet. Dem Fachmann wird damit deutlich, wie extrem einfach mittels der vorliegenden Erfindung nunmehr eine Extraktion von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung zeigt einen weiteren enormen Vorteil. Enthält eine biologische Probe große Mengen an Nukleinsäuren, so kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Plastik eine extrem große Menge an Nukleinsäuren extrahiert werden. Dies Ausbeuten übersteigen dabei die erzielbaren Ausbeuten mit bekannten Extraktionsverfahren unter Verwendung von mineralischen Trägermaterialien um ein Vielfaches. Damit ist das Verfahren auch ideal für die Bearbeitung von großen Probenvolumina geeignet. Auch zeigt sich, dass sowohl genomische DNA, RNA als auch Plasmid DNA isoliert werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als automatisierter Extraktionsprozess multiple Proben extrem schnell bearbeiten. Beispielhaft können mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter der zweckentfremdeten Verwendung des KingFisher ml, 15 Proben in 15 Minuten gleichzeitig bearbeitet werden. Auch kann dieses Verfahren ohne Verlust an Quantität und Qualität der zu isolierenden Nukleinsäure weiter verkürzt werden. Dies kann dann auch auf andere Automatenstationen übertragen werden. Z.B. kann die Extraktion auch in aufgerauten Pipettenspitzen mit allen gängigen Pipettierautomaten umgesetzt werden. Mit der Erfindung steht damit eine völlig neuartige Plattformtechnologie für die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren zur Verfügung, welche eine Vielzahl von ganz deutlichen Vorteilen gegenüber den bekannten Extraktionsverfahren zeigt. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren, umfassend angeraute Pipettenspitzen.The method is universally applicable and can be carried out both automatically and manually. Thus, it is also ideally suited for the use of a nucleic acid extraction under field conditions, since the necessary steps are easy to carry out. The plastic materials to be used are likewise not limiting. It is also possible to use so-called composite materials which are mixtures of polymers and, for example, organic components or metallic components. It is only essential to provide a roughened surface. The architecture of the plastic material is also not limiting. For example, a standard pipette tip can be roughened on its inside according to the invention and used manually or automatically for the extraction of nucleic acids. To The extraction protocol is successively processed according to the described extraction workflow by means of multiple pipetting steps. It will thus be clear to the person skilled in the art how an extraction of nucleic acids can now be carried out extremely simply by means of the present invention. The present invention shows another enormous advantage. If a biological sample contains large amounts of nucleic acids, an extremely large amount of nucleic acids can be extracted by means of the method according to the invention and the plastic according to the invention. These yields exceed the achievable yields by known extraction methods using mineral support materials many times. Thus, the method is also ideally suited for the processing of large sample volumes. It also shows that both genomic DNA, RNA and plasmid DNA can be isolated. The method according to the invention can process multiple samples extremely quickly as an automated extraction process. By way of example, using the method according to the invention under the misused use of the KingFisher ml, 15 samples can be processed simultaneously in 15 minutes. Also, this method can be further shortened without loss of quantity and quality of the nucleic acid to be isolated. This can then be transferred to other automatic stations. For example, the extraction can also be implemented in roughened pipette tips with all common pipetting machines. The invention thus provides a completely new platform technology for the isolation and purification of nucleic acids, which shows a large number of very distinct advantages over the known extraction methods. The invention thus also provides a device for isolating nucleic acids comprising roughened pipette tips.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the invention.

Ausführungsbeispieleembodiments

Beispiel 1. Nachweis der Bindung von Nukleinsäuren an rauen Oberflächen unter Nutzung einer kommerziell verfügbaren ExtraktionschemieExample 1. Detection of binding of nucleic acids to rough surfaces using commercially available extraction chemistry

Der Nachweis, dass Nukleinsäuren an raue Oberflächen binden und isoliert werden können, wurde wie folgt durchgeführt. Die Extraktion wurde dabei automatisiert umgesetzt. Zum Einsatz kam ein Magnetpartikelprozessor (KingFisher ml; Thermo Electron). Das Gerät verwendet Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen, die für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt und sollten der Bindung und nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure dienen. Das Plastikmaterial ist Polypropylen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Plastikkämme mittels eines Schleifgerätes angeraut. Eingesetzt wurden ebenfalls unbehandelte Plastikkämme. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG) genommen. Mittels eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)
The demonstration that nucleic acids can bind to rough surfaces and be isolated was performed as follows. The extraction was implemented automatically. A magnetic particle processor (KingFisher ml, Thermo Electron) was used. The device uses plastic combs, in which magnetic rods retract, which then move in a walk-away process magnetic particles, which are used for the isolation of nucleic acids. These plastic combs were used for the process according to the invention for other purposes and should serve the binding and subsequent extraction of the nucleic acid. The plastic material is polypropylene. According to the present invention, the plastic combs were roughened by means of a grinder. Also used were untreated plastic combs. Approximately 1 × 10 6 NIH 3T3 cells were used as a sample. The extraction chemistry used for the isolation of the nucleic acids was partially taken from the commercial extraction kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16X (Analytik Jena AG). Using a lysis buffer (Lysis Solution CBV) and proteinase K, the cells were lysed at 60 ° C for 15 min. During lysis, the reaction plastic of the KingFisher ml was filled with the following solutions:
  • Well 1: 400 μl isopropanol
  • Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit)
  • Well 3: 800 μl 80% ethanol
  • Well 4: 800 μl 80% ethanol
  • Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the extraction kit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Bei diesem Prozess bewegen sich die Plastikkämme sukzessive von Kavität 1 bis Kavität 5. Dabei erfolgt in jeder Kavität eine vertikale Bewegung der Plastikkämme innerhalb der jeweils vorliegenden Pufferlösung. Der Extraktionsprozess basiert dabei auf den klassischen Prinzipien der Nukleinsäureisolierung unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Es werden aber keine Partikel eingesetzt. In der Kavität 1 erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren an den Plastikkamm. Die gebundene Nukleinsäure wird sukzessive durch die Kavitäten 2–4 bewegt. Hier erfolgen die Waschschritte. Danach folgt ein kurzer Trocknungsschritt zur Entfernung von Ethanol. Final wird die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen abgelöst. Wie schon aufgeführt, wurden dabei Plastikkämme eingesetzt, deren Oberfläche aufgeraut wurden sowie die ursprünglichen unbehandelten Plastikkämme. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280 Ratio A260:A230 unbehandelter Plastikkamm 1 0 nicht messbar nicht messbar nicht messbar unbehandelter Plastikkamm 2 0 nicht messbar nicht messbar nicht messbar aufgerauter Plastikkamm 1 56 11,2 1,90 2,46 aufgerauter Plastikkamm 2 60 12 1,86 2,30 aufgerauter Plastikkamm 3 63 12,6 1,96 2,39 After lysis, the lysate (400 .mu.l) was added to the cavity 1 for already present there isopropanol and started the extraction process. During this process, the plastic combs move successively from cavity 1 to cavity 5. In each cavity, a vertical movement of the plastic combs takes place within the respective buffer solution present. The extraction process is based on the classical principles of nucleic acid isolation using magnetic particles. But no particles are used. In cavity 1, the binding of the nucleic acids to the plastic comb takes place. The bound nucleic acid is successively moved through the cavities 2-4. Here are the washing steps. This is followed by a short drying step to remove ethanol. Finally, the nucleic acid in the cavity 5 is detached from the plastic combs. As already mentioned, plastic combs were used, whose surface was roughened and the original untreated plastic combs. The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement and on an agarose gel. In addition to the yield, the purity of the isolated nucleic acid was also determined. Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A 260 : A 280 Ratio A 260: A 230 untreated plastic comb 1 0 not measurable not measurable not measurable untreated plastic comb 2 0 not measurable not measurable not measurable roughened plastic comb 1 56 11.2 1.90 2.46 roughened plastic comb 2 60 12 1.86 2.30 roughened plastic comb 3 63 12.6 1.96 2.39

1 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 4 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren bedeuten:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. unbehandelter Plastikkamm
  • 3. unbehandelter Plastikkamm
  • 4. aufgerauter Plastikkamm 1
  • 5. aufgerauter Plastikkamm 2
  • 6. Aufgerauter Plastikkamm 3
1 shows the detection of the DNA on an agarose gel. 4 μl of nucleic acid from the total eluate of 200 μl were used per lane. The tracks mean:
  • 1. DNA conductor (1b conductor)
  • 2. untreated plastic comb
  • 3. untreated plastic comb
  • 4. roughened plastic comb 1
  • 5. roughened plastic comb 2
  • 6. Brushed plastic comb 3

Wie die Ergebnisse eindrucksvoll zeigen, bindet die Nukleinsäure (sowohl DNA als auch RNA) an den unbehandelten Kämmen nicht. Sie bindet aber hocheffizient an den aufgerauten Kämmen und kann nachfolgend mit klassischen Waschpuffern gewaschen und final wieder von den Kämmen abgelöst werden. Damit entspricht der Prozess exakt den klassischen Abläufen der Isolierung von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel oder mittels dem Fachmann bekannter mineralischer Trägermaterialien. Der Prozess ist aber sehr viel schneller und einfacher in der Durchführung. Mit diesem Beispiel wurde damit gezeigt, dass allein durch ein Anrauen einer Plastikoberfläche dieses Material für die Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung bekannter Extraktionsreagenzien eingesetzt werden kann.As the results impressively show, the nucleic acid (both DNA and RNA) does not bind to the untreated ridges. However, it binds highly efficiently to the roughened combs and can subsequently be washed with classic washing buffers and finally detached again from the combs. Thus, the process corresponds exactly to the classical processes of isolating nucleic acids by means of magnetic particles or mineral carriers known to those skilled in the art. The process is much faster and easier to carry out. With this example, it was shown that solely by roughening a plastic surface, this material can be used for the extraction of nucleic acids using known extraction reagents.

Beispiel 2: Testung unterschiedlicher Plastikmaterialien mit rauen Oberflächen für die Extraktion von Nukleinsäuren unter Nutzung einer kommerziell verfügbaren ExtraktionschemieExample 2: Testing of Rough Surface Plastic Materials for the Extraction of Nucleic Acids Using Commercially Available Extraction Chemistry

Der Nachweis, dass Nukleinsäuren an raue Oberflächen von unterschiedlichen Plastikmaterialien binden und isoliert werden können, wurde wie folgt durchgeführt. Die Extraktion wurde dabei automatisiert umgesetzt. Zum Einsatz kam wieder der Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Die Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren wieder zweckentfremdet eingesetzt. Als Material zur Bindung der Nukleinsäure diente wie im Ausführungsbeispiel 1 ein angerauter Plastikkamm. Als Kontrolle wurde ein nicht behandelter Kamm eingesetzt. Zur Testung anderer Materialien wurden mittels eines 3-D-Druckers Plastikringe aus unterschiedlichen Materialien hergestellt, welche wiederum auf die Kämme des KingFisher ml Gerätes gesteckt wurden. Auch diese Ringe wurden wieder mit einem Schleifgerät angeraut. Bei den unterschiedlichen Materialien handelte es sich um angeraute Kämme der Plastik des KingFisher ml (Polypropylen), des Weiteren um das Material Biofila Linen (Fa. TwoBEars), einem Kompositmaterial bestehend aus Lignin und einem Komplexpolymer aus aromatischen Alkoholen, um das Material Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS), das Material aus Polylaktit (PLA), um das Material Polycarbonat (PC) sowie das Material Polystyrol (PS). Die Kämme vom KingFisher ml wurden dabei unterschiedlich angeraut (Typ A: ca. 3 cm des Kammes, Typ B: ca. 1 cm des Kammes; C. nur die Spitze des Kammes). Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde wiederum teilwiese aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DANN Kit/IPC16 (Analytik Jena AG) genommen. Unter Verwendung eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)
The demonstration that nucleic acids can bind to rough surfaces of different plastic materials and be isolated was performed as follows. The extraction was implemented automatically. The Magnetic Particle Processor KingFisher ml was again used. The plastic combs were again used for the process according to the invention. As the material for binding the nucleic acid served as in the embodiment 1, a roughened plastic comb. As a control, an untreated comb was used. To test other materials, plastic rings were made from a variety of materials using a 3-D printer, which were then placed on the combs of the KingFisher ml device. These rings were roughened again with a grinder. The different materials used were roughened combs of the KingFisher ml plastic (polypropylene), as well as the material Biofila Linen (TwoBEars), a composite material consisting of lignin and a complex polymer of aromatic alcohols, the material acrylonitrile-butadiene Styrene (ABS), the material of polylactite (PLA), the material polycarbonate (PC) and the material polystyrene (PS). The combs of KingFisher ml were roughened differently (type A: about 3 cm of the comb, type B: about 1 cm of the comb, C. only the tip of the comb). Approximately 1 × 10 6 NIH 3T3 cells were used as a sample. The extraction chemistry used for the isolation of the nucleic acids was in turn partially taken from the commercial extraction kit innuPREP Blood THEN Kit / IPC16 (Analytik Jena AG). Using a Lysis Solution CBV and proteinase K, the cells were lysed at 60 ° C for 15 min. During lysis, the reaction plastic of the KingFisher ml was filled with the following solutions:
  • Well 1: 400 μl isopropanol
  • Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit)
  • Well 3: 800 μl 80% ethanol
  • Well 4: 800 μl 80% ethanol
  • Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the extraction kit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Der Ablauf der Extraktion erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Die Plastikkämme (unbehandelt bzw. angeraut) sowie die Plastikkämme mit den aufgesteckten Plastikringen wurden wiederum sukzessive durch die einzelnen Kavitäten mit den vorgelegten Pufferlösungen bewegt. Final wurde die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen abgelöst. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Konzentration sowie Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280 Ratio A260:A230 unbehandelter Plastikkamm keine Nukleinsäure messbar nicht bestimmbar nicht bestimmbar nicht bestimmbar aufgerauter Plastikkamm Typ A 84 16,8 1,91 1,98 aufgerauter Plastikkamm Typ B 95 19 1,92 2,01 aufgerauter Plastikkamm Typ C 75 15 1,90 2,11 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus BioFila 178 35,6 1,95 2,22 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus ABS 179 35,8 2,03 2,30 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA 205 41 1,94 1,98 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PC 185 37 1,99 2,28 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PS 157 31,4 1,96 2,32 After lysis, the lysate (400 .mu.l) was added to the cavity 1 for already present there isopropanol and started the extraction process. The course of the extraction was carried out as described in Example 1. The plastic combs (untreated or roughened) and the plastic combs with the attached plastic rings were in turn successively moved through the individual cavities with the submitted buffer solutions. Finally, the nucleic acid in cavity 5 was detached from the plastic combs. The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement and on an agarose gel. In addition to the concentration and yield, the purity of the isolated nucleic acid was also determined. Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A 260 : A 280 Ratio A 260: A 230 untreated plastic comb no nucleic acid measurable not definable not definable not definable roughened plastic comb type A 84 16.8 1.91 1.98 roughened plastic comb type B 95 19 1.92 2.01 roughened plastic comb type C 75 15 1.90 2.11 Plastic comb with roughened ring made of BioFila 178 35.6 1.95 2.22 Plastic comb with roughened ring made of ABS 179 35.8 2.03 2.30 Plastic comb with roughened ring made of PLA 205 41 1.94 1.98 Plastic comb with roughened ring of PC 185 37 1.99 2.28 Plastic comb with roughened ring of PS 157 31.4 1.96 2.32

2 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 4 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren zeigen:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. unbehandelter Plastikkamm
  • 3. aufgerauter Plastikkamm Typ A
  • 4. aufgerauter Plastikkamm Typ B
  • 5. aufgerauter Plastikkamm Typ C
  • 6. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus BioFila
  • 7. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus ABS
  • 8. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA
  • 9. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PC
  • 10. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PS
2 shows the detection of the DNA on an agarose gel. 4 μl of nucleic acid from the total eluate of 200 μl were used per lane. The tracks show:
  • 1. DNA conductor (1b conductor)
  • 2. untreated plastic comb
  • 3. roughened plastic comb type A
  • 4. roughened plastic comb type B
  • 5. roughened plastic comb type C.
  • 6. Plastic comb with roughened ring made of BioFila
  • 7. Plastic comb with roughened ring of ABS
  • 8. Plastic comb with roughened PLA ring
  • 9. Plastic comb with roughened ring of PC
  • 10. Plastic comb with roughened ring of PS

Wie die Ergebnisse zeigen, bindet die Nukleinsäure an den unbehandelten Kämmen nicht. Sie bindet aber hocheffizient an den aufgerauten Kämmen und den aufgerauten Ringen. Damit ist gezeigt, dass die Bindung unabhängig von der Materialart ist. Alle angerauten Materialien binden hocheffizient Nukleinsäuren. Es zeigt sich ebenfalls, dass die angeraute Fläche (im Falle der Kämme) sogar nur sehr gering sein muss, um Nukleinsäuren zu binden. Es zeigt sich aber auch, dass größere Flächen auch noch höhere Mengen an Nukleinsäuren binden (die Flächen bei den eingesetzten Ringen ist größer als die angerauten Oberflächen der Kämme). Die Qualität der Nukleinsäuren ist exzellent. As the results show, the nucleic acid does not bind to the untreated combs. But it binds highly efficiently to the roughened combs and roughened rings. This shows that the bond is independent of the material type. All roughened materials efficiently bind nucleic acids. It also shows that the roughened surface (in the case of the combs) even has to be very low in order to bind nucleic acids. However, it has also been shown that larger areas also bind higher amounts of nucleic acids (the areas in the rings used are larger than the roughened surfaces of the combs). The quality of the nucleic acids is excellent.

Beispiel 3: Vergleich eines klassischen Kits zur Isolierung von Nukleinsäuren mit dem erfindungsgemäßen VerfahrenExample 3 Comparison of a Classic Kit for the Isolation of Nucleic Acids with the Method According to the Invention

Mit diesem Beispiel sollte der Vergleich zwischen einem klassischen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Als Vergleichs Kit wurde der Kit DNeasy Blood&Tissue Kit der Fa. Qiagen eingesetzt. Dieser basiert auf der Lyse der Zellen, der Bindung der Nukleinsäuren an die Oberfläche einer Spin Filtersäule mit einer Silikamembran, dem nachfolgenden Waschen der gebundenen Nukleinsäure und der finalen Elution der Nukleinsäure von der Silikamembran. Dieses Kit ist ein Standard Kit zur Extraktion von Nukleinsäuren und wird weltweit dafür eingesetzt. Es wurde nach vorliegendem Manual gearbeitet.With this example, the comparison between a classical kit for the isolation of nucleic acids with the method according to the invention should be carried out. The kit used was the Kit DNeasy Blood & Tissue Kit from Qiagen. This is based on the lysis of the cells, the binding of the nucleic acids to the surface of a spin filter column with a silica membrane, the subsequent washing of the bound nucleic acid and the final elution of the nucleic acid from the silica membrane. This kit is a standard extraction kit for nucleic acids and is used worldwide. It was worked according to this manual.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde wiederum der KingFisher ml eingesetzt. Als raue Oberfläche wurden ein aufgerauter Kamm sowie ein auf den Kamm gesteckter Ring aus angerautem PLA eingesetzt. Der Ablauf der Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte wie in den beiden Ausführungsbeispielen 1 und 2 aufgeführt. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 bzw. 2 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Konzentration sowie Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280 Ratio A260:A230 Qiagen Kit (1 × 106 Zellen) 49 9,8 1,88 2,15 Qiagen Kit(2 × 106 Zellen) 57 11,4 1,84 2,21 aufgerauter Plastikkamm (1 × 106 Zellen) 101 20,2 1,87 2,04 aufgerauter Plastikkamm (2 × 106 Zellen) 147 29,4 1,98 2,15 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (1 × 106 Zellen) 240 48 1,96 2,20 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (2 × 106 Zellen) 503 100,6 1,96 2,20 The KingFisher ml was again used for the process according to the invention. The rough surface used was a roughened comb and a ring of roughened PLA pinned to the comb. The course of the extraction by means of the method according to the invention was carried out as listed in the two embodiments 1 and 2. Approximately 1 × 10 6 NIH 3T3 or 2 × 10 6 NIH 3T3 cells were used as a sample. The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement and on an agarose gel. In addition to the concentration and yield, the purity of the isolated nucleic acid was also determined. Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A 260 : A 280 Ratio A 260: A 230 Qiagen Kit (1 × 10 6 cells) 49 9.8 1.88 2.15 Qiagen Kit (2 × 10 6 cells) 57 11.4 1.84 2.21 roughened plastic comb (1 × 10 6 cells) 101 20.2 1.87 2.04 roughened plastic comb (2 × 10 6 cells) 147 29.4 1.98 2.15 Plastic comb with roughened ring made of PLA (1 × 10 6 cells) 240 48 1.96 2.20 Plastic comb with roughened ring made of PLA (2 × 10 6 cells) 503 100.6 1.96 2.20

3 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 2 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren zeigen:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. Qiagen Kit (ca. 1 × 106 Zellen)
  • 3. Qiagen Kit (ca. 2 × 106 Zellen)
  • 4. erfindungsgemäßes Verfahren; aufgerauter Plastikkamm (ca. 1 × 106 Zellen)
  • 5. erfindungsgemäßes Verfahren; aufgerauter Plastikkamm (ca. 2 × 106 Zellen)
  • 6. erfindungsgemäßes Verfahren; Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (ca. 1 × 106 Zellen)
  • 7. erfindungsgemäßes Verfahren; Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (ca. 2 × 106 Zellen)
3 shows the detection of the DNA on an agarose gel. 2 μl of nucleic acid from the total eluate of 200 μl were used per lane. The tracks show:
  • 1. DNA conductor (1b conductor)
  • 2. Qiagen Kit (about 1 × 10 6 cells)
  • 3. Qiagen Kit (about 2 × 10 6 cells)
  • 4. Method according to the invention; roughened plastic comb (about 1 × 10 6 cells)
  • 5. Method according to the invention; roughened plastic comb (about 2 × 10 6 cells)
  • 6. Method according to the invention; Plastic comb with roughened PLA ring (about 1 × 10 6 cells)
  • 7. Method according to the invention; Plastic comb with roughened PLA ring (about 2 × 10 6 cells)

Wie die Ergebnisse zeigen, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine sehr viel höhere Menge an Nukleinsäuren gebunden und isoliert werden, als mit einem klassischen Kit. Damit sind die Bindungskapazitäten deutlich höher, als die Bindungskapazitäten eines kommerziell verfügbaren Silikamembran-Verfahrens. Dies unterstreicht den enormen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.As the results show, a much higher amount of nucleic acids can be bound and isolated with the method according to the invention than with a classical kit. Thus, the binding capacities are significantly higher than the binding capacities of a commercially available silica membrane method. This underscores the enormous advantage of the method according to the invention.

Beispiel 4: Extraktion von Nukleinsäure aus BlutExample 4: Extraction of nucleic acid from blood

Mit diesem Beispiel wird gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch aus Blutproben DNA isoliert werden kann und dabei die Ausbeuten extrem hoch sind. Eingesetzt wurden 3 ml Vollblutproben. Nach Lyse der Erythrozyten wurden die kernhaltigen Zellen pelletiert und wiederum nach Zugabe eines Lysepuffers (Lysepuffer CBV) aus dem kommerziell verfügbaren Kit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16 (Analytik Jena AG) sowie unter Zugabe von Proteinase K bei 60°C für 30 min lysiert. Eluiert wurde in 300 µl Elution Buffer.This example shows that DNA can also be isolated from blood samples by means of the method according to the invention and the yields are extremely high. 3 ml of whole blood samples were used. After lysis of the erythrocytes, the nucleated cells were pelleted and in turn lysed after addition of a lysis buffer (lysis buffer CBV) from the commercially available kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16 (Analytik Jena AG) and with the addition of proteinase K at 60 ° C for 30 min. Elution was done in 300 μl elution buffer.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde wiederum der KingFisher ml eingesetzt. Als raue Oberflächen wurde ein auf den Kamm gesteckter Ring aus angerautem Material BioFila sowie PLA eingesetzt. Der Ablauf der Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte wie in den Ausführungsbeispielen 1 bis 3 aufgeführt.The KingFisher ml was again used for the process according to the invention. The rough surfaces used were a combed ring of roughened BioFila and PLA. The course of the extraction by means of the method according to the invention was carried out as listed in the working examples 1 to 3.

Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280 Ratio A260:A230 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus Biofila 270 81 1,78 2,22 Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA 306 91,8 1,80 2,22 The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement. Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A 260 : A 280 Ratio A 260: A 230 Plastic comb with brushed ring made of biofila 270 81 1.78 2.22 Plastic comb with roughened ring made of PLA 306 91.8 1.80 2.22

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, auch aus Vollblutproben zu isolieren, wobei die erzielbaren Ausbeuten extrem hoch sind.As the results show, it is possible with the method according to the invention to also isolate from whole blood samples, wherein the recoverable yields are extremely high.

Beispiel 5: Extraktion von Nukleinsäure aus NIH 3T3 Zellen sowie aus Vollblutproben mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer modifizierten PipettenspitzeExample 5: Extraction of Nucleic Acid from NIH 3T3 Cells and Whole Blood Samples by the Method of the Invention Using a Modified Pipette Tip

Mit diesem Beispiel wird gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens extrem einfach und schnell Nukleinsäuren mittels einer modifizierten Pipettenspitze isoliert werden können.With this example it is shown that by means of the method according to the invention nucleic acids can be isolated extremely easily and quickly by means of a modified pipette tip.

Als Pipettenspitze wurde eine 1ml Pipettenspitze der Fa. Sarstedt eingesetzt. Diese Pipettenspitze wurde um ca. 5 mm gekürzt. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde dann die Innenseite der Pipettenspitze mittels eines Schleifgerätes aufgeraut.The pipette tip was a 1 ml pipette tip from Sarstedt. This pipette tip was shortened by about 5 mm. According to the method according to the invention, the inside of the pipette tip was then roughened by means of a grinding device.

Eingesetzt wurden 1 × 106 NIH 3T3 Zellen sowie 2 ml Vollblut (die Erythrozyten wurden lysiert und die kernhaltigen Zellen pelletiert und diese Zellen dann eingesetzt). Sowohl die Zellen als auch die pelletierten kernhaltigen Blutzellen wurden wie in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen behandelt und mit dem Lysepuffer CBV lysiert. Das Lysat wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 400 µl Isopropanol versetzt. Nachfolgend wurde die aufgeraute Pipettenspitze eingesetzt und mittels einer Pipette wurde der Ansatz 20× auf- und abpipettiert. Danach wurden 3 weitere 2 ml-Reaktionsgefäße mit den bekannten alkoholischen Waschpuffern (LS, 80%iger Ethanol, 80%iger Ethanol) befüllt. Die Pipettenspitze wurde dann sukzessive in die jeweiligen Waschpuffer getaucht und es wurde jeweils 5× auf- und abpipettiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Spitze getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der gebundenen Nukleinsäure erfolgte mit 200 µl Elution Buffer für die NIH 3T3 Zellen sowie mit 400 µl für die Vollblutprobe. Dieser wurde wiederum in ein 2 ml-Reaktionsgefäß gegeben. Es wurde 20× auf- und abpipettiert. Nach Entfernung der Pipettenspitze liegt die isolierte Nukleinsäure im Reaktionsgefäß vor. Das Verfahren ist extrem einfach und schnell. 1 × 10 6 NIH 3T3 cells and 2 ml whole blood were used (the erythrocytes were lysed and the nucleated cells were pelleted and these cells were then used). Both the cells and the pelleted nucleated blood cells were treated as in the previous embodiments and lysed with the lysis buffer CBV. The lysate was transferred to a 2 ml reaction vessel and 400 μl of isopropanol were added. Subsequently, the roughened pipette tip was used and by means of a pipette, the batch was pipetted up and down 20 ×. Thereafter, 3 more 2 ml reaction vessels were filled with the known alcoholic washing buffers (LS, 80% ethanol, 80% ethanol). The pipette tip was then successively in the each washing buffer dipped and it was in each case 5 × pipetted up and down. After the last washing step, the tip was dried, thereby removing the residual ethanol. The elution of the bound nucleic acid was carried out with 200 μl elution buffer for the NIH 3T3 cells and with 400 μl for the whole blood sample. This was again placed in a 2 ml reaction vessel. It was pipetted up and down 20 ×. After removal of the pipette tip, the isolated nucleic acid is present in the reaction vessel. The process is extremely simple and fast.

Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280 Ratio A260:A230 ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen; unbehandelte Pipettenspitze keine Nukleinsäure messbar nicht bestimmbar nicht bestimmbar nicht bestimmbar ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen; angeraute Pipettenspitze 84 16,8 1,97 1,88 2 ml Vollblut (Lymphozytenpellet); unbehandelte Pipettenspitze keine Nukleinsäure messbar nicht bestimmbar nicht bestimmbar nicht bestimmbar 2ml Vollblut (Lymphozytenpellet); angeraute Pipettenspitze 235 94,0 1,79 2,17 The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement. Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A 260 : A 280 Ratio A 260: A 230 about 1 x 10 6 NIH 3T3 cells; untreated pipette tip no nucleic acid measurable not definable not definable not definable about 1 x 10 6 NIH 3T3 cells; roughened pipette tip 84 16.8 1.97 1.88 2 ml whole blood (lymphocyte pellet); untreated pipette tip no nucleic acid measurable not definable not definable not definable 2 ml whole blood (lymphocyte pellet); roughened pipette tip 235 94.0 1.79 2.17

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, allein unter Verwendung einer Pipettenspitze, deren Innenseite erfindungsgemäß aufgeraut wurde, Nukleinsäure zu Binden und zu isolieren. Auch hier zeigt sich, dass die Ausbeuten extrem hoch sind. Mittels der unbehandelten Pipettenspitze können keine Nukleinsäuren isoliert werden.As the results show, it is possible with the method according to the invention to bind and isolate nucleic acid solely by using a pipette tip whose inside has been roughened according to the invention. Again, it shows that the yields are extremely high. By means of the untreated pipette tip no nucleic acids can be isolated.

Beispiel 6: Testung unterschiedlicher Lysepuffer in Kombination mit unterschiedlichen alkoholischen bzw. nichtalkoholischen Lösungen zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels des erfindungsgemäßen VerfahrensExample 6: Testing of Different Lysis Buffers in Combination with Different Alcoholic or Non-Alcoholic Solutions for the Extraction of Nucleic Acids by the Method of the Invention

Eingesetzt wurde wiederum der Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Als Material zur Bindung der Nukleinsäure diente ein mit einem Schleifgerät angerauter Ring aus BioFila Material, welcher auf die Kämme der Plastik des KingFisher ml aufgesteckt wurden. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die Lyse der Zellen wurde mit drei verschiedenen Puffern durchgeführt:

  • 1. Puffer A, enthaltend ein chaotropes Salz: Harnstoff, SDS, Tris HCl, EDTA
  • 2. Puffer B, enthaltend kein Salz: SDS; Tris HCl; EDTA
  • 3. Puffer C enthaltend ein nichtchaotropes Salz: Natriumchlorid, CTAB; Tris HCl, EDTA
The Magnetic Particle Processor KingFisher ml was used again. The material used to bind the nucleic acid was a ring of BioFila material roughened with a grinder, which was attached to the combs of the KingFisher ml plastic. Approximately 1 × 10 6 NIH 3T3 cells were used as a sample. The lysis of the cells was carried out with three different buffers:
  • 1. Buffer A, containing a chaotropic salt: urea, SDS, Tris HCl, EDTA
  • 2. Buffer B containing no salt: SDS; Tris HCl; EDTA
  • 3. Buffer C containing a non-chaotropic salt: sodium chloride, CTAB; Tris HCl, EDTA

Die Zellen wurden in 200 µl H2O resuspendiert und mit 200 µl des jeweiligen Lysepuffers sowie 20 µl versetzt und bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol oder absoluter Ethanol oder Aceton
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16)
The cells were resuspended in 200 μl H 2 O and mixed with 200 μl of the respective lysis buffer and 20 μl and lysed at 60 ° C. for 15 min. During lysis, the reaction plastic of the KingFisher ml was filled with the following solutions:
  • Well 1: 400 μl isopropanol or absolute ethanol or acetone
  • Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16)
  • Well 3: 800 μl 80% ethanol
  • Well 4: 800 μl 80% ethanol
  • Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the innuPREP Blood DNA Kit / IPC16 extraction kit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zu dort schon vorliegenden verschiedenen Lösungen (Isopropanol; absoluter Ethanol bzw. Aceton) gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Der Ablauf der Extraktion erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben Konzentration und Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280 Ratio A260:A230 Lysepuffer A + Isopropanol 174 34,8 1,90 2,10 Lysepuffer A + abs. Ethanol 213 42,6 1,89 2,11 Lysepuffer A + Aceton 220 44 1,92 2,17 Lysepuffer B + Isopropanol 150 30 1,90 2,11 Lysepuffer B + abs. Ethanol 106 21,2 1,80 1,99 Lysepuffer B + Aceton 128 25,6 1,87 1,97 Lysepuffer C + Isopropanol 112 22,4 1,85 1,97 Lysepuffer C + abs. Ethanol 98 19,6 1,86 2,00 Lysepuffer C + Aceton 89 17,8 1,87 1,99 After lysis, the lysate (400 μl) was added to cavity 1 for various solutions already present (isopropanol, absolute ethanol or acetone) and the extraction process started. The course of the extraction was carried out as described in Example 1. The proof of isolated Nucleic acid was determined by spectrophotometric measurement and on an agarose gel. In addition to concentration and yield, the purity of the isolated nucleic acid was also determined. Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A 260 : A 280 Ratio A 260: A 230 Lysis buffer A + isopropanol 174 34.8 1.90 2.10 Lysis buffer A + abs. ethanol 213 42.6 1.89 2.11 Lysis buffer A + acetone 220 44 1.92 2.17 Lysis buffer B + isopropanol 150 30 1.90 2.11 Lysis buffer B + abs. ethanol 106 21.2 1.80 1.99 Lysis buffer B + acetone 128 25.6 1.87 1.97 Lysis buffer C + isopropanol 112 22.4 1.85 1.97 Lysis buffer C + abs. ethanol 98 19.6 1.86 2.00 Lysis buffer C + acetone 89 17.8 1.87 1.99

4 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 4 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren zeigen:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. Lysepuffer A + Isopropanol
  • 3. Lysepuffer A + abs. Ethanol
  • 4. Lysepuffer A + Aceton
  • 5. Lysepuffer B + Isopropanol
  • 6. Lysepuffer B + abs. Ethanol
  • 7. Lysepuffer B + Aceton
  • 8. Lysepuffer C + Isopropanol
  • 9. Lysepuffer C + abs. Ethanol
  • 10. Lysepuffer C + Aceton
4 shows the detection of the DNA on an agarose gel. 4 μl of nucleic acid from the total eluate of 200 μl were used per lane. The tracks show:
  • 1. DNA conductor (1b conductor)
  • 2. lysis buffer A + isopropanol
  • 3. lysis buffer A + abs. ethanol
  • 4. Lysis buffer A + acetone
  • 5. Lysis buffer B + isopropanol
  • 6. lysis buffer B + abs. ethanol
  • 7. Lysis buffer B + acetone
  • 8. Lysis buffer C + isopropanol
  • 9. lysis buffer C + abs. ethanol
  • 10. Lysis buffer C + acetone

Wie die Ergebnisse zeigen, können für das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich zusammengesetzte Lysepuffer wie auch Kombination dieser Lysepuffer mit Alkoholen bzw. auch mit einem Nichtalkohol eingesetzt werden. Dabei können im Lysepuffer chaotrope Salze, kein Salz oder aber nichtchaotrope Salze enthalten sein.As the results show, differently composed lysis buffers as well as combinations of these lysis buffers with alcohols or else with a non-alcohol can be used for the process according to the invention. In this case, chaotropic salts, no salt or else non-chaotropic salts can be present in the lysis buffer.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims (11)

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren – in Anwesenheit von organischen Substanzen sowie mindestens einem Bestandteil eines Lysepuffers – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden.A method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing samples, characterized in that free or liberated by lysis nucleic acids - in the presence of organic substances and at least one component of a lysis buffer - are attached to a solid phase with a rough surface, then washed and eluted. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bestandteil eines Lysepuffers um a) chaotrope oder nicht-chaotrope Salze und / oder b) mindestens ein Detergenz und / oder c) TRIS handeltA method according to claim 1, characterized in that the constituent of a lysis buffer is a) chaotropic or non-chaotropic salts and / or b) at least one detergent and / or c) TRIS Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass weitere Zusätze, vorzugsweise eine Proteinase, enthalten sind.A method according to claim 2, characterized in that further additives, preferably a proteinase, are included. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der rauen Oberfläche um eine nicht-glatte Kunststoff- oder Gummi-Oberfläche handelt.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the rough surface is a non-smooth plastic or rubber surface. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-glatte Kunststoff-Oberfläche durch einen 3D-Druck oder durch Aufrauen eines Kunststoffs erzeugt wird.A method according to claim 4, characterized in that the non-smooth plastic surface is produced by a 3D printing or by roughening a plastic. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass raue Kompositmaterialien als feste Phase Verwendung finden.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that rough composite materials are used as the solid phase. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase angeraute Pipettenspitzen eingesetzt werden.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that as a solid phase roughened pipette tips are used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass wasserlösliche organische Substanzen, vorzugsweise Alkohole oder Ketone, eingesetzt werden. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that water-soluble organic substances, preferably alcohols or ketones, are used. Testkit zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, umfassend mindestens einen Bestandteil eines Lysepuffers, eine organische Substanz, mindestens eine feste Phase zur Anbindung der Nukleinsäuren mit rauer Oberfläche, sowie Wasch- und Elutionspuffer.Test kit for the isolation of nucleic acids from nucleic acid-containing samples, comprising at least one component of a lysis buffer, an organic substance, at least one solid phase for binding the nucleic acids with a rough surface, and wash and elution buffers. Verwendung von Materialien mit rauer Oberfläche zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben.Use of rough surface materials for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing samples. Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass ein Material mit angerauter Oberfläche als feste Phase für eine Nukleinsäure-Anbindung fungiert.Device for the isolation of nucleic acids from nucleic acid-containing samples, characterized in that a material with roughened surface acts as a solid phase for a nucleic acid binding.
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