DE102015114026A1 - Biomarker panel for the diagnosis of recurrent prostate cancer - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs, wobei eine Bestimmung mittels ausgewählten Biomarkern erfolgt. Ferner betrifft die Erfindung hierzu geeignete Kombinationen von Biomarkern-Biomarker-Panel samt Kit, insbesondere zur in-vitro Diagnostik.The invention relates to a method for the diagnosis of recurrent prostate cancer, wherein a determination is made by means of selected biomarkers. Furthermore, the invention relates to suitable combinations of biomarker biomarker panel including kit, in particular for in vitro diagnostics.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs, wobei eine Bestimmung mittels ausgewählten Biomarkern erfolgt. Ferner betrifft die Erfindung hierzu geeignete Kombinationen von Biomarkern-Biomarker-Panel samt Kit, insbesondere zur in-vitro Diagnostik. The invention relates to a method for the diagnosis of recurrent prostate cancer, wherein a determination is made by means of selected biomarkers. Furthermore, the invention relates to suitable combinations of biomarker biomarker panel including kit, in particular for in vitro diagnostics.

Ein geeigneter Biomarker(-Panel) soll die Diagnose des aggressiven, rezidivierenden Prostatakarzinoms (PCa) zu einem frühestmöglichen Zeitpunkt erlauben. Prostatakrebs ist die häufigste Krebserkrankung von Männern in Deutschland. Die Zahl der Neuerkrankungen ist in den letzten Jahren stetig angestiegen, in 2011 lag sie bei 64.515 Fällen [1]. Die Anzahl der durch Prostatakrebs bedingten Todesfälle, ist ebenfalls zwei Jahrzehnte in Deutschland stetig gestiegen. Seit 2003 jedoch, ist die alters-standardisierte Todesrate nahezu konstant geblieben. In 2011 verstarben 13.324 Männern an dieser Krankheit [1]. Eine große Herausforderung bei der Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs ist die Einschätzung des Rezidivrisikos für die Patienten. Derzeit gibt es im Stand der Technik kein Verfahren, das eine zuverlässige Aussage über die Tumorprogression der Prostata ermöglicht. Die vollständige Entfernung der Prostata sichert häufig keinen Überlebensvorteil, führt jedoch zur starken Einschränkungen der Lebensqualität, bedingt durch Nebenwirkungen wie Impotenz oder Inkontinenz. Die Einschätzung der Aggressivität der Tumore und des Rezidivrisikos einzelner Patienten vor Entfernung der Prostata ist nicht möglich. Anhand des Levels an Prostataspezifischen Antigen (kurz: PSA) im Serum der Patienten ist es bisher lediglich möglich, die Rezidivprogression postoperativ zu überwachen [2]. Der Anstieg von PSA nach einer Prostatektomie ist ein sicherer Hinweis auf ein Rezidiv und aggressiven Krebs, als Biomarker zur Detektion von aggressivem Prostatakrebs vor Entfernung der Prostata, ist PSA jedoch nicht nutzbar [2]. Für die notwendige personalisierte Therapie von Prostatakrebspatienten werden dringend neue diagnostische Tests benötigt, die Aufschluss über die individuelle Tumorprogression eines Patienten geben. Für die Entwicklung der klinischen Testverfahren werden zunächst entsprechende Targets/Antigene bzw. Biomarker benötigt. A suitable biomarker (panel) should allow the diagnosis of aggressive, recurrent prostate cancer (PCa) at the earliest possible date. Prostate cancer is the most common cancer of men in Germany. The number of new cases has risen steadily in recent years, in 2011 it was 64,515 cases [1]. The number of prostate cancer-related deaths has also risen steadily in Germany for two decades. Since 2003, however, the age-standardized death rate has remained almost constant. In 2011, 13,324 men died of this disease [1]. A major challenge in the detection and treatment of prostate cancer is the assessment of the risk of recurrence for patients. At present, there is no method in the prior art that allows a reliable statement about the tumor progression of the prostate. Complete removal of the prostate often does not provide any survival benefit but results in severe impairment of quality of life due to side effects such as impotence or incontinence. Assessing the aggressiveness of the tumors and the risk of recurrence of individual patients before removal of the prostate is not possible. Based on the level of prostate-specific antigen (PSA) in the serum of the patients, it is only possible to monitor the recurrence progression postoperatively [2]. The increase in PSA following a prostatectomy is a sure indication of recurrence and aggressive cancer as a biomarker for the detection of aggressive prostate cancer before prostate removal, but PSA is not available [2]. For the necessary personalized therapy of prostate cancer patients urgently new diagnostic tests are needed, which provide information about the individual tumor progression of a patient. For the development of the clinical test procedures appropriate targets / antigens or biomarkers are needed.

Derzeit gibt es keine Methode, die eine zuverlässige Aussage über die Tumorprogression der Prostatakarzinome ermöglicht. Noch heute ist der Goldstandard in der Diagnose des PCa der histopathologische Befund von Nadelbiopsien. Die Biopsie der Prostata ist ein invasiver Eingriff der häufig Komplikationen bei den Patienten hervorruft. So können neben Blutungen, Schmerzen, Entzündungen und Fieber beim Patienten auftreten [3, 4]. Ein Maß zur Einschätzung der Tumorprogression ist die histologische Charakterisierung des Tumors nach dem so genannten Gleason Scoring. Der Gleason Score beschreibt den Differenzierungsgrad der Prostatadrüsen [5]. Es existiert jedoch kein allgemeingültiger Zusammenhang von Gleason Score und Rezidivrisiko des Patienten. Ein bekannter jedoch in der Diagnostik gescheiterter Biomarker ist das Protein PSA. PSA ist im Serum detektierbar, ist jedoch kein ausreichend tumorspezifischer Biomarker. Heute wird PSA für das Monitoring von Patienten nach einer Prostatektomie eingesetzt. Wird nach einer Prostatektomie PSA im Serum eines Patienten detektiert, liegt ein sogenanntes biochemisches Rezidiv vor [1]. Trotz intensiver Bemühungen konnte bisher kein Biomarker identifiziert werden der zwischen aggressiven und indolenten Tumoren unterscheiden kann und in der Klinik Anwendung findet. Es besteht ein dringender Bedarf von Biomarkern sowohl für die immunhistologische Diagnostik als auch für die nicht invasive Diagnostik des PCa bzw. in-vitro Diagnostik. Currently, there is no method that provides a reliable indication of tumor progression of prostate cancer. Even today, the gold standard in the diagnosis of PCa is the histopathological findings of needle biopsies. Prostate biopsy is an invasive procedure that often causes complications in patients. This can cause bleeding, pain, inflammation and fever in the patient [3, 4]. A measure for the assessment of tumor progression is the histological characterization of the tumor after the so-called Gleason scoring. The Gleason score describes the degree of differentiation of the prostate glands [5]. However, there is no universal relationship between Gleason score and patient recurrence risk. However, a known biomarker failed in diagnostics is the protein PSA. PSA is detectable in serum but is not a sufficient tumor-specific biomarker. Today, PSA is used for monitoring patients after a prostatectomy. If PSA is detected in the serum of a patient after a prostatectomy, there is a so-called biochemical recurrence [1]. Despite intensive efforts, no biomarker has been identified that distinguishes between aggressive and indolent tumors and is used in clinical settings. There is an urgent need for biomarkers for immunohistological diagnosis as well as non-invasive diagnosis of PCa or in vitro diagnostics.

Zwecks einer geeigneten Therapie von rezidivem Prostatakrebs bedarf es einer frühen Diagnose und Differenzierung in Verbindung mit der Notwendigkeit klinische Entscheidungen zu treffen. Appropriate therapy for recurrent prostate cancer requires early diagnosis and differentiation, combined with the need to make clinical decisions.

Nachteilig an bekannten Diagnoseverfahren unter Verwendung der bisher bekannten Marker ist jedoch, dass eine frühzeitige und vollständige Erfassung von Risikopatienten nicht gelingt und daher eine Diagnose nur ungenügend oder gar zu spät erfolgt. A disadvantage of known diagnostic methods using the previously known markers, however, is that early and complete detection of high-risk patients fails and therefore a diagnosis is insufficient or even too late.

Eine der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht daher darin, ein Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs zu entwickeln, das eine verbesserte frühzeitige Diagnose sowie verbesserte Erfassung von Risikopatienten ermöglicht und den Therapieerfolg verbessert, insbesondere vor Entfernung der Prostata (Prostatektomie). An object of the invention is therefore to develop a method for the diagnosis of recurrent prostate cancer, which enables an improved early diagnosis and improved detection of high-risk patients and improves the therapeutic success, in particular before removal of the prostate (prostatectomy).

Ferner ist nachteilig, dass im Stand der Technik zumeist keine hinreichende Sensitivität und/oder Spezifität der Marker erreicht wird. Zum Beispiel besteht eine wesentliche Schwierigkeit in der Frühdiagnose von rezidivem Prostatakrebs im Fehlen eines spezifischen Biomarkers (siehe supra zu PSA). Furthermore, it is disadvantageous that in the prior art usually no sufficient sensitivity and / or specificity of the marker is achieved. For example, there is a significant difficulty in the early diagnosis of recurrent prostate cancer in the absence of a specific biomarker (see supra to PSA).

Gemäß der vorliegenden Erfindung konnten mittels einer gewebebasierten massenspektrometrischen Versuchsdurchführung Proteine als potentielle Biomarker identifiziert werden, die Tumore von Patienten mit und ohne PCa-Rezidiv voneinander unterscheiden können. Prostatakarzinome sind sehr heterogene Tumore. Für die Identifizierung der spezifischen Biomarker ist die hohe Qualität der verwendeten Proben als auch die hervorragende Begutachtung der individuellen Fälle durch Pathologen erforderlich. Alle Prostatakrebspatienten in den durchgeführten Versuchen wurden einer Prostatektomie unterzogen, die Gewebe wurden pathologisch begutachtet und es wurden über mehrere Jahre Daten über die gesundheitliche Entwicklung der Patienten erhoben. Anhand eines regelmäßigen PSA Monitoring wurde die Entstehung eines Rezidivs beobachtet und dokumentiert. Für die Analyse der Gewebe wurden die Patienten in zwei Gruppen unterteilt: Patienten mit entwickeltem Rezidiv und Patienten, die kein Rezidiv entwickelten. Die Fälle wurden hinsichtlich histologischer und pathologischer Charakteristika gematcht (Gleason Score, TNM-Status, negativer Resektionsrand), außerdem wurden alle die Patienten von den Versuchen ausgeschlossen, die bereits vor der Prostatektomie eine Therapie erhalten hatten. Durch den Ausschluss dieser Patienten wurden artifiziell induzierte Effekte auf die Biochemie des Tumors ausgeschlossen. Die Versuche zeichnen sich durch die hoch spezialisierte Isolierung von Tumorzellen aus. Die hohe Spezifizierung wurde durch die gezielte Isolierung von Tumorzellen mittels lasergestützter Mikrodissektion möglich. Mittels labelfreier Massenspektrometrie wurden die Tumorproteome der beiden Patientengruppen miteinander verglichen. Durch diesen Vergleich konnten differentiell regulierte Proteine identifiziert werden, die mit statistischer Signifikanz (siehe Fold Change) die Gruppen voneinander trennen und in Tabelle 1 dargestellt sind. According to the present invention, proteins could be identified as potential biomarkers by means of a tissue-based mass spectrometric experimental procedure and without PCa recurrence. Prostate cancers are very heterogeneous tumors. The identification of specific biomarkers requires the high quality of the samples used as well as the excellent assessment of individual cases by pathologists. All prostate cancer patients undergoing prostatectomy underwent prostatectomy, tissues were assessed pathologically and data on patient health development was collected over several years. On the basis of a regular PSA monitoring the emergence of a recurrence was observed and documented. For the analysis of the tissues, the patients were divided into two groups: patients with developed relapse and patients who did not develop relapse. The cases were matched for histological and pathological characteristics (Gleason score, TNM status, negative resection margin) and all patients were excluded from the trials that had received treatment prior to the prostatectomy. The exclusion of these patients excluded artificially induced effects on the biochemistry of the tumor. The experiments are characterized by the highly specialized isolation of tumor cells. The high specification was made possible by the targeted isolation of tumor cells by means of laser-assisted microdissection. Label-free mass spectrometry was used to compare the tumor proteomes of the two patient groups. By this comparison, differentially regulated proteins could be identified that separated the groups with statistical significance (see fold change) and are shown in Table 1.

Die Aufgabe wird daher durch ein Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs gelöst, wobei eine Bestimmung mindestens eines der Polypeptide / Proteine ausgewählt aus der Gruppe der genannten Proteine gemäß Tabelle 1, insbesondere SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54 oder jeweils Fragmente oder Teilpeptide davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten erfolgt (nachstehend erfindungsgemäßes Verfahren). The object is therefore achieved by a method for the diagnosis of recurrent prostate cancer, wherein a determination of at least one of the polypeptides / proteins selected from the group of said proteins according to Table 1, in particular SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 54 or in each case fragments or partial peptides thereof to or from a patient to be examined is carried out (method according to the invention).

Die Erfindung betrifft ebenfalls solche Aminosäure-Sequenzen (Polypeptide, Proteine), die eine Sequenzidentität oder Homologie von 70% und mehr, vorzugsweise von 80% und mehr, besonders bevorzugt von 90–95% und mehr mit SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54 aufweisen. Ebenfalls mit eingeschlossen sind solche analoge Aminosäure-Sequenzen, die aufgrund des Austausches von einer oder mehreren Aminosäure(n) in diesen Sequenzen, dennoch die gewünschte Funktion eines Biomarkers zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs gewährleisten. Erfindungsgemäß ausdrücklich eingeschlossen sind insbesondere Teilpeptide oder Fragmente von SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54. The invention also relates to those amino acid sequences (polypeptides, proteins) which have a sequence identity or homology of 70% and more, preferably 80% and more, more preferably 90-95% and more with SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 54 have. Also included are such analogous amino acid sequences which, because of the replacement of one or more amino acids in these sequences, still provide the desired function of a biomarker for the diagnosis of recurrent prostate cancer. In particular, partial peptides or fragments of SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 54th

Die erfindungsgemäßen Proteine (Biomarker) erweisen sich wie folgt: Tabelle 1: SEQ ID No. Accession UniProt/Swiss-Prot Fold Change Gene Protein 1 Q99574 434,701119 SERPINI1 Neuroserpin 2 P47736 10,3179897 RAP1GAP Rap1 GTPase-activating protein 1 3 Q9NX05 9,47936224 FAM120C Constitutive coactivator of PPAR-gamma-like protein 2 4 O00422 8,62108829 SAP18 Histone deacetylase complex subunit SAP18 5 P02511 7,14968658 CRYAB Alpha-crystallin B chain 6 P47985 5,17263718 UQCRFS1 Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial 7 Q16540 4,59753322 MRPL23 39S ribosomal protein L23, mitochondrial 8 Q9Y5Q9 4,54232206 GTF3C3 General transcription factor 3C polypeptide 3 9 P17812 3,85181924 CTPS1 CTP synthase 1 10 Q8IWA4 2,88505736 MFN1 Mitofusin-1 11 O76062 2,50336733 TM7SF2 Delta(14)-sterol reductase 12 Q8TAE8 2,47536282 GADD45GIP1 Growth arrest and DNA damage-inducible proteins-interacting protein 1 13 Q5VT66 2,29575709 MARC1 Mitochondrial amidoxime-reducing component 1 14 Q9BXP2 2,09899685 SLC12A9 Solute carrier family 12 member 9 15 Q13084 2,08712933 MRPL28 39S ribosomal protein L28, mitochondrial 16 P50148 2,00199726 GNAQ Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha 17 Q8NEU8 1,98739687 APPL2 DCC-interacting protein 13-beta 18 Q9BTX1 1,94833263 NDC1 Nucleoporin NDC1 19 Q9BZV1 1,82673834 UBXN6 UBX domain-containing protein 6 20 P02748 1,80819466 C9 Complement component C9 21 Q9NRF8 1,76343696 CTPS2 CTP synthase 2 22 Q6UXV4 1,71035998 APOOL MICOS complex subunit MIC27 23 Q9Y2Q0 1,70725671 ATP8A1 Phospholipid-transporting ATPase IA 24 O60784 1,70596731 TOM1 Target of Myb protein 1 25 Q9H223 1,67405857 EHD4 EH domain-containing protein 4 26 Q8NE01 1,6471592 CNNM3 Metal transporter CNNM3 27 Q7Z2W7 1,63910696 TRPM8 Transient receptor potential cation channel subfamily M member 8 28 O15020 1,56776574 SPTBN2 Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2 29 O15269 1,52096821 SPTLC1 Serine palmitoyltransferase 1 30 O43488 –1,52692754 AKR7A2 Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 31 Q9Y2H6 –1,54109511 FNDC3A Fibronectin type-III domain-containing protein 3A 32 P23381 –1,58456831 WARS Tryptophan-tRNA ligase, cytoplasmic 33 Q9Y3Q3 –1,60414618 TMED3 Transmembrane emp24 domain-containing protein 3 34 P13804 –1,60501137 ETFA Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial 35 Q15435 –1,61918989 PPP1R7 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7 36 P38117 –1,64315128 ETFB Electron transfer flavoprotein subunit beta 37 Q9P2R7 –1,7068819 SUCLA2 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial 38 Q15293 –1,7270237 RCN1 Reticulocalbin-1 39 P26639 –1,72881925 TARS Threonine-tRNA ligase, cytoplasmic 40 Q13451 –1,79906061 FKBP5 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP5 41 Q9NP61 –1,82608643 ARFGAP3 ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 3 42 P07947 –1,84722983 YES1 Tyrosine-protein kinase Yes 43 P08727 –2,16474718 KRT19 Keratin, type I cytoskeletal 19 44 O75674 –2,18341 TOM1L1 TOM1-like protein 1 45 P02747 –2,2808604 C1QC Complement C1q subcomponent subunit C 46 Q99538 –2,48514548 LGMN Legumain 47 P36959 –2,50270965 GMPR GMP reductase 1 48 Q14019 –2,56941981 COTL1 Coactosin-like protein 49 Q96AQ6 –2,77405581 PBXIP1 Pre-B-cell leukemia transcription factor-interacting protein 1 50 P01877 –3,3034124 IGHA2 Ig alpha-2 chain C region 51 P08294 –3,6553748 SOD3 Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] 52 Q14573 –4,07738514 ITPR3 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 3 53 P15907 –4,81753027 ST6GAL1 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 54 O15258 –12,0748768 RER1 Protein RER1 The proteins according to the invention (biomarkers) are as follows: TABLE 1 SEQ ID no. Accession UniProt / Swiss-Prot Fold change Gene protein 1 Q99574 434.701119 SERPINI1 neuroserpin 2 P47736 10.3179897 Rap1GAP Rap1 GTPase-activating protein 1 3 Q9NX05 9.47936224 FAM120C Constitutive coactivator of PPAR-gamma-like protein 2 4 O00422 8.62108829 SAP18 Histone deacetylase complex subunit SAP18 5 P02511 7.14968658 CRYAB Alpha-crystallin B chain 6 P47985 5.17263718 UQCRFS1 Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial 7 Q16540 4.59753322 MRPL23 39S ribosomal protein L23, mitochondrial 8th Q9Y5Q9 4.54232206 GTF3C3 General transcription factor 3C polypeptide 3 9 P17812 3.85181924 CTPS1 CTP synthase 1 10 Q8IWA4 2.88505736 MFN1 Mitofusin-1 11 O76062 2.50336733 TM7SF2 Delta (14) sterol reductase 12 Q8TAE8 2.47536282 GADD45GIP1 Growth arrest and DNA damage-inducible protein-interacting protein 1 13 Q5VT66 2.29575709 MARC1 Mitochondrial amidoxime-reducing component 1 14 Q9BXP2 2.09899685 SLC12A9 Solute carrier family 12 member 9 15 Q13084 2.08712933 MRPL28 39S ribosomal protein L28, mitochondrial 16 P50148 2.00199726 GNAQ Guanine nucleotide-binding protein G (q) subunit alpha 17 Q8NEU8 1.98739687 APPL2 DCC-interacting protein 13-beta 18 Q9BTX1 1.94833263 NDC1 Nucleoporin NDC1 19 Q9BZV1 1.82673834 UBXN6 UBX domain-containing protein 6 20 P02748 1.80819466 C9 Complement component C9 21 Q9NRF8 1.76343696 CTPS2 CTP synthase 2 22 Q6UXV4 1.71035998 APool MICOS complex subunit MIC27 23 Q9Y2Q0 1.70725671 ATP8A1 Phospholipid-transporting ATPase IA 24 O60784 1.70596731 TOM1 Target of Myb protein 1 25 Q9H223 1.67405857 EHD4 EH domain-containing protein 4 26 Q8NE01 1.6471592 CNNM3 Metal transporter CNNM3 27 Q7Z2W7 1.63910696 TRPM8 Transient receptor potential cation channel subfamily M member 8 28 O15020 1.56776574 SPTBN2 Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2 29 O15269 1.52096821 SPTLC1 Serine palmitoyltransferase 1 30 O43488 -1.52692754 AKR7A2 Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 31 Q9Y2H6 -1.54109511 FNDC3A Fibronectin type-III domain-containing protein 3A 32 P23381 -1.58456831 WARS Tryptophan tRNA ligase, cytoplasmic 33 Q9Y3Q3 -1.60414618 TMED3 Transmembrane emp24 domain-containing protein 3 34 P13804 -1.60501137 ETFA Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial 35 Q15435 -1.61918989 PPP1R7 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7 36 P38117 -1.64315128 ETFB Electron transfer flavoprotein subunit beta 37 Q9P2R7 -1.7068819 SUCLA2 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial 38 Q15293 -1.7270237 RCN1 Reticulocalbin-1 39 P26639 -1.72881925 TARS Threonine tRNA ligase, cytoplasmic 40 Q13451 -1.79906061 FKBP5 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP5 41 Q9NP61 -1.82608643 ARFGAP3 ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 3 42 P07947 -1.84722983 YES1 Tyrosine protein kinase Yes 43 P08727 -2.16474718 KRT19 Keratin, type I cytoskeletal 19 44 O75674 -2.18341 TOM1L1 TOM1-like protein 1 45 P02747 -2.2808604 C1QC Complement C1q subcomponent subunit C 46 Q99538 -2.48514548 LGMN legumain 47 P36959 -2.50270965 GMPR GMP reductase 1 48 Q14019 -2.56941981 COTL1 Coactosin-like protein 49 Q96AQ6 -2.77405581 PBXIP1 Pre-B-cell leukemia transcription factor-interacting protein 1 50 P01877 -3.3034124 IGHA2 Ig alpha-2 chain C region 51 P08294 -3.6553748 SOD3 Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] 52 Q14573 -4.07738514 ITPR3 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 3 53 P15907 -4.81753027 ST6GAL1 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 54 O15258 -12.0748768 RER1 Protein RER1

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Kombinationen (Unterkombination aus der obigen Gesamtheit aller erfindungsgemäßen Biomarker) der erfindungsgemäßen Biomarker zur Diagnose vorteilhaft. Besonders bevorzugt ist jedoch SEQ ID No. 1 (Neuroserpin), SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 6. Weiterhin bevorzugt ist ein Panel enthaltend mindestens SEQ ID No. 1 neben mindestens einer weiteren SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 54, insbesondere SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 6. In a further preferred embodiment, combinations (subcombination of the above entirety of all biomarkers according to the invention) of the biomarkers according to the invention are advantageous for diagnosis. However, particular preference is given to SEQ ID no. 1 (neuroserpin), SEQ ID no. 2 to SEQ ID no. 6. Further preferred is a panel containing at least SEQ ID NO. 1 in addition to at least one further SEQ ID no. 2 to SEQ ID no. 54, in particular SEQ ID no. 2 and SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 2 to SEQ ID no. 6th

Darüber hinaus ist bevorzugt ein Panel enthaltend mindestens drei Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, und SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 6. In addition, a panel containing at least three sequences selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 54, in particular selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 3, and SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 6th

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Panel (Anordnung) von Markern für die Diagnose von rezidivem Prostatakrebs umfassend mindestens zwei oder drei verschiedene Biomarker unabhängig voneinander ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 54, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, und SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 6, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 54 mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 54 und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 54 mit mindestens 95 % Homologie. The invention therefore relates to a panel (arrangement) of markers for the diagnosis of recurrent prostate cancer comprising at least two or three different biomarkers independently selected from the sequences SEQ ID NO. 1 to 54, in particular selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 3, and SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 6, homologs of the sequences SEQ ID no. 1 to 54 with at least 95% homology and partial sequences of SEQ ID NO. 1 to 54 and partial sequences of the homologs of SEQ ID no. 1 to 54 with at least 95% homology.

Aufgrund der hohen klinischen und serologischen Heterogenität der rezidiven Prostatakrebs-Erkrankung ist es schwierig, mit nur einem Biomarker rezidiven Prostatakrebs eindeutig zu diagnostizieren. Daher ist es oft erforderlich, möglichst unkorrelierte Antigene zu sogenannten Paneln von Markern („Biomarker-Panel für rezidiven Prostatakrebs“) zu kombinieren. Beispielsweise im Rahmen der individualisierten Medizin können entsprechende Panel von erfindungsgemäßen Biomarkern für rezidiven Prostatakrebs für einzelne Patienten oder Patientengruppen individuell zusammengestellt werden. Due to the high clinical and serological heterogeneity of the recurrent prostate cancer disease, it is difficult to unequivocally diagnose recurrent prostate cancer with just one biomarker. Therefore, it is often necessary to combine uncorrelated antigens into so-called marker panels ("biomarker panel for recurrent prostate cancer"). For example, in the context of individualized medicine, corresponding panels of biomarkers according to the invention for recurrent prostate cancer can be individually compiled for individual patients or patient groups.

Der Begriff „rezidiven Prostatakrebs“ umfasst erfindungsgemäß einen solchen Prostatakrebs bzw. Prostatakarzinom oder entsprechenden Tumor, der mit einem Rezidivrisiko einhergeht, d.h. das Wiederauftreten eines Prostatakrebs nach erfolgter Erstbehandlung am Patienten. The term "recurrent prostate cancer" according to the invention comprises such a prostate cancer or prostate cancer or tumor, which is associated with a risk of recurrence, i. the recurrence of a prostate cancer after initial treatment on the patient.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Identifizierung von Patienten mit erhöhtem Risiko oder/und einer ungünstigen Prognose eines rezidiven Prostatakrebs, insbesondere bei symptomatischen und / oder asymptomatischen Patienten. The invention also relates to the identification of patients at increased risk and / or unfavorable prognosis of recurrent prostate cancer, especially in symptomatic and / or asymptomatic patients.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht daher klinische Entscheidungen, die zu einem schnellen Therapieerfolg und zur Vermeidung von Todesfällen führen. Solche klinische Entscheidungen umfassen ebenfalls weiterführende Behandlungen mittels Arzneimitteln zur Behandlung oder Therapie von rezidivem Prostatakrebs als auch eine Entscheidung zur Prostatektomie. The method according to the invention therefore makes possible clinical decisions which lead to rapid therapeutic success and to the avoidance of death. Such clinical decisions also include on-going treatments using drugs to treat or treat recurrent prostate cancer as well as a decision on prostatectomy.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Diagnose von Patienten mit rezidivem Prostatakrebs zur Durchführung von klinischen Entscheidungen, wie weiterführende Behandlung und Therapie mittels Arzneimitteln. Therefore, the invention also relates to a method for diagnosing patients with recurrent prostate cancer for making clinical decisions, such as further treatment and therapy by drugs.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Diagnose zur Prognose, zur differentialdiagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur Beurteilung des Schweregrades und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung. In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the diagnosis is made for the prognosis, for the differential diagnostic early detection and recognition, for the evaluation of the degree of severity and for the therapy-accompanying course assessment.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnostik zur Früh- oder Differentialdiagnose oder Prognose von rezidivem Prostatakrebs, wobei eine Bestimmung der erfindungsgemäßen Biomarker an oder von einem zu untersuchenden Patienten durchgeführt wird. In a further preferred embodiment, the invention relates to a method for diagnostics for the early or differential diagnosis or prognosis of recurrent prostate cancer, wherein a determination of the biomarker according to the invention is carried out on or by a patient to be examined.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dem zu untersuchenden Patienten Gewebeproben oder Körperflüssigkeit (Blut, Plasma, Prostatagewebe) entnommen, und die Diagnose erfolgt in vitro/ex vivo, d.h. außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers. Aufgrund der Bestimmung der erfindungsgemäßen Marker wird eine hohe Signifikanz für das rezidive Prostatakrebs erzielt und anhand der vorhandenen Menge oder deren Veränderung (Levelierung: Erhöhung / Erniedrigung) in mindestens einer Patientenprobe kann die Diagnose erfolgen. In one embodiment of the method according to the invention, tissue samples or body fluid (blood, plasma, prostate tissue) are taken from the patient to be examined, and the diagnosis is made in vitro / ex vivo, i. outside the human or animal body. Due to the determination of the markers according to the invention, a high significance for the recurrent prostate cancer is achieved, and the diagnosis can be made on the basis of the existing amount or its change (leveling: increase / decrease) in at least one patient sample.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen einer in-vitro Diagnose mittels parallelen oder simultanen Bestimmungen der Marker durchgeführt werden (z.B. Multititerplatten mit 96 und mehr Kavitäten), wobei die Bestimmungen an mindestens einer Patientenprobe durchgeführt werden. In a further embodiment of the invention, the method of the invention may be carried out as part of an in vitro diagnosis by means of parallel or simultaneous determinations of the markers (e.g., 96 and more well multi-well plates), with determinations being made on at least one patient sample.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer 2D-Elektrophorese erfolgen, wobei in der ersten Dimension eine isoelektrische Fokussierung, in der zweiten Dimension eine Gelelektrophorese durchgeführt wird (im weitesten Sinne ist hierzu die Proteomforschung („Proteomics“) anzuwenden). In a further embodiment of the invention, the method according to the invention can be carried out by means of 2D electrophoresis, in the first dimension an isoelectric focusing, in the second dimension a gel electrophoresis is carried out (in the broadest sense proteomics is to be used for this purpose) ,

In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren und dessen Bestimmungen mittels einem Schnelltest durchgeführt werden (z.B. lateral-flow Test), sei es in Einzel- oder Multiparameterbestimmung. In a further embodiment, the method according to the invention and its determinations can be carried out by means of a rapid test (for example, lateral-flow test), whether in single or multiparameter determination.

Der Fachmann ist in der Lage ausgewiesene Sonden und Antikörper zur Detektion der erfindungsgemäßen Biomarker herzustellen und einzusetzen, siehe unten. The person skilled in the art is able to prepare and use labeled probes and antibodies for the detection of the biomarkers according to the invention, see below.

In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren in-vivo durchgeführt werden, wobei die erfindungsgemäßen Biomarker mit einer Sonde, insbesondere ein Antikörper, die ein Kontrastmittel aufweisen markiert und mit einem in der Bildgebung geeignetem Detektor („Molecular Imaging“) nachgewiesen werden ( Ralph Weissleder, Molecular Imaging in Cancer, Science, Vol. 312, 1168 (2006) ). In a further embodiment, the method according to the invention can be carried out in vivo, wherein the biomarkers according to the invention are labeled with a probe, in particular an antibody which has a contrast agent, and detected with a detector which is suitable for imaging ("molecular imaging") ( Ralph Weissleder, Molecular Imaging Cancer, Science, Vol. 312, 1168 (2006) ).

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Biomarker zur Diagnose und / oder Prognose und/oder zur Früh- oder Differentialdiagnose von rezidivem Prostatakrebs. Furthermore, the invention relates to the use of the biomarkers according to the invention for the diagnosis and / or prognosis and / or for the early or differential diagnosis of recurrent prostate cancer.

Die Erfindung betrifft zudem ein Kit oder eine diagnostische Vorrichtung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, insbesondere enthaltend Nachweisreagenzien und weitere Hilfsmittel. Solche Nachweisreagenzien umfassen z.B. Antikörper etc. The invention additionally relates to a kit or a diagnostic device for carrying out the methods according to the invention, in particular containing detection reagents and further auxiliaries. Such detection reagents include e.g. Antibodies etc.

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter einer solchen diagnostischen Vorrichtung, insbesondere ein Array oder Assay verstanden (z.B. Immunoassay, ELISA etc.), insbesondere ein Proteinbiochip ( US6346413B1 . US20050014292 ) im weitesten Sinne eine Vorrichtung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. In the context of this invention is meant such a diagnostic device, in particular an array or assay (eg immunoassay, ELISA etc.), in particular a protein biochip ( US6346413B1 , US20050014292 ) in the broadest sense an apparatus for carrying out the method according to the invention.

Der Nachweis und die Quantifizierung der erfindungsgemäßen Biomarker kann ebenfalls mit Hilfe weiterer, dem Fachmann geläufiger Protein-Diagnoseverfahren durchgeführt werden, insbesondere unter Verwendung radioaktiv oder fluoreszenzmarkierter Antikörper. Zu nennen sind hier insbesondere dazu geeignete bioanalytische Verfahren, wie zum Beispiel Immunhistochemie, Antikörperarrays, Luminex, ELISA, Immunfluoreszenz, Radioimmunoassays sowie weiteren geeigneten bioanalytischen Verfahren, wie zum Beispiel massenspektrometrischen Verfahren, z.B. MRM (Multi reaction monitoring) oder AQUA (absolute Quantification), mit deren Hilfe die Biomarker quantitativ gemessen werden können, durchgeführt werden. The detection and quantification of the biomarkers according to the invention can likewise be carried out with the aid of further protein diagnostic methods familiar to the person skilled in the art, in particular using radioactively or fluorescently labeled antibodies. These include, in particular, suitable bioanalytical methods, such as, for example, immunohistochemistry, antibody arrays, Luminex, ELISA, immunofluorescence, radioimmunoassays and other suitable bioanalytical methods, for example mass spectrometric methods, e.g. MRM (Multi-Reaction Monitoring) or AQUA (Absolute Quantification), with the help of which the biomarkers can be measured quantitatively.

Nachfolgende Beispiele und Abbildungen dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, jedoch ohne die Erfindung auf diese Beispiele und Abbildungen zu beschränken. The following examples and illustrations serve to explain the invention in more detail, but without restricting the invention to these examples and illustrations.

Beispiele und Abbildungen: Examples and illustrations:

Experimentelles Design Experimental design

Ziel der Studie war die Identifizierung von Unterschieden in den Tumorproteomen von Prostatakrebspatienten mit und ohne Rezidiventwicklung nach einer radikalen Prostatektomie. The aim of the study was to identify differences in the tumor proteomics of prostate cancer patients with and without recurrence after radical prostatectomy.

Abb. 1: Fig. 1:

Die zeigt das experimentelle Design schematisch und zeigt den Workflow zur Identifizierung von Biomarkern. Tumorgewebe und korrelierendes tumorfreies Gewebe von Prostatakrebspatienten mit oder ohne Rezidiv wurde mittels labelfreier Massenspektrometrie analysiert. The shows the experimental design schematically and shows the workflow for the identification of biomarkers. Tumor tissue and correlated tumor-free tissue from prostate cancer patients with or without recurrence were analyzed by label-free mass spectrometry.

Beispiel 1: Example 1:

Klinische Daten Clinical data

Das Tumorgewebe von 14 Prostatakrebspatienten wurde für eine differenzielle labelfreie Proteomstudie verwendet. Die Patientenproben wurden hinsichtlich ihres Tumorstatus (TNM System, T3a/b, N0, M0) und Gleason Scores (Differenzierung der Drüsen, Gleason 7) gematcht. Es wurden Patienten mit und ohne Entwicklung eines Rezidivs nach radikaler Prostatektomie untersucht. Vor der Operation erhielten die Patienten weder eine Hormontherapie, noch Bestrahlung. Alle Patienten wiesen nach der Prostatektomie einen negativen Resektionsrand auf (R0). Die Patienten dieser Studie wurden in der Klinik für Urologie der Uniklinik RWTH Aachen behandelt. Die Prostatektomieproben wurden nach der Operation in flüssigen Stickstoff schockgefroren und unter Tieftemperatur (–80°C) gelagert. Die Befundung der Gewebeproben wurde in der Pathologie der Uniklinik RWTH Aachen nach dem UICC TNM Systems [1] durchgeführt. Die Follow-up Informationen über den Krankheitsverlauf der Patienten wurden gesammelt und dokumentiert. Ein Rezidiv wurde definiert als der Anstieg von Prostata spezifischen Antigen (PSA) im Blut der Patienten (> 0,2 ng/ml). In dieser Studie wurden Patienten untersucht die im Mittel nach 38 Monaten ein Rezidiv entwickelten. Das Follow-up der rezidivfreien Patienten wurde im Mittel über 56 Monate gesammelt. The tumor tissue of 14 prostate cancer patients was used for a differential label-free proteome study. The patient samples were matched for tumor status (TNM system, T3a / b, N0, M0) and Gleason score (Gleason differentiation, Gleason 7). Patients with and without development of relapse after radical prostatectomy were studied. Before surgery, patients received neither hormone therapy nor radiation. All patients had a negative resection margin after prostatectomy (R0). The patients of this study were treated in the Department of Urology of the University Hospital RWTH Aachen. The prostatectomy specimens were flash frozen after surgery in liquid nitrogen and stored at cryogenic temperature (-80 ° C). The findings of the tissue samples were carried out in the pathology of the University Hospital RWTH Aachen after the UICC TNM Systems [1]. The follow-up information on the disease course of the patients was collected and documented. Recurrence was defined as the increase of prostate-specific antigen (PSA) in the blood of patients (> 0.2 ng / ml). In this study, patients were studied who developed relapse on average after 38 months. The follow-up of the relapse-free patients was collected on average over 56 months.

Beispiel 2: Example 2:

Probenpräparation sample preparation

Wenn nicht anders gekennzeichnet wurden für alle Schritte der Probenpräparation Chemikalien mit einem geeigneten Reinheitsgrad für Massenspektrometrie verwendet. Unless otherwise indicated, for all steps of sample preparation, chemicals with a suitable purity for mass spectrometry were used.

Beispiel 3: Example 3:

Gewebepräparation tissue preparation

Nach der Prostatektomie wurde das Gewebe im flüssigen Stickstoff schockgefroren und bei Tieftemperaturen (–80°C) gelagert. Für die labelfreie Proteomstudie wurden 10 µm dicke Schnitte auf Glasträgern angefertigt und von einem Pathologen begutachtet. Nach der Befundung wurden 10 µm dicke Schnitte auf PEN-Slides (Zeiss, München, GER) für die Lasermikrodissektion aufgebracht. Um einen proteolytischen Abbau der Proteine zu vermeiden und die Gewebestrukturen zu konservieren wurden die Schnitte in einer Ethanolreihe fixiert (70 %, 1 min, 100 %, 5 sec). Die Schnitte wurden bis zur Lasermikrodissektion in luftdichten Boxen bei –80°C gelagert. Following prostatectomy, the tissue was snap frozen in liquid nitrogen and stored at cryogenic temperatures (-80 ° C). For the label-free proteome study, 10 μm thick sections were made on glass slides and examined by a pathologist. After the diagnosis, 10 μm thick sections were applied to PEN slides (Zeiss, Munich, GER) for laser microdissection. In order to avoid proteolytic degradation of the proteins and to preserve the tissue structures, the sections were fixed in an ethanol series (70%, 1 min, 100%, 5 sec). The sections were stored in airtight boxes at -80 ° C until laser microdissection.

Beispiel 4: Example 4:

Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung Hematoxylin and eosin (HE) staining

Um die Gewebestrukturen und Zellen für die Lasermikrodissektion zu visualisieren, wurde eine HE Färbung durchgeführt. Alle Lösungen für die Färbung der Gewebeschnitte wurden gekühlt (4°C), Leitungswasser wurde mit Proteaseinhibitoren versetzt (complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, GER). Nach kurzem Eintauchen in Leitungswasser, wurden die Schnitte 2 min in Hämatoxylin (Sigma Aldrich Co. LLC, MO, USA) inkubiert, gefolgt von einer erneuten Inkubation in Leitungswasser zum Bläuen des Gewebes. Eosin Y (0,5 %) wurden zum Anfärben der Bindegewebsanteile benutz, der Schnitt wurde wenige Sekunden inkubiert. Das Gewebe wurde dann durch eine Ethanolreihe (50 %, 70 %, 95 %, je 15 sec und 100 %, 1 min) dehydriert und anschließen mikrodissektiert. To visualize the tissue structures and cells for laser microdissection, an HE staining was performed. All solutions for staining the tissue sections were cooled (4 ° C.), tap water was mixed with protease inhibitors (complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, GER). After a brief immersion in tap water, the sections were incubated for 2 minutes in hematoxylin (Sigma Aldrich Co., LLC, MO, USA) followed by reincubation in tap water to blue the tissue. Eosin Y (0.5%) was used to stain connective tissue fractions Cut was incubated for a few seconds. The tissue was then dehydrated through an ethanol series (50%, 70%, 95%, 15 sec. And 100%, 1 min.) And then microdissected.

Beispiel 5: Example 5:

Lasermikrodissektion laser microdissection

Um die Tumorzellen und Epithelzellen gezielt aus dem Gewebeverbund isolieren und analysieren zu können, wurde eine lasergestützte Mikrodissektion (PALM MicroBeam, Zeiss) vorgenommen. Für jeden Patienten und jede experimentelle Bedingung (siehe ) wurde 1 mm2 Tumorzellen bzw. korrespondierende tumorfreie Drüsenzellen isoliert. Die Zellen wurden in Aufschlusspuffer (0,1 M Ammoniumbicarbonat, 0,1 % RapiGestTM surfactant (Waters GmbH, Eschborn, GER, pH 8.3)) gesammelt und bei –80°C gelagert. In order to be able to isolate and analyze the tumor cells and epithelial cells specifically from the tissue composite, a laser-assisted microdissection (PALM MicroBeam, Zeiss) was performed. For every patient and every experimental condition (see ) 1 mm 2 tumor cells or corresponding tumor-free glandular cells was isolated. The cells were collected in digestion buffer (0.1M ammonium bicarbonate, 0.1% RapiGest ™ surfactant (Waters GmbH, Eschborn, GER, pH 8.3)) and stored at -80 ° C.

Beispiel 6: Example 6:

Verdau und Identifizierung von Proteinen Digestion and identification of proteins

Für die labelfreie Flüssigchromatographie und anschließende Massenspektrometrie (liquid chromatography mass spectrometry LC-MS/MS) wurden die gesammelten Zellen zuerst aufgeschlossen und dann proteolytisch mit Trypsin verdaut. Für die Lyse der Zellen wurden die Proben zweimal in eisgekühlten Wasser sonifiziert (1 min, 20 sec). Die Proben wurden zentrifugiert und die Proteine bei 95°C (5 min) denaturiert. Die denaturierten Proteine wurden mit Dithiothreitol (Endkonzentration von 5 mM) reduziert (60°C, 30 min) und mit Iodacetamid (Endkonzentration 15 mM) unter Lichtausschluss alkyliert (Raumtemperatur, 30 min). Der proteolytische Verdau wurde mit Trypsin (Serva Electrophoresis, Heidelberg, GER) in einem Verhältnis von 1:20 zur Probe über Nacht bei 37°C durchgeführt. Die Reaktion wurde unter Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA, Sigma Aldrich Co. LLC, Endkonzentration von 0,5 %) gestoppt. Das Detergenz RapiGest und die PEN-Membran wurde mittels Zentrifugation (16.000 g, 10 min) aus der Probe gefällt. Die Peptidkonzentration wurde mittels Aminosäurensequenzanalyse (ASA) bestimmt. Dazu wurde eine ACQUITY-UPLC mit einer AccQ Tag Ultra-UPLC Säule (Waters), kalibriert mit Pierce Amino Acid Standard (Thermo Scientific, Bremen, GER) eingesetzt. Die Peptide wurden für die LC-MS/MS Analyse in 0,1 % TFA gelöst. Jede Probe wurde in technischen Triplikaten vermessen. For the label-free liquid chromatography and subsequent mass spectrometry (LC-MS / MS), the collected cells were first digested and then proteolytically digested with trypsin. For the lysis of the cells, the samples were sonicated twice in ice-cold water (1 min, 20 sec). The samples were centrifuged and the proteins denatured at 95 ° C (5 min). The denatured proteins were reduced with dithiothreitol (final concentration of 5 mM) (60 ° C, 30 min) and alkylated with iodoacetamide (final concentration 15 mM) with exclusion of light (room temperature, 30 min). The proteolytic digestion was performed with trypsin (Serva Electrophoresis, Heidelberg, GER) at a ratio of 1:20 to the sample overnight at 37 ° C. The reaction was stopped by adding trifluoroacetic acid (TFA, Sigma Aldrich Co. LLC, final concentration of 0.5%). The detergent RapiGest and the PEN membrane were precipitated from the sample by centrifugation (16,000 g, 10 min). The peptide concentration was determined by amino acid sequence analysis (ASA). An ACQUITY UPLC with an AccQ Tag Ultra-UPLC column (Waters) calibrated with Pierce Amino Acid Standard (Thermo Scientific, Bremen, GER) was used for this purpose. The peptides were solved for LC-MS / MS analysis in 0.1% TFA. Each sample was measured in triplicates.

Beispiel 7: Example 7:

Labelfreie Massenspektrometrie Label-free mass spectrometry

LC-MS/MS Analyse LC-MS / MS analysis

Die LC-MS/MS wurde mit einem Ultimate 3000 RSLnano System gekoppelt an ein Orbitrap Elite Massenspektrometer (beides Thermo Scientific, Bremen, GER) durchgeführt. Für jede Analyse wurden 330 ng Peptide für auf einer Vorsäule (Acclaim® PepMap 100, 75 µm × 2 cm, nano Viper, C18, 3 µm, 100 Å) aufkonzentriert (7 min, 30 µl/min). Die Auftrennung der Probe wurde über eine analytische Säule (Acclaim® PepMap RSLC, 75 µm × 50 cm, nano Viper, C 18, 2 µm, 100 Å) mit einem Gradienten von 5 % bis 40 % Lösemittel B über 98 min durchgeführt (Lösemittel A, 0.1% Ameisensäure; Lösemittel B, 0.1% Ameisensäure, 84% Acetonitril). Die Flussgeschwindigkeit wurde dabei auf 400 nl/min, die Temperatur des Säulenofens auf 60°C eingestellt. Das Massenspektrometer operierte im „Data dependent mode“. Die Full-Scan Massenspektren wurden mit einer Auflösung von 60.000 in der Orbitrap aufgenommen, die Tandemmassenspektren der 20 höchst abundanten Peaks wurden in der linearen Ionenfalle nach der Peptidfragmentierung durch CID (collision induced dissociation) gemessen. The LC-MS / MS was performed with an Ultimate 3000 RSLnano system coupled to an Orbitrap Elite mass spectrometer (both Thermo Scientific, Bremen, GER). 330 ng of peptides on a pre-column were used for each analysis (Acclaim ® PepMap 100, 75 microns x 2 cm, nano Viper, C18, 3 micron, 100 Å) and concentrated (7 min, 30 .mu.l / min). The separation of the sample was on an analytical column (Acclaim ® PepMap RSLC, 75 microns x 50 cm, Nano Viper, C 18, 2 microns, 100 Å) using a gradient of 5% to 40% Solvent B over 98 min performed (solvent A, 0.1% formic acid, solvent B, 0.1% formic acid, 84% acetonitrile). The flow rate was set to 400 nl / min, the temperature of the column oven to 60 ° C. The mass spectrometer operated in "Data dependent mode". The full-scan mass spectra were recorded in orbitrap at a resolution of 60,000, and the tandem mass spectra of the 20 most abundant peaks were measured in the linear ion trap after peptide fragmentation by CID (collision induced dissociation).

Beispiel 8: Example 8:

Peptidquantifizierung und Filtern Peptide quantification and filtering

Für die labelfreie Quantifizierung basierend auf Ionenintensitäten wurde Progenesis LC-MSTM (v.4.1, Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) genutzt. Nach dem Import des Rohdatenformats der gemessenen Proben, wurde der repräsentativste LC-MS/MS-Lauf als Referenz-Probe ausgewählt. Die Retentionszeiten der Vorläufermassen aller Läufe wurden demnach dem Referenzlauf angeglichen. Aus der generierten Feature Liste die alle m/z Werte der gemessenen Peptide enthält, wurden in einem weiteren Schritt nur die 2-, 3- und 4-fach positiv geladenen für die Quantifizierung genutzt. Nachfolgend wurden alle Abundanzen der Rohdaten, für jedes Feature, automatisch normalisiert um die experimentellen Unterschiede auszugleichen. In diesem Schritt wurden auch die quantitativen Abundanzen aller Proben im Verhältnis zum Referenzlauf berechnet, logarithmiert und angepasst. Diese logarithmische Transformation ist nötig damit sowohl hoch- als auch herunterregulierte Features mit einbezogen werden. Basierend auf diesen Daten, stellt der anti-log des Mittels (Ratio) einen globalen Faktor für die Skalierung jedes einzelnen LC-MS Laufs dar. Dies wird genutzt, um dann alle Läufe hinsichtlich experimenteller und technischer Abweichungen anzupassen. Diese Unterschiede können z.B. die in das Massenspektrometer eingeführten Peptidmenge oder unterschiedliches Ionisierungsverhalten der Proben sein. In einem letzten Schritte werden die LC-MS-Läufe nach dem experimentellen Design für die weitere Analyse gruppiert. For label-free quantification based on ion intensities, Progenesis LC-MS ™ (v.4.1, Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle upon Tyne, UK) was used. After importing the raw data format of the measured samples, the most representative LC-MS / MS run was selected as the reference sample. The retention times of the precursor masses of all runs were accordingly adjusted to the reference run. From the generated feature list containing all m / z values of the measured peptides, only the 2-, 3- and 4-fold positively charged ones were used for the quantification in a further step. Below were all the abundances of Raw data, for each feature, automatically normalized to compensate for the experimental differences. In this step, the quantitative abundances of all samples in relation to the reference run were also calculated, logarithmized and adjusted. This logarithmic transformation is necessary so that both up- and down-regulated features are included. Based on this data, the anti-log of the mean (ratio) represents a global factor for the scaling of each LC-MS run. This is used to then adjust all runs for experimental and technical discrepancies. These differences may be, for example, the amount of peptide introduced into the mass spectrometer or different ionization behavior of the samples. In a final step, the LC-MS runs are grouped by experimental design for further analysis.

Beispiel 9: Example 9:

Proteinidentifizierung protein identification

Die Proteine wurde mittels Proteome Discoverer (ver.1.4.1.14, DBVersion:79, Thermo Scientific) und der UniProt Datenbank (Release 2014_11, 546.790 Einträge) via MASCOT (ver. 2.5.0) (Matrix Sciences Ltd., London, UK) identifiziert. Es wurden folgende Suchparameter eingestellt: Als variable Modifikation Oxidation am Methionin, als statische Modifikation eine Carbamidomethylierung am Cystein; Tryptischer Verdau mit 1 „missed cleavage“, eine Vorläuferionen Massentoleranz von 5 ppm und einer Fragmentionen Massentoleranz von 0,4 Da. Um die Ergebnisse weiter zu Filtern und eine „False Discovery Rate (FDR)“ auf Peptidebene von 1 % zu erlauben, wurde das Perculator Tool in den Proteom Discoverer Workflow integriert. Die Ergebnisse des Datenbankabgleichs wurden in Progenesis LC-MSTM importiert. Durch das Einfügen der Ergebnisse des Datenbankabgleichs wurde jedes Peptid einem vorher quantifizierten Feature zugeordnet. The proteins were analyzed using Proteome Discoverer (ver.1.4.1.14, DBVersion: 79, Thermo Scientific) and the UniProt database (Release 2014_11, 546.790 entries) via MASCOT (ver. 2.5.0) (Matrix Sciences Ltd., London, UK). identified. The following search parameters were set: as variable modification oxidation on methionine, as static modification carbamidomethylation on cysteine; Tryptic digest with 1 "missed cleavage", a precursor ion mass tolerance of 5 ppm and a fragment ion mass tolerance of 0.4 Da. To further filter the results and allow a 1% false discovery rate (FDR) at the peptide level, the Perculator tool has been integrated into the Proteom Discoverer workflow. The results of database synchronization were imported into Progenesis LC-MS TM . By inserting the database matching results, each peptide was assigned to a previously quantified feature.

Beispiel 10: Example 10:

Proteinquantifizierung und Filtern Protein quantification and filtering

Für die Quantifizierung der Proteine wurden nur die „unique peptides“ eines Proteins betrachtet und die Proteingruppierungsfunktion von Progenesis LC-MSTM wurde nicht genutzt. Die Signifikanz der Unterschiede in der Proteinexpression wurde mittels einer ANOVA getestet. Der ANOVA p Wert wurde basierend auf dem statistischen Mittel der drei Technischen Replikate jeder Probe berechnet. Proteine, welche nicht den Signifikanzkriterien (ANOVA p Wert ≤ 0.05) entsprachen, wurden entfernt. Ebenso Proteine, die eine geringere Regulierung der Proteinexpression als 1,5 zeigten. For protein quantification, only the unique peptides of a protein were considered and the protein moiety of Progenesis LC-MS ™ was not used. The significance of differences in protein expression was tested by ANOVA. The ANOVA p value was calculated based on the statistical mean of the three Technical Replicates of each sample. Proteins that did not meet the significance criteria (ANOVA p value ≤ 0.05) were removed. Likewise proteins that showed a lower regulation of protein expression than 1.5.

Beispiel 11: Example 11:

Analyse deregulierter Proteine Analysis of deregulated proteins

Um die Einflüsse der Proteinderegulierung auf den Organismus einschätzen zu können, wurde neben klassischer Literaturreche eine automatisierte Pathway Analyse durchgeführt. Dazu wurde die Software Ingenuity® Pathway Analysis ( IPA Version 24390178, 2015, www.ingenuity.com, QIAGEN, Hilden, Germany ) genutzt. In order to be able to assess the effects of protein regulation on the organism, an automated pathway analysis was carried out in addition to classical literary research. The software Ingenuity ® Pathway Analysis ( IPA Version 24390178, 2015, www.ingenuity.com, QIAGEN, Hilden, Germany ) used.

Literatur: Literature:

  • [1] Robert Koch Institut, Prostate cancer, ICD-10 C61, Stand 12.02.2015 [1] Robert Koch Institute, Prostate cancer, ICD-10 C61, as of 12.02.2015
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • US 6346413 B1 [0030] US 6346413 B1 [0030]
  • US 20050014292 [0030] US 20050014292 [0030]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • Ralph Weissleder, Molecular Imaging in Cancer, Science, Vol. 312, 1168 (2006) [0027] Ralph Weissleder, Molecular Imaging Cancer, Science, Vol. 312, 1168 (2006) [0027]
  • IPA Version 24390178, 2015, www.ingenuity.com, QIAGEN, Hilden, Germany [0045] IPA Version 24390178, 2015, www.ingenuity.com, QIAGEN, Hilden, Germany [0045]

Claims (10)

Verfahren zur in-vitro Diagnose von rezidivem Prostatakrebs, wobei eine Bestimmung mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54 oder Fragmenten und Teilpeptiden davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten erfolgt.  A method for the in-vitro diagnosis of recurrent prostate cancer, wherein a determination of at least one biomarker selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 54 or fragments and partial peptides thereof to or from a patient to be examined. Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der/die Biomarker ausgewählt ist/sind aus der Gruppe SEQ ID No. 1 (Neuroserpin) oder SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 6. Method for the diagnosis of recurrent prostate cancer according to claim 1, characterized in that the biomarker (s) is / are selected from the group SEQ ID no. 1 (neuroserpin) or SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 3 or SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 6th Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs nach Anspruch 1, wobei ein Panel mindestens SEQ ID No. 1 neben mindestens einer weiteren SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 54, insbesondere SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 6 aufweist. A method for the diagnosis of recurrent prostate cancer according to claim 1, wherein a panel at least SEQ ID no. 1 in addition to at least one further SEQ ID no. 2 to SEQ ID no. 54, in particular SEQ ID no. 2 and SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 2 to SEQ ID no. 6 has. Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Panel mindestens zwei oder drei Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, oder SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 6 aufweist. A method for the diagnosis of recurrent prostate cancer according to any one of the preceding claims 1 to 3, wherein a panel at least two or three sequences selected from the group SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 54, in particular selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 3, or SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 6 has. Verfahren zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs nach Anspruch 1 bis 4 zur Durchführung von klinischen Entscheidungen, insbesondere weiterführende Behandlung und Therapie mittels Arzneimitteln.  Method for the diagnosis of recurrent prostate cancer according to Claims 1 to 4 for carrying out clinical decisions, in particular further treatment and therapy by means of medicaments. Verfahren zur Diagnose nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Diagnose zur Prognose, zur differentialdiagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur Beurteilung des Schweregrades und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung erfolgt. Diagnostic method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the diagnosis for prognosis, for the differential diagnostic early detection and detection, for the assessment of the degree of severity and the therapy-accompanying course assessment takes place. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmungen mittels einem Schnelltest, insbesondere in Einzel- oder Multiparameterbestimmungen durchgeführt werden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the determinations are carried out by means of a rapid test, in particular in individual or multiparameter determinations. Panel zur Diagnose von rezidivem Prostatakrebs, wobei der Panel mindestens zwei oder drei Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 54, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, oder SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 6 aufweist. Panel for the diagnosis of recurrent prostate cancer, wherein the panel at least two or three sequences selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 54, in particular selected from the group SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 3, or SEQ ID NO. 1 to SEQ ID no. 6 has. Kit oder diagnostische Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur Diagnose nach einem der Ansprüche 1–7 enthaltend Nachweisreagenzien und weitere Hilfsmittel. Kit or diagnostic device for performing a method of diagnosis according to any one of claims 1-7 containing detection reagents and other adjuvants. Kit oder diagnostische Vorrichtung nach Anspruch 9 enthaltend ein Panel nach Anspruch 8.  Kit or diagnostic device according to claim 9 comprising a panel according to claim 8.
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