Millionen Genabschnitte des menschlichen Genoms und vieler Tiergenome stehen in redundanter Ausfertigung als Gefrierkulturen von E. coli Klonen (BACs, PACs, Shizuya et al. 1992 , Ioannou et al. 1994 ) in Ressourcenzentren zur Verfügung. Diese zumeist strukturell und funktionell weitgehend uncharakterisierten Genabschnitte sind zunächst nur in Form von Bakterien eingefroren und können in dieser Form nicht eingesetzt werden. Herkömmliche DNA Isolierungsmethoden (alkalische Lyse, Säulen etc), liefern bei langen genomischen Klonen (> 20 kb) sehr wenig DNA, die nur in einer kleinen Fraktion von maximal wenigen Prozent intakt vorliegt und bei der Lagerung schnell degradiert. Solche Genabschnitte können nach einem neuen DNA Isolierungsverfahren des Erfinders ( Schindelhauer and Cooke 1997 , US 6331397 , DE 19720839B4 ) mit Vektoren für künstliche Chromosomen verbunden werden, wie die pTAT-Vektoren des Erfinders, mit Beschreibungen für pTAT ( US 6,331,397 / DE 197 20 839 B4 , Laner 2004 ), pTT (Doktorarbeit Laner 2004 , online http://edoc.ub.uni-muenchen.de/4286 , Laner et al. 2004 ) pTTE1 ( Laner 2004 , Laner et al., 2004 , Laner et al., 2005 ) und Anwendungen in primären Zellen und Tieren in PCT/EP2008/007422 , die als Referenzen in der Gesamtheit hier miteingeschlossen werden. Mit dem neuen DNA Herstellungsverfahren kann aus E. coli Klonen ein zuverlässiges, langmoleküliges Genbaumaterial (> 20 kb, bevorzugt > 100 kb) mit höchstem Intaktheitsgrad gewonnen und gelagert werden, so dass funktionelle Genorte und multigene Konstruktionen als künstliche Chromosomen (human artificial chromosome) und künstliche Chromosomen mit gentherapeutisch relevanten Genen (Gene Mendelischer Erbkrankheiten und nicht-Mendelischer Krankheitsgene, Schutzgene bei Volkskrankheiten) mit umliegenden Regulatoren und allen für eine stabile Vererbung erforderlichen, selbstreplizierenden Sequenzelementen als verlässliches Baumaterial bereitgestellt werden können. Damit können aus einer Vielzahl medizinisch relevanter Genmoleküle Genmedikamente für medizinische innere (z. B. Injektion, Inhalation, intraoperiativ) und äussere (z. B. primäre Zellen, Zellkultur) somatische Applikationsformen hergestellt werden.Millions of gene segments of the human genome and many animal genomes are available in redundant form as freezing cultures of E. coli clones (BACs, PACs, Shizuya et al. 1992 . Ioannou et al. 1994 ) are available in resource centers. These mostly structurally and functionally largely uncharacterized gene segments are initially frozen only in the form of bacteria and can not be used in this form. Conventional DNA isolation methods (alkaline lysis, columns, etc.) provide very little DNA in long genomic clones (> 20 kb), which is intact only in a small fraction of a few percent maximum and degrades rapidly on storage. Such gene segments can be prepared according to a new DNA isolation method of the inventor ( Schindelhauer and Cooke 1997 . US 6331397 . DE 19720839B4 ) are linked to vectors for artificial chromosomes, such as the inventor's pTAT vectors, with descriptions for pTAT ( US 6,331,397 / DE 197 20 839 B4 . Laner 2004 ), pTT (PhD thesis Laner 2004 , online http://edoc.ub.uni-muenchen.de/4286 . Laner et al. 2004 ) pTTE1 ( Laner 2004 . Laner et al., 2004 . Laner et al., 2005 ) and applications in primary cells and animals in PCT / EP2008 / 007422 , which are included here as references in their entirety. With the new DNA production process, a reliable, long-molecule gene construction material (> 20 kb, preferably> 100 kb) can be obtained and stored from E. coli clones with the highest degree of intactness, so that functional gene loci and multigene constructions can be used as artificial chromosomes and human artificial chromosomes artificial chromosomes with genetically relevant genes (genes of Mendelian hereditary diseases and non-Mendelian disease genes, protective genes in common diseases) can be provided with surrounding regulators and all required for a stable inheritance, self-replicating sequence elements as a reliable building material. This makes it possible to produce gene medications for medical internal (eg injection, inhalation, intraoperative) and external (eg primary cells, cell culture) somatic application forms from a large number of medically relevant gene molecules.

Allerdings wird für klinisch und tierklinisch relevante Funktionsanalysen eine Menge und Qualität benötigt, die normale Laborkapazitäten vielfach übersteigt. Für lange DNA Moleküle und künstliche Chromsomen können aussagekräftige Gentherapiestudien mit genomischen Genabschnitten nicht durchgeführt werden, weil in der praktischen Anwendung kein adäquates Verfahren zur Herstellung großer Mengen arzneimitteltauglicher DNA (> 20 kb) existiert. Konstruktionen für die Forschung sind nur eingeschränkt möglich, weil langes, intaktes Genmaterial nicht in ausreichender Zahl und Menge zur Verfügung steht und nicht routinemässig, oder nur mit enormem Aufwand hergestellt werden kann (vgl. Multigenkonstrukte für die Xenotransplantation).Indeed is used for clinically and animal clinically relevant functional analyzes a lot and quality needed, the normal Laboratory capacity often exceeds. For long DNA molecules and artificial chromosomes can meaningful gene therapy studies with genomic gene sections not be done because in practical application not an adequate process for making big ones Amounts of drug-suitable DNA (> 20 kb) exists. Constructions for research is limited, because long, intact genetic material is not in sufficient numbers and Quantity is available and not routine, or can be produced only with enormous effort (see Multigenkonstrukte for xenotransplantation).

Vom Erfinder wurde die neue, bisher bei Längen > 20 kb unerreichte DNA Qualität ”Grad 1 DNA” genannt, was bedeutet, dass bei Längen > 20 kb kein Einzelstrangbruch in der Gesamtheit der Moleküle einer Präparation vorliegen. Grad 2 DNA enthält zusätzlich eine Molekülfraktion mit Einzelstrangbrüchen, und Grad 3 DNA enthält zusätzlich eine Fraktion mit Doppelstrangbrüchen, wie das mit herkömmlichen DNA Herstellungsverfahren > 20 kb, z. B. bei alkalischer Lyse oder bei Lagerung in wässriger Lösung oder bei Einfrieren oder bei Alkoholpräzipitation der Fall ist.from Inventor became the new, so far with lengths> 20 kb unequaled DNA quality called "grade 1 DNA", what means that for lengths> 20 kb no single-strand break in the whole the molecules of a preparation are present. Degree 2 DNA additionally contains a molecular fraction with single-strand breaks, and grade 3 DNA additionally a fraction with double-strand breaks, as with conventional DNA manufacturing methods> 20 kb, z. B. in alkaline Lysis or when stored in aqueous solution or freezing or alcohol precipitation.

Für die Herstellung der neuen Grad 1 DNA Qualität, bei der in E. coli klonierte Genmoleküle und genomische Konstrukte für künstliche Chromosomen mit Längen > 20 kb ohne Strangbrüche bereitgestellt und viele Jahre verlustfrei gelagert werden können, kommt ein aufwändiger Laborprozess zum Einsatz, der bevorzugt enzymatische, chemische, und elektrophysikalische Methoden zur Reiningung und Abtrennung von E. coli Resten und Ausschussmolekülen vorsieht ( Schindelhauer and Cooke, 1997 , DE 19720839B4 und US6331397 des Erfinders). Dabei kommen prolongierte Inkubations-, Diffusions-, Wasch- und Reinigungsschritte zum Einsatz, die in der Summe mehrere Wochen überschreiten (vorwiegend Inkubations- und Wartezeiten bei Raumtemperatur). Im Anschluss können Genanalysen und Funktionstests für die funktionelle Zusammensetzung der Molekülpräparation aus der längst abgeschlossenen Bakterienanzucht durchgeführt werden. Eine dringende Notwendigkeit für die zugrundeliegende Erfindung, die in der bevorzugten Ausführung eine einfache und stabile Lagerung einer Herstellungszwischenstufe unter Reinraumbedingung ermöglicht, ist die Tatsache, dass erst auf dieser (ersten) Lagerstufe, die dann ohne weitere Massnahmen im gleichen Beutel auch für Langzeitgenlager von > 5 Jahren und > 10 Jahren geeignet ist und problemlos bei Raumtemperatur erfolgt, von vielen redundant in E. coli angezogenen Klonen, diejenigen Klonanzuchten mit funktionell einwandfreien Molekülen identifiziert werden. Dafür werden kleine Proben eines Genlagers für strukturelle und funktionelle Analysen im geschlossenen System entnommen. Parallel zur Lagerung werden die richtigen Klone identifiziert. Durch das Anlegen größerer Genlager stehen die charakterisierten Moleküle (d. h. der Anteil strukturell und funktionell charakterisierter Moleküle an der Gesamtheit der Moleküle eines Genlagers wird charakterisiert) dann für die Weiterreinigung und Isolierung bis zur arneimitteltauglichen Qualität im Prozessbeutel zur Verfügung. So konnte nach 7 Jahren Lagerung durch quantitatives Funktionieren einer 64 kb genomischen PCR (very long PCR) des menschlichen Mukoviszidosegens kein Abbau der Einzelstrangmoleküle gegenüber der Lagerung von 1 Jahr festgestellt werden ( Noerenberg 2006 ). Very long PCR, die mit Grad 1 input DNA möglich geworden ist und in DE 10 2004 025 650 des Erfinders beschrieben wurde, wird hier als Referenz in ihrer Gesamtheit mitaufgenommen. Very long PCR dient darüberhinaus dem Nachweis der Grad 1 Qualität aus Genlagern und liefert mittels einer sehr geringen Fehlerrate klonierbare, funktionelle, genomische Gene ( Kraner et al. 2007 ). Nach erfolgtem Klonidentitätsnachweis und Kenntnis der funktionellen Fraktion von der Gesamtheit der Moleküle im Genlager, kann das wertvolle Material den fortgeschrittenen Reinigungsprozeduren bis hin zur Isolierung reiner Grad 1 DNA Moleküle (das heisst unter praktisch vollständiger Vermeidung einer gebrochenen Fraktion) weiter aufgereinigt werden. Gebrochene Moleküle, die bei jeder Herstellung von DNA oder Biomolekülen primär vorhandenen sind, werden im Reinigungsprozess praktisch vollständig aus der Trägermatrix entfernt, so dass die Gesamtheit der verbleibenden Moleküle intakt ist (im bevorzugten Verfahren DNA Moleküle > 20 kb, aber auch > 50 kb, > 100 kb und länger). DNA Moleküle deutlich unter 20 kb können mit diesem speziellen Verfahren und den beschriebenen Materialien nicht aufgereinigt werden, weil sie in der Elektrophorese zusammen mit der gebrochenen Fraktion die Agaroseträgermatrix verlassen, selbst wenn sie Grad 1 Qualität haben. Je nach Bedarf und Lagergröße kann nach weiteren mehrschrittigen Verfahren ein Teil oder das gesamte DNA Material aus dem Prozessbeutel isoliert werden. Die Moleküle in wässriger Lösung müssen steril verpackt werden und bei 0–4°C ohne Einfrieren gelagert werden. In der vorliegenden Erfindung wird berücksichtigt, dass die Abfüllung für eine Applikation ausserhalb des Prozessbeutels als reine, wässrige Lösung erfolgt und die weitere Lagerung für eine zeitnahe Applikation direkt aus dem Herstellungsprozess im Beutel heraus vorgenommen wird und im geschlossenen System erfolgt, wobei eine geeignete, schüttelarme Verpackung zum Einsatz kommt, wodurch Kontaminationen und Scherkräfte durch Schütteln oder Pipettieren und den Transport minimiert werden. Alternativ können Transportscherkräfte gänzlich vermieden werden, indem die Grad 1 Moleküle durch weitergehende Inkubationen noch im Beutel zu einer applikationsfähigen Form weiterverarbeitet und verpackt werden.For the production of the new grade 1 DNA quality, in which E. coli cloned gene molecules and genomic constructs for artificial chromosomes with lengths> 20 kb can be provided without strand breaks and stored loss-free for many years, an elaborate laboratory process is used, preferably enzymatic , chemical, and electrophysical methods for the purification and separation of E. coli residues and reject molecules ( Schindelhauer and Cooke, 1997 . DE 19720839B4 and US6331397 of the inventor). In this case, prolonged incubation, diffusion, washing and purification steps are used, which in total exceed several weeks (predominantly incubation and waiting times at room temperature). Afterwards, genetic analyzes and functional tests for the functional composition of the molecule preparation from the long-established bacterial culture can be carried out. An urgent need for the underlying invention, which in the preferred embodiment enables a simple and stable storage of a manufacturing intermediate under clean room conditions, is the fact that only on this (first) storage stage, which then without further measures in the same bag for long-term storage of> 5 years and> 10 years and is easily carried out at room temperature, of many clones grown redundantly in E. coli, those clones with functionally flawless molecules are identified. Small samples of a gene pool for structural and functional analyzes are taken in a closed system. Parallel to storage, the right clones are identified. By creating larger gene stocks, the characterized molecules (ie, the proportion of structurally and functionally characterized molecules in the entirety of the molecules of a gene pool is characterized) are then available for further purification and isolation to the quality of the food grade in the process bag. Thus, after 7 years of storage, it was possible to quantitatively operate a 64 kb genomic PCR (very long PCR) of the human Mukoviszi dosegens no degradation of the single-stranded molecules compared to the storage of 1 year can be determined ( Noerenberg 2006 ). Very long PCR made possible with grade 1 input DNA and in DE 10 2004 025 650 of the inventor is incorporated herein by reference in its entirety. Very long PCR also serves to detect grade 1 quality from gene libraries and provides cloning-able, functional, genomic genes by means of a very low error rate ( Kraner et al. 2007 ). After clone identity detection and knowledge of the functional fraction of all the molecules in the gene pool, the valuable material can be further purified from advanced purification procedures to isolation of pure grade 1 DNA molecules (i.e., virtually completely avoiding a fractured fraction). Broken molecules that are primarily present in each preparation of DNA or biomolecules are virtually completely removed from the support matrix in the purification process, so that the entirety of the remaining molecules is intact (in the preferred method, DNA molecules> 20 kb, but also> 50 kb). > 100 kb and longer). DNA molecules well below 20 kb can not be purified by this particular method and materials because they leave the agarose support matrix in electrophoresis along with the fraction fractured, even if they have grade 1 quality. Depending on requirements and storage size, after further multi-step procedures, part or all of the DNA material can be isolated from the process bag. The molecules in aqueous solution must be packaged sterile and stored at 0-4 ° C without freezing. In the present invention, it is considered that the filling for an application outside of the process bag takes place as a pure, aqueous solution and the further storage for a timely application is made directly from the manufacturing process in the bag and takes place in a closed system, with a suitable, shaking Packaging is used, which minimizes contamination and shear by shaking or pipetting and transport. Alternatively, shear forces can be completely avoided by further processing the grade 1 molecules by further incubations in the bag to a form suitable for application and packaging.

Die bei dem gesamten DNA Reinigungsprozess im molekularen Labor zu verwendenden Kammern, Lösungen, Pipetten, Röhrchen, Medienwechsel und der hohe zeitliche Aufwand stellen eine enorme Anforderung an die Einhaltung kontinuierlicher Reinraumbedingungen. Für die parallele Produktion mehrerer Testkonstruktchargen mit Molekülzahlen von > 10¹⁵ bis 10¹⁸ Molekülen, wie sie für funktionelle Genanalysen und kleinere klinische oder tierklinische Testanwendungen benötigt werden, oder von größeren Produktionen > 10¹⁸, die für klinische und tierklinische Applikationen und Transfer/Wirkungsstudien an mehreren Zentren/Forschungseinrichtungen benötigt werden, oder für die Deckung des Gesamtbedarfs eines gentherapeutischen Medikaments von z. B. > 10²⁰ funktionellen Molekülen, existieren zur Zeit keine geeigneten Methoden, unter denen eine realistische Reinraumbedingung erzielt werden könnte. Damit stellt der Prozessbeutel für die Herstellung eines DNA Medikaments in ausreichender Menge einen entscheidenden Schritt für die Gentherapie dar. Da es sich hier um besonders lange DNA Moleküle handelt, und Gene in der Regel auf längeren chromosomalen Abschnitten liegen und im Chromatinkontext funktionieren, wird mit der Erfindung des Prozessbeutels auch die Herstellung von DNA Arzneistoffen für die Gentransferforschung und weitergehende Wirkungsanalysen mit einer Vielzahl von Genen und Konstrukten ermöglicht. Das Verfahren im Prozessbeutel erlaubt ebenfalls eine dezentralisierte Herstellung vieler verschiedener DNA Abschnitte in der neuen, bislang nicht erreichten Qualität und Menge, so dass erwartet werden kann, dass mehrere Speziallabors weltweit eine größere Zahl von Genen für Forschungszwecke in Prozessbeuteln und mitgelieferten, oder mit vor Ort befüllten Inkubationskits und vertriebenen Apparaten herstellen, lagern, charakterisieren, und verbrauchen werden.The chambers, solutions, pipettes, tubes, media changes to be used in the entire DNA purification process in the molecular laboratory and the high expenditure of time place an enormous requirement on the maintenance of continuous clean-room conditions. For the parallel production of multiple test construct lots with molecular numbers of> 10 ¹⁵ to 10 ¹⁸ molecules, as required for functional gene analysis and smaller clinical or animal clinical test applications, or larger productions> 10 ¹⁸ , for clinical and animal clinical applications and transfer / efficacy studies several centers / research facilities or to cover the total needs of a gene therapy drug, eg For example,> 10 ²⁰ functional molecules, there are currently no suitable methods under which a realistic clean room condition could be achieved. Thus, the process bag for the production of a DNA drug in sufficient quantity is a crucial step for gene therapy dar. Since these are very long DNA molecules, and genes are usually on longer chromosomal sections and work in chromatin context, with the Invention of the process bag also allows the production of DNA drugs for gene transfer research and further impact analysis with a variety of genes and constructs. The procedure in the process bag also allows for decentralized production of many different DNA sections in the new, unprecedented quality and quantity, so it can be expected that several specialty laboratories worldwide will supply a larger number of genes for research purposes in process bags and supplied, or on-site filled incubation kits and distributed apparatus to produce, store, characterize, and consume.

Somit bestehen multiple Ebenen der Beutelanwendungen, von der Erforschung funktioneller Gene und Genwirkungen über Anwendungen multipler Gene in künstlichen Chromosomen (vgl Xenotransplantation) durch das einfache Verfügbarmachen von funktionellen Genabschnitten für funktionelle Konstruktionen, über klinisch relevante Studien mit gentherapeutischen Konstrukten und künstlichen Chromosomen mit korrigierten, genomischen, selbstreplizierenden Genen, hin zur Herstellung von DNA Medikamenten, aber auch den Vertrieb an Anwenderlaboratorien für ein dezentralisiertes Anlegen von Genlagern (in Form vorgefertigter Prozessbeutel) für Genomforschungszentren aus existierenden und weiterentwickelten genomischen Genbanken (PAC, BAC, pTAT Vektoren künstlicher Chromosomen), und für die Entwicklung von Spezialbeuteln für andere Arzneimittelentwicklungen aus Biomolekülen und ihre Herstellung.Consequently There are multiple levels of bag applications, from exploration Functional genes and gene effects on multiple applications Genes in artificial chromosomes (see xenotransplantation) by simply making available functional gene segments for functional constructions, about clinical relevant studies with gene therapy constructs and artificial chromosomes with corrected, genomic, self - replicating genes, to Production of DNA drugs, but also distribution to user laboratories for a decentralized creation of genetic stores (in form prefabricated process bag) for genome research centers from existing and further developed genomic gene banks (PAC, BAC, pTAT vectors of artificial chromosomes), and for the development of special bags for other drug developments from biomolecules and their production.

Die im Genlabor verwendeten Methoden finden bisher vornehmlich in offenen Systemen statt, die nicht beliebig vergrößerbar sind und aufgrund eines enormen Kosten und Platzbedarfs praktisch nicht lückenlos oder nur in geringer Anzahl in einem klassischen Reinraum durchgeführt werden könnten und insbesondere einer erforderlich werdenden Produktionserhöhung nicht standhielten. Die herkömmliche Miniaturisierung und Aufarbeitung von Biomolekülen, etwa für die DNA Analyse etc durch Pipettierroboter, wie sie bei DNA für analytische Zwecke eingesetzt wird, kommt in der bekannten Form (Multiwell, Mikrotiterplatten) praktisch nicht in Frage, weil erheblich größere Volumina bearbeitet werden müssen und die herzustellende Lagerform z. B. bei der langmoleküligen Grad 1 DNA in einer schützenden Agarosegelmatrix nicht für das Pipettieren geeignet ist.The methods used in the gene laboratory have so far mainly in open systems, which are not arbitrarily scalable and due to an enormous cost and space requirements practically not completely or only in small numbers in a classic clean room could be performed and in particular a required production increase not withstood. The conventional miniaturization and processing of biomolecules, such as for DNA analysis etc by pipetting robots, as in DNA for analytical purposes is set, comes in the known form (multiwell, microtiter plates) practically out of the question, because much larger volumes must be processed and the bearing to be produced z. B. is not suitable for pipetting in the long-molecule grade 1 DNA in a protective agarose gel matrix.

Um Reinraumkriterien selbst bei dem komplexen Verfahren der Herstellung langer DNA Moleküle kostengünstig zu gewährleisten, und eine flexible Vergrößerung der Produktion zu ermöglichen, sieht die Erfindung vor, das Herstellungsverfahren in kostengünstige, automatisiert herstellbare Module/Container/Beutel/Mehrkammerbeutel einzuschliessen, so dass Reinraumbedingungen für den gesamten Prozess geschaffen werden können, eine Produktionssteigerung durch Erhöhung der Stückzahl einfach möglich ist, und gleichermassen die verschiedenen Material- und Sterilisations- und Sauberkeitsanforderungen und Lagerzeiten der Beutelteile und Ansteckkammern und der Verfahrenslösungen/Medien berücksichtigt werden können.Around Clean room criteria even with the complex manufacturing process cost-effective to ensure long DNA molecules and a flexible increase in production to enable, the invention provides, the manufacturing process into cost-effective, automated modules / containers / bags / multi-chamber bags Include, so that clean room conditions for the entire Process can be created, an increase in production simply by increasing the number of pieces possible and, equally, the different material and sterilization and cleanliness requirements and storage times of the bag parts and Containment chambers and the process solutions / media considered can be.

Gegenstand der Erfindung ist damit der Einschluss eines komplexen Laborablaufs in einen multifunktionalen Kunststoffbehälter/Beutel, in dem praktisch alle für den Prozess benötigten Schritte, Bewegungen, Zugaben von Lösungen und Enzymen, Inkubationen, und Lagerungen im geschlossenen System erfolgen. Lediglich bei der Ausführung mit dem Einbringen der Bakterienmasse, z. B. in Form einer Agarosegelmatrix in einer externen Giessform/Siebrahmen ist eine Seite zum anschliessenden Verschweissen geöffnet. Bei interner Giessform wird nur ein steriler Port geöffnet. Während der elektrophoretischen Reinigung wird das Beutelsystem unter Reinraumbedingungen (Filterboxen, Laminar flow module) vorübergehend an den Elektrodenzugängen oder über einen Port geöffnet, um Gas und verbrauchten Puffer abzulassen. Diese oder zusätzliche Zugänge dienen auch dem Entweichen von Elektrophoresegasen und werden anschliessend wieder steril verschlossen (oder verschweisst).object the invention is thus the inclusion of a complex laboratory process in a multifunctional plastic container / bag, in virtually all needed for the process Steps, movements, additions of solutions and enzymes, Incubations, and storage done in a closed system. Only in the implementation with the introduction of the bacterial mass, z. In the form of an agarose gel matrix in an external mold / screen frame One side is open for subsequent welding. With internal mold, only one sterile port is opened. During the electrophoretic cleaning becomes the bag system under clean room conditions (filter boxes, laminar flow modules) temporarily at the electrode accesses or via a port opened to drain gas and spent buffer. These or additional accesses also serve to escape of electrophoresis gases and are then closed again sterile (or welded).

Somit kann selbst in einem begrenzten Reinraumareal einer Produktionsstätte die Produktion eines DNA Medikaments selbst bei großen zu lagernden Chargenzahlen (verschiedene Gene, mehrere Testkonstrukte für klinische Studien) durchgeführt werden. Bei Bedarf einer größeren Menge eines DNA-Medikaments kann die Produktion einfach und flexibel mit größeren Beutelzahlen hochgefahren werden.Consequently can even in a limited cleanroom area of a production facility the production of a DNA drug even at large to be stored batch numbers (different genes, multiple test constructs for clinical trials). at Need for a larger amount of a DNA drug Production can be simple and flexible with larger ones Bag numbers are ramped up.

Voraussetzung für die Reinigung innerhalb eines Prozessbeutels mit einer Trägermatrix ist die selektive Bindung der zu gewinnenden Biomoleküle (durch Einfangen in einem Gelgitter, durch Bindungseigenschaften wie kovalente Bindung oder Rezeptoren, Antikörper etc) innerhalb der Trägermatrix, während einer Reihe von Reinigungsschritten zur Absonderung aller verunreinigender anderer Bestandteile der eingebrachten Biomasse (z. B. Bakterien, Medien, Gewebeaufschlüsse, Zellkulturen usw). Nach Erreichen der vorgesehenen Reinheit und Verdünnen unerwünschter Bestandteile findet eine Lagerung und Prüfung einer Probe statt. Anschliessend wird das Biomolekül gezielt behandelt, um es aus der Trägermatrix herauszulösen und innerhalb des geschlossenen Systems zu verpacken.requirement for cleaning within a process bag with a Carrier matrix is the selective bond of the to be won Biomolecules (by trapping in a gel lattice, through Binding properties such as covalent binding or receptors, antibodies etc) within the carrier matrix, during one Set of purification steps to separate all contaminants other constituents of the biomass introduced (eg bacteria, Media, tissue digests, cell cultures, etc.). After reaching the intended purity and thinning unwanted Ingredients will find a storage and testing a sample instead of. Subsequently, the biomolecule is treated specifically, to release it from the carrier matrix and within of the closed system.

Als Stand der Technik war von medizinischen Infusionslösungen und Mischlösungen für die parenterale Ernährung bekannt, dass durch die Verwendung von Mehrkammerbeuteln (z. B. EP 0776649 , US 4997083 , DE 3238649 , US 5296242 , DE 9401288 , EP 0790051 , EP 0875231 , US 5176634 , US 5308334 , US 6231559 ) verschiedene Stoffe mit unterschiedlichen Sterilisationsverfahren oder für die Aufrechterhaltung der Stabilität erst kurz vor der Applikation im geschlossenen System gemischt werden können (z. B. DE 69736909 , DE 60030682 , US 4997083 , US 5560403 , US 6468259 , DE 10041295A1 ). Ebenfalls wird Spenderblut nach der Entnahme innerhalb des Beutels durch Zentrifugation grob fraktioniert und Plasma oder Zellfraktionen in angeschlossene Beutel mittels Schläuchen überführt, filtriert und gelagert (diverse Systeme, z. B. US 4425114 , US 4098456 , US 4915847 , US 4637813 , US 5382526 ) oder es werden Zellen kultiviert (z. B. DE 10 2006 026 179 A1 ).As state of the art, it has been known from medical infusion solutions and mixed solutions for parenteral nutrition that through the use of multi-compartment bags (e.g. EP 0776649 . US 4997083 . DE 3238649 . US 5296242 . DE 9401288 . EP 0790051 . EP 0875231 . US 5176634 . US 5308334 . US 6231559 ) different substances with different sterilization processes or for the maintenance of stability can be mixed only shortly before application in a closed system (eg. DE 69736909 . DE 60030682 . US 4997083 . US 5560403 . US 6468259 . DE 10041295A1 ). Likewise, after removal within the bag, donor blood is roughly fractionated by centrifugation and plasma or cell fractions are transferred into connected bags by means of hoses, filtered and stored (various systems, eg. US 4425114 . US 4098456 . US 4915847 . US 4637813 . US 5382526 ) or cells are cultivated (eg. DE 10 2006 026 179 A1 ).

Bisher ist aber nicht bekannt, dass Mehrkammersysteme mit Puffern für Inkubations- und Reinigungskaskaden von Laborprozessabläufen inclusive Elektrophoresen für den molekularen Aufschluss, die Lagerung und die Reindarstellung von Biomolekülen in einem Prozessbeutel, inklusive dem Durchschweissen und der Probengewinnnung und Verpackung einer Reinform eines Biomoleküls verwendet werden. Aus den bereits existierenden Beutel und Anschlusslösungen und Ports der Ernährungs-, Infusions- und Transfusionsmedizin ergeben sich mehrere flexible Lösungen für die Zuführung von Puffern und Medien in einen geschlossenen Prozessbeutel. So können Puffer und Reaktionslösungen mittels herkömmlicher Infusionssysteme aus autoklavierten Einzelkammerbeuteln oder Mehrkammerbeuteln zugefügt werden. Für die diversen Ausführungen existieren automatisierte, auf verschiedene Materialien abgestimmte, geprüfte Verfahren zur Befüllung/Herstellung und das Sterilisieren, Autoklavieren von Lösungen und der späteren Applikation von Medikamenten oder Nährstoffen über verschiedene Port Systeme, wie es in vielfachen Ausführungen von Infusionsbeuteln, Blutbeuteln, oder Mehrkammerbeuteln für die parenterale Ernährung bekannt ist. Die konkreten Materialanforderungen an Prozessbeutel sind vielfältig und benötigen mitunter weitere Entwicklungen, die von dem know how mit Beutelmaterialien herkömmlicher Systeme profitieren können.So far, however, it is not known that multi-chamber systems are used with buffers for incubation and purification cascades of laboratory processes including electrophoresis for the molecular digestion, storage and purification of biomolecules in a process bag, including the through-blowing and sample extraction and packaging of a pure form of a biomolecule. The already existing bags and connection solutions and ports of nutritional, infusion and transfusion medicine result in several flexible solutions for the supply of buffers and media in a closed process bag. Thus, buffers and reaction solutions can be added by conventional infusion systems of autoclaved single chamber bags or multi-chamber bags. For the various versions exist automated, tailored to different materials, tested procedures for filling / manufacturing and sterilizing, autoclaving solutions and the subsequent application of drugs or nutrients through various port systems, as in multiple versions of infusion bags, blood bags, or multi-chamber bags known for parenteral nutrition. The concrete material requirements for process bags are diverse and sometimes require further removal developments that can benefit from the know-how with bag materials of conventional systems.

Allerdings ist die Füllung und Unterteilung von Mehrkammerbeuteln technisch immer noch schwierig, weil nach heutigem Stand jede Kammer einen eigenen Zugang zur Füllung benötigt, und damit räumlich und technisch automatisierbare Anzahl von Kammern rasch begrenzt ist.Indeed is the filling and subdivision of multi-chamber bags technically still difficult, because today each chamber has one own access to the filling needed, and so spatially and technically automatable number of chambers is quickly limited.

Peelnähte von Mehrkammerbeuteln werden z. B. eingesetzt, wenn verschiedener Inhalt erst kurz vor der Anwendung vermengt werden soll. So werden nach dem heutigen Stand die Kammern über eigene Zugänge bereits vor der Füllung durch Peelnaht-Schweisstechniken voneinander getrennt. Bei den in dieser Erfindung an den Prozessbeutel anzuschliessenden Zuführungsbeuteln mit Lösungskaskaden wird eine viel größere Anzahl relativ kleiner Volumina benötigt, so dass nach heutigem Stand der Technik eine große Zahl von Schlauchstücken/Befüllstutzen angeschweisst werden müsste, wodurch technisch schwierige Platzverhältnisse sowie Erhöhung des Ausschusses und der Kosten in einem automatisierten Herstellungsvorgang auftreten würden. Ein Ausführungsaspekt des hier beschriebenen Prozessbeutels, insbesondere eines oder mehrerer Zuführungsbeutel sieht deshalb ein neues Verfahren für das Anbringen von Peelnähten vor, bei dem eine lange Schlauchkammer zunächst über einen Port locker mit wässrigem Puffer befüllt wird, und dann die befüllte Kammer an den zu schweissenden Stellen leergedrückt wird, und dann die Schichten zusammengeschweisst werden (Durchschweissen durch einen gefüllten Beutel). Dabei wird einfach durch die verbleibenden wässrigen Spuren/Tröpfchen hindurchgeschweisst, um eine größere Anzahl mit gleicher Flüssigkeit gefüllte Kammern in einem Multikammerbeutel zu erhalten (4). In einer Ausführung wird die zu verschweissende Stelle über einer Kantenfläche/Erhöhung hoch gelagert, wobei der Kammerinhalt rechts und links davon nach unten abläuft. Das zu verschweissende Areal der übereinanderliegenden, für eine Peelnaht geeigneten Folie (z. B. interne Polyolefinschicht) wird nötigenfalls vorgewärmt, um eine weitgehende Trocknung vor dem Setzen der Foliennaht zu erhalten und erst anschliessend wird die Peelnaht geschweisst. Ebenfalls können auseinanderweichende Walzen/Druckstege im Bereich der Peelnaht vor dem Druchschweissen aufgesetzt und auseinanderbewegt werden, damit Flüssigkeit nach aussen gedrückt wird und anschliessend dazwischen die Peelnaht gesetzt werden kann. Auf diese Weise wird ein kostengünstiger Zulaufbeutel, mit praktisch unbegrenzt schaltbarer Kammerzahl mit gleichem Inhalt erzeugt, der für die mehrstufigen Reaktions- und Verdünnungskaskaden eingesetzt werden kann. Die Beladung aber auch die Verbindung von dem Multikammerbeutel (zum Beispiel mit 8 × 200 ml wässriger Reinigungslösung, oder 6 × 200 ml hintereinandergeschalteter Tensidlösung für den chemischen Aufschluss, oder 8 × 400 ml Elektrolytlösung etc) zum Prozessbeutel kann nun über einen einzigen Einfüll und Auslaufstutzen erfolgen, wodurch die Herstellung und Sterilisierung zunächst als langer Einkammerschlauch und die Befüllung stark vereinfacht wird. Durch die Unterteilung wird zudem ein günstiger Effekt auf die Transportfähigkeit der Pufferkaskaden erzielt, weil große Volumina unterteilt wesentlich höhere Beschleunigungs/Bremskräfte aushalten, als eine große, gemeinsame Kammer. Damit werden ebenfalls Dehnungsbelastungen im Material gesenkt, wodurch indirekt eine längere sterile Lagerbarkeit gewährleistet werden kann. Der Multikammerbeutel für Reaktionskaskaden erfüllt dabei einen weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung, weil auf jeder Stufe der über Wochen durchgeführten Reaktionskaskaden, Reinigungen, Inkubationen, eine automatische Kontrolle anhand der bereits geleerten und noch gefüllten Zulaufkammern durch einfaches Hinsehen und Abzählen realisiert wird. So können in einer weiteren Ausführung, um alle erfolgten Enzym/Puffer/Zugaben sichtbar am Beutel zu dokumentieren, zusätzlich kleinere Trocken-/Lichtschutz-/Nebenkammern eingebracht werden, die als Pulver lagerbare Enzyme (RNasen, Proteinasen, Nukleasen etc) oder Puffersubstanzen enthalten und z. B. nachträglich nach der Sterilisation am Beutel angebracht und in den Hauptpuffer eingebracht werden. Techniken für das Schützen und Einsetzen von Medikamenten in Kunststoffbehälter existieren (Bruchröhrchen, nachträgliches steriles Einsetzen von Peelkammern, steriles Verkleben, Aufbringen von Gas- und Dampfschutzschichten, Alu beschichtete Folien durch Bekleben von Infusionsbeutelfolien von aussen etc). Durch entsprechende Ausfertigung des Reinraumprozessbeutels werden weitere Kontaminationsquellen bei der Zuführung externer Substanzen vermieden, die Anwendung erleichtert, die Überprüfung/Dokumentation des Prozesses vereinfacht und ein Risiko der Verwechslung oder Falschdokumentation gesenkt (5).Peelnähte of multi-chamber bags are z. B. used when different content should be mixed just before use. Thus, according to the current state, the chambers are already separated from one another by means of peel-seam welding techniques prior to filling. In the invention to be attached to the process bag feed bags with solution cascades a much larger number of relatively small volumes is required, so that according to the current state of the art, a large number of hose pieces / filler neck would have to be welded, creating technically difficult space and increasing the Committee and the Costs would occur in an automated manufacturing process. An embodiment aspect of the process bag described here, in particular one or more feed bags, therefore, provides a new method for attaching peeled seams in which a long tube chamber is first loosely filled with aqueous buffer via a port, and then the filled chamber at the points to be welded is pressed, and then the layers are welded together (through a filled bag). It is simply welded through the remaining aqueous traces / droplets in order to obtain a larger number of chambers filled with the same liquid in a multi-chamber bag ( 4 ). In one embodiment, the site to be welded is stored high above an edge surface / elevation, with the chamber contents running down to the right and left thereof. The area to be welded of the overlapping, suitable for a peel seam film (eg., Internal polyolefin) is preheated, if necessary, to obtain a substantial drying before setting the foil seam and only then the peel seam is welded. Likewise diverging rollers / pressure ridges in the area of the peel seam can be placed on and removed from each other prior to the soot-welding, so that liquid is forced outwards and subsequently the peel seam can be set therebetween. In this way, a low-cost inlet bag, with virtually unlimited switchable chamber number is generated with the same content, which can be used for the multi-stage reaction and dilution cascades. The loading but also the connection of the multi-chamber bag (for example, with 8 × 200 ml aqueous cleaning solution, or 6 × 200 ml catalysed surfactant solution for chemical digestion, or 8 × 400 ml electrolyte solution, etc.) to the process bag can now via a single filling and outlet nozzle take place, whereby the production and sterilization is initially greatly simplified as a long Einkammerschlauch and the filling. The subdivision also has a favorable effect on the transportability of the buffer cascades, because large volumes subdivided can withstand much higher acceleration / braking forces than a large common chamber. This also strain loads are lowered in the material, which indirectly a longer sterile storage can be guaranteed. The multi-chamber bag for reaction cascades thereby fulfills another important aspect of the invention, because at each stage of the carried over weeks reaction cascades, cleanings, incubations, an automatic control of the already emptied and still filled feed chambers by simply looking and counting is realized. Thus, in a further embodiment, in order to document all the enzyme / buffer / additions visible on the bag, additionally smaller dry / light protection / secondary chambers are introduced which contain storable enzymes (RNases, proteinases, nucleases, etc.) or buffer substances as powder and z. B. subsequently after sterilization attached to the bag and placed in the main buffer. Techniques for the protection and insertion of drugs in plastic containers exist (broken tubes, subsequent sterile insertion of Peelkammern, sterile bonding, applying gas and vapor protective layers, aluminum-coated films by pasting infusion bag films from the outside, etc.). Appropriate production of the clean room process bag avoids further sources of contamination in the supply of external substances, simplifies the application, simplifies the review / documentation of the process and reduces the risk of confusion or false documentation ( 5 ).

Ebenfalls sind mit chemischen substanzen für die Pufferherstellung vorgefüllte Beutel möglich, die in Form von Leerbeuteln als Reinraumprozessbeutel-Kits erst vor Ort mit Wasser aufgefüllt und autoklaviert werden.Also are using chemical substances for buffer production pre-filled bags are possible, in the form of empty bags as cleanroom process bag kits filled with water on site and autoclaved.

Ein Beispiel für die Ausführungsgröße eines z. B. 30 × 40 cm Prozessbeutels (vgl Modell 11) und einen Siebrahmen mit 20 × 10 cm × 5 mm, dessen Boden flach, plan, verwindungsarm, bevorzugt zwischen 0°C und 65°C verformungsarm (bei nachträglich in den Prozessbeutel eingebrachter Giessform/Trägermatrix), bevorzugt verformungsstabil bei Leerlagerung und beim Autoklavieren, verformungsstabil bei Dampfautoklavieren (bei Einbringen in den Beutel in geöffneter Form vor dem Autoklavieren des Leerbeutels), bevorzugt transparent ist.An example of the execution size of a z. B. 30 × 40 cm process bag (see model 11 ) and a screen frame with 20 × 10 cm × 5 mm, the bottom of which flat, flat, torsionally, preferably between 0 ° C and 65 ° C deformation (in subsequently introduced into the process bag mold / carrier matrix), preferably stable in deformation during storage and autoclaving , deformation stable in steam autoclaving (when introduced into the bag in an open mold before autoclaving the empty bag), preferably transparent.

Für das Giessen des flüssigen Agarosegels in die Giessform innerhalb des Beutels, über einen kleinen Zugang für eine externe Pipette oder einen Port/Schlauchadapter (1, 2).For pouring the liquid agarose gel into the mold within the bag, via a small access for an external pipette or a port / hose adapter ( 1 . 2 ).

Dabei ist der im Beutel vorgelegte Giessrahmen (2A) mittig am Beutelboden entlang einer Mittellinie des Siebrahmens und entlang einer Mittellinie des Beutelbodens vorbefestigt. Die Befestigung ist nicht ganzflächig, damit der Beutel blähen kann und umgebende Elektroden (3 oder mehr) räumlich oberhalb und unterhalb der Gelmatrix angeordnet werden können (3, 6), oder einseitig zwei Elektroden in Kombination mit weiteren Elutionselektroden (1 oder mehr) in einer angeschlossenen Elutionsbeutelkammer, für die Isolierung der Grad 1 DNA und Überführung in ein Transportröhrchen im geschlossenen System, räumlich angeordnet werden können (7).In this case, the presented in the bag casting frame ( 2A ) is centrally mounted on the bottom of the bag along a centerline of the screen frame and along a centerline of the bag bottom. The attachment is not over the entire surface, so that the bag can inflate and surrounding electrodes (3 or more) can be arranged spatially above and below the gel matrix ( 3 . 6 ), or unilaterally two electrodes in combination with other elution electrodes (1 or more) in a connected elution bag chamber, for the isolation of the grade 1 DNA and transfer into a closed-tube transport tube, can be spatially arranged ( 7 ).

Ein wesentlicher Aspekt der Lagerung von Biomolekülen in dem Prozessbeutel betrifft die sterile Entnahme von Proben zu verschiedenen Zeiten der Herstellung und Lagerung, bis hin zur Entnahme von Teilen des Lagers. In einer Ausführung ist die Trägermatrix durch den Beutel hindurch leicht brechbar, so dass kleinere oder größere Anteile von der Gesamtfläche des Genlagers im Beutel getrennt werden. Die Waschlösung wird für diesen Schritt über den Auslauf entfernt. Die abgetrennte Trägermatrix wird nun in eine Ecke des Beutels bewegt, in der keine Anschlüsse bestehen. Zwischen der Probe in der Ecke (von z. B. 1 × 1 cm) und dem verbleibenden, grossflächigen Biomoleküllager befinden sich nur noch kleine Mengen einer wässrigen Waschlösung, so dass unter Zuhilfenahme von Stäben/Rollen oder Gleitschienen oder einer Ablauferhöhung ein quasi trockener Bereich gebildet werden kann, der durch eine einfache Schweissnaht (gegebenenfalls mit zuvor erfolgter vorsichtiger Erwärmung zum vollständigeren Trocknen), geschlossen wird, so dass die Beutelecke mit der Probe abgschweisst/getrennt wird (6).An essential aspect of the storage of biomolecules in the process bag relates to the sterile removal of samples at different times of production and storage, to the removal of parts of the bearing. In one embodiment, the carrier matrix is easily breakable through the bag so that smaller or larger portions of the total area of the gene store are separated in the bag. The wash solution is removed via the spout for this step. The separated carrier matrix is now moved into a corner of the bag in which there are no connections. Between the sample in the corner (of, for example, 1 × 1 cm) and the remaining, large-area biomolecule storage are only small amounts of an aqueous washing solution, so that with the help of rods / rollers or slides or a flow increase a quasi-dry area can be formed, which is closed by a simple weld (possibly with previous careful heating for more complete drying), so that the bag corner is abgschweis with the sample ( 6 ).

Die Spuren der wässrigen, dünnen Salzlösung, die sich im Bereich der Naht befinden könnten (ausgefallene Salzkristalle/Dampftröpfchen etc) werden einfach in der grosszügig gesetzten, wiedererstarrenden Naht oder Doppelnaht (etwa mit einer Handwärmzange, oder in einer HF-Schweissvorrichtung, oder mit einem Laser, je nach Material in einer handelsüblichen Folienschweissvorrichtung zum Schweissen mit/ohne Trennen, gegebenenfalls doppelt, oder mit einer speziell an die Prozessbeutelfolien und Vorwärmzeiten angepassten Schweisszange/Tischgerät für Prozessbeutel) mit eingeschlossen. Damit bleibt die Stabilität des verbleibenden Lagerbeutels erhalten, die entnommene Probe befindet sich ebenfalls in einem geschlossenen Beutel und kann problemlos transportiert und für die Analyse geöffnet werden. Die Bedruckung der entsprechenden Beutelecken und weiterer für spätere Entnahmen vorgesehener Abschnitte des Beutels sowie des verbleibenden Beutels mit laufenden Nummern und/oder den Informationen des gelagerten Inhalts gewähreistet zudem eine verwechslungsfreie Probenentnahme und ein einfaches Handling. Auf diese Weise können auch bei der Entnahme und dem Verschicken von Analyseabschnitten der Chargen und der wertvollen Materialabschnitte Kontaminationsquellen vermieden werden. Im gesamten Prozess werden keine herkömmlichen Röhrchen (50 ml) und Einmalpipetten (10 ml, 25 ml) mehr zum zahlöreichen Ab- und Umfüllen von Puffern verbraucht, die bisher pro Genlager im normalen Laborablauf erhebliche Kosten und durch zahlreiches Öffnen/Verschliessen eine erhebliche Kontaminationsquelle darstellten. Zusätzlich kann auf zahlreiche Glasgefässe und ihre Reinigung vor und nach Autoklavieren verzichtet werden.The Traces of the aqueous, thin saline solution, which could be in the area of the seam (unusual Salt crystals / steam droplets etc) will be easy in the generously set, re-setting seam or double seam (eg with a hand-held tongs, or in an HF welding device, or with a laser, depending on the material in a commercial Foil welding device for welding with / without cutting, if necessary double, or with a special to the process bag films and Preheating times adapted welding tongs / table device for process bag) included. This leaves the Stability of the remaining storage bag obtained taken sample is also in a closed Bag and can be easily transported and for analysis be opened. The printing of the corresponding bag corners and others for later withdrawals Sections of the bag and the remaining bag with running Numbers and / or the information of the stored content In addition, a confusion-free sampling and easy handling. In this way, even when removing and sending analysis sections of batches and valuable material sections Contamination sources are avoided. In the whole process will be no conventional tubes (50 ml) and disposable pipettes (10 ml, 25 ml) more for the numerous filling and decanting consumed by buffers, which so far per gene stock in the normal laboratory process considerable costs and by numerous opening / closing one significant source of contamination. additionally can precede numerous glass vessels and their cleaning and to be omitted after autoclaving.

Andere Ausführungen sehen herkömmliche Kunststoffbeutel und Adaptoren vor, wie sie für Infusionslösungen eingesetzt werden und in beliebigen Größen von z. B. 100 ml oder 5000 ml aus verschiedenen Folienmaterialien hergestellt werden (z. B. Polypropylenbeutel für die Infusion). Dabei kann jede einzelne Kammer unabhängig befüllt, verschlossen und sterilisiert werden und als geschlossenes System an den Prozessbeutel angeschlossen werden. Von solchen Beuteln ist ebenfalls bekannt, dass einer Infusionslösung nachträglich eine weitere Komponente zugefügt werden kann, die in einem anderen Behälter gelöst wird und im geschlossenen System mittels einer Vielzahl möglicher Ventil/Injektionssysteme/Ports hinzugegeben wird. Andere bekannte Anwendungen verwenden Sollbruchstellen (Bruchröhrchen, Peelnähte zwischen Beutelkammern) zwischen zwei oder mehr Kammern, um Komponenten zusammenzuführen, und damit die endgültige Applikationsform (antibiotische Lösung, Ernährungslösung etc) für die unmittelbare Anwendung zu erhalten. So können pulverisierte Komponenten, etwa Enzyme oder Antibiotika in Kunststoff eingeschweisst und durch Aufbringen von Sauerstoffsperrschichten bei der Folienherstellung oder durch nachträgliches Aufkleben angebracht werden. Solche zuschaltbaren Kapseln/Kammern können gegebenenfalls auch nachträglich (zum Beispiel nach dem Autoklavieren eines Beutels mit einer anderen Komponente/Lösung) und gegebenenfalls automatisiert in den Kunststoffbeutel eingebracht/angeschweisst werden. In ähnlicher Weise existieren Methoden zur nachträglichen Verbindung von Kammern, die entweder über Schlauch und Ventilsysteme oder durch Peelnaht- oder -Adapteranordnungen sekundär verschweisst oder verbunden werden können.Other Designs see conventional plastic bags and adapters before, as for infusion solutions be used and in any sizes of z. B. 100 ml or 5000 ml of various film materials (eg polypropylene bags for infusion). there every single chamber can be filled independently, be closed and sterilized and as a closed system be connected to the process bag. From such bags is also known that an infusion solution subsequently another component can be added in one other container is released and closed System using a variety of possible valve / injection systems / ports is added. Other known applications use predetermined breaking points (Break tubes, peel seams between bag compartments) between two or more chambers to merge components and thus the final application form (antibiotic Solution, nutritional solution etc) for to get the immediate application. So can be pulverized Components, such as enzymes or antibiotics in plastic and welded by applying oxygen barrier layers during film production or be attached by subsequent sticking. Such switchable capsules / chambers may optionally also later (for example, after autoclaving a Bag with another component / solution) and optionally automatically inserted / welded into the plastic bag become. Similarly, there are methods for retrofitting Connection of chambers, either via hose and Valve systems or by Peelnaht- or -Adapteranordnungen secondary welded or can be connected.

Aufbauend auf dem Stand der Technik, dass sterile medizinische Lösungen in Kunststoffbehältern und Beuteln hergestellt und > 1 Jahr gelagert werden können, und eine spätere Zuführung weiterer Komponenten möglich ist, und aus der Notwendigkeit einer GMP DNA Herstellung für die Gentherapie entstand die Erfindung, nicht nur ein medizinisches Endprodukt und deren Mischung zum Verbrauch der Applikationsform in einem kostengünstigen und sauberen Kunststoffbeutel durchzuführen, sondern einen komplexen molekulargenetischen und biochemischen Reinigungsprozess in speziell an die Prozessabläufe abgestimmten Prozessbeuteln aus Kunststoffen durchzuführen. Durch die Verlegung des vielschrittigen Prozesses bis zum Erhalt hochgradig gereinigter, intakter und funktioneller Biomoleküle in einen Kunststoffbeutel wird eine kostengünstige Massenfertigung unter Reinraumbedingungen erzielt und die dem Verfahren mit zahlreichen Genlagern zugrundeliegende Notwendigkeit einer Langzeitlagerbarkeit geschaffen. Ein ganzes Laborverfahren mit Reinigung, Lagerung, Probengewinnung, funktionelle Charakterisierung, elektrophoretischen Reinigungsstufen und Elution bis hin zur Verpackung in einem multifunktionellen Kuststoffbeutel durchzuführen ist neuartig und bringt erhebliche Vorteile, wie hier für die Herstellung von Genlagern mit Grad 1 DNA Qualität dargestellt wird, um lange DNA Abschnitte für Gentherapeutika bereitzustellen.Building on the state of the art, sterile medical solutions are produced in plastic containers and bags and stored for> 1 year can be, and a subsequent supply of other components is possible, and from the need for GMP DNA production for gene therapy, the invention arose, not only a medical end product and their mixture to consume the application form in a low-cost and clean plastic bag perform, but a complex molecular genetic and perform biochemical cleaning process in specially adapted to the process sequences process bags made of plastics. By moving the multi-step process to obtaining highly purified, intact and functional biomolecules in a plastic bag, cost-effective mass production under clean room conditions is achieved and the long term storage requirement underlying the multi-gene storage process is created. Performing a complete laboratory procedure, including purification, storage, sample collection, functional characterization, electrophoretic purification, and elution to packaging in a multifunctional plastic bag, is novel and brings significant benefits, as demonstrated here for the production of gene stores with grade 1 DNA quality, for a long time To provide DNA sections for gene therapeutics.

Laborprozessbeutel können aber auch auf andere, ähnliche Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen unter Reinbedingungen angewendet werden. Ebenso können wahlweise bestimmte Teilprozesse, insbesondere Teilabläufe des Prozesses der hier bevorzugten Anwendung in einem Prozessbeutel, besser und sauberer als bisher durchgeführt werden. So stellt allein die im Beutel durchgeführte Elektrophorese/pulsfeldgelelektrophoretische Reinigung ein Novum dar, das eine Reihe ähnlicher elektrochemischer Anwendungen in anderen Bereichen der Biomolekülgewinnung nahelegt. Ebenso stellt die einfache Elektroelution von Biomolekülen aus Trägermaterialien im Beutel unter Reinraumbedingungen eine leistungsstarke Alternative zu bisherigen Systemen dar, die in der Regel aus offenen Elektrophoresekästen mit eingesteckten Elutionskammern und Dialysemembranen/Filtermembranen bestehen. Durch die geringen Kosten gegenüber einem herkömmlichen Reinraum und die schnelle Steigerbarkeit der Herstellungsmenge durch Verwenden und Lagern mehrerer Beutel, sowie die schnelle Realisierung der Automatisierung für größere Zahlen, der kostengünstigen Herstellung zuschaltbarer Pufferlösungen, Waschlösungen, Enzymbeigaben, ermöglicht das Herstellungsverfahren von Genlagern im Prozessbeutel den Einsatz von Genen in einer größeren, sauberen Herstellungsform und schafft damit die Voraussetzungen für klinische Studien und die Entwicklung von Gen-Medikamenten und deren Herstellung.Laboratory Process bag But you can also use other similar methods used for the isolation of biomolecules under clean conditions become. Likewise, optionally certain sub-processes, in particular Sub-sequences of the process of the preferred application here in a process bag, better and cleaner than before become. Thus, only the electrophoresis / pulse field electrophoresis carried out in the bag Purification is a novelty, the a series of similar electrochemical applications in other areas of biomolecule production suggests. Similarly, the simple electroelution of biomolecules provides from carrier materials in the bag under clean room conditions a powerful alternative to previous systems, the usually from open electrophoresis boxes with inserted Elution chambers and dialysis membranes / filter membranes exist. By the low cost compared to a conventional one Clean room and the rapid increase in the production volume through Use and store multiple bags, as well as the quick realization automation for larger numbers, the cost-effective production of switchable buffer solutions, Washing solutions, enzyme additives, allows the manufacturing process of Gene storage in the process bag the use of genes in a larger, clean production form and thus creates the conditions for clinical trials and the development of gene drugs and their production.

Vorzugsweise kann auch das neu entwickelte Verfahren zur Herstellung einer sprunghaft höheren DNA Qualität (Grad 1 DNA) für die Herstellung von DNA Medikamenten im Prozessbeutel durchgeführt werden. Durch die Erfindung des eingeschlossenen Laborablaufs im Beutel kann somit erstmals eine medizinisch relvante DNA Produktion unter Reinraumbedingungen realisiert werden, die auch geeignet ist, bei einer schnell wachsenden Nachfrage die Produktionsmenge zu steigern. Damit stellt das Verfahren ein Schlüsselverfahren für den Einsatz einer neuen DNA Technologie mit hochwertigen, langen DNA Molekülen ganzer Genorte und den Einsatz künstlicher Chromosomen dar.Preferably can also use the newly developed method of making a leap higher DNA quality (grade 1 DNA) for the production of DNA drugs in the process bag become. By the invention of the enclosed laboratory process in Bag can thus for the first time a medically relevant DNA production be realized under clean room conditions, which is also suitable to increase the production volume with a fast growing demand. Thus, the procedure represents a key procedure for the use of a new DNA technology with high quality, long DNA molecules of whole genorte and the use of artificial Chromosomes

Die in nur einem einzigen Beutel (mit z. B. 10 × 20 cm Trägermaterial) herstellbare und lagerbare DNA Menge übertrifft bereits, bei deutlicher Kostenreduktion, die üblicherweise in einem modernen Genlabor zur Verfügung stehende Menge und ermöglicht eine relevante Lagerhaltung. Die Lagerung der zunächst präparierten DNA Moleküle als Genlager ist absolut notwendig, damit zusätzlich zur hohen physikalischen Integrität und Intaktheit der hergestellten DNA Moleküle, auch die funktionell intakte Fraktion der Gesamtheit der Moleküle in der aktuellen Produktionseinheit bestimmt werden kann. Da keine andere geeignete Vermehrungsmethode als die Klonierung von DNA Konstrukten in low copy Vektoren für die Herstellung künstlicher Chromosomen (PACs, BACs, pTAT-Vektoren) in Grad 1 DNA Qualität zur Verfügung steht, als die Klonierung in Bakterien (bevorzugt E. coli oder theoretisch auch als zirkuläre Moleküle in Hefezellen, mit um mehrere Größenordnungen geringeren Ausbeuten als bei Bakterien), ist biologisch durch die vielen Zellteilungen während des Wachstums bedingt, in jeder individuellen Präparation ein real existierendes, neues Risiko vorhanden, dass einzelne oder viele der Moleküle von Rekombinationen, Deletionen, Mutationen der DNA Sequenzen betroffen sein könnten.The in a single bag (with eg 10 × 20 cm carrier material) producible and storable DNA quantity already exceeds, at a significant cost reduction, usually in one modern gene lab available quantity and allows a relevant storage. The storage of the first Prepared DNA molecules as gene storage is absolute necessary, in addition to high physical integrity and integrity of the DNA molecules produced, including the functionally intact fraction of the totality of the molecules can be determined in the current production unit. There no other suitable propagation method than the cloning of DNA constructs in low copy vectors for making artificial Chromosomes (PACs, BACs, pTAT vectors) in grade 1 DNA quality is available as the cloning in bacteria (preferred E. coli or theoretically also as circular molecules in yeast cells, with orders of magnitude lower yields than bacteria) is biologically due to the caused by many cell divisions during growth, in each individual preparation a real existing, new risk exists that single or many of the molecules affected by recombinations, deletions, mutations of DNA sequences could be.

So tragen z. B. die Tandemrepeatsequenzen der Telomere und Zentromere und die verteilt auftretenden repetitiven Abschnitte in genomischen Sequenzen eines künstlichen Chromosoms ein Risiko für Rekombinationen, so dass in der Regel sicherheitshalber zwei bis vier Einzelzellanzuchten einer geeigneten Masterkultur des gleichen Bakterienklons durchgeführt werden, um nach prolongiertem Wachstum in einer Kultur von 10¹⁵ und mehr Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit eine hochwertige Präparation zu erhalten. Dabei können manche problematische Genomstellen höhere Kulturzahlen benötigen. In der Regel sind die meisten Abschnitte sehr gut in den erwähnten low copy Systemen in E. coli klonierbar, zumal redundante Klonsammlungen mit einer oft über 10-fachen Genrepräsentation mit zufällig angeordneten Abschnitten zugrunde liegen, woraus in der Regel einzelne funktionelle Abschnitte erhalten werden können, und durch die Präparation hochqualitativer DNA weitere Methoden zur Ergänzung und Weiterklonierung unvollständiger Klone verfügbar sind, z. B. very long PCR des Erfinders (z. B. Kraner et al. 2007 ).To wear z. For example, the tandem repeat sequences of telomeres and centromeres and the repeating sections occurring in genomic sequences of an artificial chromosome risk recombination so that as a rule two to four single cell cultures of a suitable master culture of the same bacterial clone are usually performed in order to avoid prolonged growth in one Culture of 10 ¹⁵ and more cells is highly likely to obtain a high quality preparation. Some problematic genome sites may require higher culture numbers. In general, most of the sections are very well cloned in the mentioned low copy systems in E. coli, especially as redundant clone collections are often based on a more than 10-fold gene representation with randomly arranged sections, from which individual functional sections can be obtained, as a rule and by the preparation of high-quality DNA further methods for supplementation and further cloning incomplete clones are available, e.g. B. Very long PCR of the inventor (eg. Kraner et al. 2007 ).

Bei der Vermehrung der Bakterienkultur hat nach prolongiertem Wachstum prinzipiell jedes Molekül aus jeder der 10¹⁵ bis > 10²⁰ E. coli Zellen eine potentiell andere Mutationsvergangenheit. Überspitzt gesagt, könnte jedes DNA Molekül eine andere Mutation tragen. Da diese bei einer Sequenzierung einer Probe der Molekülgesamtheit nicht auffallen werden, und die Sequenz/Funktionsrelationen für die weitaus größeren Anteile eines genomischen Genabschnitts nicht bekannt sind (so fallen nur etwa 10% der Sequenzen auf kolierende Genabschnitte, Splicesites und Regulatorbindungsstellen, während die anderen 90% zwar auch die Genfunktionen wesentlich beeinflussen (Chromatinkontext) können, aber jede potentielle Variante a priori nicht auf Sequenzebene erfasst werden kann), müssen zusätzlich zu strukturellen Untersuchungen für die Beurteilung eines Genlagers immer auch Einzelmolekültransfer/Funktionsexperimente durchgeführt werden (oder Sequenzierungen von Einzelmolekülsubklonierungen, im Falle einer bekannten Sequenz eines funktionellen Konstrukts, um die funktionelle Rate der hergestellten DNA Moleküle einer Präparation zu erfassen. Aus diesem Grund kann die Funktionalität eines Genlagers erst nach der Herstellung des Lagers, in der Regel nicht vor 1–3 Monaten und/oder erst nach 1 Jahr und später bestimmt werden, wobei mit dem funktionellen Nachweis mit einer kleinen Probe, der Wert des gelagerten Materials drastisch steigt und andere Genlager, die in einer kleinen Probe der geforderten Qualität nicht entsprechen, ausgemustert und verworfen werden (oder, bei zumindest weitgehend struktureller Intaktheit, z. B. zu sehr sauberer Sonden-DNA für die Herstellung markierter Proben für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) verarbeitet werden). Die Erfolgsquote für ein funktionelles Genlager hängt dabei von Konstrukteigenschaften und E. coli Wachstumsbedingungen der künstlichen Chromosomen und von der intrinsischen Klonierstabilität eines jeden enthaltenen Genabschnitts ab.When propagating the bacterial culture, after prolonged growth, in principle every molecule from each of the 10 ¹⁵ to> 10 ²⁰ E. coli cells has a potentially different mutation history. To put it bluntly, every DNA molecule could carry a different mutation. Since these will not be noticed when sequencing a sample of the whole population, and the sequence / function relations for the much larger portions of a genomic gene section are not known (so only about 10% of the sequences fall on Kolierende gene sections, spliceites and regulatory binding sites, while the other 90 % Although the gene functions can also significantly influence (chromatin context), but each potential variant can not be detected a priori at the sequence level), in addition to structural investigations for the evaluation of a gene storage, single molecule transfer / functional experiments must always be carried out (or sequencing of single molecule subcloning) In the case of a known sequence of a functional construct in order to detect the functional rate of the prepared DNA molecules of a preparation, for this reason, the functionality of a gene store can not be determined until after the preparation of the store, as a rule not determined before 1-3 months and / or after 1 year and later, with the functional proof with a small sample increasing drastically the value of the stored material and other gene stocks which do not correspond in a small sample of the required quality, discarded and discarded (or, at least largely structural integrity, eg. B. to very clean probe DNA for the production of labeled samples for fluorescence in situ hybridization (FISH) are processed). The success rate for a functional gene storage depends on the construct characteristics and E. coli growth conditions of the artificial chromosomes and on the intrinsic cloning stability of each contained gene segment.

Damit werden zwei Herstellungsphasen des Prozesses unterschieden. Während einer anfänglichen Phase zur Identifizierung geeigneter Klone bis zum Anlegen und dem Ablegen des Genlagers sind demnach andere Anforderungen an die Materialien notwendig, als in der später, mitunter erst nach Jahren zu erfolgenden, eigentlichen Aufreinigung zur Grad 1 DNA und der Isolierung freier DNA Moleküle für eine gezielte Applikation.In order to Two production phases of the process are distinguished. While an initial phase to identify suitable ones Clones to create and deposit the Genlagers are accordingly other requirements for the materials necessary than in the later, sometimes only after years to be carried out, actual purification to grade 1 DNA and the isolation of free DNA molecules for a targeted application.

Die Erfindung beinhaltet das Verwenden unterschiedlicher Kunststoffe, entsprechend der gewünschten Eigenschaften für die entsprechende Phase des Prozesses. Hier sei darauf hingewiesen, dass die Erfindung sich nicht auf die Verwendung oder Reihenfolge von bestimmten Kunststoffen, Folienmaterialien, Konnektormaterialien etc. festlegt, wie sie in den Ausführungsbeispielen vorliegen. Mit dem Verfügbarwerden neuer Kunststoffe, Kunststoffkombinationen oder von Kunststoffen mit neuen Additiven oder dem Verwenden verschiedener mehrschichtiger Folien und Laminate, aber auch mit Erfahrungen aus den Anwendungen, wird es dem Fachmann möglich sein, Beutel in anderen Ausfertigungen und Größen herzustellen, die für die speziellen Anforderungen des jeweiligen Laborprozesses geeignet sind. Im Ausführungsbeispiel werden die zurzeit massgeblich für Infusionslösungen oder Blutbeutel verwendeten Materialien PVC, EVA und PP eingesetzt. Dabei wird weitgehend auf PVC verzichtet, das weniger als ca. 10% der eingesetzten Kunststoffmasse ausmacht, aber für die Langzeitlagerung der DNA zum Einsatz kommt. Aus den Eigenschaften der Beispielmaterialien ergeben sich spezifische Vorteile für die jeweilige Prozessphase und für die Kontrolle und Senkung freiwerdender Stoffe (Weichmacher, Extender, Abbrecher, Metalle aus Stabilisatoren, Stoffe aus dem Prozess, UV Absorber, Füllstoffe, Metalle aus Wärmestabilisatoren oder Katalysatoren).The Invention involves using different plastics, according to the desired properties for the appropriate phase of the process. It should be noted that the invention is not based on the use or order of certain plastics, film materials, connector materials etc., as they are in the embodiments. With the availability of new plastics, plastic combinations or of plastics with new additives or using different ones multilayer films and laminates, but also with experience from the Applications, the skilled person will be able to bag in other designs and sizes, those for the special requirements of the respective laboratory process are suitable. In the embodiment, the currently essential for infusion solutions or blood bags used materials PVC, EVA and PP. It will be largely dispensed with PVC, which is less than about 10% of the plastic mass used but is used for the long-term storage of DNA. The properties of the example materials give rise to specific ones Advantages for the respective process phase and for the control and reduction of liberated substances (plasticizers, extenders, Breakers, metals from stabilizers, substances from the process, UV Absorbers, fillers, metals from heat stabilizers or catalysts).

Flexible PVC Beutel enthalten in der Regel Phtalat-haltige Weichmacher in großer Menge, von denen vermutet wird, dass sie in größeren aufgenommenen Mengen und bei kontinuierlichem Kontakt in der Summe schädliche Wirkungen auf den Menschen aufweisen. Besonders durch den Verdacht, dass der über viele Jahrzehnte eingesetzte Weichmacher DEHP und andere Phtalate Infertilität beim Menschen hervorrufen könnten, wurde zunehmend auf die Verwendung von Phtalat-haltigem PVC für Kinderspielzeug und für die Medizintechnik verzichtet, zumindest wenn die medizinisch notwendige Versorgung mit anderen Materialen sichergestellt werden konnte. Darüberhinaus wurden andere, nicht-Phtalat-haltige Weichmacher für PVC in der Medizintechnik und andere sensitive Bereiche entwickelt (DINCH und andere). So werden Blutbeutel bevorzugt aus PVC gefertigt, weil Blut darin stabil ist. PVC hält einer Dampfsterilisiation gut Stand und hat eine ausgesprochen hohe Langzeitstabilität. Zudem kann es in dickeren Folienlagen (0,4 mm und mehr) gut verschweisst werden, wodurch sehr lange Lagerzeiten von weit über 5 Jahren erreichbar sind. Ein Beispiel für die enorme Langzeitfestigkeit von PVC Folien stellen Teichfolien in der freien Witterung dar, die üblicherweise mit einer Garantie von mindestens 10 Jahren angeboten werden. PVC ist ein weiches, haltbares, gut bedruckbares, auch bei Kälte gut lagerbares und Sauerstoff-/Wasserdampf-dichtes oder zusätzlich versperrbares Material, das eine lange Sterilität gewährleistet. PVC erfüllt damit speziell für die Langzeitlagerung von Biomolekülen und für die unterschiedlichen Inkubationen innerhalb einer Agarosegelmatrix bei 0°C bis 65°C die erforderlichen Stabilitätsparameter bei gleichzeitiger Temperaturbeständigkeit über das 121°C Dampfautoklavieren hinaus, so dass auch Leerbeutel ohne Verkleben der Flächen autoklavierbar sind.Flexible PVC bags generally contain phthalate-containing plasticizers in large quantities, which are believed to have deleterious effects on humans in larger quantities received and in continuous contact. Especially due to the suspicion that DEHP and other phthalates, which have been used for many decades, could cause infertility in humans, the use of phtalate-containing PVC for children's toys and medical technology was increasingly abandoned, at least if the medically necessary supply of other materials was ensured could be. In addition, other non-phthalate-containing plasticizers for PVC in medical technology and other sensitive areas have been developed (DINCH and others). Thus, blood bags are preferably made of PVC because blood is stable therein. PVC withstands steam sterilization well and has a very high long-term stability. In addition, it can be well welded in thicker foil layers (0.4 mm and more), which means that very long storage times of well over 5 years can be achieved. An example of the enormous long-term strength of PVC films is the use of pond liners in the open air, which are usually offered with a warranty of at least 10 years. PVC is a soft, durable, well printable, well storable even in the cold and oxygen / water vapor-tight or additionally lockable material, which ensures a long sterility. PVC thus fulfills the required stability parameters for simultaneous long-term storage of biomolecules and for the different incubations within an agarose gel matrix at 0 ° C to 65 ° C with simultaneous temperature control durability beyond 121 ° C steam autoclaving, so that even empty bags without sticking the surfaces are autoclavable.

Da bisher Genpräparationen/Genlager auf herkömmliche Weise vordringlich in dickwandigen 50 ml Falconröhrchen (aus glasartigem Polypropylen oder modifiziertem Polystyrol erhältlich) gelagert wurden und Langzeitgenlager mit Chelatbildnern nach 7 Jahren Lagerung bei Raumtemperatur keine spürbare Qualitätsverschlechterung aufwiesen, ist es durchaus denkbar, dass die Genlager in stärkerwandigen Beuteln mit einer dichten Barrierefunktion bis weit über 10 Jahre intakt und steril bleiben, wodurch eine zeitversetzte, kostengünstige Nachlieferung geprüften Materials und sehr große Genlager gewährleistet werden können, wodurch DNA Arzneimittel für Massenanwendungen herstellbar werden.There So far gene preparations / genetic stock on conventional Foremost in thick-walled 50 ml Falcon tubes (available from vitreous polypropylene or modified polystyrene) were stored and long-term storage with chelating agents after 7 years Storage at room temperature no noticeable quality deterioration It is quite conceivable that the gene storage in thick-walled bags with a dense barrier function well over 10 years remain intact and sterile, resulting in a time-delayed, cost-effective Subsequent delivery of tested material and very large Genlager can be guaranteed, thereby DNA drugs for mass applications to be produced.

Es ist zu bedenken, dass bei der sehr langen Lagerung, die angestrebt wird, herkömmliche Erfahrungswerte mit potentiell aus der Containerwand austretenden Stoffen nicht einfach auf Beutelfolien übertragen werden können. Zum einen ist die Kontaktoberfläche vergleichsweise groß, wodurch schnell releativ hohe Konzentrationen der Substanzen anfallen können, zum anderen ist die Gesamtmasse bei der Verwendung einer dünneren Folie verhältnismässig klein (vielfach kleiner als bei konventionellen Präparationen und Containern und mehrfachem Containerwechsel), so dass bei der Langzeitlagerung im dünnwandigen Beutel, in dem der gesamte Prozess stattfindet, kaum noch mit Nachschub aus dem Material gerechnet werden muss, zumal die Waschprozesse zu Beginn mit Tensiden stattfinden, die stärker als in den späteren, rein wässrigen Reinigungsschritten und Elektrophoresen, die fettlöslichen Weichmacher aufnehmen und aus den innersten Schichten herausspülen können. Netto könnte somit die Verwendung von dünnen Folien (oder Kombinationen mit dünnen Folien mit unterschiedlichen Eigenschaften und kombinierte Folienmaterialien), zu einer deutlich geringeren Belastung führen, als die Verwendung dickwandiger Container der gleichen Materialien, insbesondere bei den vielfachen Pufferwechseln, die der eigentlichen Isolierung des Arzneimittels vorangehen und den weitaus größten Teil an potentiell anfallenden Substanzen herausschwemmen.It It should be remembered that in the very long storage, the desired is, conventional experience with potentially from the Container wall escaping substances not simply transferred to bag films can be. First, the contact surface comparatively large, which quickly causes relatively high concentrations of the substances can accumulate, on the other hand, the total mass when using a thinner film relatively small (many times smaller than conventional preparations) and containers and multiple container change), so that at the Long-term storage in the thin-walled bag in which the entire process takes place, hardly reckoned with supplies from the material must be, especially since the washing processes take place at the beginning with surfactants, the stronger than in the later, purely aqueous Purification steps and electrophoresis, the fat-soluble plasticizer pick up and wash out of the innermost layers can. Net could thus be the use of thin films (or combinations with thin films with different properties and combined foil materials), lead to a significantly lower load than the Using thick-walled containers of the same materials, in particular at the multiple buffer changes, the actual isolation of the drug and by far the largest Wash out part of potentially accumulating substances.

Darüberhinaus werden Kontakte mit anderen Materialien, wie Glas, Elektrophoresekammern, Kühlschläuche, Elutionskammer, Einmalpipetten etc, komplett vermieden, so dass die gesamte Menge des in Kontakt tretenden Containermaterials durch den Einsatz eines Prozessbeutels auf ein Minimum gesenkt wird.Furthermore contacts with other materials such as glass, electrophoresis chambers, cooling hoses, Elution chamber, disposable pipettes etc, completely avoided, leaving the entire amount of the container material passing into contact the use of a process bag is reduced to a minimum.

Inzwischen werden Weichmacherersatzstoffe, z. B. DINCH, das in Wasser schwer löslich ist, eine geringere Migrationsrate aufweist, und typischerweise keine Metallrückstände enthält ( Technisches Merkblatt Januar 2008 M6168d, BASF ) in PVC verwendet, von denen bislang keine medizinischen Nachteile für den Menschen bekannt sind oder bei viel höheren Testkonzentrationen keine fruchtschädigende Wirkung nachweisbar war ( Welle et al. 2005 ; Ref. Scientific Commettees 2008, SCENIHR Opinion, http://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_scenihr/docs/scenihr_o_014.pdf ).Meanwhile, plasticizer substitutes, eg. B. DINCH, which is sparingly soluble in water, has a lower migration rate, and typically contains no metal residues ( Technical Data Sheet January 2008 M6168e, BASF ) used in PVC, of which no medical disadvantages for humans are known or at much higher test concentrations no fructaffactory effect was detectable ( Welle et al. 2005 ; Ref. Scientific Commettees 2008, SCENIHR Opinion, http://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_scenihr/docs/scenihr_o_014.pdf ).

Dennoch ist bekannt, dass die zum Teil in größeren Mengen im PVC eingesetzten Weichmacher über einen längeren Zeitraum hinweg leicht im Kunststoff migrieren können und damit bei einer Langzeitlagerung, besonders bei lipophiler Füllung, auch in die zu lagernden Substanzen diffundieren ( K. Inoue et al. 2005 ). Auch wenn in den ersten Tagen und Wochen des Reinigungsprozesses mehrfach die tensidhaltigen Puffer im Prozessbeutel erneuert werden, würde mit Sicherheit nach der anschliessenden Langzeitlagerung wieder Weichmacher in die tensidhaltige Lagerlösung nachwandern, auch wenn anfangs schon eine gewisse Menge der innersten Schicht weggewaschen wurde. In Anlehnung an die Lagerbarkeit von Blutzellen in PVC wäre aber nicht zu erwarten, dass die Bakterien und die daraus resultierende Biomasse und letztlich die enthaltenen, biologisch inerten DNA Moleküle durch den Weichmacher geschädigt werden würden. Weichmacherfreies EVA hat ebenfalls eine hohe Widerstandsfähigkeit mit einer hohen Wasserdampfsperre und ist gut verschweissbar.Nevertheless, it is known that the plasticizers sometimes used in relatively large quantities in PVC can easily migrate in the plastic over a relatively long period of time and thus also diffuse into the substances to be stored in the case of long-term storage, especially in the case of lipophilic filling ( K. Inoue et al. 2005 ). Even if the surfactant-containing buffers in the process bag are renewed several times in the first few days and weeks of the cleaning process, plasticizer would certainly migrate back into the surfactant-containing storage solution after the subsequent long-term storage, even if initially a certain amount of the innermost layer had already been washed away. Based on the storability of blood cells in PVC but would not be expected that the bacteria and the resulting biomass and ultimately the contained, biologically inert DNA molecules would be damaged by the plasticizer. Plasticizer-free EVA also has a high resistance with a high water vapor barrier and is well weldable.

Da bei den anzuschliessenden Puffer-Mehrkammerbeuteln auch eine gewisse Lagerung durchgeführt werden muss, diese aber nicht die übliche Lagerzeit von Infusionslösungen von Monaten bis wenige Jahre übersteigt, und die Beutel nicht den vielen Manipulationen standhalten müssen, wird in einer Ausführung bevorzugt für alle Beutel der Nachfüllösungen, die nach der Lagerung zum Einsatz kommen, und für alle kurzfristigen Prozessbeutel (Elutionsbeutel, Elutionskammer, Transportschlauch etc.) ein weichmacherfreier Polyolefinkunststoff verwendet. PP Beutel werden vermehrt für Infusionslösungen eingesetzt und können durch zusätzliche Schichten mit einer höheren Gas- und Dampfbarriere hergestellt werden. Darüberhinaus bieten z. B. Spezialpolyolefinfolien mit Peelnaht-Eigenschaften die Möglichkeit der Herstellung von Multikammerbeuteln mit Kaskaden wässriger Lösungen nach dem hier vorgeschlagenen Verfahren.There in the buffer to be connected multi-chamber bags also a certain Storage must be performed, but this is not the usual storage time of infusion solutions from months to a few years, and the bags do not have to withstand the many manipulations is preferred in one embodiment for all bags the refilling solutions, which after storage for Use, and for all short-term process bag (Elution bag, elution chamber, transport tube, etc.) a plasticizer-free Polyolefine plastic used. PP bags are being propagated for Infusion solutions used and can by additional layers with a higher gas and Steam barrier are produced. In addition, offer z. B. Spezialpolyolefinfolien with Peelnaht properties the possibility the production of multi-chamber bags with cascades of aqueous Solutions according to the method proposed here.

Da Gentherapieapplikationen auch verstärkt an Neugeborenen und Kleinkindern zum Einsatz kommen werden, muss die Materialwahl mit besonderer Vorsicht und mit einem besonders günstigen Nutzen-Risiko Verhältnis erfolgen. So ist im Hinblick auf Verunreinigungen in der zu applizierenden DNA Lösung bevorzugt ein weichmacherfreies Material/Beutelsystem, etwa nur Polyolefine, anzustreben, oder auf phtalathaltige Weichmacher zu verzichten.Since gene therapy applications will increasingly be used on newborns and infants, the choice of materials must be made with particular caution and with a particularly favorable risk-benefit ratio. Thus, with regard to impurities in the DNA solution to be applied, preference is given to a plasticizer-free material al / bag system, such as polyolefins only to strive, or to abstain from phthalate-containing plasticizers.

Allerdings ist zu berücksichtigen, dass Zusatzstoffe, die bei der Polyolefinpolymerisation zum Einsatz kommen können, wie Katalysatoren und Co-Katalysatoren (oder andere Additive in anderen Kunststoffen), im hergestellten Beutel (hier Polypropylen) vorhanden sind und geringe Spuren in die Lösungen geraten können. Solche wären zwar für den Menschen (bei Infusion, Nahrungsverpackung etc) wegen der höchstens spurenhaften Menge und Art der Stoffe und dem nicht-migrierenden Verhalten gesundheitlich unbedenklich und wären bei herkömmlichen Verpackungen und mässigen Lagerzeiten kaum nachweisbar, aber könnten während der Langzeitlagerung dennoch eine nachteilige Wirkung auf enthaltene inerte, nicht-biologische DNA Moleküle haben (direkt chemisch versus potentiell genotoxisch im komplexen lebenden System). So könnten z. B. die bei der Polypropylenherstellung verwendeten Ziegler-Natta-Katalysatoren, die in der Regel metallorganische Verbindungen darstellen (Cobalt, Eisen, Nickel, etc), oder Co-Katalysatoren, ein Problem speziell für die Stabilität der freien DNA Doppelhelix darstellen, selbst wenn nur Spuren über längere Zeit in der Lagerlösung vorhanden sein würden, obwohl solche Substanzen in diesen Mengen keinerlei nachteilige, oder sogar vorteilige Wirkungen auf lebende biologische Systeme hätten, wie das für Eisen und viele Metalle und andere Spurenelemente der Fall ist.Indeed It should be borne in mind that additives used in the Polyolefinpolymerisation can be used as Catalysts and co-catalysts (or other additives in other plastics), in the manufactured bag (here polypropylene) are present and small Traces can be found in the solutions. Such would be for humans (with infusion, food packaging etc) because of the maximum trace amount and type of Substances and the non-migratory behavior harmless to health and would be conventional packaging and moderate Storage times barely detectable, but could be during the long-term storage nevertheless contained an adverse effect inert, non-biological DNA molecules (directly chemical versus potentially genotoxic in the complex living system). So could z. As used in polypropylene production Ziegler-Natta catalysts, which are usually organometallic compounds (cobalt, iron, nickel, etc), or co-catalysts, a problem specifically for the stability of the free DNA double helix, even if only traces over be present for a longer time in the storage solution although such substances would be none in these quantities adverse, or even beneficial effects on living biological Have systems like iron and many metals and other trace elements is the case.

Ein wesentlicher Aspekt der Erfindung in der Ausführung eines Prozessbeutels für die Grad 1 DNA Produktion ist die absolute Vermeidung von Metallkontakt und die Ausschaltung kleinster Mengen freier Metallionen/Schwermetalle, wie sie etwa in sauberem Leitungswasser oder Mineralwasser vorkommen oder aus Glasbehältern austreten können, da diese im nicht-biologischen System schädigend auf freie DNA Moleküle wirken können. So werden durch den Einsatz eines Kunststoff-Prozessbeutels durch das neue Verfahren und durch das Material metallische Konaktoberflächen, wie sie in herkömmlichen Kühlkreisläufen der Elektrophoresekammern auftreten, durch Verzicht auf einen Kühlkreislauf verbannt. Damit gelingt auch der Verzicht auf herkömmliche Kühlkreisläufe in Glasgefässen/Wärmetauschern/Glaswendeln/Kühlfallen/Schläuchen, aus denen zusätzlich Metallionen herausgewaschen werden können. Zum Ansetzen der Pufferlösungen wird ausschliesslich Wasser aus einer Quarzglasbidistille verwendet. Platindrahtelektroden werden bei der elektrophoretischen Aufreinigung durch Kohlenstoffmodifikationen, insbesondere Glaskohlenstoff oder andere ersetzt, die sich elektrochemisch praktisch rückstandsfrei in entweichendes Gas und nicht in Feststoffe und Metallionen zersetzen. Damit wird ebenfalls vermieden, dass im Platin vorhandene andere Metalle anfallen. PVC mit Weichmacher ist seit dem Verzicht auf Blei und dem Einsatz von Zink und Calcium für Stabilisatoren praktisch schwermetallfrei. Somit ist eine Lagerung der Genlager, unabhängig von der Anwesenheit von Weichmachern, in haltbarem PVC oder anderen geeigenten Folienmaterialen vorzunehmen, bis nach mitunter vielen Jahren die eigentliche, verbrauchsnahe Reinigung mit Pufferkaskaden aus weichmacherfreien Materialien erfolgt. Da nach der Langzeitlagerung der Genlager (Jahre) das vielstufige Reinigungsverfahren fortgesetzt wird, und eine längere Serie frischer Pufferlösungen zugeführt wird, kann eine weitestgehend vollständige Abreicherung aller im Lagerbeutel vorhandenen, beweglichen Substanzen erreicht werden, wodurch die anfängliche Anwesenheit von Weichmachern und anderen Substanzen, solange sie der Haltbarkeit des Prozessbeutels und damit der sterilen Langzeitlagerbarkeit der DNA Moleküle dienen, wünschenswert oder akzeptierbar sind.One essential aspect of the invention in the execution of a Process bag for the grade 1 DNA production is the absolute Avoidance of metal contact and elimination of smallest quantities free metal ions / heavy metals, such as in clean tap water or mineral water or leak out of glass containers can, as these are harmful in the non-biological system can act on free DNA molecules. So be through the use of a plastic process bag through the new Method and through the material metallic contact surfaces, as in conventional cooling circuits the electrophoresis chambers occur by dispensing with a cooling circuit banished. Thus, the renunciation of conventional succeeds Cooling circuits in glass vessels / heat exchangers / glass coils / cold traps / hoses, from which additional metal ions are washed out can. To prepare the buffer solutions becomes exclusive Water from a quartz glass biotope used. Platinum wire electrodes be in the electrophoretic purification by carbon modifications, in particular Glassy carbon or other substitutes that are electrochemically practical residue-free in escaping gas and not in solids and decompose metal ions. This also avoids that accumulate in platinum other metals. PVC with plasticizer is since the abandonment of lead and the use of zinc and calcium For stabilizers practically free of heavy metals. Thus is a storage of gene storage, regardless of the presence of Plasticizers, in durable PVC or other suitable film materials until after many years, the actual, consumption-related Cleaning with buffer cascades of plasticizer-free materials takes place. Since after long-term storage of gene storage (years) multistage Cleaning process continues, and a longer series fresh buffer solutions is fed, a Largest complete depletion of all in the storage bag existing, mobile substances are achieved, whereby the initial presence of plasticizers and other substances, as long as the durability of the process bag and therefore the sterile Long-term storability of DNA molecules serve, desirable or acceptable.

Zum Zeitpunkt der Wiederaufnahme der Reinigung des Langzeitlagers zum medizinischen Endprodukt hat eine fortgeschrittene Auswaschung des Weichmachers aus dem PVC Beutel stattgefunden, wodurch die dann nur noch für kurze Zeiten vorhandenen Lösungen (Tage), nur noch vernachlässigbar kleine Weichmacherkonzentrationen aufnehmen können. Damit ab dem Zeitpunkt der Fortsetzung der Reinigung bis zur endgültigen Isolierung der freien DNA Moleküle in der angeschlossenen Elutionskammer keine erneute Weichmacherzufuhr stattfindet, erfolgt ein Wechsel des Materials der anzuschliessenden Pufferbeutel auf andere autoklavierbare Materialien, z. B. Polyolefine, bevorzugt das Polypropylen ohne Weichmacher. Bei diesen relativ kurzen Verweildauern ist von den zugeführten Lösungen mit potentiell spurenartigen metallischen Verunreinigungen keine relevante DNA Schädigung mehr zu befürchten (bestimmbar im Langzeittest).To the Time of resuming cleaning of long - term storage for medical end product has an advanced leaching of the plasticizer out of the PVC bag, which then only for short times existing solutions (days), only negligible small Plasticizer concentrations. So from the Time of continuation of cleaning until final Isolation of free DNA molecules in the connected Elutionskammer no renewed softener supply takes place takes place a change of the material of the buffer bag to be connected other autoclavable materials, e.g. For example, polyolefins are preferred the polypropylene without plasticizer. At these relatively short dwell times is potentially of the solutions supplied trace-like metallic contaminants no relevant DNA Damage to be feared more (determinable in the long-term test).

Damit bestehen prinzipiell unterschiedliche Anforderungen an das Beutelmaterial wärend zwei verschiedener Prozessphasen. Während der Phase 1 von der Einbringung der Biomatrix bis zur Lagerung der Genlager müssen vor allem DNA-schädigende Verunreinigungen ausgeschaltet werden, während für den Menschen kritische, aber materialtechnisch günstige Stoffe akzeptiert werden können, weil sie später herausgewaschen und stark verdünnt werden. Während der Phase 2 wird aus den funktionell charakterisierten Genlagern in einer mehrwöchigen, vielstufigen Isolierung reine Grad 1 DNA hergestellt, oder in hohem Masse funktionelle DNA für eine Applikation als Arzneimittel in wässriger Lösung isoliert. Insbesondere wenn die DNA zu einem Arzneimittel verarbeitet werden soll, muss während der Phase 2 die weitestgehend vollständige Reduzierung von für den Menschen kritischen Verunreinigungen erreicht werden (allen voran muss Sterilität, Partikel- und Pyrogenfreiheit gewährleistet werden, aber auch Weichmacher in hohen Konzentrationen, z. B. aus Überleitungssystemen und Schläuchen vermieden werden). Aus diesem Grund kommen andere Materialien für die zugeführten Waschlösungen in der Phase 2 zum Einsatz.In principle, there are different requirements for the bag material during two different process phases. During Phase 1, from the introduction of the biomatrix to the storage of gene storage, it is first and foremost necessary to eliminate DNA-damaging contaminants, while for humans it is possible to accept substances that are critical but material-favorable because they are later washed out and heavily diluted. During Phase 2, pure Grade 1 DNA is prepared from the functionally characterized gene stocks in multi-level multi-week isolation, or high levels of functional DNA are isolated for drug application in aqueous solution. In particular, if the DNA is to be processed into a drug, the most complete reduction of human-critical impurities must be achieved during Phase 2 (sterility, particle and pyrogen free, but also must be guaranteed Plasticizers in high concentrations, eg. B. from transfer systems and hoses are avoided). For this reason, other materials are used for the supplied washing solutions in phase 2.

Es soll hier zum Stand der Technik darauf hingewiesen werden, dass nicht bekannt ist, ob Metallspuren aus entsprechenden Kunststoffen überhaupt messbar in wässrigen Lösungen anfallen und ob daraus eine direkte DNA schädigende Wirkung ausgehen könnte. Es ist bekannt, dass Polyolefine besonders gute, saubere Folien für die Verpackung darstellen, aus denen im Vergleich zu Weichmachern, praktisch keine Substanzmengen austreten. Bei der hier geschilderten Materialabwägung handelt es sich also um ein Beispiel, wie die bestmögliche Stabilität des intakten Genlagers, und damit eine hohe Wirksamkeit pro Molekül für ein DNA Arzneimittel erreicht werden kann, und dabei gewährleistet werden kann, dass das endgültige DNA Arzneimittel in einem optimalen, rückstandsfreien, gesundheitlich unbedenklichen Medium zur Verfügung steht.It should be noted here to the prior art, that It is not known if metal traces of corresponding plastics at all measurable in aqueous solutions and whether could be a direct DNA damaging effect. It is known that polyolefins are particularly good, clean films represent for the packaging from which compared to Softeners, practically no substance amounts leak. In the Here described material weighing is so for example, how the best possible stability of the intact gene storage, and thus a high efficiency per molecule for a DNA drug can be achieved, and thereby can be guaranteed that the final DNA drugs in an optimal, residue-free, sanitizing medium is available.

Eine weitere Massnahme zur Reduzierung enzymaktiver Metallionen sind Zusätze von Chelatbildnern in die Waschlösungen, wie das häufig verwendete EDTA (1–500 mM, in einer möglichst schwermetallfreien Spezifikation) oder das hier vorgeschlagene, speziell für die zusätzliche Komplexierung von zweiwertigen Metallionen (z. B. Zn, Ca aus Stabilisatoren) und Schwermetallen in kleiner Konzentration während aller Stufen der Verwendung des im Prozessbeutels für die Grad 1 DNA Herstellung obligat zugegebene EGTA (0,1 mM).A Further measures for reducing enzyme-active metal ions are Additions of chelating agents into the washing solutions, like the commonly used EDTA (1-500 mM, in one possibly heavy metal-free specification) or here proposed, especially for the additional complexation of divalent metal ions (eg Zn, Ca from stabilizers) and Heavy metals in low concentration during all stages using the process bag for the grade 1 DNA Preparation of obligate added EGTA (0.1 mM).

In anderen Ausführungen eines Reinraumprozessbeutels werden andere und neue Materialien gezielt eingesetzt, um den jeweiligen Anforderungen zu entsprechen. Ebenso ist denkbar, sollte sich eine > 5 jährige, bevorzugt > 10 jährige Lagerbarkeit langer DNA Moleküle in einem weichmacherfreien Folienmaterial demonstrieren lassen, dass der Prozess-/Lagerbeutel und die Zuführungsbeutel aus einem Material sein können.In other versions of a clean room process bag other and new materials used specifically to the respective To meet requirements. It is also conceivable, if a> 5 year old, preferably> 10 years old Storage of long DNA molecules in a plasticizer-free Demonstrate foil material that the process / storage bag and the feed bags may be of a material.

Ähnliche Materialabwägungen werden für die Adaptoren, Zuführungsschläuche, ggf. Kleber, Kunststoffdruckfarben und für den Halterahmen/die Gelgiessform getroffen. Dabei kommen geprüfte Materialien für die Medizintechnik zum Einsatz, wobei je nach Anwendung spezielle Anforderungen an die Festigkeit, Transparenz, Hitzestabilität, Verklebbarkeit oder Verarbeitbarkeit (z. B. Spritzgussformen aus Polykarbonaten usw) gestellt werden, oder besonders für die Sterilitätserhaltung über lange Anwendungszeiten ausgelegte Ventilverschlüsse und Ports verwendet werden.Similar Material considerations are for the adapters, feed hoses, if necessary adhesive, plastic printing inks and for the holding frame / the gel casting mold met. Here are tested materials for Medical technology is used, whereby depending on the application special Requirements for strength, transparency, heat stability, Adhesion or processability (eg Polycarbonates, etc.), or especially for Sterility maintenance over long periods of use designed valve locks and ports are used.

Durch den Einsatz eines Beutellabors können auf einfache Weise herkömmliche Verfahren, Puffer, und der Einsatz elektrophoretischer Reinigungsverfahren stark vereinfacht, Ausbeuten vervielfacht, Abfall minimiert, und wechselnde oder weiterentwickelte Materialparameter auf den Bedarf abgestimmt werden. Eine besondere Situation stellt die Pulsfeldreinigungselektrophorese im Beutel dar. Dabei ist die Besonderheit, dass nicht wie bisher des zu reinigende Material in ein Agarosegel eingebracht wird, das dann in eine spezielle Pulsfeldgelektrophoresekammer mit Pufferkühlanlage/Kreislauf eingebracht wird, sondern dass nur das zu reinigende Gelmaterial/die Trägermatrix in dem verschlossenen Beutel vorliegt und dort alle Schritte (unter Reinraumbedingungen) stattfinden (unter drastischer Einsparung von Agarose).By The use of a bag lab can be done in a simple way conventional methods, buffers, and the use of electrophoretic Cleaning procedure greatly simplified, yields multiplied, waste minimized, and changing or advanced material parameters be tailored to the needs. A special situation Pulse field cleaning electrophoresis in the bag Peculiarity that not as before the material to be cleaned in an agarose gel is introduced, which is then placed in a special pulsed field gel electrophoresis chamber with buffer cooling system / circuit is introduced, but that only the gel material to be cleaned / the carrier matrix is present in the sealed bag and there all steps (under Clean room conditions) take place (with drastic savings of Agarose).

In den Beutel werden für die elektrochemischen Reinigungsschritte sterile Elektroden eingeschoben, wobei die Einschubzugänge längere schlauchförmige Aussackungen darstellen, die nach der Entnahme der Elektroden mit einer einfachen, thermo- und/oder zeitregulierten Handschweisszange wieder verschweisst werden können. Dabei wird unterhalb der Zersetzungstemperatur des Materials gearbeitet, um schädliche Reaktionsprodukte zu vermeiden. In einer Ausführung werden während des Strombetriebs die Elektrodenkanäle der schlauchartigen Beutelaussackungen, über die Elektroden mit flexiblen Elektrodenkabeln eingesteckt werden, schräg nach oben gewinkelt nach oben offen betrieben (10, Kanäle E1-4). Damit kann Gas der Elektrophorese aus dem Puffer nach aussen entweichen, während die zu reinigende Gelmatrix weiterhin im Prozessbeutel verweilt.Sterile electrodes are inserted into the bag for the electrochemical cleaning steps, wherein the insertion accesses represent longer tubular protuberances which, after removal of the electrodes, can be re-welded with a simple, thermo-and / or time-regulated manual welding tongs. It works below the decomposition temperature of the material to avoid harmful reaction products. In one embodiment, during the current operation, the electrode channels of the tube-like Beutelaussackungen, are inserted over the electrodes with flexible electrode cables, obliquely upwardly angled open up operated ( 10 , Channels E1-4). This allows gas from the electrophoresis to escape from the buffer to the outside, while the gel matrix to be cleaned remains in the process bag.

Alternativ werden die einsteckbaren Elektrodenmaterialien mit einem Adapter in den Beutel eingesteckt und damit fest verbunden (9). Dabei werden die Elektroden ausserhalb des Adapters an die Stromkabel angeschlossen (leitfähig verklebt, oder geschraubt, geklemmt) und mit einer Isolierschicht versehen (bevorzugt aufgeschrumpfter thermoplastischer Überzug, der sterilisierbar ist). Die Elektrodenstäbe werden entsprechend ihres Durchmessers bevorzugt im Steckaddapter gegen Pufferaustreten abgedichtet, so dass nur das Elektrodenmaterial selbst, und nicht die Kabel oder der Kabel- und Elektrodenanschluss den Puffer im Innenbereich berühren. Bei dieser Lösung mit gas- und pufferdichter Elektrodeneinsteckung wird ein zusätzlicher Pufferablauf/Gasablasskanal, der eine druckregulierende Wassersäule formt, so geöffnet, dass das nach oben strömende Gas und der nach oben abgeleitete Puffer (warm, verbraucht) nach oben abgeleitet wird, in dem die Öffnung über dem Beutelniveau angebracht wird. Dafür kann der Beutel speziell konzipiert werden, oder während der Elektrophorese schräg gelagert werden, so dass der Innenbereich durch Puffer aufgebläht ist, und der Ablaufkanal/Gasablasskanal den höchsten Punkt des Beutels darstellt, und der Kanal weiter nach oben abgeleitet wird, so dass der Pufferstand im Ablasskanal den Beuteldruck weiter erhöht, bevor der Puffer und das Gas am Ende des Kanals entweichen (6, 7).Alternatively, the insertable electrode materials are inserted with an adapter in the bag and thus firmly connected ( 9 ). The electrodes are connected outside the adapter to the power cable (glued conductive, or screwed, clamped) and provided with an insulating layer (preferably shrunk thermoplastic coating that can be sterilized). The electrode rods are preferably sealed according to their diameter in the plug adapter against buffer leakage, so that only the electrode material itself, and not the cable or the cable and electrode connection touch the buffer indoors. In this solution with gas- and buffer-tight Elektrodeneinsteckung an additional buffer drain / gas outlet channel, which forms a pressure-regulating water column, opened so that the upwardly flowing gas and the upwardly derived buffer (warm, consumed) is discharged upwards, in which the Opening is placed above the bag level. For this purpose, the bag can be specially designed, or be stored obliquely during electrophoresis, so that the inner area is inflated by buffer, and the drainage channel / Gasab channel is the highest point of the bag, and the channel is further upwardly directed so that the buffer level in the drain channel further increases the bag pressure before the buffer and gas at the end of the channel escape ( 6 . 7 ).

Die Elektrodenmaterialien können je nach Anforderung an das Genlager variiert werden. So stellen beispielsweise kostengünstige Graphitelektroden für eine rückstandsarme Zersetzung der Elektrode in Gas, eine metallfreie Lösung mit möglicher Einmalverwendung der sterilen Elektrode dar. Allerdings besteht bei Graphit die Gefahr von Kohlenstoffabrieb beim Einsetzen/Einschieben. Da Graphitabriebpartikel biologisch inert sind (vgl. sauber applizierte Tatoo Farbe) und die Elutionskammer, die zur Gewinnug der freien DNA Moleküle mit einem Partikelfilter/Filtermembran bestückt wird (7, 8), wird keine nachteilige Wirkung durch den Einsatz von Graphit erwartet und damit ein kostengünstiges Einmalelektrodenmaterial mit gleichzeitiger Kostensenkung und Ausschaltung von Kontaminationsquellen eingesetzt. Die Verwendung von Graphitelektroden und hochreinen Graphitelektroden und Graphitkomposite frei von Verunreinigungen im Reinraumprozessbeutel ist Gegenstand der Erfindung.The electrode materials can be varied depending on the requirements of the genetic stock. For example, low-cost graphite electrodes for a low-residue decomposition of the electrode into gas, a metal-free solution with a possible single use of the sterile electrode. However, in graphite there is a risk of carbon abrasion during insertion / insertion. Since graphite abrasion particles are biologically inert (compare cleanly applied Tatoo color) and the elution chamber, which is equipped to gain the free DNA molecules with a particle filter / filter membrane ( 7 . 8th ), no adverse effect is expected from the use of graphite and thus a low-cost disposable electrode material with simultaneous cost reduction and elimination of contamination sources used. The use of graphite electrodes and high-purity graphite electrodes and graphite composites free of impurities in the clean room process bag is the subject of the invention.

Gegenstand der Erfindung des Verfahrens mit einem Prozessbeutel schliesst in der Ausführung der Grad 1 DNA Präparation und Anlegung von Genlagern für ein DNA Arzneimittel zur inneren Anwendung am Menschen den Einsatz von Glaskohlenstoffelektroden ein, die eine rückstandsfreie Reinigungselektrophorese ermöglichen. Glaskohlenstoff mit fullerenartigem Aufbau stellt ein extrem hartes, glattes, hitzebeständiges, autoklavierbares, und partikelfreies Material dar, das sich bei der Elektrolyse quasi rückstandsfrei in Gas auflöst. Damit können Platinabsonderungen und Absonderungen von anderen metallischen Platinverunreinigungen und elektrochemische Reaktionsprodukte an der Oberfläche herkömmlicher Elektroden in Pulsfeldelektrophoreseanlagen vermieden werden, die der Stabilität von gelagerten Biomolekülen entgegenwirken könnten. Damit ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Glaskohlenstoffelektroden und anderen Kohlenstoffmodifikationen im Reinraumprozessbeutel, die je nach Ausgangsmaterial für die spezielle Anwendung gefertigt werden können und eine sehr saubere Lösung zu allen verfügbaren elektrophoretischen Aufreinigungen darstellen.object the invention of the method with a process bag includes in the execution of the grade 1 DNA preparation and Creation of gene stores for a DNA drug to the inner Application to humans the use of glassy carbon electrodes a, which is a residue-free purification electrophoresis enable. Glassy carbon with fullerenartig construction represents an extremely hard, smooth, heat-resistant, autoclavable, and particle-free material, which virtually without residue in the electrolysis dissolves in gas. This can platinum secretions and secretions of other metallic platinum contaminants and electrochemical reaction products on the surface conventional electrodes in pulsed field electrophoresis equipment which avoids the stability of stored biomolecules could counteract. This is the subject of the invention the use of glassy carbon electrodes and other carbon modifications in the cleanroom process bag, depending on the starting material for the special application can be made and one very clean solution to all available electrophoretic Represent purifications.

Andere in der Erfindung miteingeschlossene Elektrodenmaterialien für die Verwendung im Prozessbeutel sind Kohlestäbe.Other Electrode materials included in the invention the use in the process bag are carbon rods.

Ein weiteres, neues Elektrodenmaterial der Erfindung zur Verwendung als Elektrode in einem Reinraumprozessbeutel, entweder fest integriert/verschweisst, oder sekundär eingesetzt, stellt Kohlenstoff/Graphit/reiner Russ/nicht-metallische Einschlüsse in fein dispersierter, gebundener Form dar, wie er in elektrisch leitfähigen Kunststofffolien verwendet wird. Herstellungsverfahren (z. B. DE 69525902T2 ) für ähnliche Folien sind bekannt für die Verwendung als antistatische Verpackung von elektronischen oder explosiven Materialien entwickelt, oder werden für die Stromversorgung kompakter elektronischer Geräte verwendet. Der Einsatz als Elektrodenmaterial für molekulare Aufschlüsse und elektrophoretische Reinigungsschritte oder Elektroelutionen in Reinraumprozessen ist nicht bekannt. Damit ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung elektrisch leitfähiger Kunststoffolien als Elektrodenmaterial in einem Reinraumprozessbeutel und die Verwendung anderer gemischter leitfähiger Elektrodenmaterialien im Prozessbeutel, z. B. Silikate, Keramik und Ligierungen oder auf die Innenseite des Prozessbeutels aufgebrachte leitfähige Schichten, Folien, Laminate, Lacke.Another novel electrode material of the invention for use as an electrode in a clean room process bag, either integral / welded or secondarily employed, is carbon / graphite / pure carbon black / non-metallic inclusions in finely dispersed, bonded form as used in electrically conductive Plastic films is used. Manufacturing process (eg DE 69525902T2 ) for similar films are known for use as antistatic packaging of electronic or explosive materials, or are used for powering compact electronic devices. The use as electrode material for molecular digestions and electrophoretic purification steps or electroelutions in clean room processes is not known. Thus, the subject of the invention is the use of electrically conductive plastic films as electrode material in a clean room process bag and the use of other mixed conductive electrode materials in the process bag, z. As silicates, ceramics and ligation or applied to the inside of the process bag conductive layers, films, laminates, paints.

In anderen Ausführungen kommen je nach Anforderungen an die zu erwartende Verweildauer der Biomoleküle im Folgepuffer nach einer elektrophoretischen Reinigung oder nach der Elektroelution andere oder wechselnde Elektrodenmaterialien in Betracht. So können wahlweise Platinelektroden, Graphitelektroden, Glaskohlenstoffelektroden, oder Kohlestäbe oder andere Elektrodenmaterialien zum Einsatz kommen, und die Elektroden für mehrfache Sterilisation/Verwendung vorgesehen sein oder als Einmalartikel.In other designs come depending on the requirements of the expected residence time of biomolecules in the follow-up buffer after electrophoretic cleaning or after electroelution others or changing electrode materials into consideration. So can optional platinum electrodes, graphite electrodes, glassy carbon electrodes, or carbon rods or other electrode materials come, and the electrodes for multiple sterilization / use be provided or as a disposable item.

In die Erfindung eingeschlossen sind sterilisierbare, elektrisch nicht leitende Ummantelungen der Elektrodenenden und angeschlossenen Elektrokabel, um ein Eintauchen der Kabel in den Betriebspuffer zu ermöglichen, wobei das zuführende Kabel in den Puffer eintauchen kann (Ausführung mit offenen Elektrodenkanälen). Demnach werden die Elektrodenenden und Kabel mit einer nichtleitfähigen Schicht/Lack/Folie (z. B. schrumpfende Eigenschaft) ummantelt. Die Verbindung von Kabel zu Elektrode ist bevorzugt reversibel und wird vor (also unterhalb) der isolierenden Ummantelung angebracht, gesteckt, geklemmt, geschraubt, oder leitfähig verklebt.In the invention included are sterilizable, not electrically conductive sheaths of the electrode ends and connected electrical cables, to allow immersion of the cables in the operating buffer, wherein the feeding cable can dip into the buffer (Version with open electrode channels). Therefore are the electrode ends and cables with a non-conductive layer / paint / foil (eg shrinking property) sheathed. The connection of cable to electrode is preferably reversible and is before (that is below) the insulating sheath attached, plugged, clamped, screwed, or glued conductive.

Darüberhinaus wird durch den Reinraumprozessbeutel eine gegenüber den bekannten Pulsfeldelektrophoreseverfahren und Elektrophoresekammersystemen mit Puffer-Kühlumwälzung eine neue, reinere Elektrophoresesituation erzeugt, die einen kontinuierlichen Zulauf aus einem Zulaufbeutel (etwa ein großvolumiger Polypropyleninfusionsbeutel (z. B. 3000 ml, 5000 ml), mit sterilisiertem, vorgekühlten (4°C) Elektrophoresepuffer (etwa ein Tris-Acetat-EDTA Puffer) und einem getrennten, kontinuierlichen Ablauf des erwärmten, gegebenenfalls nach oben steigenden, verbrauchten Puffers unter Überlaufdruck ermöglicht, wodurch eine übermässige Vermischung/Kreislaufsituation vermieden wird, und der Beutel unter mässigem Druck vollständig gefüllt wird und sich von selbst aufbläht. Im geblähten Zustand wird die notwendige räumliche Elektrodenanordnung gewährleistet. In verschiedenen Ausführungen werden die Elektroden entweder aussen fixiert und der Beutel entsprechend gelagert, oder sie werden in einer dem Einsteckschacht gegenüberliegenden Führung im Beutel verankert, oder sie werden z. B. in Führungsvorrichtungen am Siebrahmen der Trägermatrix eingesteckt.Moreover, the cleanroom process bag creates a new purer electrophoresis situation compared to the known pulsed field electrophoresis and electrophoresis buffer buffer recirculation systems comprising a continuous feed from a feed bag (such as a large volume polypropylene infusion bag (e.g., 3000 ml, 5000 ml), with sterilized, precooled (4 ° C) electrophoresis buffer (such as a Tris-acetate-EDTA buffer) and a separate continuous flow of heated, optionally rising, spent buffer under overflow pressure, whereby excessive vermi is avoided, and the bag is completely filled under moderate pressure and inflates by itself. In the inflated state, the necessary spatial electrode arrangement is ensured. In various embodiments, the electrodes are either fixed outside and the bag stored accordingly, or they are anchored in a slot opposite the guide in the bag, or they are z. B. inserted in guide devices on the screen frame of the carrier matrix.

Durch die Einwegrichtung des neu nachlaufenden Puffers werden die während der Reinigungselektrophorese in den Puffer transportierten Abfallmoleküle (E. coli Reste, Peptidreste aus Proteinase-Abbau, DNA und Restriktionsenzymabbauprodukte, Lagerpufferanteile, Rückstände aus den Vorstufen, Restseifen etc) nicht in einen Kühlkreislauf eingespeist, sondern werden zügig aus dem Beutel abgeschieden. Durch diese Massnahme wird die Belastung des Reinigungspuffers mit elektrophoretischen Reaktionsprodukten und mit herausgereinigten Biostoffen und Reinigungsrückständen gegenüber einer herkömmlichen, pulsfelgelektrophoretischen Isolierung stark reduziert. So werden elektrochemische Reaktionen zirkulierender Abfallstoffe an den Elektroden auf ein Minimum gesenkt. Ausserdem kann nach dem Endpunkt der Elektrophorese, bei der eine vollständige Reinigung des Gels stattgefunden hat, aber noch Abfallmoleküle im Puffer vorhanden sind, ein vollständiger Pufferwechsel vorgenommen und eine zweite Elektrophorese durchgeführt werden, wodurch restliche Abfallmoleküle wirksam entfernt werden (6, 7). Durch kühle Lagerung des Prozessbeutels und gekühltem Zulaufpuffer kann bei einer geeigneten, angelegten Spannung zwischen 1,5–9 V/cm auf eine zusätzliche Kühlung mit einem Pumpenkreislauf verzichtet werden, wodurch für den Prozess eine weitere erhebliche Kontaminationsquelle der herkömmlichen Laborverfahren ausgeschaltet wird. So fallen keine mehrfach zu verwendenden Elektrophoresekammern an, auf zusätzliche meterlange Schläuche, Kühlleitungen und Kühlaggregate mit Flüssigkeitsumlauf und auf Pumpen kann verzichtet werden, Pufferkammern/Toträume an Schlauchverbindungsstellen werden vermieden, eine aufwändige Sterilisation separater Elektrophoresekammern, mit zum Teil schwer zugänglichen Nischen und Toträumen wird komplett vermieden. Damit stellt der hier erfundene Reinraumprozessbeutel mit integriertem Elektrophoresevorrichtung und Elutionsbeutel und der zuschaltbaren Eluatkammer eine grundsätzlich neue, sprunghaft bessere Methode für den gesamten Prozess der Biomolekülisolierung, insbesondere der Isolierung von Grad 1 DNA Molekülen für den medizinischen und tiermedizinischen Einsatz dar. Darüberhinaus wird eine technische Vereinfachung erreicht, die selbst in Fällen, in denen Reinraumbedingungen nicht zwingend benötigt werden (Verfügbarkeit relevanter Mengen an hochqualitativen Genfragmenten für die Forschung), eine deutliche Kostensenkung bei drastischer Qualitätssteigerung gegenüber den herkömmlichen, offenen Systemen ermöglicht.Due to the one-way direction of the trailing buffer, the waste molecules transported into the buffer during the purification electrophoresis (E. coli residues, peptide residues from proteinase degradation, DNA and restriction enzyme degradation products, storage buffer fractions, residues from the precursors, residual soaps, etc.) are not fed into a cooling circuit, but instead are quickly removed from the bag. By this measure, the burden of the cleaning buffer with electrophoretic reaction products and with purified biostats and cleaning residues over a conventional, pulse-wave electrophoretic isolation is greatly reduced. Thus, electrochemical reactions of circulating waste at the electrodes are minimized. Furthermore, after the end point of the electrophoresis in which a complete purification of the gel has taken place, but there are still waste molecules in the buffer, a complete buffer change can be made and a second electrophoresis can be carried out, thereby effectively removing residual waste molecules ( 6 . 7 ). Cool storage of the process bag and cooled feed buffer eliminates the need for additional cooling with a pump circuit at a suitable applied voltage between 1.5-9 V / cm, eliminating the need for another significant source of contamination in conventional laboratory processes. Thus, no need to reuse multiple electrophoresis on, additional meter-long hoses, cooling lines and cooling units with fluid circulation and on pumps can be dispensed with, buffer chambers / dead spaces at hose joints are avoided, a costly sterilization of separate electrophoresis chambers, with sometimes difficult to access niches and dead space is complete avoided. Thus, the here invented cleanroom process bag with integrated electrophoresis and elution and the switchable Eluatkammer a fundamentally new, leaps and bounds better method for the entire process of biomolecule isolation, in particular the isolation of grade 1 DNA molecules for medical and veterinary use. In addition, a technical simplification Even in cases where clean room conditions are not absolutely necessary (availability of relevant quantities of high quality gene fragments for research), it enables a significant reduction in costs and a drastic increase in quality compared to conventional, open systems.

Während der pulsfeldelelektrophoretischen Reinigung im Beutel werden, anders als bei bekannten Pulsfeldelektrophoresen, die der Längenbestimmung langer DNA Fragmente dienen, keine analytischen Eigenschaften benötigt. Die angestrebten Laufweiten sind geringer (z. B. < 1 cm) als in herkömmlichen Pulsfeldgelanlagen, die zudem auch für eine gute Trennschärfe und Auflösung für 10 cm Laufweiten und mehr konzipiert wurden und z. B. durch computergesteuerte Regulierung der Spannung vieler (>> 4) Elektroden eine Laufausrichtung der Trennbahnen und ein gleichförmiges Analysebild gewährleisten (vgl die vorherrschende CHEF Technik, etwa im BioRad CHEF DR II, III etc.). Diese in einer analytischen Gelelektrophorese benötigten Eigenschaften werden in der Reinigungselektrophorese nicht benötigt. Hier kommt lediglich das Prinzip zum Einsatz, dass zirkuläre Moleküle mit einer Länge > 20 kb nicht in der Pulsfeldgelelektrophorese laufen, wenn sie ohne Einzel- und Doppelstrangbrüche mit plektonemischen Supercoils vorliegen. Geschädigte Moleküle oder linearisierte E. coli Genomfragmente verlassen hingegen die Gelmatrix und treten direkt in den Elektrophoresepuffer über. Dafür ist kein analytisches Gelbild notwendig, sondern lediglich eine Registrierung der Spannung, Stromstärke und Zeit des Stromflusses, um eine vollständige Reinigung zu gewährleisten. Es wurde herausgefunden, dass die Rückhaltung der intakten Moleküle gleichermassen bei verschiedenen Spannungswerten von 1,5–9 V im eingesetzten Reinigungspuffer stattfindet, sodass bei einer Ausführung der Erfindung der elektrophoretischen Reinigung im Prozessbeutel eine einfache, die Kühlung kontrollierende Temperaturregulierung über die Spannungszufuhr/Stromstärke zum Einsatz kommt. Damit kann einer übermässigen Wärmeentwicklung/Kühlung (z. B. gewünscht zwischen 8–20°C) entgegengewirkt werden, wobei in einer Ausführung die optimale Reinigungsbedingung (um 12°C) nur über die Widerstandsmessung und gekoppelte Spannungsregulierung ohne weitere Temperaturfühler erfolgt, indem bei im Verlauf auftretender zu hoher Widerstandserhöhung gegenüber dem Anfangswert eine Strompause oder Spannungsreduzierung geschaltet wird. Die umschaltenden Stromfelder mit einer Anordnung der kreuzversetzten Pole der parallel angeordneten Elektroden über und unter der Reinigungsmatrix lieben in einem Schaltwinkel zwischen 0 und 180° vor, bevorzugt 90–120°, und werden durch Einstecken von vier Elektroden (Minimum 3) in den Prozessbeutel sichergestellt.While the pulse field electrophoretic cleaning in the bag will be different as in known pulsed field electrophoresis, the length determination serve long DNA fragments, no analytical properties needed. The desired travel widths are lower (eg <1 cm) than in conventional ones Pulsfeldgelanlagen, which also also for a good selectivity and resolution designed for 10 inches of travel and more were and z. B. by computerized regulation of the voltage many (>> 4) electrodes one Running orientation of the separator sheets and a uniform Assure analytical image (see the prevailing CHEF Technology, for example in the BioRad CHEF DR II, III etc.). This in an analytical Gel electrophoresis properties needed in the Cleaning electrophoresis not needed. Here comes only the principle used that circular molecules with a length> 20 kb do not run in pulse field gel electrophoresis, if they are without Single and double strand breaks with plectonemic Supercoils available. Damaged molecules or linearized E. coli genomic fragments, on the other hand, leave the gel matrix and enter directly into the electrophoresis buffer. Therefore No analytical gel picture is needed, just one Registration of voltage, current and time of current flow, to ensure complete cleaning. It was found that the retention of the intact Molecules equally at different voltage levels of 1.5-9 V takes place in the cleaning buffer used, so that in one embodiment of the invention, the electrophoretic Cleaning in the process bag a simple, cooling-controlling Temperature regulation via the voltage supply / amperage is used. This can be an excessive Heat development / cooling (eg desired between 8-20 ° C), where in one version the optimal cleaning condition (around 12 ° C) only via the resistance measurement and coupled voltage regulation without further temperature sensor takes place by during occurring too high increase in resistance switched to the initial value of a power break or voltage reduction becomes. The switching power fields with an arrangement of the crossed Pole of parallel electrodes above and below of the cleaning matrix love in a switching angle between 0 and 180 ° before, preferably 90-120 °, and be by inserting four electrodes (minimum 3) into the process bag ensured.

Eine Ausführung der Elektrodeneinsteckkanäle sieht vor, dass für die Elektroelution weiter entfernt liegende, oder in einem weithalsig angeschlossenen weiteren Beutel (Elutionsbeutel) gelegene Elektroden der (netto) Pluspole zum Einsatz kommen, um das Eluat in eine dazwischen liegende Abfüllkammer (Transportschlauch, Eluatkammer) zu überführen. Diese ist auf einer Seite mit einer Elektroelutionsmembran/Dialysemembran verschlossenen, an der DNA Moleküle hängenbleiben. Auf der anderen Seite ist sie mit einem DNA durchlässigen Partikelfilter versehen, durch den die aus dem Gel eluierten DNA Moleküle durchtreten (vgl. die zum Stand der Technik bekannte Anordnung zweier Membranen bei Biometra/Schleicher-Schuell Elutionskammern im offenen System) und Trägermatrix/Agarosereste und gegebenenfalls materialabhängig anfallende Elektrodenpartikel aufgehalten werden. Zusätzliche Pufferbrücken werden ausserhalb des Bereichs in dem sich die eluierten Moleküle in Richtung Elutionsmembran/Verpackungsbehälter bewegen, dazugeschaltet, um elektroosmotische Effekte (pH, Pufferstandverschiebungen etc.) zu verhindern. Durch Abschweissen der Eluatkammer/des Transportschlauchs von dem Elutionsbeutel und dem Prozessbeutel hat der Reinraumprozessbeutel seinen Zweck erfüllt (7). Die herausgenommenen Elektroden werden gegebenenfalls gereinigt und wiederverwendet. Geeigneterweise werden die freien DNA Moleküle in der wässrigen Lösung, die den filtrierten Elutionspuffer ohne Zusätze darstellt, bei 0–4°C ohne Frieren gelagert, weil Grad 1 DNA > 20 kb beim Einfrieren in Grad 2 und Grad 3 Moleküle zerfällt. In anderen Ausführungen können der Eluatkammer/dem Transportröhrchen stabilisierende Zusätze zugefügt werden (zur Erhöhung der Viskosität, für die DNA Doppelhelixstabilisierung, z. B. 100 mM NaCl, oder mit komplexierenden Stoffen, oder mit Stoffen für die Vorbereitung einer Transfektionsmischung (vgl. Lipofectamin, Lipoplexe, Polyplexe etc) oder zur direkten Injektion in Organe, Zelloberflächen, Gefäße. Die Transportschläuche haben geeigneterweise eine lange, dünne Form, um eine hohe Konzentration des Eluats zu erhalten und um Scherkräfte bei Transporterschütterungen nicht in turbulante Strömungen umzuwandeln. Eine Ausführung des Transportschlauchs ist mit einem berührungsfreien Reiss/Öffnungsmechanismus zur sterilen Entnahme ausgestattet. In einer anderen Ausführung mit einem grosslumigen, seitlichen Schraubverschluss (8), oder mit verschiedenen Entnahmestellen, Sterilports, die an Kanülen/Infusionsbesteck angeschlossen werden, um einen Transfer in eine Transferlösung oder eine Injektion/Dosierung/Weitermischung zu ermöglichen. Ein Seitenport im Transportschlauch dient ebenfalls dem Potential/Pufferausgleich, indem eine nach oben offene Puffersäule nach oben gegen die Schwerkraft aufgebaut wird.An embodiment of the Elektrodeneinsteckkanäle provides that further ent for the electro-elution remote lying, or in a weithalsig connected further bag (elution bag) located electrodes of the (net) positive poles are used to transfer the eluate in an intermediate filling chamber (transport tube, eluate). This is sealed on one side with an electroelution membrane / dialysis membrane, stuck to the DNA molecules. On the other hand, it is provided with a DNA-permeable particle filter through which the DNA molecules eluted from the gel pass (see the prior art arrangement of two membranes in Biometra / Schleicher-Schuell open-system elution chambers) and carrier matrix / agarose residues and possibly depending on the material resulting electrode particles are stopped. Additional buffer bridges are added outside the range in which the eluted molecules move in the direction of the elution membrane / packaging container, in order to prevent electroosmotic effects (pH, buffer level shifts, etc.). By welding off the eluate chamber / transport tube from the elution bag and process bag, the clean room process bag has served its purpose ( 7 ). The removed electrodes are optionally cleaned and reused. Conveniently, the free DNA molecules in the aqueous solution, which is the filtered elution buffer without additives, are stored at 0-4 ° C without freezing, because Grade 1 DNA> 20 kb decays into Grade 2 and Grade 3 molecules upon freezing. In other embodiments, stabilizing additives can be added to the eluate chamber / transport tube (for increasing the viscosity, for DNA double helix stabilization, eg 100 mM NaCl, or with complexing substances, or with substances for the preparation of a transfection mixture (compare Lipofectamin, Lipoplexes, polyplexes, etc.) or for direct injection into organs, cell surfaces, vessels, etc. The transport tubes are suitably of a long, thin shape to maintain a high concentration of the eluate and not to transform shearing forces during transient vibrations into turbulent flows equipped with a non-contact tear / opening mechanism for sterile removal, in another version with a large-lumen lateral screw cap ( 8th ), or with various donor sites, sterile ports attached to cannulas / infusion sets to allow transfer to a transfer solution or injection / dosage / remix. A side port in the transport tube also serves the potential / buffer equalization by building up an upwardly open buffer column against gravity.

Die Transportschläuche sind geeigenterweise lichtgeschützte, lange, dünne Röhrchen, die ein Durchschweissen erlauben und durch ihre Form beim Transport und bei der Entnahme turbulenten Strömungen entgegenwirken, etwa wie ein auf beiden Seiten verschweisster Strohhalm (8). Durch den beidseitigen Schweissverschluss des Röhrchens, in dem sich das Eluat befindet, wird die kontaminationsfreie Verpackung gewährleistet. Vor dem Abschweissen des Behälters wird durch Umpolen der Stromrichtung das Eluat von der ausserhalb der Schweissnaht liegenden Dialysemembran gelöst und einige cm zurück in das Röhrchen bewegt (Zeitpuls), woraufhin der Schweissvorgang erfolgt. Dabei wird auf einer Seite die Membran entfernt und auf der anderen Seite der restliche Prozessbeutel abgetrennt, so dass nur noch der Transportschlauch vorliegt.The transport hoses are suitably light-protected, long, thin tubes, which allow a through-blowing and counteract by their shape during transport and when taking turbulent flows, such as a welded on both sides of a straw ( 8th ). The double-sided seal of the tube in which the eluate is located ensures contamination-free packaging. Before the container is welded off, by reversing the flow direction, the eluate is released from the dialysis membrane lying outside the weld seam and moved a few cm back into the tube (time pulse), whereupon the welding operation takes place. In this case, the membrane is removed on one side and separated on the other side of the remaining process bag, so that only the transport hose is present.

Mit der vorliegenden Erfindung des Prozessbeutelverfahrens kann für Nachschub identischen, funktionell charakterisierten DNA Materials höchster Qualität und für eine reibungslose Versorgung mit einem genomischen DNA Arzneimittel gesorgt werden. Damit stellt das Verfahren den notwendigen technologischen Entwicklungssprung für die klinische und tierklinische Entwicklung einer Gentherapie bis hin zur Deckung des Gesamtbedarfs eines Gentherapiekonstrukts dar.With The present invention of the process bag method can be used for Replenishment of identical, functionally characterized DNA material highest quality and for a smooth Care with a genomic DNA drug can be taken care of. In order to the process provides the necessary technological development leap for the clinical and animal clinical development of gene therapy to cover the total needs of a gene therapy construct represents.

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Beschreibung der FigurenDescription of the figures

1 Schema Siebrahmen für ein LMP-Agarosegel (bei Ausführung mit Siebrahmen). 1 Scheme Screen frame for a LMP agarose gel (with screen frame design).

• A Siebrahmen mit Boden und Deckel aus fomstabilem Kunststoff und adichtender Bodenfolie (z. B. mit Stärke oder wasserlöslichem Kleber aufgebrachte Folie aus wasserlöslichem Polymer, z. B. Polyvinylalkohol). Gegen Verrutschen und Undichtigkeit ist die Folie eingepasst und mit dem Siebboden verbunden.A sieve frame with bottom and lid made of fomstabilem Plastic and adhesive floor foil (eg with starch or water-soluble adhesive applied film of water-soluble Polymer, e.g. B. polyvinyl alcohol). Against slipping and leaking the film is fitted and connected to the sieve bottom.
• B Der Siebrahmen wird mit geschmolzener Gelmatrix befüllt. Bis zum Erstarren des Gels und Aushärten dichtet die Folie den Boden gegen auslaufen ab. Anschliessend wird die Folie entfernt, bevorzugt in dem sie sich im Laufe des nächsten Tages bei 37°C im wässrigen, tensidhaltigen Inkubationspuffer auflöst, oder sie wird innerhalb eines Tages für Inkubationspuffer durchlässig und löst sich darin innerhalb mehrerer Tage bei z. B. 55°C vollständig auf.B The screen frame is filled with molten gel matrix. Until the gel solidifies and hardens, the film seals the ground against leaching off. Subsequently, the film is removed, preferably during the next day at 37 ° C dissolves in aqueous, surfactant-containing incubation buffer, or it will be incubated within one day for incubation permeable and dissolves within it within several Days at z. B. 55 ° C completely.
• C Durch Zuklappen des Siebdeckels und Einrasten befindet sich das Agarosegel geschützt innerhalb des flachen Siebrahmens. Durch die zahlreichen Siebporen können Reinigungssubstanzen eindringen, frei in das Gel diffundieren und abtropfen. Ebenso kann ein Elektrophoresepuffer eindringen und Luft/Gasblasen entweichen, so dass ein elektrisches Feld ungehindert im Gel wirken kann. Durch Sollbruchlinien, die an unterteilenden Stegen entlang im Rahmen verlaufen, können kleine Teile des Gels durch Knicken abgebrochen werden. Die geschützten Gelstücke können vom Genlager wegbewegt werden. Das große Agarosegel des Genlagers befindet sich weiterhin geschützt in dem verbeleibenden Siebrahmen. Das Material des Siebrahmens hat bevorzugt ein größeres spezifisches Gewicht als Wasser, damit das Gel in wässrigen Puffern untertaucht.C By closing the strainer lid and snapping into place the agarose gel protected within the flat screen frame. Due to the numerous sieve pores cleaning substances can penetrate, diffuse freely into the gel and drain. Likewise, an electrophoresis buffer penetrate and air / gas bubbles escape, leaving an electric Field can act unhindered in the gel. By breaking lines, the along subdividing ridges along in the frame, can small Parts of the gel are broken off by kinking. The protected Gel pieces can be moved away from the gene storage. The large agarose gel of Genlagers is still located protected in the remaining screen frame. The material the screen frame preferably has a larger specific Weight as water to allow the gel in aqueous buffers submerges.

2 Schema Befüllen des Siebrahmens bei entsprechender Ausführung. 2 Scheme Filling the sieve frame with appropriate design.

• A Bei der Ausführung mit dem im Prozessbeutel bereits steril verpackten, noch nicht zugeriegelten Siebrahmen dient ein weitlumiger Port der direkten Einbringung des geschmolzenen Agarosegels.A In the version with the already in the process bag sterile packed, not yet locked sieve frame serves a wide-lumen port of direct introduction of the molten agarose gel.

Dabei wird das geschmolzene Gel entweder von Hand pipettiert, oder von einem Bakterien-Agarose-Misch- und Dosiergerät mit einem geeigneten Einfüllstutzen abgefüllt.

• B Bei der Ausführung mit externer Giessform wird diese nach dem Befüllen und Aushärten durch eine unverschlossene Seite des Prozessbeutels eingebracht. Die Beutelseite wird anschliessend durch eine Thermoschweissnaht verschlossen.

• B In the case of the version with external casting mold, this is introduced after filling and hardening through an unclosed side of the process bag. The bag side is then closed by a thermal welding seam.

3 Schema Reinigungsverfahren durch Inkubation mit Pufferkaskaden 3 Scheme purification procedure by incubation with buffer cascades

Das im Beutel eingeschlossene Gel wird einer vielschrittigen Behandlung mit Reinigungspuffern etc ausgesetzt. Dabei kommen pro Inkubationsschritt ausreichende Puffermengen zum Einsatz, die das Gel gerade bedecken (Teilfüllung, gegebenenfalls durch Schaffen einer Beutelmulde durch eine äussere Form, so dass das Gel am tiefsten Punkt zu liegen kommt und nicht der ganze Geutel gefüllt werden muss, nicht gezeigt). Über einen steril verschliessbaren Ablauf (durch nach unten hängenden Schlauch mittels Schwerkraft und zweitem Rücklaufventil) wird der verbrauchte Puffer entfernt, der die bei der Reinigung durch Diffusion anfallenden Substanzen enthält. Durch sukzessives Öffnen von Peelnähten läuft jeweils ein nächstes, frisches Puffervolumen für die nächste Reinigungsstufe nach. Ein Y Port ermöglicht gegebenenfalls die sterile Zuführung weiterer Komponenten (Enzyme, Wirkstoffe).The Bagged gel becomes a multi-step treatment exposed with cleaning buffers etc. There are sufficient per incubation step Buffer quantities are used, which just cover the gel (partial filling, optionally by creating a bag tray through an outer Shape, so that the gel comes to rest at the lowest point and not the whole bag has to be filled, not shown). about a sterile sealable drain (by hanging down Hose by gravity and second return valve) the spent buffer is removed, which during cleaning Contains by diffusion occurring substances. By successive opening of Peelnähten runs one next, fresh buffer volume for the next cleaning stage to. A Y port may be sterile Supply of additional components (enzymes, active ingredients).

4 Schema Durchschweissverfahren zum Setzen von Peelnähten in einem befüllten Zuführungsbeutel 4 Scheme Welding method for setting peeled seams in a filled feed bag

Ein mit wässrigem Puffer gefüllter, autoklavierter, schlauchartiger Beutel aus Peelnahtgeeignetem Folienmaterial wird in eine vielkammrige Pufferkaskade unterteilt.

• A Der Schlauchbeutel (z. B aus peelnahtfähiger Polyolefinfolie) wird über einen Port am Ende des Schlauchs mässig befüllt und autoklaviert.
• B Der Schlauch wird über einen oder mehrere Stege mit dem Schweisswerkzeug und der Gegenseite so gelagert, dass der Puffer rechts und links in die unteren Aussackungen abläuft und sich beide Folienlagen berühren. Restpuffer im Bereich der Schweissnähte wird durch Vorwärmen weitestgehend getrocknet, worauf die Peelnaht durch den befüllten Beutel hindurch geschweisst wird.
• C Das Ergebnis ist ein steriler Mehrkammerbeutel, der einfach und kostengünstig über einen einzigen Port befüllt wurde. Im Einsatz wird die jeweilige Reinigungsstufe, die sich im Prozessbeutel befindet, durch die Anzahl der entleerten und noch gefüllten Kammern einfach dokumentiert und kann jederzeit ohne weitere Dokumentation überprüft werden.

• A The tube bag (eg made of peelable polyolefin film) is filled moderately via a port at the end of the tube and autoclaved.
• B The hose is mounted via one or more webs with the welding tool and the opposite side so that the buffer runs off to the right and left into the lower pockets and contacts both film layers. Residual buffer in the area of the weld seams is largely dried by preheating, whereupon the peel seam is welded through the filled bag.
• C The result is a sterile multi-chamber bag that has been easily and inexpensively charged through a single port. In use, the respective cleaning stage, which is located in the process bag, is simply documented by the number of emptied and still filled chambers and can be checked at any time without further documentation.

5 Schema Pufferkaskaden, diverse Beispiele für Zuführungsbeutel 5 Scheme buffer cascades, various examples of feed bags

Gezeigt sind drei Beispiele für Zuführungsbeutel mit Pufferkaskaden für verschiedene Anwendungsstufen. Mit der linken Beutelkaskade werden primäre Genlager aus uncharakterisierten Bakterienklonen bestimmter E. coli Klone (Einzelkolonien eines bestimmten Masterklons für eine Anwendung, oder Klonnummern aus Banken) angelegt und bis zur Lagerstufe vorgereiningt. In der Ausführung wird die gesamte Prozedur durch Öffnen der Peelnähte der einzelnen Stufen automatisch dokumentiert. Enzymgaben und Puffer können nicht vertauscht werden und befinden sich im geschlossenen System. Der Beutel, der bevorzugt an einem Ständer eines fahrbaren Rollwagens über dem Prozessbeutel hängt, ist zusätzlich mit der entsprechenden Inkubationstemperatur für das Einbringen in den entsprechenden Ofen/Raum bedruckt. Die angegebenen Verdünnungsfaktoren (jeweils oben rechts) stellen nur einen Richtwert für frei diffundierende Substanzen in einem entsprechenden Gelvolumen dar. Die tatsächlichen Verdünnungsstufen unterscheiden sich in Abhängigkeit der zersetzenden Wirkung der Reinigungslösungen und dem Migrationsverhalten und können stark differieren. Die letzte Pufferkaskade wird nur für die Langzeitlagerung benötigt und kommt im Beispiel nach 180 Tagen zum Einsatz. Bereits nach 8–14 Tagen können erste Proben entnommen werden, um die strukturelle Zusammensetzung zu erfassen. Lager, die der erwarteten Molekülform nicht entsprechen werden entsorgt. Im Laufe der Lagerung können weitere funktionelle labortests durchgeführt werden, um ein Genlager weiterzucharakterisieren. Werden funktionelle Moleküle festgestellt, kommt die mittlere Pufferkaskade zum Einsatz. Je nach Anforderungen werden mitunter 2–10 mal weniger mittlere Kaskaden benötigt, als primäre Kaskaden. Im Fall einer Genbank ist bis zur Identifizierung weniger wertvoller Klone aus tausenden unbekannten Klonen eine geringere Fortsetzungsrate zu erwarten. Allerdings stellt das Genlager eine nahezu unverwüstliche, unmittelbar anzapfbare Form von Molekülen dar, die nach einer Charakterisierung in identischer Funktionalität sofort verfügbar werden.Shown are three examples of feed bags with buffer cascades for different application levels. With the left bag cascade become primary gene stores from uncharacterized bacterial clones certain E. coli clones (single colonies of a particular master clone for an application, or clone numbers from banks) and pre-confined to the storage level. In the execution The entire procedure is done by opening the peel seams the individual levels automatically documented. Enzyme and buffer can not be reversed and are closed System. The bag, which prefers to a stand of a mobile trolley hangs above the process bag, is in addition to the corresponding incubation temperature printed for insertion in the appropriate oven / room. The specified dilution factors (top right) provide only a guideline for freely diffusing substances in a corresponding volume of gel. The actual dilution levels differ depending on the decomposing effect the cleaning solutions and the migration behavior and can differ greatly. The last buffer cascade becomes only needed for long-term storage and comes in the example after 180 days to use. Already after 8-14 Days can be taken first to the structural samples Capture composition. Stock, that of the expected molecular shape will not be disposed of. In the course of storage can Further functional laboratory tests are carried out to to further characterize a genetic stock. Become functional molecules found, the middle buffer cascade is used. Depending on Requirements sometimes become 2-10 times less average cascades needed, as primary cascades. In the case of one Genbank is looking to identify less valuable clones Thousands of unknown clones have a slower rate of continuation expect. However, gene storage is an almost indestructible, directly tappable form of molecules that after a characterization in identical functionality immediately become available.

Mit der mittleren Kaskade wird eine spätere Enzymbehandlung durch Vorwaschen mit einem neutralen wässrigen Puffer erreicht. Dabei sinkt im Beispiel die Konzentration an EDTA auf 1–2 mM, so dass Enzymreaktionen in spezifischen Puffern durchgeführt werden können. Nach der Enzymbehandlung wird durch erneuten Proteinabbau das entsprechende Enzym beseitigt und anschliessend einer zweiten, im Beispiel vierstufig dargestellten Reinigung unterzogen. Die Verdünnungsreihen haben inzwischen die ursprünglich frei diffundierbaren Substanzen in der Biomatrix auf ppm Konzentrationen reduziert.With the middle cascade becomes a later enzyme treatment achieved by prewashing with a neutral aqueous buffer. In the example, the concentration of EDTA drops to 1-2 mM, allowing enzyme reactions to be carried out in specific buffers can be. After the enzyme treatment is replaced by Protein degradation eliminates the corresponding enzyme and then a second, in the example four-stage purification shown. The dilution series have meanwhile the original freely diffusible substances in the biomatrix to ppm concentrations reduced.

Im rechten Beispielbeutel wird eine elektrophoretische Reinigung vorbereitet, wobei ein neutraler Elektrophoresepuffer den Lagerpuffer ersetzt, was eine weitgehende Verdünnung der EDTA (angegebene Werte), Salz-, und Tensidkonzentrationen bewirkt, so dass im Anschluss durch Einstecken der Elektroden und Anschluss eines Einkammerbeutels mit z. B. 2 l Elektrophoresepuffer eine Pulsfeldreinigungselektrophorese durchgeführt werden kann. (die Volumenangaben und Verdünnungswerte stellen nur Beispielgrößen dar)in the right sample bag is prepared an electrophoretic cleaning, wherein a neutral electrophoresis buffer replaces the storage buffer, which is a substantial dilution of the EDTA (indicated values), Salt, and surfactant concentrations causes, so that by Insert the electrodes and connect a single chamber bag with z. B. 2 l electrophoresis buffer pulse field purification electrophoresis can be carried out. (the volume and dilution values represent only example sizes)

6 Schema Pulsfeldreinigungselektrophorese im Prozessbeutel und Abschweissen einer Probe 6 Scheme Pulsfeldreinigungselektrophorese in the process bag and welding a sample

Über einen Einkammer-Zulaufbeutel mit Elektrophoresepuffer mit höhenverstellbarem Tropf/Port läuft kontinuierlich Puffer in den gefüllten Prozessbeutel nach. Der gekühlte Puffer läuft in die untere Beutelebene ein und verdrängt den vorhandenen Puffer nach oben. Das in der Mitte des Beutels platzierte Gel wird einem gepulsten elektrischen Feld ausgesetzt. Dafür werden über vier Ports Stabelektroden parallel zur Gelfläche in den Prozessbeutel eingesteckt und mittels Elektrodenadaptoren dicht an den Beutel angeschlossen und verkabelt. In der gezeigten Ausführung wird das bei der Elektrolyse entstehende Gas über einen oben liegenden Port zusammen mit dem unter Druck nach oben ablaufenden Puffer abgeleitet. Die im Puffer anfallenden Reinigungsprodukte, die unter Stromeinfluss die Gelmatrix verlassen, reichern sich im Puffer nach oben hin an und werden abgeschieden. Bei übermässiger Erwärmung wird die Spannung reduziert oder unterbrochen, so dass kein Kühlkreislauf benötigt wird. Durch geeignete Elektrodenmaterialien und Vermeidung der Umwälzung in einem Kühlkreislauf wird ein sofortiges Abscheiden der anfallenden Substanzen erreicht, wodurch unerwünschte Elektrolyseprodukte vermieden werden und ein hoher Reinigungsgrad realisiert wird. Der Fülldruck des Beutels und Kühlmengeneinlauf wird über höhenverstellbare Zulauf- und Ablaufniveaus reguliert, so dass in dieser Ausführung keine Pumpen zum Einsatz kommen.about a single-chamber infusion bag with electrophoresis buffer with height-adjustable drip / port Buffer runs continuously into the filled process bag to. The cooled buffer runs into the lower one Bag level and displaces the existing buffer above. The gel placed in the middle of the bag becomes pulsed exposed to electric field. For that will be over four ports of stick electrodes parallel to the gel surface in the Process bag inserted and sealed by means of electrode adapters connected to the bag and wired. In the illustrated embodiment is the resulting gas during electrolysis via a overhead port together with the pressure going upwards Buffer derived. The cleaning products in the buffer, which leave the gel matrix under the influence of current, accumulate in the Buffer upwards and are deposited. In case of excessive Warming, the voltage is reduced or interrupted, so no cooling circuit is needed. By suitable Electrode materials and avoiding the circulation in one Cooling cycle is an immediate separation of accumulating Achieved substances, thereby avoiding unwanted electrolysis products and a high degree of purification is realized. The filling pressure of the bag and cooling inlet is about height adjustable Regulated inlet and outlet levels, so that in this embodiment no pumps are used.

Ein weiterer Vorteil des Prozessbeutels aus einem thermoschweissbaren Folienmaterial ist die einfache Abtrennung einer Probe (links oben am Prozessbeutel dargestellt). Dabei wird im Zustand mit entleertem Puffer ein im Beutel durch die Wand hindurch abgetrenntes Gelstückchen in eine Ecke oder Blindkammer des Beutels bewegt. Auf der innen gelegenen Seite der Probe wird anschliessend mit einem Thermoschweissgerät eine kleine Beutelecke/tasche durch Setzen von bevorzugt zwei Schweissnähten und Trennschneiden abgetrennt. Der Prozessbeutel ist nach wie vor steril verschlossen. Der Beutelabschnitt mit der Probe ist ebenfalls steril verschlossen und kann bequem gelagert, verschickt, oder funktionellen Analysen zugeführt werden.A further advantage of the process bag made of a heat-sealable film material is the simple separation of a sample (shown at the top left of the process bag). In the state with deflated buffer, a piece of gel separated in the bag through the wall is moved into a corner or blind chamber of the bag. On the inside side of the sample, a small bag corner / bag is then separated by setting preferably two welding seams and separating cutters with a thermo-welding device. The process bag is still sterile closed. The bag section with the sample is also sterile sealed and can be conveniently stored, shipped, or fed to functional analyzes who the.

Durch eine entsprechende Beutelbedruckung mit Barcodes und laufenden Nummern der vorgesehenen Plätze des Prozessbeutels für die Probenentnahme und das verbleibende Genlager kann das Risiko eine Verwechslung der Proben und Genlager wirksam gesenkt werden.By a corresponding bag printing with barcodes and serial numbers the designated places of the process bag for Sampling and remaining gene storage can increase the risk a confusion of samples and gene storage can be effectively reduced.

7 Schema Betrieb des Prozessbeutels mit einem Elektroelutionsbeutel, Überführung in einen Transportschlauch 7 Scheme Operation of the process bag with an electro-release bag, transfer into a transport hose

Der Prozessbeutel wird an einen Elutionsbeutel angeschlossen, indem ein Port mit einem Partikelfilter und einer dahinter liegenden Eluatkammer und die Eluatkammer wiederum über eine zwischengesteckte Dialysemembran mit einem Port des Elutionsbeutels verbunden wird. Der Elutionsbeutel stellt damit eine kleine Version eines Prozessbeutels dar, der dazu dient, den puffertragenden Bereich des Prozessbeutels auszudehnen. Dafür wird zusätzlich zur Verbindung über die Eluatkammer mindestens eine großlumige Pufferbrücke angeschlossen. Für den Ausgleich des elektroosmotischen Pufferpotentials dient zusätzlich ein im Eluatschlauch befindlicher Seitenport (der später als Entnahmestelle dienen kann), an dem während der Elution (volle Leistung) ein Schlauch nach oben angeschlossen wird, der ein höheres Pufferniveau der Eluatkammer ermöglichen kann. Vor dem Umpolen dient eine Phase schwacher Leistung dem Rücklauf des Ausgleichspuffers, ohne dabei Eluat an der Dialysemembran zu verlieren. Das Eluat wird durch Umpolen zurück in den freien Eluatschlauch befördert. Anschliessend wird der Schlauch an beiden Enden mittels der thermoplastischen Durchschweisstechnik geschlossen und abgetrennt. In der dargestellten Ausführung dient der steril verschlossene Seitenport der späteren Entnahme des Eluats. (vgl Detail Transportschlauch/Eluatkammer in 8). Andere Ausführungen leiten das Eluat elektrisch über den Seitenportder Eluatkammer in weitere Reaktionsbehälter weiter.The process bag is connected to an elution bag by connecting a port with a particle filter and an eluate chamber behind it and the eluate chamber in turn via an interposed dialysis membrane with a port of the elution bag. The elution bag thus represents a small version of a process bag, which serves to expand the buffer-carrying area of the process bag. For this purpose, in addition to the connection via the eluate chamber, at least one large-lumen buffer bridge is connected. To compensate for the electro-osmotic buffer potential, there is additionally a side port located in the eluate tube (which can later serve as a sampling point), at which a tube is connected up during the elution (full power), which can allow a higher buffer level of the eluate chamber. Before the polarity reversal, a phase of low power is used for the return of the equalizing buffer, without losing eluate on the dialysis membrane. The eluate is transported by reverse polarity back into the free Eluatschlauch. Subsequently, the tube is closed and separated at both ends by means of the thermoplastic welding technique. In the illustrated embodiment, the sterile sealed side port serves for later removal of the eluate. (see detail transport hose / eluate chamber in 8th ). Other embodiments pass the eluate electrically via the side port of the eluate chamber into further reaction vessels.

8 Schema Transportschlauch und Eluatkammer mit Membranen 8th Scheme transport hose and eluate chamber with membranes

Verschraubbare Adaptorenhälften mit formstabilen Dichtungsringen (schwarz) klemmen die DNA durchlässige Filtermembran (weisses Kästchen) und die DNA rückhaltende Dialysemembran (unterbrochene Kästchen) fest und verbinden die Beutelports mit der Eluatkammer.screwable Adapter halves with dimensionally stable sealing rings (black) clamp the DNA permeable filter membrane (white box) and the DNA retaining dialysis membrane (interrupted Box) and connect the bag ports to the eluate chamber.

9 Schema Stabelektroden, Elektrodenadapter, Elektrodenstecker 9 Scheme stick electrodes, electrode adapters, electrode plugs

Glaskohlenstoffelektroden mit dünnem Durchmesser und glatter Oberfläche werden fest mit einem Adapterdeckel verbunden, und durch Adapterports, die mit einer Pufferdichtung ausgestattet sind, eingeschoben. Durch weiteres Einschrauben kann bei längerem Betrieb einem Undichtwerden durch Dünnerwerden der Elektroden im Bereich der Dichtung entgegengewirkt werden. Ausserhalb des Adapterdeckels wird direkt auf die herausragende Elektrode eine Kabelsteckverbindung aufgesetzt, die mit einer Isolierhülle mit Abdichtung nach aussen ausgestattet ist und den Port, Adapter und die Elektrode vor eindringender Flüssigkeit von aussen abschirmt. A Dicht eingesteckte Elektroden verhindern ein Auslaufen des Elektrophoresepuffers. Das Elektrodenmaterial der Stabelektroden ragt aus dem Port/Adapter heraus. B Auf die trockene Seite der Elektrode wird ein Stecker mit Kontaktfedern aufgesetzt, der zusätzlich die Elektrode vor von aussen eindringender Nässe schützt.Glassy carbon electrodes with a thin diameter and a smooth surface are firmly connected to an adapter cover, and through adapter ports, which are equipped with a buffer seal inserted. By further screwing in may leak during prolonged operation by thinning the electrodes in the region of the seal be counteracted. Outside the adapter cover is directly put on the protruding electrode a cable connector, equipped with an insulating sleeve with external sealing is and the port, adapter and the electrode from penetrating liquid shields from the outside. A Prevent tightly inserted electrodes leakage of the electrophoresis buffer. The electrode material the stick electrode projects out of the port / adapter. B On the dry Side of the electrode, a plug with contact springs is placed, which additionally penetrates the electrode from the outside Moisture protects.

10 Schema Reinraumprozessbeutel mit Hauptkomponenten (ohne Geräte) 10 Scheme cleanroom process bag with main components (without devices)

Darstellung einer Ausführung eines Reinraumprozessbeutels mit einer (möglichst kleinen) Zahl von 6 Ports Z1-6 (plus einem Port Z7 der Eluatkammer), Z1-3 am Prozessbeutel und Z4-6 am Eluatbeutel, und einer kleinen Zahl von 4 Elektrodeneinsteckkanälen und gemeinsamem Gas/Pufferablass während dem Elektroelutionsbetrieb (im Schaltkreis rechts mit Belegung der Zugänge).presentation an execution of a clean room process bag with a (smallest possible) number of 6 ports Z1-6 (plus one port Z7 of the eluate chamber), Z1-3 on the process bag and Z4-6 on the eluate bag, and a small number of 4 electrode insertion channels and common gas / buffer drain during electroelution operation (in the circuit on the right with access assignments).

Während anderer Reinigungsstufen sind Elutionsbeutel und Eluatkammer abgeklemmt und die Ports werden anders belegt (siehe Beschriftung der Komponenten links und oben). Durch gedrehte Beutellagerung während der Elektrophorese wird bei dieser Prozessbeutelausführung Z1 zum Einlauf unten und Z2 zum Gas/Pufferablauf oben (nicht dargestellt). Über Z3 werden Reinigungspuffer und Kaskaden angeschlossen. Der Siebrahmen im Prozessbeutel wird über Port Z1 befüllt.While In other purification stages, the elution bag and eluate chamber are disconnected and the ports are assigned differently (see caption of the components left and above). By twisted bag storage during the electrophoresis becomes in this process bag execution Z1 to the inlet below and Z2 to the gas / buffer outlet above (not shown). about Z3 cleaning buffers and cascades are connected. The sieve frame in the process bag is filled via port Z1.

11 Foto Trockenmodell Prozessbeutel 11 Photo dry model process bag

Zweilagige Ausführung aus einer gefalteten, 1 m breiten Schlauchfolie. Der Prozessbeutel besitzt 6 Probenentnahmestellen (drei Blindsäcke in jeder Ebene, links), 8 Zuführungsports (Z1 grosslumig hinten, Z2 grosslumig vorne, Z3-5, kleinlumig rechts obere Ebene, Z6-8 kleinlumig rechts untere Ebene) und 4 Elektrodeneinsteckkanälen (E1-4) mit eingesteckten Graphitstabelektroden (einfache Ausführung mit offener Elektrodensteckung ohne Dichtungsadapter mit einer Gas- und Pufferableitung über die nach oben gelenkten Elektrodenkanäle, die aus Beutelmaterial gefertigt werden). A flache Darstellung, B gestützter räumlicher Aufbau mit Elektrodenkanälen nach oben.two-ply Execution from a folded, 1 m wide tubular film. The process bag has 6 sampling points (three blind bags in each plane, left), 8 feed ports (Z1 large-lobed behind, Z2 large-lobed front, Z3-5, small-lobed right upper level, Z6-8 small lumen right lower level) and 4 electrode insertion channels (E1-4) with inserted graphite stick electrodes (simple design with open electrode connection without sealing adapter with a gas and buffer discharge via the upwardly directed electrode channels, which are made of bag material). A flat illustration, B supported spatial structure with electrode channels after above.

12 Schema Herstellung langer intakter DNA in einer Agarosematrix 12 Scheme Preparation of long intact DNA in an agarose matrix

Reinigungsprinzip für lange DNA Moleküle mit Grad 1 DNA Qualität und für dauerhafte Genlager, aus denen verschiedenste Genanwendungen viel besser durchgeführt werden können. Gegenstand der Erfindung ist das Beutelverfahren, wodurch der komplexe Laborablauf im geschlossenen System durchgeführt werden kann. Dadurch können nun sprunghaft mehr und sogleich unerreicht saubere, funktionell charakterisierte Moleküle (GMP) kostengünstig bereitgestellt werden. Die neue Technologie kann funktionelle Genbanken mit künstlichen Chromosomen generieren und den Gesamtbedarf an genomischen DNA Arzneimitteln decken.cleaning principle for long DNA molecules with grade 1 DNA quality and for permanent gene storage, from which a variety of gene applications a lot can be done better. object the invention is the bag method, whereby the complex laboratory process can be performed in a closed system. Thereby can now jump more and immediately unmatched clean, functional characterized molecules (GMP) cost to be provided. The new technology can be functional gene banks Generate with artificial chromosomes and total needs to cover genomic DNA drugs.

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