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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden
einer Struktur in einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs
des unabhängigen
Patentanspruchs 1. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine
Vorrichtung zum räumlich
hochaufgelösten
Abbilden einer Struktur in einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs
des unabhängigen
Patentanspruchs 19.
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Mit
dem räumlich
hochaufgelösten
Abbilden einer Struktur in einer Probe ist hier insbesondere das
Abbilden der Struktur mit einer räumlichen Auflösung gemeint,
die besser als die Beugungsgrenze ist, wie sie für herkömmliche lichtmikroskopische
Verfahren gilt.
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STAND DER TECHNIK
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Aus
der
US 2004/0212799
A1 ist ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden
einer Struktur in einer Probe bekannt, bei dem eine Substanz zum
Markieren der Struktur in der Probe aus einer Gruppe von Substanzen
ausgewählt
wird, die mit einem ersten elektromagnetischen Signal aus einem ersten
Zustand, in dem sie erste spektrale Eigenschaften aufweist, bis
auf einen von dem ersten elektromagnetischen Signal gezielt ausgelassenen
Bereich in einen zweiten Zustand überführbar ist, in dem sie zweite
spektrale Eigenschaften aufweist. Für die beiden spektralen Eigenschaften
der Substanz werden verschiedene Möglichkeiten angegeben. Die auch
in den näher
beschriebenen Ausführungsbeispielen
der als
US 2004/0212799
A1 angeführte Möglichkeit
der unterschiedlichen spektralen Eigenschaften ist ein erster Zustand,
in dem die Substanz fluoreszent ist, und ein zweiter Zustand, in
dem sie nicht fluoreszent ist. Um die Struktur in der Probe abzubilden,
wird die Fluoreszenz der Substanz mit einem zweiten elektromagnetischen Signal
angeregt, und das von der Substanz emittierte Fluoreszenzlicht wird
detektiert. Dabei kann das Fluoreszenzlicht von der Substanz nur
aus dem mit dem ersten elektromagnetischen Signal gezielt ausgelassenen
Bereich der Probe stammen, in dem sich die Substanz weiterhin in
dem ersten Zustand befindet. Wenn dieser Bereich beispielsweise
die Nullstelle eines Interferenzmusters des ersten elektromagnetischen
Signals ist, kann er kleiner gemacht werden als die Beugungsgrenze,
die für
das Abbilden der Probe mit Licht der Wellenlänge des ersten oder des zweiten
elektromagnetischen Signals gilt. Unter den weiteren Möglichkeiten
für die
beiden unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der Substanz in
dem ersten und zweiten Zustand, die in der
US 2004/0212799 A1 angesprochen
werden, findet sich der Hinweis auf eine unterschiedliche Absorption
für ein
zweites optisches Signal in Form eines Teststrahls. Zu dieser dem
Oberbegriff des unabhängigen
Patentanspruchs 1 entsprechenden Variante des bekannten Verfahrens
und der damit implizit offenbarten Vorrichtung mit den Merkmalen
des Oberbegriffs des unabhängigen
Patentanspruchs 16 finden sich aber keine näheren Angaben.
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Zur
Umsetzung der aus der
US 2004/0212799
A1 bekannten Grundidee, mit einem elektromagnetischen Signal
eine räumliche
Verteilung eines Anteils der Substanz in einem fluoreszierenden
Zustand einzustellen, bei der die Bereiche, in denen die Substanz
in dem fluoreszierenden Zustand vorliegt, räumlich begrenzt sind, ist es
auch bekannt, ein elektromagnetisches Signal, das die Substanz von
einem nicht fluoreszierenden in einen fluoreszierenden Zustand überführt, in
derartiger Intensität
auf die Probe aufzubringen, dass sich danach nur einzelne Moleküle der Substanz
in dem fluoreszierenden Zustand befinden, die bei einer mikroskopischen
Abbildung des von ihnen ausgehenden Fluoreszenzlichts getrennt voneinander
abgebildet werden. Damit steht fest, dass die getrennt voneinander erfassten
Anteile des Fluoreszenzlichts von der Probe jeweils von einzelnen
Molekülen
stammen, deren Lage aus dem Schwerpunkt der Intensitätsverteilung des
Fluoreszenzlichts mit höherer
Ortsauflösung
als der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts bestimmt
werden kann. Diese Technik ist neben dem Namen SPARSE auch unter
dem Namen STORM oder PALM bekannt, während für die aus der
US 2004/0212799 A1 bekannte
Technik der Name RESOLFT verwendet wird.
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Als
grundsätzlicher
Nachteil von fluoreszenzmikroskopischen Verfahren ist das Bleichen
der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe bekannt. Dies bedeutet, dass
ein Fluoreszenzfarbstoff nur eine endliche Anzahl von Anregungs-
und Fluoreszenz-Emissionszyklen durchlaufen kann, meistens weniger
als 100.000, bevor er eine unerwünschte
chemische Umwandlung in einen dauerhaft nicht mehr fluoreszierenden
Zustand erleidet. Dieses Problem tritt auch bei den oben beschriebenen
RESOLFT- bzw. SPARSE-Techniken auf. Hier kommt hinzu, dass das erste elektromagnetische
Signal, mit dem die räumliche Verteilung
des Anteils der Substanz in dem fluoreszierenden Zustand eingestellt
wird, ebenfalls zu einer Belastung und damit ggf. zu einem früheren Bleichen der
Substanz führen
kann. Bei einigen Ausführungsformen
der SPARSE-Technik
ist es daher vorgesehen, die einzelnen Moleküle der Substanz nur einmal mit
dem ersten Signal in den fluoreszierenden Zustand zu bringen und
dann darin so lange zur Fluoreszenz anzuregen, bis das einzelne
Molekül
gebleicht ist.
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Zudem
ist neben der absoluten Ausbeute an Fluoreszenzlicht von einem Molekül eines
Fluoreszenzfarbstoffs auch die von diesem während eines bestimmten Zeitraums
erhältliche
Menge an Fluoreszenzlicht begrenzt. Ein Molekül eines Fluoreszenzfarbstoffs
kann immer nur dann mit Anregungslicht zu Fluoreszenz angeregt werden,
wenn es sich in seinem Grundzustand befindet. Bis zu einer nächstmöglichen
Anregung muss also gewartet werden, bis das Molekül in seinen
Grundzustand zurückgekehrt
ist. Ob es bei dieser Rückkehr
in seinen Grundzustand überhaupt
Fluoreszenzlicht aussendet, hängt
von dem Verhältnis
seiner Übergangswahrscheinlichkeiten
ab. Häufig
kommt es in weniger als 50% der Anregungen zur Aussendung von Fluoreszenzlicht.
Mit welcher Wahrscheinlichkeit ein Fluoreszenzphoton detektiert
wird, bestimmt der jeweiligen Messaufbau; dieser Wert ist meistens
sogar kleiner als 10%. Um auswertbare Mengen an Fluoreszenzlicht
zu detektieren, müssen
daher vielfach lange Messzeiten in Kauf genommen werden; sie betragen
in der Regel mehr als 10 μs
pro Bildpunkt oder Fluoreszenzmolekül. Diese Messzeiten akkumulieren
sich insbesondere im Fall von stark lokalisierten Anteilen des in dem
fluoreszierenden Zustand befindlichen Fluoreszenzfarbstoffs oder
gar einzelnen fluoreszierenden Molekülen bis ein vollständiges Abbild
der interessierenden Struktur in der Probe erstellt ist. Lange Messzeiten
sind nicht nur grundsätzlich
unökonomisch, sondern
werfen regelmäßig Probleme
mit einem Driften verschiedener Komponenten des verwendeten Messaufbaus
auf.
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Als
Alternative zur Markierung einer Struktur in einer Probe mit einer
fluoreszierenden Substanz ist es aus S. Berciaud et al.: "Photothermal heterodyne imaging
of individual metallic nanoparticles: Theory versus experiment" in PHYSICAL REVIEW
B 73, 045424 (2006) bekannt, die Struktur mit Goldnanopartikeln
zu markieren. Zur Sichtbarmachung der markierten Struktur wird ein
als photothermisches Heterodyn-Abbilden (Photothermal Heterodyne
Imaging = PHI) bezeichnetes Verfahren beschrieben, das auf einer
Temperaturerhöhung
der Probe um einen einzelnen Nanopartikel in Folge der Absorption
eines elektromagnetischen Signals durch einen in dem jeweiligen
Messbereich befindlichen Goldnanopartikel beruht. Das von dem Goldnanopartikel
absorbierte elektromagnetische Signal wird in Wärme umgewandelt. Hierdurch
wird eine lokale Temperaturerhöhung der
Probe am Ort des Nanopartikels hervorgerufen. Konkret bildet sich
ein von dem Nanopartikel weg zeigender Temperaturgradient aus. Dieser
Temperaturgradient wirkt sich auf die Phase eines durch die Probe
laufenden Teststrahls aus, der zusätzlich zu dem elektromagnetischen
Signal eingesetzt wird, das von den Goldnanopartikeln absorbiert
wird und damit deren Temperatur erhöht. Zur Erfassung der Phasenverschiebung
aufgrund einer lokalen Temperaturerhöhung, um die Größe und ggf.
auch die Lage der Temperaturerhöhung
zu bestimmen, wird bei der PHI-Technik ein frequenzmodulierter Laserstrahl zum
Erwärmen
der Goldpartikel eingesetzt, der zu einer frequenzmodulierten Phasenverschiebung
des Teststrahls führt,
die beim Vergleich mit dem nicht phasenverschobenen Teststrahl leicht
erfasst werden kann. Hiermit soll es möglich sein, Goldnanopartikel
bis hinab zu einer Größe von 1,4
nm (67 Atomen) zu detektieren.
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Andere
Verfahren zur Detektion lokaler Temperaturerhöhungen aufgrund absorbierender
Goldnanopartikel umfassen andere Formen der Fernfeldinterferenzmikroskopie,
bei denen verschiedene Anteile eines Teststrahls, von denen nur
einer durch den Bereich der Temperaturerhöhung hindurch getreten ist,
miteinander zur Interferenz gebracht werden (siehe D. Boyer
et al.: "Photothermal
Imaging of Nanometer-Sized Metal Particles Among Scatterers" in Science Vol.
297, S. 1160–1163
(16. August 2002).
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Auch
der als thermische Linse bekannte Effekt kann zur mikroskopischen
Detektion einer durch Absorption verursachten lokalen Temperaturerhöhung verwendet
werden, wobei hier das die Temperaturerhöhung aufgrund seiner Absorption
verursachende elektromagnetische Signal und der infolge des resultierenden
Temperaturgradienten phasenverschobene Teststrahl identisch sind
(s. E. Tamaki et al.: "Single-Cell
Analysis by a Scanning Thermal Lens Microscope with a Microchip:
Direct Monitoring of Cytochrome c Distribution during Apoptosis
Process" in Analytical
Chemistry, Vol. 74, No. 7, S. 1560–1564 (April 1, 2002)).
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AUFGABE DER ERFINDUNG
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein konkret praktizierbares
Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs
1 und eine entsprechende Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs
des unabhängigen Patentanspruchs
16 aufzuzeigen, die eine bessere räumliche Auflösung der
Struktur in der Probe als die Beugungsgrenze ermöglichen, ohne dabei die bekannten
Nachteile der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen in Kauf zu nehmen.
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LÖSUNG
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Die
Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen
des unabhängigen
Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs
19 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen
des neuen Verfahrens finden sich in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis
18. Die abhängigen
Patentansprüche
20 bis 32 sind auf besonders bevorzugte Ausführungsformen der neuen Vorrichtung
gerichtet.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bei
dem neuen Verfahren wird die Struktur in der Probe mit einer Substanz
markiert, die mit einem ersten elektromagnetischen Signal von einem
ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist oder umgekehrt, wobei
die Substanz in dem ersten Zustand einen höheren Absorptionsquerschnitt
für ein
zweites elektromagnetisches Signal aufweist als in dem zweiten Zustand.
Dieses zweite elektromagnetische Signal wird auf die Probe aufgebracht,
nachdem mittels des ersten elektromagnetischen Signals eine räumliche
Verteilung eines Anteils der Substanz in dem ersten Zustand eingestellt
wurde, bei der mindestens ein Bereich, in dem die Substanz im Wesentlichen
in dem ersten Zustand vorliegt, räumlich begrenzt ist. Dabei
muss keine Lokalisierung des zweiten elektromagnetischen Signals
auf bestimmte Bereiche der Probe erfolgen. Die räumliche Eingrenzung erfolgt
bereits zuvor mittels des ersten elektromagnetischen Signals. Die
Absorption des zweiten elektromagnetischen Signals durch die in
dem ersten Zustand befindlichen Anteile der Substanz führt in deren
Bereich zu einer lokalen Temperaturerhöhung der Probe. Diese wird
bei dem neuen Verfahren detektiert, statt zu versuchen, direkt die
unterschiedliche Absorption der Substanz mit einem Teststrahl zu erfassen.
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Die
lokale Temperaturerhöhung
der Probe beim Beaufschlagen der Probe mit dem zweiten elektromagnetischen
Signal in Folge des größeren Absorptionsquerschnitts
der Substanz in den ersten Zustand kann mit allen als solchen bekannten
Techniken zur Detektion lokaler Temperaturerhöhungen detektiert werden. Dazu
gehören
alle unter der Überschrift
Stand der Technik beschriebenen Verfahren zum photothermischen Abbilden.
D. h. die mindestens eine lokale Temperaturerhöhung der Probe kann insbesondere
anhand einer mit ihr verbundenen Phasenverschiebung eines durch
die Probe laufenden elektromagnetischen Signals detektiert werden.
Diese Phasenverschiebung basiert auf der mit der Temperaturerhöhung verbundenen
Brechungsindexänderung
der Probe. Grundsätzlich
ist aber auch die Detektion von Streulicht, das durch diese Brechungsindexänderung
der Probe zustande kommt, möglich.
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Bei
diesem elektromagnetischen Signal, dessen Phasenverschiebung beobachtet
wird, kann es sich um ein zusätzliches
drittes elektromagnetisches Signal, das sich in seiner Wellenlänge von dem
ersten und dem zweiten elektromagnetischen Signal unterscheidet,
handeln. Es kann aber auch das erste oder das zweite elektromagnetische
Signal bezüglich
auftretender Phasenverschiebungen beobachtet werden. Im Fall des
zweiten elektromagnetischen Signals liegt dann eine ähnliche
Konstellation wie bei der als thermische Linse bekannten Technik vor.
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Typischerweise
ist mindestens eines der hier erwähnten elektromagnetischen Signale
ein monochromatisches optisches Signal. Häufig werden alle eingesetzten
elektromagnetischen Signale monochromatische optische Signale sein.
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Eine
besonders hohe Empfindlichkeit in Bezug auf lokale Temperaturerhöhungen der
Probe weisen die unter der Überschrift
Stand der Technik beschriebenen Techniken der optischen Fernfeldinterferenzmikroskopie
auf, zu denen auch die PHI-Technik zählt.
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Vorzugsweise
wird nicht nur binär
registriert, ob eine lokale Temperaturerhöhung in einem Bereich der Probe
vorliegt oder nicht, sondern es wird auch die Höhe dieser Temperaturerhöhung bestimmt,
um damit einen Hinweis auf die Menge der Substanz in dem ersten
Zustand in dem jeweiligen Bereich zu erhalten.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann eine Lage der lokalen Temperaturerhöhungen in der Probe registriert
werden. Wenn feststeht oder angenommen wird, dass die Verteilung
der die Temperaturerhöhung
verursachenden Substanz innerhalb des jeweiligen Bereichs konstant
ist und der Bereich selbst hinreichend klein ist, kann hieraus die
Lage der Substanz in der Probe und damit ein Teil der interessierenden
Struktur mit einer Ortsauflösung
besser als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des elektromagnetischen Signals,
mit der die Temperaturerhöhung
erfasst wird, bestimmt werden. Dabei wird der Schwerpunkt der Lage
der Temperaturerhöhung
in der Probe der Lage der Substanz in dem ersten Zustand gleichgesetzt.
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Wenn
jedoch die Substanz mittels des ersten elektromagnetischen Signals
in als solchen bekannten Bereichen der Probe in dem ersten Zustand
belassen oder in diesen überführt wird,
ist es günstiger, als
Lage der die Temperaturerhöhung
verursachenden Substanz die Lage dieser Bereiche zu verwenden, und
nur die Größe der Temperaturerhöhung zusätzlich zu
registrieren, um ein Maß für die Menge der
Substanz in dem jeweiligen Bereich zu erhalten.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wäre
es zwar wünschenswert,
dass die Substanz in dem ersten Zustand einen sehr großen und
in dem zweiten Zustand einen Absorptionsquerschnitt für das zweite
elektromagnetische Signal von null aufweist. Dies ist jedoch nicht
zwingend. Vielmehr ist es ausreichend, wenn die Substanz aus einer
Gruppe von Substanzen ausgewählt
wird, die in dem ersten Zustand einen mindestens zehnmal, vorzugsweise
mindestens einhundertmal größeren Absorptionsquerschnitt
für das zweite
elektromagnetische Signal aufweisen als in dem zweiten Zustand.
Der Temperaturgradient, der sich in Folge des zweiten elektromagnetischen
Signals der Probe ausbildet, steigt mit dem Absorptionsquerschnitt
der Substanz für
das zweite elektromagnetische Signal an.
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Die
mit der Temperaturerhöhung
einhergehende Brechungsindexänderung
der Probe, die durch die Phasenverschiebung eines durch die Probe
laufenden Signals oder auch durch Streulicht umso besser detektierbar
ist, je größer sie
ist, hängt neben
dem Absorptionsquerschnitt für
das zweite elektromagnetische Signal und damit der absoluten Temperaturänderung
von der spezifischen Brechungsindexänderung der Probe mit der Temperatur ab.
Daher ist es von Vorteil, die zu untersuchende Probe in ein Medium
einzubetten, bei dem die Temperaturerhöhung mit einer besonders hohen
Brechungsindexänderung
einhergeht. So weisen viele organische flüssige Medien eine Brechungsindexreduktion
von 0.0005 pro 1 K Temperaturerhöhung
auf, wohingegen Wasser nur eine Brechungsindexreduktion 0.0001 pro
1°C aufweist.
Alternativ oder zusätzlich
kann die Probe auf eine solche Temperatur eingestellt werden, bei
der die durch das zweite elektromagnetische Signal hervorgerufene
Temperaturerhöhung
in dem vorhandenen Medium einen möglichst großen Brechungsindexsprung hervorruft.
So ist es bei wässrigen
Proben von Vorteil sein, die Probe zu kühlen, wobei eine Probentemperatur
von –10
bis 5°C
in Hinblick auf eine große
Brechungsindexänderung
bei Temperaturänderung
besonders günstig
ist.
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In
der Praxis der vorliegenden Erfindung sind besonders solche Substanzen
bevorzugt, die wiederholt mittels des ersten elektromagnetischen
Signals aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand überführbar sind.
Dies ermöglicht
es, mit dem ersten optischen Signal eine räumliche Verteilung eines Anteils
der Substanz in dem ersten Zustand einzustellen, bei dem sich nur
solche Anteile der Substanz in dem ersten Zustand befinden, die
sich am Ort einer durch destruktive Überlagerung gebildeten Nullstelle des
ersten elektromagnetischen Signals befinden, um mit einer oder mehrerer
der derart gebildeten Nullstellen des ersten Signals die gesamte
Probe abzuscannen. Bei der Nullstelle, die durch destruktive Überlagerung
des ersten Signals mit sich selbst gebildet wird, kann es sich um
eine Nullstelle eines Interferenzmusters handeln. Eine besonders
bevorzugte Nullstelle dieser Art ist das Zentrum einer Doughnutförmigen Intensitätverteilung
des ersten optischen Signals.
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Wenn
jeweils nur einzelne räumlich
voneinander getrennte Moleküle
oder Cluster von Molekülen
der Substanz, mit der die Struktur in der Probe markiert wird, in
den ersten Zustand überführt werden,
kann es ausreichend sein, wenn die Substanz aus einer Gruppe von
Substanzen ausgewählt
wird, die mittels des ersten elektromagnetischen Signals nur einmal
aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand überführbar ist. Wenn sie nicht mehr
in den zweiten Zustand zurückkehrt,
muss sie dann aber aus dem ersten Zustand in einen dritten Zustand überführbar sein,
in dem ihr Absorptionsquerschnitt wieder kleiner als in dem ersten
Zustand ist. Beim Verwenden einer solchen Substanz wird mit dem
ersten optischen Signal eine räumliche
Verteilung eines Anteils der Substanz in dem ersten Zustand eingestellt,
bei der sich nur einzelne Moleküle
oder Cluster von Molekülen
der Substanz in dem ersten Zustand befinden, die so weit voneinander
beabstandet sind, dass die von ihnen beim Beaufschlagen der Substanz
mit dem zweiten Signal ausgehenden lokalen Temperaturerhöhung der
Probe in einer Abbildung auf einen zweidimensionalen Photosensor,
wie z. B. eine Kamera, getrennt voneinander detektierbar sind. Jede
Temperaturerhöhung
kann dann einem einzelnen Molekül
oder Cluster von Molekülen
zugeordnet werden und die Lage dieses einzelnen Moleküls oder
Clusters von Molekülen
kann aus der Lage der Temperaturerhöhung in der Probe mit einer
besseren Ortsauflösung
als der Beugungsgrenze registriert werden.
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Bei
einer speziellen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, die sich an dem Konzept der SPARSE-Technik
orientiert, wird nur ein einziges elektromagnetisches Signal auf
die jeweilige Probe gerichtet. Dieses Signal wird von einzelnen
Molekülen
oder Clustern von Molekülen
der Substanz, mit der die interessierende Struktur in der Probe
markiert ist, absorbiert, die spontan, d. h. aufgrund thermischer
Anregung schon bei der Ausgangstemperatur der Probe, und/oder in
Folge der globalen Erwärmung
der Probe durch das eine elektromagnetische Signal in den absorbierenden
ersten Zustand gelangt sind. Das eine elektromagnetische Signal
dient auch zum Detektieren der daraus resultierenden lokalen Temperaturerhöhungen der
Probe und überführt die derart
gemessenen Moleküle
oder Cluster von Molekülen
der Substanz letztlich im Sinne eines Bleichens in einen dritten
Zustand, in dem die Substanz das elektromagnetische Signal nicht
mehr absorbiert und aus dem die Substanz auch nicht mehr in den
absorbierenden zweiten Zustand zurück gelangt. Ein zusätzliches
erstes elektromagnetisches Signal, das auf die Probe gerichtet wird,
um mittels diesem den Anteil der Substanz in der Probe in dem ersten
absorbierenden Zustand einzustellen, entfällt dann zwar; es kann aber
in der thermischen Anregung der Probe gesehen werden. Wenn diese
thermische Anregung auf dem einen elektromagnetischen Signal beruht, das
dann auch von der Substanz in dem ersten Zustand absorbiert wird,
stellt dieses eine elektromagnetische Signal im Sinne der Patentansprüche sowohl
das erste als auch das zweite elektromagnetische Signal dar.
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Als
Substanz zur Markierung der Struktur der Probe kommen insbesondere
photochrome Farbstoffe in Frage, die beim Verändern ihres Zustands mittels
des ersten Signals für
das zweite Signal einen stark veränderten Absorptionsquerschnitt
aufweisen.
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Die
Substanz kann auch aus einer Gruppe von Substanzen ausgewählt werden,
die in dem ersten Zustand zusätzlich
andere Fluoreszenzeigenschaften als in dem zweiten Zustand aufweisen.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um solche Substanzen, die in
dem ersten Zustand schwach fluoreszent sind und in dem zweiten Zustand
nicht fluoreszent sind. Dabei kann das zweite elektromagnetische
Signal oder auch ein anderes elektromagnetisches Signal die Substanz
zur Emission von Fluoreszenzlicht anregen, mit dem die Verteilung
der Substanz bzw. die mit ihr markierte Struktur in der Probe über einen zweiten
Kanal abbildbar ist.
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Besonders
bevorzugt wird das zweite elektromagnetische Signal in Pulsen mit
hoher Intensitätsdichte
auf die Probe aufgebracht, wobei die vorübergehende lokale Temperaturerhöhung der
Probe unmittelbar nach jedem Puls des zweiten elektromagnetischen
Signals detektiert wird. Auf dieses Weise ist es möglich, vorübergehend
einen sehr hohen Temperaturgradienten aufgrund der lokalen Temperaturerhöhung der
Probe in der Probe auszubilden. Entsprechend ist der Effekt in Bezug
auf die Phasenverschiebung des elektromagnetischen Signals, das zur
Detektion der lokalen Temperaturerhöhung verwendet wird, besonders
groß.
Gleichzeitig wird durch das gepulste zweite elektromagnetische Signal
im Mittel aber nur wenig Wärmeenergie
in die Probe eingetragen, so dass auch das Beobachten von lebenden
biologischen Proben möglich
ist, ohne diese thermisch zu zerstören.
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Grundsätzlich kann
das zweite elektromagnetische Signal auch moduliert sein, wenn es
auf die Probe aufgebracht wird, um hierdurch die Voraussetzungen
für die
Anwendung der PHI-Technik
zu schaffen.
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Die
neue Vorrichtung weist einen Detektor auf, mit dem mindestens eine
aus dem größeren Absorptionsquerschnitt
der Substanz in dem ersten Zustand resultierende lokale Temperaturerhöhung der Probe
beim Beaufschlagen mit dem zweiten elektromagnetischen Signal detektierbar
ist. Für
das erste und das zweite elektromagnetische Signal weist die neue
Vorrichtung entsprechende Signalquellen auf. Zusätzlich kann eine dritte Signalquelle
für ein
drittes elektromagnetisches Signal vorgesehen sein, anhand dessen
Phasenverschiebung der Detektor die lokalen Temperaturerhöhungen der
Probe detektiert. Der Detektor kann aber auch dazu vorgesehen sein, hierfür das erste
oder das zweite elektromagnetische Signal von der ersten bzw. zweiten
Signalquelle zu verwenden.
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Die
Signalquellen sind vorzugsweise solche, die monochromatische optische
Signale, beispielsweise in Form von Laserstrahlen liefern. Dabei
unterscheiden sich das erste und das zweite Signal bei den meisten
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ebenso wie ein eventuelles drittes Signal durch
unterschiedliche Wellenlängen.
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Weitere
Aspekte der neuen Vorrichtung wurden bereits anhand des neuen Verfahrens
erläutert.
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Wenn
die Probe auf eine bestimmte Temperatur, bei der sie eine besonders
hohe spezifische Brechungsindexänderung
mit der Temperatur aufweist, temperiert werden soll, ist dazu eine
Temperiereinrichtung für
die Probe vorzusehen. Wenn die Struktur in der Probe zusätzlich mit
Fluoreszenzlicht von der Substanz in dem ersten Zustand abgebildet werden
soll, so ist ein Fluoreszenzlichtdetektor zum ortsaufgelösten Detektieren
von Fluoreszenzlicht von der Probe vorzusehen. Dieser Fluoreszenzlichtdetektor
kann mit dem Detektor für
das Detektieren lokaler Temperaturerhöhungen der Probe zusammengefasst
sein.
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Vorteilhafte
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und
der gesamten Beschreibung. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere
den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer
Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen.
Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen
der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche abweichend
von den gewählten
Rückbeziehungen
ist ebenfalls möglich
und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die
in separaten Zeichnungsfiguren dargestellt sind oder bei deren Beschreibung
genannt werden. Diese Merkmale können
auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand von verschiedenen Ausführungsbeispielen
näher erläutert und
beschrieben.
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1 zeigt
den grundsätzlichen
Aufbau einer ersten Ausführungsform
der neuen Vorrichtung zur Durchführung
des neuen Verfahrens mit drei Signalquellen.
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2 zeigt
eine zweite Ausführungsform
der neuen Vorrichtung zur Durchführung
des neuen Verfahrens, ebenfalls mit drei Signalquellen.
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3 zeigt
eine dritte Ausführungsform
der neuen Vorrichtung zur Durchführung
des neuen Verfahrens mit zwei Signalquellen.
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4 zeigt
eine vierte Ausführungsform
der neuen Vorrichtung zur Durchführung
des neuen Verfahrens, ebenfalls mit zwei Signalquellen.
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FIGURENBESCHREIBUNG
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In S.
Berciaud et al.: "Photothermal
heterodyne imaging of individual metallic nanoparticles: Theory
versus experiment" in
PHYSICAL REVIEW B 73, 045424 (2006) ist berichtet worden,
dass Goldnanopartikel von 1,4 nm Größe (67 Atome) durch die PHI-Technik
detektiert werden können.
Der Absorptionsquerschnitt von photochromen Farbstoffen bei der
von ihnen maximal absorbierten Wellenlänge liegt in derselben Größenordnung
wie derjenige von Goldatomen in einem Cluster. Entsprechend können zumindest
solche Bereiche einer mit einem photochromen Farbstoff markierten
Struktur gemäß dem neuen
Verfahren photothermisch abgebildet werden, die einige 10 Moleküle des photochromen
Farbstoffs in dem ersten Zustand aufweisen. Bei einer hinreichend
hohen Konzentration des photochromen Farbstoffs ist diese Bedingung
auch dann unkritisch, wenn der photochrome Farbstoff in der Probe
mittels des ersten elektromagnetischen Signals jeweils bis auf einen
Bereich aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand mit dem kleineren
Absorptionsquerschnitt überführt wird,
der kleinere Abmessungen als die Beugungsgrenze aufweist. Es kommt
dann nur darauf an, dass in dem jeweiligen Bereich die Struktur
in der Probe gegebenenfalls mit mehr als etwa einigen 10 Farbstoffmolekülen markiert
ist.
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Einzelne
herkömmliche
Farbstoffmoleküle
in dem stärker
absorbierenden ersten Zustand wurden mit bekannten photothermischen
Abbildungstechniken zwar noch nicht detektiert, es erscheint aber
sowohl möglich,
photochrome Farbstoffe mit besonders großem Absorptionsquerschnitt
eines einzelnen Moleküls
zu selektieren, als auch Cluster von photochromen Farbstoffmolekülen auszubilden,
die mittels des ersten Signals entweder als ganzes oder gar nicht aus
dem zweiten Zustand in den stärker
absorbierenden ersten Zustand überführt werden.
Weiterhin erscheint es möglich,
die mit einer Temperaturerhöhung
einhergehende Brechungsindexänderung durch
optimierte Auswahl des Mediums und seiner Temperatur zu maximieren.
Darüber
hinaus ist davon auszugehen, dass die Empfindlichkeit photothermischer
Abbildungstechniken weiter ansteigt, und zwar durch Verwendung noch
empfindlicher Detektoren und elektromagnetischer Signal, die besser
an die Anforderungen der Temperaturmessung angepasst sind. So ist
es praktisch möglich,
das neue Verfahren auch in Form einer Variante der SPARSE-Technik durchzuführen, bei
der nur einzelne Moleküle
bzw. Cluster von Molekülen
mittels des ersten Signals in den stärker absorbierenden Zustand überführt werden,
die soweit voneinander entfernt sind, dass sie beim photothermischen
Abbilden auf einen zweidimensionalen Photosensor getrennt voneinander
abgebildet werden.
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1 zeigt
den grundsätzlichen
Aufbau einer Vorrichtung 1 zur Durchführung des neuen Verfahrens.
D. h., die Vorrichtung 1 dient zum Abbilden einer Struktur
in einer Probe 2. Die hier nicht separat wiedergegebene
Struktur in der Probe 2 ist dabei mit einer Substanz, hier
einem photochromen Farbstoff markiert, der zwei Zustände aufweist.
In dem ersten Zustand ist ein Absorptionsquerschnitt jedes Moleküls viel
größer, d.
h. mindestens zehnmal, vorzugsweise mindestens einhundert Mal größer als
in seinem zweiten Zustand. Diese unterschiedlichen Absorptionsquerschnitte
beziehen sich auf ein elektromagnetisches Signal 3, bei
dem es sich um ein monochromatisches optisches Signal in Form eines
Laserstrahls handelt, von einer Signalquelle 4, d. h. einem
Laser. Aus seinem ersten Zustand mit dem großen Absorptionsquerschnitt
ist der photochrome Farbstoff mit einem elektromagnetischen Signal 5, bei
dem es sich ebenfalls um ein monochromatisches optisches Signal
in Form eines Laserstrahls handelt, von einer Signalquelle 6,
d. h. einem Laser, überführbar. Dabei
erfolgt die Überführung in
einem jeweiligen Messbereich der Probe 2 bis auf einen
aktuell interessierenden Bereich, so dass sich der photochrome Farbstoff
nur noch in diesem interessierenden Bereich in seinem Zustand mit
dem großen
Absorptionsquerschnitt befindet. Zu diesem Zweck wird das elektromagnetische
Signal 5 im Bereich der Probe 2 so mit sich selbst überlagert,
dass es am Ort des interessierenden Bereichs eine Nullstelle seiner
Intensitätsverteilung
ausbildet, während
es den weiteren Messbereich mit einer so großen Intensität abdeckt, dass
der Farbstoff mit hoher Wahrscheinlichkeit in seinen zweiten Zustand überführt wird.
Konkret kann die Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5 im Bereich der Probe 2 Doughnut-förmig sein,
wobei im Zentrum des Doughnuts die Nullstelle der Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5 gegeben ist. Wenn jetzt
der Messbereich mit dem elektromagnetischen Signal 3 von
der Signalquelle 4 beaufschlagt wird, kann das Signal 3 nur
von solchen Molekülen
des photochromen Farbstoffs absorbiert werden, die sich im Bereich
der Nullstelle der Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5 befinden, da alle anderen
Moleküle
des photochromen Farbstoffs in dem Messbereich mit dem elektromagnetischen
Signal 5 in den nicht absorbierenden Zustand überführt wurden.
Hieraus resultiert eine lokale Temperaturerhöhung der Probe 2,
die von der Konzentration des photochromen Farbstoffs im Bereich
der Nullstelle der Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5 abhängt. Diese lokale Temperaturerhöhung wird
in der Vorrichtung 1 photothermisch abgebildet, indem ein
weiteres elektromagnetisches Signal 7 wieder in Form eines
monochromatischen optischen Signals, konkret eines Laserstrahls
von einer Signalquelle 8, d. h. einem Laser, auf die Probe 2 gerichtet
wird. Das elektromagnetische Signal 7 läuft durch den Messbereich in
der Probe 2 und trifft hinter der Probe 2 auf
einen Detektor 9. Mit dem Detektor 9 wird registriert,
ob sich eine Phasenverschiebung des elektromagnetischen Signals 7 aufgrund
eines Temperaturgradienten in der Probe 2 ergibt, der auf
eine lokale Temperaturerhöhung
der Probe 2 in Folge der Absorption des elektromagnetischen
Signals 3 am Ort der Nullstelle der Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5 zurückgeht. Mit dem Detektor 9 ist
auch die Größe des Gradienten
und damit die Größe der Temperaturerhöhung und
damit letztlich die Konzentration des photochromen Farbstoffs am
Ort der Nullstelle des elektromagnetischen Signals 5 registrierbar.
Wenn die Probe 2 mit einer Scanneinrichtung 10 derart zweidimensional
verschoben wird, dass mit der Nullstelle der Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5, wobei auch eine Vielzahl
derartiger Nullstellen vorgesehen sein kann, die gesamte Probe 2 abgetastet
wurde, entsteht ein Abbild der Intensitätsverteilung des photochromen
Farbstoffs in der Probe 2. Auf diese Weise wird die mit
dem photochromen Farbstoff markierte Struktur in der Probe abgebildet.
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Gegenüber der
Verwendung eines fluoreszenten Farbstoffs ergeben sich dabei erhebliche
Vorteile in Bezug auf die Größe und damit
das Signal-zu-Rauschverhältnis
des Messsignals. Ein Molekül
eines fluoreszenten Farbstoffs kann immer nur dann, wenn es sich
in seinem Grundzustand befindet, mit Anregungslicht zu Fluoreszenz
angeregt werden. Bis zu einer nächstmöglichen
Anregung, die frühestens
nach 1 bis 5 ns erfolgen kann, muss gewartet werden, bis das Molekül in seinen
Grundzustand zurückgekehrt
ist. Ob es bei dieser Rückkehr
in seinen Grundzustand Fluoreszenzlicht aussendet, hängt von
dem Verhältnis
seiner Übergangswahrscheinlichkeiten
ab; meistens beträgt
die Fluoreszenz-Quanteneffizienz der Anregung weniger als 50%. Hinzu
kommt, dass sich das fluoreszente Molekül regelmäßig in einem langlebigen Dunkelzustand, wie
zum Beispiel dem Triplettzustand, verfängt, in dem es 1 μs bis einige
Sekunden verharrt, ohne in der Lage zu sein, zum Fluoreszenzsignal
beizutragen. Mit welcher Wahrscheinlichkeit das Fluoreszenzlicht
auch im Gerät
detektiert wird, hängt
von dem jeweiligen Messaufbau ab; sie beträgt meistens weniger als 10%.
In jedem Fall ist die Ausbeute an Photonen je Molekül des fluoreszenten
Farbstoffs pro Zeiteinheit eng begrenzt. Hinzu kommt die Gefahr, dass
der fluoreszente Farbstoff in Folge der mehrfachen Anregung durch
das Anregungslicht gebleicht wird. Demgegenüber wird bei dem hier geschilderten neuen
Verfahren der photochrome Farbstoff mit dem elektromagnetischen
Signal 3 zwar auch angeregt, diese Anregung wird aber sehr
kurzfristig (binnen weniger als 2 ps) in Wärme umgewandelt und jedes Farbstoffmolekül steht
damit sofort wieder für
eine erneute Anregung mit dem elektromagnetischen Signal 3 zur
Verfügung.
Das ultraschnelle Relaxieren des Moleküls wirkt einer chemischen Veränderung
entgegen, weil diese nur aus einem angeregten Zustand heraus stattfinden
kann, der aber bereits binnen weniger als 2 ps zerfällt. So
kann in extrem kurzer Zeit eine große Zahl von Photonen aus dem
zweiten elektromagnetischen Signal absorbiert werden und eine lokale
Temperaturerhöhung
in der Probe 2 hervorgerufen werden. Beispielsweise kann
das elektromagnetische Signal 3 gepulst sein, und während jedes Pulses
erfolgt bereits eine Vielzahl von Anregungen jedes in dem absorbierenden
Zustand befindlichen Farbstoffmoleküls, die in eine Temperaturerhöhung der
Probe resultiert, die nach jedem einzelnen Puls erfassbar ist. Zum
Erfassen dieser Temperaturerhöhung
findet mit dem elektromagnetischen Signal 7 ebenfalls ein
viel stärkeres
Signal Verwendung, als es durch Fluoreszenzlicht bereitgestellt
wird.
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Dabei
bleiben alle wesentlichen Vorteile erhalten, die mit der Markierung
einer Struktur in einer Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff verbunden sind.
Die selektive Markierung eines bestimmten Zellbestandteils, wie
eines Proteins, ist weiterhin durch die Spezifizität der Substanz
gegeben. Auch können Mehrfachmarkierungen
durchgeführt
werden, da Marker mit unterschiedlichen Absorptionsspektren gewählt werden
können.
Ebenso können
zellendogene Markierungen verwendet werden, wie zum Beispiel Proteine
oder Proteinabschnitte, die bei bestimmten Wellenlängen eine
besonders starke Absorption aufweisen. Einer der wichtigsten Marker
der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für lebende Zellen, ist das Grün-Fluoreszierende-Protein
(GFP) und die davon abgeleiteten Derivate, weil sie sich so gut
wie an jedes Protein biochemisch fusionieren lassen. Bei fluoreszierenden
Proteinen ist es wichtig, dass diese auf hohe Fluoreszenzquantenausbeute optimiert
sind, d. h. dass die Anregungsenergie möglichst in Fluoreszenzlicht
und nicht in Wärme
umgewandelt wird – was
eher schwer zu bewerkstelligen ist. Im Gegenteil führen Stöße mit der
Umgebung des Moleküls
(z. B. Wassermolekülen)
zu einer in der Fluoreszenzmikroskopie ungewollt effizienten Umwandlung
der Anregungsenergie in Wärme.
Es ist daher viel schwieriger ein gut fluoreszentes Protein zu erzeugen
oder zu finden als ein nicht fluoreszierendes, d. h. eines das die
Anergungsenergie gut in Wärme umwandelt.
Dies gilt auch für
photochrome (schaltbare) Proteine. Ein Vorteil der hier beschriebenen
Erfindung ist, dass dieser Nachteil in einen Vorteil umgewandelt
wird, weil die Umwandlung in Wärme
hier sogar erwünscht
ist. Sie führt
nicht nur zum schnellen Aufheizen der Mikroumgebung der Substanz
in der Probe, sondern führt
das Molekül
schnell in den absorbierenden Grundzustand zurück, in dem es wieder Energie
aus dem elektromagnetischen Signal 3 aufnehmen kann. Genauso
ist es eher schwieriger organische Fluoreszenzmarker zu finden,
die sowohl schaltbar als auch fluoreszent sind, denn die meisten optisch
schaltbaren (photochromen) organischen Verbindungen sind nicht fluoreszent,
sondern ändern nur
ihr Absorptionsspektrum. Dagegen können sie ihre Energie effizient
in Wärme
umwandeln.
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Nichtsdestotrotz
kann es bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung von Vorteil
sein, eine Substanz für
die Markierung der Struktur in der Probe auszuwählen, die neben einer hohen
Umwandlungsrate der absorbierten Photonenergie in Wärme in ihrem
ersten Zustand immerhin noch eine messbare Quantenausbeute an Fluoreszenz
aufweist. Damit hat man einen weiteren Messkanal zur Verfügung, in welchem
die Substanz durch eine Fluoreszenzabbildung erfasst werden kann.
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Bei
sachgerechter Abstimmung der Wellenlängen der elektromagnetischen
Signale 3 und 7 sowie 5 besteht trotz
der beim Absorbieren des elektromagnetischen Signals 3 vielfachen
Anregung wegen der nur sehr geringen Lebensdauer des angeregten Zustands
keine nennenswerte Gefahr eines Bleichens des photochromen Farbstoffs.
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Die
Rückkehr
des photochromen Farbstoffs aus seinem zweiten Zustand zurück in seinen
ersten Zustand, die so schnell erfolgen muss, dass ein Scannen der
Probe 2 mit der Scanneinrichtung 10 möglich ist,
erfolgt hier spontan. Sie kann aber durch ein weiteres, hier nicht
gezeigtes elektromagnetisches Signal angeregt werden. Ebenso ist
es denkbar, dass eines der elektromagnetischen Signale 3 und 7 diese
Rückführung anregt.
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Zur
Zusammenführung
bzw. Trennung der verschiedenen elektromagnetischen Signale 3, 5 und 7 weist
die Vorrichtung 1 dichroitische Spiegel 11, 12 und 13 auf,
die auf die jeweiligen Wellenlängen
abgestimmt sind. Ein Objektiv 14 fokussiert die elektromagnetischen
Signale 3, 5 und 7 auf die Probe 2.
Ein weiteres, hier nicht dargestelltes Objektiv ist regelmäßig auch
zwischen der Probe 2 und dem Detektor 6 vorgesehen.
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Während 1 den
Detektor 9 in Bezug auf die Signalquellen 4, 6 und 8 hinter
der Probe 2 aufweist, ist er bei der Ausführungsform
der Vorrichtung 1 gemäß 2 nicht
in einer Transmissions- sondern in einer Reflektionsanordnung vorgesehen.
Zur Umlenkung des reflektierten elektromagnetischen Signals 7 zu
dem Detektor 9 ist dabei ein polarisierender Strahlteiler 15 in
Verbindung mit einer Lambda/4-Platte 16 vorgesehen. Dabei
kann das elektromagnetische Signal 3 mit einem hier nicht
dargestellten Modulator bezüglich
seiner Intensität über der Zeit
moduliert werden, um die Voraussetzungen für eine PHI-Technik beim thermischen
Abbilden der lokalen Temperaturerhöhungen in der Probe 2 zu schaffen.
Weiterhin ist die Scaneinrichtung 10 hier so ausgebildet,
dass sie nicht die Probe 2 gegenüber den elektromagnetischen
Signalen 3, 5 und 7, sondern das elektromagnetische
Signal 5, das den Bereich des Farbstoffs in dem absobierenden
Zustand festlegt, gegenüber
der Probe 2 bewegt. Die Scaneirichtung 10 kann
dazu beispielsweise ein von einem Galvanometerscanner bewegtes optisches
Element oder auch einen so genannten Spatial Light Modulator und
die jeweils zugehörigen,
dem Fachmann bekannten weiteren Bauteile einer solchen Scaneinrichtung,
insbesondere Linsen zur Anpassung der Abbildung, aufweisen. Ansonsten
ist aber die Funktionsweise der Vorrichtung 1 gemäß 2 grundsätzlich dieselbe
wie derjenigen gemäß 1.
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Die
Vorrichtung 1 gemäß 3 weist
den Detektor 9 wieder in einer Transmissionsanordnung auf.
Zudem ist hier auf eine separate Signalquelle 8 für das elektromagnetische
Signal 7 verzichtet. Stattdessen wird hier die lokale Temperaturerhöhung der Probe 2 dadurch
erfasst, dass mit dem Detektor 9 das elektromagnetische
Signal 5 auf Phasenverschiebungen hin beobachtet wird.
Konkret kann mit dem Detektor 9 erfasst werden, ob sich
eine Doughnutförmige
Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5 im Bereich der Probe 2 in Folge
des elektromagnetischen Signals 3, d. h. in Folge einer
hieraus resultierenden lokalen Temperaturerhöhung deformiert. Dabei kann
das elektromagnetische Signal 3 wieder moduliert sein,
um festzustellen, ob hinter der Probe 2 eine entsprechende Modulation
des elektromagnetischen Signals 5 gegeben ist, die auf
eine modulierte lokale Temperaturerhöhung der Probe 2 bzw.
einen modulierten Temperaturgradienten in der Probe 2 hinweist.
Die Größe der Modulation
des elektromagnetischen Signals 5 hinter der Probe 2 gibt
dabei einen Hinweis auf die Größe der Temperaturerhöhung und
damit auf die Konzentration des photochromen Farbstoffs im Bereich
der Nullstelle der Intensitätsverteilung
des elektromagnetischen Signals 5. Die Scaneinreichtung 10 ist
hier von der Probe 2 aus direkt hinter dem Objektiv 14 angeordnet
und bewegt synchron alle elektromagnetischen Signale 3, 5 und 7,
die auf die Probe 2 gerichtet werden, gegenüber der
Probe 2. So können alle
elektromagnetischen Signale 3, 5 und 7,
die auf die Probe 2 gerichtet werden, auf den jeweiligen Messbereich
der Probe 2 konzentriert werden.
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Bei
der Ausführungsform
der Vorrichtung 1 gemäß 4 ist
der Detektor 9 wie in 2 in einer Reflektionsanordnung
vorgesehen. Entsprechend gibt es hier wieder den Polarisationsstrahlteiler 15 und
die Lambda/4-Platte 16. Hier ist jedoch auf die zusätzliche
Signalquelle 8 für
das elektromagnetische Signal 7 verzichtet, indem das elektromagnetische
Signal 3, mit dem die Probe 2 zunächst dort,
wo sich der photochrome Farbstoff in seinem ersten, stark absorbierenden
Zustand befindet, lokal erwärmt
wird, auch zum Detektieren dieser Erwärmung verwendet wird. Hierbei
macht man sich einen Effekt zu Nutze, der als thermische Linse bekannt
ist. Der von dem elektromagnetischen Signal 3 selbst in
der Probe 2 hervorgerufene Temperaturgradient bewirkt eine
Phasenverschiebung des elektromagnetischen Signals 3, die
mit dem Detektor 9 feststellbar ist. Die Scaneinreichtung 10 ist
grundsätzlich
wie in 3 ausgebildet. Sie verschiebt hier dabei auch
das von der Probe zurückkommende
Licht, so dass dieses unabhängig
von dem jeweiligen Messbereich der Probe 2 immer auf denseben
Bereich des Detektors 9 fällt.
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- 1
- Vorrichtung
- 2
- Probe
- 3
- elektromagnetisches
Signal
- 4
- Signalquelle
- 5
- elektromagnetisches
Signal
- 6
- Signalquelle
- 7
- elektromagnetisches
Signal
- 8
- Signalquelle
- 9
- Detektor
- 10
- Scanneinrichtung
- 11
- dichroitischer
Spiegel
- 12
- dichroitischer
Spiegel
- 13
- dichroitischer
Spiegel
- 14
- Objektiv
- 15
- Polarisationsstrahlteiler
- 16
- Lambda/Viertel-Platte