DE102006047911A1 - Arrangement for splitting detection light - Google Patents
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Abstract
Anordnung zur Aufteilung von Detektionslicht in einem Laser-Scanning-Mikroskop, wobei eine spektrale Separierung unterschiedlicher Spektralanteile in transmittierte und ausgeblendete Anteile erfolgt, wobei die Aufteilung durch mindestens einen in einem Winkel ungleich 90° und 0° zur optischen Achse verkippten beschichteten Filter erfolgt, wobei der Winkel zu optischen Achse weniger als 20°, vorteilhaft weniger als 10°, von der optischen Achse abweicht.Arrangement for the division of detection light in a laser scanning microscope, wherein a spectral separation of different spectral components in transmitted and hidden parts takes place, wherein the division is effected by at least one tilted at an angle not equal to 90 ° and 0 ° to the optical axis coated filter, wherein the angle to the optical axis deviates less than 20 °, advantageously less than 10 °, from the optical axis.
Description
In einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine grosse Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder zur Beleuchtung dienen.In A laser scanning system uses lasers of different power classes used. Furthermore, a laser scanning system is characterized by a large Number of variable modules marked as detector or to serve for lighting.
Ein konfokales Scanmikroskop enthält ein Lichtquellenmodul, das bevorzugt aus mehreren Laserstrahlquellen besteht, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen. Eine Scaneinrichtung, in die das Beleuchtungslicht als Beleuchtungsstrahl eingekoppelt wird, weist einen Hauptfarbteiler, einen x-y-Scanner und ein Scanobjektiv auf, um den Beleuchtungsstrahl durch Strahlablenkung über eine Probe zu führen, die sich auf einem Mikroskoptisch einer Mikroskopeinheit befindet. Ein dadurch erzeugter von der Probe kommender Messlichtstrahl wird über einen Hauptfarbteiler und eine Abbildungsoptik auf mindestens eine konfokale Detektionsblende (Detektionspinhole) eines Detektionskanals gerichtet.One confocal scanning microscope contains a light source module, which preferably consists of several laser beam sources exists that generate illumination light of different wavelengths. A scanning device, in which the illumination light as an illumination beam has a main color divider, an x-y scanner and a scan lens to scan the illumination beam through a beam deflection To lead a sample which is located on a microscope stage of a microscope unit. A measuring light beam coming from the sample generated thereby is transmitted via a Main color divider and an imaging optic on at least one confocal Detection aperture (detection pinhole) directed a detection channel.
In
Ein
LSM gliedert sich im wesentlichen wie in
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto-optischen Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.to specific stimulation of the different dyes in a preparation used in a LSM laser with different wavelengths. The choice of Excitation wavelength depends on the absorption properties of the examined Dyes. The excitation radiation is generated in the light source module. Various lasers (argon, argon krypton, TiSa laser). Furthermore, the selection is carried out in the light source module the wavelengths and the setting of the intensity the needed Excitation wavelength, e.g. through the use of an acousto-optic crystal. Then arrives the laser radiation over a fiber or a suitable mirror arrangement in the scan module.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.The Laser radiation generated in the light source is using the lens diffraction limited over Focus the scanner, the scan optics and the tube lens into the specimen. The focus rasterizes punctiform sample in the x-y direction. The pixel dwell times when scanning over the Samples are usually in the range of less than a microsecond up to several 100 microseconds.
Bei einer konfokales Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende/Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Tiefenauflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dichroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen.at a confocal detection (descanned detection) of the fluorescent light, The light comes from the focal plane (Specimen) and from the above and underlying levels is emitted via the scanner to a dichroic beam splitter (MD). This separates the fluorescent light from the excitation light. Subsequently, will the fluorescent light is focused on a diaphragm (confocal aperture / pinhole), which is located exactly in a plane conjugate to the focal plane. As a result, fluorescent light portions outside the focus are suppressed. By Varying the aperture size can the optical depth resolution of the microscope. Behind the panel is located another dichroic block filter (EF) again the excitation radiation suppressed. After passing through the block filter, the fluorescent light is of a point detector (PMT).
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).at Using a multiphoton absorption, the excitation of the Dye fluorescence in a small volume at which the excitation intensity especially is high. This range is only slightly larger than the detected range when using a confocal arrangement. The use of a confocal Aperture can thus be omitted and the detection can be done directly after the Objectively done (non-descanned detection).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).In another arrangement for detecting one by Mehrphotonenabsorption excited dye fluorescence is still a descanned detection, however, this time the pupil of the objective is in the detection unit imaged (non-confocal descanned detection).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.From a three-dimensionally illuminated image is by both detection arrangements in conjunction with the corresponding one-photon or multiphoton absorption only the plane (optical section) reproduced in the Focusing plane of the lens is located. By recording several optical sections in the x-y plane at different depths z Sample can subsequently computer-aided a three-dimensional image of the sample will be generated.
Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.The LSM is therefore suitable for the examination of thick specimens. The excitation wavelengths become by the dye used with its specific absorption properties certainly. Matched to the emission properties of the dye Dichroic filters ensure that only that of the respective Dye emitted fluorescent light from the point detector measured becomes.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x).In biomedical applications, several different cell regions are currently labeled with different dyes simultaneously (multifluorescence). The individual dyes can with the prior art either due to different absorption properties or emission (spectra) are detected separately. For this purpose, there is an additional splitting of the fluorescent light of several dyes with the secondary beam splitters (DBS) and a separate detection of the individual dye emissions in separate point detectors (PMT x).
Das
LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen
Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde
(
(
Die Verbindung der Lichtquellenmodule mit dem Scanmodul erfolgt in der Regel über Lichtleitfasern.The Connection of the light source modules with the scan module takes place in the Usually over Optical fibers.
Das
Einkoppeln mehrerer unabhängiger
Laser in eine Faser zur Übertragung
zum Scankopf wurde beispielsweise in Pawley:
In
In
Die
in
Emissionsfilter und dichroitische Strahlteiler wurden nach dem Stand der Technik bisher unterschiedlich eingesetzt:
- • Emissionsfilter im Strahlengang vor dem Detektor zur Auswahl der detektierten Wellenlängen, senkrecht zur optischen Achse angeordnet. Gleichzeitig unterdrücken die Emissionsfilter das Licht außerhalb des gewählten Spektralbereiches
- • Dichroitische Strahlteiler (mit deutlich schwächeren Unterdrückungseigenschaften ausserhalb ihres transmissiven Wirkungsbereiches) zur Vorselektion von Wellenlängenbereichen, ebenfalls, auch wechselbar, nicht senkrecht, typisch unter 45° zur optischen Achse angeordnet
- • Emission filter in the beam path in front of the detector for selecting the detected wavelengths, arranged perpendicular to the optical axis. At the same time, the emission filters suppress the light outside the selected spectral range
- • Dichroic beamsplitters (with significantly lower suppression properties outside their transmissive range of action) for the preselection of wavelength ranges, also, also changeable, not vertical, typically at 45 ° to the optical axis
Zum
Erreichen der in
Daneben gibt es einen hohen Platzbedarf für die benötigten Elemente.Besides There is a high space requirement for the required elements.
Dieser hohe Aufwand soll durch die Erfindung reduziert werden.This high cost to be reduced by the invention.
Erfindungsgemäss wurde erkannt, dass vorteilhaft beschichtete Emissionsfilter praktisch keine Absorption aufweisen. Diese Filter reflektieren alles Licht mit Wellenlängen außerhalb des selektierten Spektralbereiches. Es scheint daher möglich, dieses reflektierte Licht für weitere spektrale Kanäle zu nutzen Damit das reflektierte Licht vom einfallenden Licht ohne weitere Filter getrennt werden kann, werden die Emissionsfilter leicht aus dem senkrechten Einfall heraus gekippt. Ein kleiner Winkel (<< 20°) wurde dabei als besonders vorteilhaft erkannt, weil die spektralen Eigenschaften typischer Emissionsfilter (hohe Unterdrückung, steile Bandkanten) sich für senkrechten Einfall und kleine vom senkrechten Einfall abweichende Winkel sich besonders gut realisieren lassen.According to the invention was recognized that advantageously coated emission filters practically have no absorption. These filters reflect all light with wavelengths outside of the selected spectral range. It therefore seems possible, this reflected Light for additional spectral channels To use the reflected light from the incident light without Further filters can be separated, the emission filters slightly tilted out of the vertical incidence. A small angle (<< 20 °) was there recognized as particularly advantageous because the spectral properties typical emission filter (high suppression, steep band edges) for vertical Incidence and small angle deviating from the vertical incidence especially good to realize.
Weiterhin erfolgt mit den Filtern eine Transmission des nicht reflektierten Strahlanteils mit hoher Unterdrückung der nicht erwünschten Strahlung (vorteilhaft grösser 10-3) in diesem Bereich.Furthermore, with the filters, a transmission of the non-reflected beam portion with high suppression of unwanted radiation (advantageously greater than 10 -3 ) in this area.
Durch diese Anordnung ergibt sich vorteilhaft die Möglichkeit einer einfacheren, kompakteren und kostenreduzierten „Kaskadierung" der Detektionskanäle in einer oder mehreren Ebenen.By this arrangement advantageously results in the possibility of a simpler, more compact and cost-reduced "cascading" of the detection channels in one or more levels.
Die
Erfindung wird nachstehend anhand der
Es zeigen:It demonstrate:
Die NEF 1-3 jeweils auf Filterrädern zur AuswechslungThe NEF 1-3 each on filter wheels for replacement
Erfindungsgemäss sind die Emissionsfilter so ausgebildet, dass sie einen definierten Teil der Lichtstrahlung transmittieren und den Rest nahezu vollständig reflektieren.According to the invention are the emission filters are designed so that they have a defined part transmit the light radiation and reflect the rest almost completely.
Zu diesem Zweck sind sie in einem Winkel ungleich 90 Grad im Strahlengang angeordnet, der einen Einfallswinkel auf dem Filter von ungleich null Grad realisiertTo For this purpose, they are at an angle not equal to 90 degrees in the beam path arranged, which has an angle of incidence on the filter of unequal zero degrees realized
Es erfolgt also eine Gestaltung der Emissionsfilter so, dass reflektiertes Spektrum noch genutzt werden kann:
- – Reflektion des noch gewünschten Restspektrums
- – Nicht gewünschtes Restspektrum kann absorbiert werden
- – Einfallswinkel abweichend von 0°, aber noch klein (typischerweise 10°, auf jeden Fall deutlich kleiner 45°)
- – kleiner Einfallswinkel garantiert nahezu gleiche Eigenschaften für s- und p-polarisiertes Licht sowie hocheffiziente Unterdrückung der nicht gewünschten Spektralbereiche in Transmission.
- - Reflection of the desired residual spectrum
- - Unnecessary residual spectrum can be absorbed
- - Incidence angle deviating from 0 °, but still small (typically 10 °, in any case significantly less than 45 °)
- - Small angle of incidence guarantees almost the same properties for s- and p-polarized light as well as highly efficient suppression of unwanted spectral regions in transmission.
In einem weiteren Schritt erfolgt ein Nachschalten eines zweiten vorzugsweise schaltbaren Emissionsfilters vor dem Detektor mit folgenden Vorteilen:
- – Erhöhung der Flexibilität, mit dem Filter kann Spektralbereich weiter eingeschränkt werden
- – Zur einseitigen Einengung des Spektrums reicht ein zusätzlicher Kurz- bzw. Langpaß, das ergibt zusammen mit dem vorgeschalteten Filter ein Bandpaß und ist kostengünstiger als zwei schaltbare Bandpässe
- – Das reflektiertes Licht vom nachgeschalteten Filter kann ebenfalls genutzt werden.
- - Increased flexibility, with the filter spectral range can be further restricted
- - For one-sided narrowing of the spectrum an additional short or long pass, which together with the upstream filter bandpass and is less expensive than two switchable bandpasses
- - The reflected light from the downstream filter can also be used.
Der ungenutzte Teil des Spektrums kann auch in eine Strahlfalle S geleitet werden. Eine Detektion des Lichts mit einem weiteren Detektor z.B. für Kontrollzwecke ist ebenfalls denkbar.Of the Unused portion of the spectrum may also be directed into a beam trap S become. Detection of the light with another detector e.g. for control purposes is also possible.
Beispielhaft wurden hier immer Anordnungen mit 3 Kanälen gezeigt, es können aber auch nur zwei oder beliebig viele Kanäle sein.exemplary Here, arrangements with 3 channels have always been shown, but they can be just two or any number of channels.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8181 | Inventor (new situation) |
Inventor name: STEINERT, JOERG, 07743 JENA, DE Inventor name: HUHSE, DIETER, DR., 12167 BERLIN, DE Inventor name: BATHE, WOLFGANG, 07743 JENA, DE Inventor name: WOLLESCHENSKY, RALF, 07743 JENA, DE |
|
R081 | Change of applicant/patentee |
Owner name: CARL ZEISS MICROSCOPY GMBH, DE Free format text: FORMER OWNER: CARL ZEISS MICROIMAGING GMBH, 07745 JENA, DE Effective date: 20130204 |
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Effective date: 20130905 |
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