DE102005048187A1 - Mechanism for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures, comprises filter mechanism, fluorescent marker, fluorescence photometer, level measurer, pump, impedance spectrometer and computer system - Google Patents

Mechanism for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures, comprises filter mechanism, fluorescent marker, fluorescence photometer, level measurer, pump, impedance spectrometer and computer system Download PDF

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Abstract

The mechanism for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures, comprises transwell filter mechanism (2), fluorescent marker, fluorescence photometer (3), level measurer (4), pump (5), impedance spectrometer (7) and computer system (9). The filter mechanism comprises the cell culture for the analysis of transcytosis processes in the cell culture by means of a measurement of the input concentration and of the input volume of the marker in a liquid column that loads the cell culture with hydrostatic pressure. The mechanism for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures, comprises transwell filter mechanism (2), fluorescent marker, fluorescence photometer (3), level measurer (4), pump (5), impedance spectrometer (7) and computer system (9). The filter mechanism comprises the cell culture for the analysis of transcytosis processes in the cell culture by means of a measurement of the input concentration and of the input volume of the marker in a liquid column that loads the cell culture with hydrostatic pressure. The fluorescence photometer is used for the determination of a respective initial concentration of the cell culture of the marker diffusing through the cell culture. A pressure sensor is used for the regulation of the liquid column. The level measurer with another pressure sensor is used for the measurement of a liquid quantity diffusing through the cell culture. The pump is used for the maintenance of an open loop liquid cycle (6), which stands in connection with the filter mechanism. The impedance spectrometer is used for the measurement of the electrical transendothelial resistance of the cell culture. The computer system is used for the control and evaluation of the measurement, and for the display of the permeabilities as functions of the quantities such as input concentration, initial concentration, input volume of the liquid, output volume of the liquid by means of a program-oriented mass balance. The filter mechanism exhibits upper and lower compartments between a downwardly-porous, small-volumed chamber with a filter insert. The cell culture is present in the form of a layer of inter-connected cells. The chamber to the liquid column is arranged with a ring electrode assigned to the upper compartment and to an electrode plate turned away from the liquid column, and is assigned to the lower compartment for the measurement of the transendothelial resistance with the help of the impedance spectrometer. The chamber is applicable in the upper compartment and is connected to the lower compartment over the open loop liquid cycle. The upper compartment possesses a supply line in the area of the liquid column for the controlled metering of the marker, which mixed with water rests on the cell culture. The pressure sensor, which constantly examines the liquid column height- and signal-wise, is connected with the computer system over a line. The fluorescence photometer exhibits detection unit comprising a power supply unit, to which a light source of light is attached. Lens is arranged after an excitation filter, which together form an excitation arrangement. A flow cuvette is arranged on a holding device with a supply and a discharge. An evaluation mechanism is integrated in the computer system. The liquid with the intended marker is present in the flow cuvette. The fluorescence photometer is equipped with supply- and signal reception leads or the connection of the light source and for the connection of the evaluation mechanism. The fluorescence photometer is provided with detection units and the holding device is used for flow cuvettes in centrally symmetrical arrangement, where the holding device possesses a base for holding the flow cuvettes and associated partitions. A rotatable holder is connected with a computer-controlled drive system capable of switching the direction of rotation. A measuring sector is formed by partitions and a flow cuvette present between them. The fluorescence photometer is connected with the holding device for the flow cuvettes. The flow cuvettes are stationarily fixed and are aligned next to one another in a row and the fluorescence photometer is movably arranged relatively linear and parallel to the row arrangement of the flow cuvettes. The detector is connected to the evaluation mechanism over a lead and to a semipermeable mirror, which is present between the excitation filter and the lens. In the fluorescence photometer, screens are inserted into the paths of rays. Skew angles are optimally adjusted the flow cuvettes that are black dyed for the substantial decrease of the scattered light and/or, for improvement of the wavelength-dependent fluorescence signal/noise-ratio. The flow cuvettes are made from quartz glass, with which a high signal/noise-ratio is attainable. A volume measuring capillary with another liquid column, is assigned to the level measurer and is connected with a valve-operatable discharge. A discharge volume is transferred as a measured variable to the computer system. The volume measuring capillary serves for the quantification of the liquid volume takes place through the pressure sensor, which is coupled with the volume measuring capillary. The impedance spectrometer is attached to the transwell filter arrangement over electrical junction wires. The computer system is electrically connected over lines with the impedance spectrometer, the fluorescence photometer, the level measurer, and the pressure sensor and with the pump. The computer system represents a self-regulation/control unit or is integrated as the primary component in a unit. The pump is designed as a multi-channel roller pump for multiple measuring chambers, where each measuring chamber is assigned to one of the closed loop liquid cycles and the impedance spectrometer and the computer system are singly present. The fluorescent marker is a fluorescein isothiocyanate albumin or tetramethylrhodamine dextran, where the marker to be supplied differ from one another in their molecular weight or quality. An independent claim is included for a method for determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures.

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen.The The invention relates to a device and a method for determining of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures.

Das Gesamtphänomen des Durchtritts von Substanzen durch flächenmäßig zusammenhängende Zellen hindurch wird durch Permeabilitäten definiert. Prinzipiell können zwei Formen von Permeabilitätsänderungen unterschieden werden. Einmal der transzelluläre Transport von Substanzen oder Wasser durch eine Zelle hindurch mit Hilfe einer zellulären Maschinerie oder der parazelluläre Tranport zwischen angrenzenden Zellen hindurch.The total phenomenon the passage of substances through coalesced cells passing through permeabilities Are defined. In principle, you can two forms of permeability changes be differentiated. Once the transcellular transport of substances or water through a cell with the help of a cellular machinery or the paracellular Tranport between adjacent cells.

Endothelzellen bilden als Grenzschicht zwischen intra- und extravasalem Raum eine semipermeable Barriere, die zudem unterschiedlichen physikalischen Einflüssen – Schubspannung, Blutdruck, Dehnung – ausgesetzt ist und sowohl den Austausch von im Blut gelösten Substanzen als auch die Passage korpuskulärer Elemente (Zellen) kontrolliert. Diese prinzipiellen Verhältnisse treffen ebenso für andere Grenzflächen bildende Zellschichten, zu denen z.B. Epithelien der Lunge, des Magens, des Darms, der Niere und Mesothelien von Hohlräumen und Lymphendothelien gehören, zu.endothelial form a boundary layer between intra- and extravasal space semipermeable barrier, which also has different physical Influences - shear stress, Blood pressure, stretching - exposed is and both the exchange of substances dissolved in the blood as well as the Passage corpuscular Controls elements (cells). These basic conditions meet as well other interfaces forming cell layers, e.g. Epithelia of the lungs, of the Stomach, intestine, kidney, and mesothelia of cavities and lymph endothelia belong, to.

Als Grenzflächen können Epithelzellen und Endothelzellen Ziel unterschiedlicher Stimuli werden, die auf verschiedenen Signalwegen unterschiedlichen Wegen zu einer Permeabilitäts-Zunahme führen. Solche Störungen kommen im Rahmen zahlreicher Erkrankungen vor, wie z.B. bei akuten und chronischen Entzündungsaktionen, Autoimmunerkrankungen u.a. Die Aufklärung der Mechanismen ist von generellem Interesse um die Pathogenese und gegebenenfalls als Basis zur Konzeptionierung therapeutischer Ansätze zu verstehen.When interfaces can Epithelial cells and endothelial cells target different stimuli be different ways on different signaling paths lead to a permeability increase. Such disorders occur in many diseases, such as in acute and chronic inflammatory actions, Autoimmune diseases u.a. The explanation of the mechanisms is general Interest in the pathogenesis and possibly as a basis for conception therapeutic approaches to understand.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen (engl. paracellular-transcellular permeability analyses system) anzugeben, die derart geeignet ausgebildet sind, dass die transzelluläre (transzytotische) Permeabilität und die parazelluläre Permeabilität von Zellen mittels Marker (engl. tracer) schnell, präzise und kostengünstig ermittelt werden können. Es soll insbesondere auch ein Nachweis von geringen Konzentrationen der Marker bei einer Markierungsrate von 1% gewährleistet werden.Of the Invention is based on the object, a device and a method for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures (paracellular-transcellular permeability analysis system), which are designed so suitable that the transcellular (transcytotic) permeability and the paracellular permeability of cells using markers (English tracer) quickly, accurately and inexpensively determined can be. In particular, it should also be a proof of low concentrations the markers are guaranteed at a labeling rate of 1%.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentanspruchs 1 und 22 gelöst.The The object is solved by the features of patent claims 1 and 22.

Der Einrichtung zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen, insbesondere zur Messung von Permeabilitätsparametern von Zellkulturen gemäß Patentanspruch 1 sind folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes zugeordnet:

  • – mindestens eine Filtereinrichtung, wobei vorher auf einer Filtermembran die zu untersuchenden Zellen kultiviert und als eine rasenartige Zellkultur in eine Filtereinrichtung zur Analyse von Tranzytoprozessen eingesetzt werden. Dadurch entstehen zwei Kompartimente, ein oberes und ein unteres Kompartiment, in der Filtereinrichtung. Der Zellrasen wird mit einem hydrostatischen Druck beansprucht, der über eine Flüssigkeitssäule aufgebaut wird. Die Flüssigkeit enthält mindestens einen fluoreszierenden Marker mit einer Eingangskonzentration KE und einem Eingangsvolumen VE. Mit Hilfe eines ersten Drucksensors wird die Konstanthaltung der Flüssigkeitssäule über ein Regelsystem durchgeführt.
  • – mindestens ein Fluoreszenzphotometer zur Erfassung mindestens eines durch die Zellkultur hindurch tretenden fluoreszierenden Markers,
  • – mindestens ein Füllstandsmesser mit einem zweiten Drucksensor zur Messung der durch den Zellrasen hindurch getretenen Volumenmenge VA,
  • – mindestens eine Pumpe zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes, die mit der Filtereinrichtung in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung, das Fluoreszenzphotometer, der Füllstandsmesser und die Pumpe sich im Flüssigkeitskreislauf befinden sowie
  • – ein Impedanzspektrometer zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur und
  • – ein Computersystem zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige verschiedener Parameter, aus denen die parazellulären Permeabilitäten Pp und die transzellulären Permeabilitäten Pt als Funktionen der Größen KE, KA, TER, VE, VA berechnet werden können.
The device for determining paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures, in particular for measuring permeability parameters of cell cultures according to claim 1, the following apparative device components are assigned within an open fluid circuit:
  • - At least one filter device, wherein previously cultivated on a filter membrane, the cells to be examined and used as a lawn-like cell culture in a filter device for the analysis of Tranzytoprozessen. This results in two compartments, an upper and a lower compartment, in the filter device. The cell lawn is subjected to a hydrostatic pressure, which is built up via a liquid column. The liquid contains at least one fluorescent marker with an input concentration K E and an input volume V E. With the help of a first pressure sensor, the constant maintenance of the liquid column is carried out via a control system.
  • At least one fluorescence photometer for detecting at least one fluorescent marker passing through the cell culture,
  • At least one level gauge with a second pressure sensor for measuring the amount of volume V A passed through the cell lawn,
  • - At least one pump for maintaining the liquid circuit, which is in communication with the filter device, wherein the filter device, the fluorescence photometer, the level gauge and the pump are in the liquid circuit and
  • An impedance spectrometer for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture and
  • A computer system for measuring control and evaluation and for displaying various parameters from which the paracellular permeabilities P p and the transcellular permeabilities P t can be calculated as functions of the quantities K E , K A , TER, V E , V A.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von parazellulären Permeabilitäten Pp und transzellulären Permeabilitäten Pt von Zellkulturen gemäß Patentanspruch 22 mittels der vorgenannten Einrichtung ist durch folgende Schritte gekennzeichnet,

  • – Vorgabe des Eingangsvolumens VE und der Eingangskonzentration KE in einer Filtereinrichtung,
  • – Konstanthaltung des Eingangsvolumens VE und eines Eingangsdrucks mittels eines Füllstandsmessers,
  • – Messen des transendothelialen elektrischen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers,
  • – Messung von durch den Zellrasen hindurchtretenden Substanzen (einer Ausgangskonzentration KA) mittels eines Fluoreszenzphotometers,
  • – Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems,
  • – Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER VE, VA)
  • – Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform,
  • – Vergleich der Permeabilitäts-Kurven und
  • – Anwendung eines Massenbilanzierungsprogrammes.
The method according to the invention for the determination of paracellular permeabilities P p and transcellular permeabilities P t of cell cultures according to claim 22 by means of the aforementioned device is characterized by the following steps,
  • - Specification of the input volume V E and the input concentration K E in a filter device,
  • Keeping constant the input volume V E and an inlet pressure by means of a level gauge,
  • Measuring the transendothelial electrical resistance TER by means of an impedance spectrometer,
  • - Measurement of passing through the cell lawn substances (a Ausgangskonzentrati on K A ) by means of a fluorescence photometer,
  • Storing the measured quantities K E , K A , TER, V E , V A in the memory of the computer system,
  • Calculation of the permeabilities P p , P t as functions of the measured values of the quantities K E , K A , TER, V E , V A with P p , P t = f (K E , K A , TER V E , V A )
  • Representation of the permeabilities P p , P t in the form of a curve,
  • - Comparison of the permeability curves and
  • - Application of a mass balance program.

Dabei werden im Wesentlichen zeitgleiche Mehrfachmessungen an die Marker enthaltenden Flüssigkeiten sowohl bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen als auch in mehreren Durchflussküvetten, durch die Flüssigkeiten mit der zu messenden Konzentration der Marker fließen, durchgeführt und dabei störendes Streulicht minimiert.there are essentially simultaneous multiple measurements to the markers containing liquids both at several different wavelengths as well as in several flow cells, through the liquids with the concentration of markers to be measured, conducted and thereby disturbing Stray light minimized.

Mit der Einrichtung wird Messzeit eingespart, die Genauigkeit der Bestimmung der Permeabilitäten erhöht und die Parameter können quantitativ miteinander verglichen werden.With the device saves measurement time, the accuracy of the determination the permeabilities increased and the Parameters can quantitatively compared.

Weiterbildungen und weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in weiteren Unteransprüchen angegeben.further developments and further embodiments of the invention are specified in further subclaims.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen mittels mehrerer Zeichnungen näher erläutert.The Invention is based on embodiments closer by means of several drawings explained.

Es zeigen:It demonstrate:

1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Einrichtung zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität und der transzellulären Permeabilität einer Zellkultur über die zeitgleiche Messung verschiedener Parameter, 1 a schematic representation of a device according to the invention for determining the paracellular permeability and the transcellular permeability of a cell culture via the simultaneous measurement of various parameters,

2 eine schematische Darstellung einer Zellkultur und von zugehörigen Diffusions-Vorgängen, 2 a schematic representation of a cell culture and associated diffusion processes,

3 ein Fluoreszenzphotometer als Detektionseinheit in einer perspektivischen Darstellung mit einer Durchflussküvette sowie einer Anregungsanordnung und einer Detektionsanordnung, 3 a fluorescence photometer as a detection unit in a perspective view with a flow cell and an excitation arrangement and a detection arrangement,

4 ein Fluoreszenzphotometer in einer perspektivischen Darstellung mit einer Drehhalterungseinrichtung für mehrere Detektionseinheiten in zentralsymmetrischer Anordnung, 4 a fluorescence photometer in a perspective view with a rotary support device for a plurality of detection units in a centrally symmetrical arrangement,

5 ein Fluoreszenzphotometer in einer schematischen Darstellung mit einer Verschiebehalterungseinrichtung und mehreren stationären Durchflussküvetten für eine Detektionseinheit, 5 a fluorescence photometer in a schematic representation with a displacement holding device and a plurality of stationary flow cells for a detection unit,

6 eine Darstellung einer Transmissions-Wellenlängen-Kurve von Anregungsfilter und Detektionsfilter für eine Probe FITC-Dextran als Marker, 6 a representation of a transmission-wavelength curve of excitation filter and detection filter for a sample FITC-dextran as a marker,

7 eine Darstellung einer Fluoreszenzintensität(Detektorstromsignal)-Zeit-Kurve mit Eichkurve in Abhängigkeit von Konzentrationen des FITC-Dextrans, und 7 a representation of a fluorescence intensity (detector current signal) -time curve with calibration curve as a function of concentrations of FITC-dextran, and

8 eine Darstellung eines Diagramms der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran. 8th a representation of a diagram of the relative fluorescence to the concentration of FITC-dextran.

In 1 ist eine erfindungsgemäße Einrichtung 1 zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität und der transzellulären Permeabilität einer rasenartigen Zellkultur 16 mit mindestens einem Marker 23 dargestellt, der folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes 6 mit einer Flüssigkeit 25 zugeordnet sind:

  • – mindestens eine der Zellkultur 16 enthaltende Filtereinrichtung 2 zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur 16 mittels jeweils einer Eingangskonzentration KE und eines Eingangsvolumens VE mindestens eines fluoreszierenden, der Flüssigkeit 25 beigefügten Markers 23 in einer, die Zellkultur 16 mit einem hydrostatischen Druck belastenden Flüssigkeitssäule 17 sowie mit einem ersten Drucksensor 27 zur Regelung der Höhe der Flüssigkeitssäule 17,
  • – ein Fluoreszenzphotometer 3 zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration KA des durch die Zellkultur 16 diffundierenden Markers 23,
  • – mindestens ein Füllstandsmesser 4 mit einem zweiten Drucksensor 26 zur Regelung der Höhe einer zweiten Flüssigkeitssäule 31 und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens VA der Flüssigkeit 25 mit dem darin befindlichen Marker 23,
  • – eine Pumpe 5 zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes 6, die mit der Filtereinrichtung 2 in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung 2, das Fluoreszenzphotometer 3, der Füllstandsmesser 4 und die Pumpe 5 sich im Flüssigkeitskreislauf 6 befinden, sowie
  • – ein Impedanzspektrometer 7 zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur 16 und
  • – ein Computersystem 9 mit programmtechnischen Mitteln zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen von KE, KA, TER, VE, VA.
In 1 is a device according to the invention 1 for determining paracellular permeability and transcellular permeability of a lawn-like cell culture 16 with at least one marker 23 shown, the following apparatus components within an open fluid circuit 6 with a liquid 25 assigned:
  • - at least one of the cell culture 16 containing filter device 2 for the analysis of transcytosis processes in cell culture 16 in each case by means of an input concentration K E and an input volume V E of at least one fluorescent, the liquid 25 attached marker 23 in one, the cell culture 16 with a hydrostatic pressure-polluting liquid column 17 as well as with a first pressure sensor 27 for regulating the height of the liquid column 17 .
  • - a fluorescence photometer 3 for detecting a respective initial concentration K A of the cell culture 16 diffusing marker 23 .
  • - At least one level gauge 4 with a second pressure sensor 26 for regulating the height of a second liquid column 31 and for determining an initial volume V A of the liquid 25 with the marker in it 23 .
  • - a pump 5 to maintain the fluid circuit 6 that with the filter device 2 communicates with the filter device 2 , the fluorescence photometer 3 , the level gauge 4 and the pump 5 in the fluid circuit 6 are located as well
  • - An impedance spectrometer 7 for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture 16 and
  • - a computer system 9 with program-technical means for measuring control and evaluation and for displaying the permeabilities P p , P t as functions of K E , K A , TER, V E , V A.

Das Impedanzspektrometer 7 ist an die Filtereinrichtung 2 über elektrische Verbindungsleitungen 8, 32 angeschlossen, wobei die Filtereinrichtung 2 eine Transwellfiltereinrichtung darstellen kann.The impedance spectrometer 7 is to the filter device 2 via electrical connection lines 8th . 32 connected, the filter device 2 can represent a Transwellfiltereinrichtung.

Das Computersystem 9 steht über erste Leitungen 10 mit dem Impedanzspektrometer 7, über zweite Leitungen 11 mit dem Flu oreszenzphotometer 3, über dritte Leitungen 12 mit dem Füllstandsmesser 4 einschließlich des zweiten Drucksensors 26 und über vierte Zeitungen 13 mit der Pumpe 5 in elektrischer und signaltechnischer Verbindung, wobei die Pumpe 5 eine Rollerpumpe darstellen kann.The computer system 9 stands over first lines 10 with the impedance spectrometer 7 , over second lines 11 with the fluorescence photometer 3 , via third lines 12 with the level gauge 4 including the second pressure sensor 26 and about fourth newspapers 13 with the pump 5 in electrical and signaling connection, the pump 5 can represent a roller pump.

Das Computersystem 9 kann derart ausgebildet sein, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist.The computer system 9 can be designed such that it itself represents a control / regulating device or is integrated into such a main component.

Die Transwellfiltereinrichtung 2 weist im Wesentlichen ein oberes Kompartiment 20 und ein unteres Kompartiment 21 auf, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten 20, 21 eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer 14 mit einem darin einsetzbaren Filterinsert 15 befindet, in dem die Zellkultur 16 in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist.The transwell filter device 2 essentially has an upper compartment 20 and a lower compartment 21 on, being between the two compartments 20 . 21 a downwardly porous small-volume chamber 14 with a filter insert usable therein 15 in which the cell culture 16 is present in the form of a layer of contiguous cells.

In 2 ist in einer schematischen Darstellung die auf dem Filterinsert 15 aufgebrachte Zellkultur 16 – Zellrasen – perspektivisch vergrößert gezeigt, wobei die parazellulären Diffusions-Vorgänge 29 und die transzellulären (tranzytotischen) Diffusions-Vorgänge 30 durch Pfeile richtungsbezogen angegeben sind.In 2 is a schematic representation of the on the filter insert 15 applied cell culture 16 - Cellular lawn - shown enlarged in perspective, with the paracellular diffusion processes 29 and the transcellular (trancytotic) diffusion processes 30 are indicated by arrows directional.

In der nach oben freien Kammer 14 lastet auf der Zellkultur 16, wie in 1 gezeigt ist, die erste Flüssigkeitssäule 17 von vorzugsweise exakt 10 cm, wobei als Flüssigkeit 25 Kulturmedium eingebracht ist. Die Kammer 14 steht zur ersten Flüssigkeitssäule 17 gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment 20 zugeordneten Ringelektrode 18 sowie von der ersten Flüssigkeitssäule 17 abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment 21 zugeordneten Elektrodenplatte 19 zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER in Verbin dung, der mit Hilfe des Impedanzspektrometers 7 ermittelt wird. Die Ringelektrode 18 ist über eine erste Verbindungsleittang 8 an das Impedanzspektrometer 7 angeschlossen. Die Elektrodenplatte 19 steht über eine zweite Verbindungsleitung 32 mit dem Impedanzspektrometer 7 in Verbindung.In the upstairs free chamber 14 weighs on the cell culture 16 , as in 1 is shown, the first liquid column 17 of preferably exactly 10 cm, being used as a liquid 25 Culture medium is introduced. The chamber 14 stands to the first liquid column 17 directed with one of the upper compartment 20 associated ring electrode 18 as well as from the first liquid column 17 averted with a lower compartment 21 associated electrode plate 19 for measuring the electrical transendothelial resistance TER in conjunction with the impedance spectrometer 7 is determined. The ring electrode 18 is via a first link 8th to the impedance spectrometer 7 connected. The electrode plate 19 is via a second connection line 32 with the impedance spectrometer 7 in connection.

Die Kammer 14 ist in das obere Kompartiment 20 einsetzbar und steht über das untere Kompartiment 21 mit dem Flüssigkeitskreislauf 6 in Verbindung. Das von den Elektroden 18, 19 aufgebaute elektrische Feld greift durch den porösen Teil der Kammer 14 und den zugehörigen Bereich des Flüssigkeitskreislaufs 6 hindurch. Die Flüssigkeit wird zwischen dem Filterinsert 15 und der Elektrodenplatte 19 quer zur Flüssigkeitssäule 17 mittels der Pumpe 5 bewegt.The chamber 14 is in the upper compartment 20 can be used and is above the lower compartment 21 with the fluid circuit 6 in connection. That of the electrodes 18 . 19 built-up electric field reaches through the porous part of the chamber 14 and the associated area of the fluid circuit 6 therethrough. The liquid is inserted between the filter insert 15 and the electrode plate 19 transverse to the liquid column 17 by means of the pump 5 emotional.

Das obere Kompartiment 20 besitzt im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule 17 mindestens eine Zuführungsleitung 22 zur gesteuerten Zugabe des mit der Flüssigkeit 25 gemischten Markers 23 aus einem Vorratsbehälter heraus, wobei die Flüssigkeit 25 der Flüssigkeitssäule 17 über die Zellkultur 16 und das Filterinsert 15 der Flüssigkeit 25 des Kreislaufs 6 zuführbar ist. Die Flüssigkeit 25 kann vorzugsweise Wasser sein.The upper compartment 20 owns in the area of the first liquid column 17 at least one supply line 22 for the controlled addition of the liquid 25 mixed marker 23 from a reservoir, the liquid 25 the liquid column 17 about the cell culture 16 and the filter insert 15 the liquid 25 of the cycle 6 can be fed. The liquid 25 may preferably be water.

Der ersten Flüssigkeitssäule 17 ist im Bereich zur Kammer 14 der erste Drucksensor 27 zugeordnet, der über eine fünfte Leitung 28 mit dem Computersystem 9 in Verbindung steht und mit dem die erste Flüssigkeitssäule 17 ständig höhenmäßig signaltechnisch überprüft wird.The first liquid column 17 is in the area to the chamber 14 the first pressure sensor 27 assigned to a fifth line 28 with the computer system 9 communicates and with which the first liquid column 17 is always checked in terms of signal level.

In 3 ist ein miniaturisiertes Fluoreszenzphotometer 3 zur Erfassung der Konzentration KA des durch die dimensionierungsminimierte Zellenkultur 16 hindurchgelangten fluoreszierenden Marker 23 gezeigt.In 3 is a miniaturized fluorescence photometer 3 for detecting the concentration K A of the dimensioning-minimized cell culture 16 passed through fluorescent markers 23 shown.

Dafür ist in der 3 das Fluoreszenzphotometer 3 in einer einfachen schematischen Form mit einer Durchflussküvette 34 auf einer Haltevorrichtung 35 gezeigt.That is in the 3 the fluorescence photometer 3 in a simple schematic form with a flow cell 34 on a holding device 35 shown.

Das Fluoreszenzphotometer 3 kann als Detektionseinheit im Wesentlichen folgende Bauelemente/Baugruppen aufweisen:

  • – eine Energieversorgungseinheit 36, an die
  • – eine Lichtquelle 37, z.B. eine Leucht- oder Laserdiode angeschlossen ist,
  • – eine erste Optik 38, der
  • – ein Anregungsfilter 39 nachgeordnet ist, die allesamt eine Anregungsanordnung 40 bilden,
  • – eine auf der Haltevorrichtung 35 angeordnete Durchflussküvette 34 mit einem Küvettenzufluss 41 und einem Küvettenabfluss 42, wobei sich in der Durchflussküvette 34 die zugeführte Flüssigkeit 25 mit mindestens einem vorgesehenen Marker 23 befindet,
  • – eine zweite Optik 44,
  • – einen Detektionsfilter 45,
  • – eine dritte Optik 46 sowie
  • – einen Detektor 47,
  • – eine Auswerteeinrichtung 48, die in das Computersystem 9 integriert ist, wobei die zweite Optik 44, das Detektionsfilter 45, die dritte Optik 46 und der Detektor 47 mit Auswerteeinerichtung 48 eine Detektoranordnung 43 bilden.
The fluorescence photometer 3 may comprise as detection unit essentially the following components / assemblies:
  • - a power supply unit 36 , to the
  • - a light source 37 , eg a light emitting diode or laser diode is connected,
  • - a first appearance 38 , of the
  • - an excitation filter 39 is subordinate, all an excitation order 40 form,
  • - one on the holding device 35 arranged flow cell 34 with a cuvette influx 41 and a cuvette drain 42 , being in the flow cell 34 the supplied liquid 25 with at least one designated marker 23 is,
  • - a second optic 44 .
  • - a detection filter 45 .
  • - a third optics 46 such as
  • - a detector 47 .
  • - An evaluation 48 that are in the computer system 9 is integrated, with the second optics 44 , the detection filter 45 , the third optics 46 and the detector 47 with evaluation device 48 a detector arrangement 43 form.

Anschlusskabel 49, 50 – als Versorgungs- und Signalempfangsleitungen – für den Anschluss der Laserdiode 37 und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung 48 vervollständigen das Flureszenzphotometer 3.connection cable 49 . 50 - as supply and signal receiving lines - for the connection of the laser diode 37 and for the connection of the evaluation device 48 complete the fluorescence photometer 3 ,

Der Küvettenzufluss 41, die Durchflussküvette 34 und der Küvettenabfluss 42 sind ein Teil des Flüssigkeitskreislaufes 6.The cuvette influx 41 , the flow cell 34 and the cuvette drain 42 are part of the fluid circuit 6 ,

Das Fluoreszenzphotometer 3 und die Haltevorrichtung 35 mit den wahlweise darauf befestigten Durchflussküvetten können relativ zueinander bewegbar angeordnet sein.The fluorescence photometer 3 and the holding device 35 with the optionally attached flow cuvettes can be arranged to be movable relative to each other.

Dem in 1 gezeigten Füllstandsmesser 4 ist eine Volumenmesskapillare 24 mit einer zweiten Flüssigkeitssäule 31 zugeordnet, wobei der Volumenmesskapillare 24 ein Abfluss 33 zugeordnet ist, der ventilmäßig betätigbar ist.The in 1 shown level gauge 4 is a volume measuring capillary 24 with a second liquid column 31 assigned, wherein the volume measuring capillary 24 a drain 33 is assigned, which is valve-actuated.

Die Volumenmesskapillare 24 dient der Quantifizierung des durch die Zellkultur 16 hindurchtretenden Flüssigkeitsvolumens VA. Die Volumenquantifizierung von VA erfolgt über den zweiten Drucksensor 26, der mit der Volumenmesskapillare 24 gekoppelt ist. Das abfließende Volumen VA wird als Messgröße über die Leitung 12 an das Computersystem 9 übermittelt.The volume measuring capillary 24 serves the quantification of the through the cell culture 16 passing through the liquid volume V A. The volume quantification of V A is done via the second pressure sensor 26 that with the volume measuring capillary 24 is coupled. The effluent volume V A is measured over the line 12 to the computer system 9 transmitted.

Vorzugsweise können Mehrfachvorgänge in mehreren parallel angeordneten und aufeinander abgestimmten Flüssigkeitskreisläufen durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden. Z.B. können

  • – die Transwellfiltereinrichtung 2 mehrfach, vorzugsweise sechsfach,
  • – das Fluoreszenzphotometer 3 für mehrfache, vorzugsweise sechs Detektionseinheiten,
  • – der Füllstandsmesser 4 mehrfach, insbesondere sechsfach und
  • – die Pumpe 5 in Form einer Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache, vorzugsweise sechs Flüssigkeitskreislauf-Kanäle
ausgebildet sein,
während das Impedanzspektrometer 7 und das Computersystem 9 aus Gründen des vorhandenen Empfangs über mehrere signalelektrische Ein- und Ausgangs-Kanäle in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.Preferably, multiple operations may be performed in a plurality of parallel and matched liquid circuits by a corresponding number of the apparatus components. For example, you can
  • - The transwell filter device 2 several times, preferably six times,
  • - the fluorescence photometer 3 for multiple, preferably six detection units,
  • - the level gauge 4 multiple, especially sixfold and
  • - the pump 5 in the form of a multi-channel roller pump for multiple, preferably six fluid circulation channels
be educated
while the impedance spectrometer 7 and the computer system 9 for reasons of the existing reception via a plurality of signal-electrical input and output channels are provided in a simple design.

In der 4 ist ein zweites Fluoreszenzphotometer 51 in einer perspektivischen Darstellung mit einer Haltevorrichtung 351 für mehrere Durchflussküvetten 341, 342, 343, 344 (vier von sechs möglichen) in zentralsymmetrischer Anordnung gezeigt, wobei zur Haltevorrichtung 351 ein Boden 52 zur Halterung der Durchflussküvetten 341, 342, 343, 344 sowie zugehörige Trennwände 531, 532, 533, 534, 535, 536 gehören. Die drei Detektionseinheiten 56, 57, 58, jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung 401, 402, 403 und einer Detektionsanordnung 931, 432, 433, sind einer schematisch dargestellten Drehhalterungseinrichtung 54 zugeordnet, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem (nicht eingezeichnet) verbunden ist, das vom Computersystem 9 aus gesteuert werden kann. Die Haltevorrichtung 351 ist z.B. um die Drehhalterungseinrichtung 54 drehbar gelagert angeordnet.In the 4 is a second fluorescence photometer 51 in a perspective view with a holding device 351 for several flow cells 341 . 342 . 343 . 344 (four out of six possible) shown in a centrally symmetrical arrangement, wherein the holding device 351 a floor 52 for holding the flow cells 341 . 342 . 343 . 344 and associated partitions 531 . 532 . 533 . 534 . 535 . 536 belong. The three detection units 56 . 57 . 58 each consisting of an excitation arrangement 401 . 402 . 403 and a detection arrangement 931 . 432 . 433 , are a schematically illustrated rotary support device 54 associated with a reversible drive system (not shown) connected to the computer system 9 can be controlled from. The holding device 351 is, for example, the rotary support device 54 arranged rotatably mounted.

Mittels der Trennwände 531, 532; 532, 533; 533, 534; 534, 535; 535, 536; 536, 531 und der jeweils dazwischen befindlichen Durchflüssküvette 341, 342, 343, 344 usw. entsteht jeweils ein Messsektor 55, wobei in 4 sechs Messsektoren 55 einem Winkel von 60° zugeordnet und drei Detektionseinheiten 56, 57, 58 vorgesehen sind.By means of partitions 531 . 532 ; 532 . 533 ; 533 . 534 ; 534 . 535 ; 535 . 536 ; 536 . 531 and the each in between Durchflüssküvette 341 . 342 . 343 . 344 etc., a measuring sector is created in each case 55 , where in 4 six measuring sectors 55 associated with an angle of 60 ° and three detection units 56 . 57 . 58 are provided.

Das Fluoreszenzphotometer 3 kann auch, wie in 5 gezeigt ist, mit einer Halterungsvorrichtung 352 für die Durchflussküvetten 341, 342, 343 angeordnet sein, wobei die Durchflussküvetten 341, 342, 343 ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sein können. Das Fluoreszenzphotometer 3 kann dabei linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durchflussküvetten 341, 342, 343 verschiebbar angeordnet und die Halterungsvorrichtung 352 fest platziert sein. Auf einem in Pfeilrichtung 61 bewegbaren Verschiebetisch 62 ist die Anregungsanordnung und die Detektionsanordnung fest platziert. In einem vorgegebenen Strahlengang 63 befinden sich die La serdiode 37, die erste Optik 38, der Anregungsfilter 39, die zweite Optik 44, der Detektionsfilter 45, die dritte Optik 46 und der Detektor 47, der über das Anschlusskabel 50 mit der Auswerteeinrichtung 48 verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel 64, der sich zwischen dem Anregungsfilter 39 und der zweiten Optik 46 befindet, und die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette 342 zur dritten Optik 46 und dem Detektor 47 gerichtet umlenkt.The fluorescence photometer 3 can also, as in 5 is shown with a mounting device 352 for the flow cells 341 . 342 . 343 be arranged, the flow cuvettes 341 . 342 . 343 held stationary and can be aligned in series next to each other. The fluorescence photometer 3 can be linear and parallel to the series arrangement of the flow cells 341 . 342 . 343 slidably disposed and the mounting device 352 be firmly placed. On one in the direction of the arrow 61 movable translation table 62 the excitation arrangement and the detection arrangement is firmly placed. In a given beam path 63 are the La serdiode 37 , the first look 38 , the excitation filter 39 , the second optics 44 , the detection filter 45 , the third optics 46 and the detector 47 that's over the connection cable 50 with the evaluation device 48 connected, as well as a semipermeable mirror 64 that is between the excitation filter 39 and the second optics 46 and the retroreflective fluorescence to be detected in the flow cell 342 to the third optics 46 and the detector 47 directed deflected.

Zusätzlich können in beiden Fluoreszenzphotometern 3 und 51 Blenden in die Strahlengänge eingefügt, die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses eingesetzt sein.In addition, in both fluorescence photometers 3 and 51 Blends inserted into the beam paths, the deflection angle optimally adjusted and flow cuvettes black colored used to substantially reduce the scattered light or to improve the wavelength-dependent fluorescence signal / noise ratio.

Als zweckmäßig erweisen sich Küvetten aus Quarzglas, mit denen das Signal-Rausch-Verhältnis wesentlich gesteigert werden kann.When prove expedient cuvettes made of quartz glass, which significantly increases the signal-to-noise ratio can be.

Auf dem Verschiebetisch 62 können auch mehrere parallel zueinander angebrachte Detektionseinheiten angebracht sein.On the translation table 62 it is also possible to attach a plurality of detection units mounted parallel to one another.

Die Fluoreszenzsignale bezogen auf den jeweiligen Marker 23 in der Flüssigkeit 25 werden folgendermaßen dargestellt:
In 6 ist eine Darstellung der Transmissions-Wellenlängen-Kurve des Anregungsfilters 39 und des Detektionsfilters 45 aus 3 oder 5 für eine Probe des Markers FITC-Dextran 23 bei einer Küvettenlänge von 10 mm und einer Konzentration von 100 μg/ml (rechte Größenachse) gezeigt. Dabei sind die Transmissionen des Anregungsfilters 39 und des Detektionsfilters 45 angegeben. Für eine Strahlung unter größerem Einfallswinkel als 90° verschiebt sich die Transmission des Detektionsfilters 45 zu kürzeren Wellenlängen, so dass dann auch Anregungslicht das Detektionsfilter 45 passieren kann. Das FITC-Fluoreszenzspektrum wird aus dem Absorptions spektrum durch Spiegelung mit dem bekannten Emissionsmaximum von 517 nm berechnet. Zum Vergleich ist das Spektrum der eingesetzten Laserdiode 37 aufgetragen. Die Anregungswellenlänge 59 liegt etwa bei 470 nm, die fluoreszierende Beobachtungswellenlänge 50 hat ihr Maximum bei etwa 520 nm.The fluorescence signals relative to the respective marker 23 in the liquid 25 are represented as follows:
In 6 is a representation of the transmission-wavelength curve of the excitation filter 39 and the detection filter 45 out 3 or 5 for one Sample of the marker FITC-dextran 23 at a cuvette length of 10 mm and a concentration of 100 μg / ml (right size axis). Here are the transmissions of the excitation filter 39 and the detection filter 45 specified. For radiation at a greater angle of incidence than 90 °, the transmission of the detection filter shifts 45 to shorter wavelengths, so that then also excitation light the detection filter 45 can happen. The FITC fluorescence spectrum is calculated from the absorption spectrum by reflection with the known emission maximum of 517 nm. For comparison, the spectrum of the laser diode used 37 applied. The excitation wavelength 59 is about 470 nm, the fluorescent observation wavelength 50 has its maximum at about 520 nm.

In 7 ist eine Darstellung der Fluoreszenzintensität-Zeit-Kurve (Eichkurve) in Form einer Detektorsignal-Zeitreihe in Abhängigkeit von der Konzentration des FITC-Dextrans gezeigt, wobei die Fluoreszenzintensität als Signal jeweils im Detektor 47 in Ampere für eine Verdünnungsreihe von FITC-Dextran gemessen wird. Die Konzentration von FITC-Dextran wird ausgehend von einer Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml zunächst um einen Faktor 1000 auf 100 μg/ml verdünnt. Danach ist eine Verdünnungsreihe erstellt, bei der die Konzentration jeweils um einen Faktor 10 bis auf 0,1 ng/ml reduziert wird.In 7 is a representation of the fluorescence intensity-time curve (calibration curve) in the form of a detector signal time series as a function of the concentration of the FITC-dextrans shown, wherein the fluorescence intensity as a signal in each case in the detector 47 in amperes for a dilution series of FITC-dextran. The concentration of FITC-dextran is first diluted by a factor of 1000 to 100 μg / ml starting from a stock solution with a concentration of 100 mg / ml. Thereafter, a dilution series is prepared in which the concentration is reduced by a factor of 10 to 0.1 ng / ml.

Auch die verwendete Zellkulturlösung – Promocell – ergibt bereits ein geringes Fluoreszenzsignal. Ab einer Konzentration von 0,41 μg/ml ist eine deutliche Zunahme der Fluoreszenzintensität zu erkennen. Nach Erreichen der höchsten Konzentration von 100 μg/ml ist die Durchflussküvette mit der Flüssigkeit 25 gespült und erneut die Fluoreszenz gemessen worden. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis kein weiterer Abfall der Detektorsignale mehr zu beobachten ist. Zwischen den einzelnen Messungen wird die Durchflussküvette 34 aus dem Strahlengang entfernt, was am Einbruch der Detektorsignale erkennbar ist.Also the cell culture solution used - Promocell - results already a low fluorescence signal. From a concentration of 0.41 μg / ml a significant increase in fluorescence intensity can be seen. After reaching the highest Concentration of 100 μg / ml is the flow cell with the liquid 25 rinsed and again the fluorescence was measured. The process is as long as repeatedly until no further drop in detector signals is observed is. Between the individual measurements, the flow cell 34 removed from the beam path, which is due to the collapse of the detector signals is recognizable.

In 8 ist ein Diagramm der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran 23 dargestellt. Die aus den der 7 zugrunde liegenden Messungen ermittelten Fluoreszenzströme sind auf das Maximum normiert und gegen die Konzentration aufgetragen. Neben dem relativen Detektorstrom ist zum Vergleich das mit dem CytoFluor II 23 für die gleichen Lösungen bestimmte Fluoreszenzsignal aufgetragen. Zum leichteren Vergleich ist das Signal auch auf das Maximum normiert. Durch Abzug des auch mit reiner Nährlösung vorhandenen Rauschsignals können auch noch Konzentrationen im Bereich von 0,01 μg/ml erkannt werden.In 8th is a plot of relative fluorescence to the concentration of FITC-dextran 23 shown. The from the 7 Underlying measurements of fluorescence currents are normalized to the maximum and plotted against the concentration. In addition to the relative detector current is compared with the CytoFluor II 23 applied fluorescence signal for the same solutions. For easier comparison, the signal is normalized to the maximum. By subtracting even with pure nutrient solution existing noise signal even concentrations in the range of 0.01 ug / ml can be detected.

Die Kombination von mehreren bei unterschiedlichen Wellenlängen arbeitenden Fluoreszenzdetektionseinheiten 56, 57, 58 im Fluoreszenzphotomer 51 ermöglicht nahezu simultane Messungen mehrerer Fluoreszenzmarker 23.The combination of multiple fluorescence detection units operating at different wavelengths 56 . 57 . 58 in the fluorescence photomer 51 enables nearly simultaneous measurements of several fluorescence markers 23 ,

In dem Verfahren zur Bestimmung von Permeabilitäten von Zellkulturen 22 werden folgende Schritte unter Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 durchgeführt:

  • – Messen des Eingangsvolumens VE und der Eingangskonzentration KE mittels der Filtereinrichtung 2,
  • – Messen des Ausgangsvolumens VA mittels des Füllstandsmessers 4,
  • – Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels des Impedanzspektrometers 7,
  • – Messung der Ausgangskonzentration KA mittels des Fluoreszenzphotometers 3 oder 51,
  • – Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems 9,
  • – Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER, VE, VA),
  • – Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform und
  • – Vergleich der Permeabilitäts-Kurven.
In the method for determining permeabilities of cell cultures 22 The following steps are performed using the device according to the invention 1 carried out:
  • - Measuring the input volume V E and the input concentration K E by means of the filter device 2 .
  • - Measuring the output volume V A by means of the level gauge 4 .
  • - Measuring the electrical transendothelial resistance TER by means of the impedance spectrometer 7 .
  • - Measurement of the initial concentration K A by means of the fluorescence photometer 3 or 51 .
  • - Saving the measured quantities K E , K A , TER, V E , V A in the memory of the computer system 9 .
  • Calculation of the permeabilities P p , P t as functions of the measured values of the quantities K E , K A , TER, V E , V A with P p , P t = f (K E , K A , TER, V E , V A )
  • - Representation of the permeabilities P p , P t in waveform and
  • - Comparison of the permeability curves.

Im Folgenden wird die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 zur Bestimmung der Permeabilitäten Pp, Pt unter Bezugnahme auf die 2 und 1 erläutert.The following is the operation of the device according to the invention 1 for determining the permeabilities P p , P t with reference to 2 and 1 explained.

Die schichtartige Zellkultur 16 wird je nach Bedarf auf Filterinserts 15 von 6,5 mm, 12 mm oder 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer 14 eingesetzt. Die Zellen der Zellkultur 16 werden somit während des Messvorgangs einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeits(Wasser)säule 17 ausgesetzt. Der Druck entspricht dem physiologischen, postkapillaren, hydrostatischen Druck in vivo und führt zu einem Abdichten der Zellkultur 16.The layered cell culture 16 will switch to filter inserts as needed 15 of 6.5 mm, 12 mm or 24 mm or other diameter and cultivated in the small-volume chamber 14 used. The cells of cell culture 16 Thus, during the measurement process, a hydrostatic pressure of 10 cm liquid (water) column 17 exposed. The pressure corresponds to the physiological, postcapillary, hydrostatic pressure in vivo and leads to a sealing of the cell culture 16 ,

Über die beiden Elektroden 18, 19 wird der elektrische transendotheliale Widerstand (TER – TransEndothelial Resistance) mit Hilfe des Impedanzspektrometers 7, das ein bekanntes Solartron 1260 – Gerät darstellen kann, gemessen. Die zwischen den Kompartimenten 20, 21 strömende Flüssigkeit 25 wird mit Hilfe der Pumpe 5 ständig in dem Flüssigkeitskreislauf b, der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen 17, 31 halboffen ist, gepumpt. In den Flüssigkeitskreislauf 6 ist das Fluoreszenzphotometer 3 eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare 24 mit der zweiten Flüssigkeitssäule 31 des Füllstandsmessers 4 angeordnet.About the two electrodes 18 . 19 is the electrical transendothelial resistance (TER - TransEndothelial Resistance) using the impedance spectrometer 7 , which can represent a well-known Solartron 1260 device, measured. The between the compartments 20 . 21 flowing liquid 25 is using the pump 5 constantly in the liquid circuit b, due to the two open liquid columns 17 . 31 semi-open, pumped. In the fluid circuit 6 is the fluorescence photometer 3 integrated and in addition the volume measuring capillary 24 with the second liquid column 31 of the level gauge 4 arranged.

Das Fluoreszenzphotometer 3, wie in den 3, 4 und 5 gezeigt ist, erfasst mindestens einen durch die Zellkultur 16 diffundierenden und durch die Durchflussküvette 34 fließenden, fluoreszierenden Marker 23, z.B. ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran, die der Zellkultur 16 über das obere Kompartiment 20 unter Messung des zugeführten Volumens VE gesteuert zugeführt werden. Die zuführbaren Marker 23 können sich im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.The fluorescence photometer 3 as in the 3 . 4 and 5 shown captures at least one by cell culture 16 diffusing and through the flow cell 34 flowing, fluorescent markers 23 , eg a FITC-albumin or a TRITC-dextran, the cell culture 16 over the upper compartment 20 be supplied controlled under measurement of the supplied volume V E. The feedable markers 23 may differ in molecular weight or in quality from each other.

Mit der die zweite Flüssigkeitssäule 31 enthaltenden Volumenmesskapillare 24 kann das durch die Zellkultur 16 diffundierte Flüssigkeitsvolumen VA mit dem Marker 23 über den zweiten Drucksensor 26 gemessen und überwacht werden.With the second liquid column 31 containing volume measuring capillary 24 This can be done through cell culture 16 diffused volumes of liquid V A with the marker 23 via the second pressure sensor 26 be measured and monitored.

Als Vergleichswerte für die Permeabilitäten Pp, Pt bezogen auf die den Marker 23 enthaltende Flüssigkeit im Bereich der Zellkultur 16 kann die Permeabilität Pw der verwendeten Flüssigkeit 25, insbesondere des Wassers in einem vorher oder nachfolgenden Messvorgang ermittelt werden.As comparison values for the permeabilities P p , P t relative to the marker 23 containing liquid in the field of cell culture 16 can the permeability P w of the liquid used 25 , In particular of the water in a previous or subsequent measurement process can be determined.

Die Erfindung ermöglicht es, dass insbesondere mit einer mehrkanaligen Einrichtung mehrere in Molekulargewicht und Qualität verschiedene Marker 23 weitgehend zeitgleich angeboten und detektiert werden können.The invention makes it possible, in particular with a multichannel device, to have a plurality of markers different in molecular weight and quality 23 can be offered and detected largely at the same time.

Die aus den apparativen Einrichtungs-Komponenten 3, 4, 7 gemäß einem Messprogramm bereitgestellten Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA werden in einen Speicher des Computersystems 9 eingebracht, dort gespeichert und nach Lesung mittels programmtechnischer Mittel zu Werten der zutreffenden Permeabilitäten Pp, Pt zumindest als Funktionen der Messwerte KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER, VE, VA) berechnet, in Kurvenform dargestellt und zur Erstellung von Schlussfolgerungen miteinander verglichen.Those from the apparative furnishing components 3 . 4 . 7 Measured values of the quantities K E , K A , TER, V E , V A provided in accordance with a measuring program are stored in a memory of the computer system 9 introduced, stored there and after reading by means of programmable means to values of the true permeabilities P p , P t at least as functions of the measured values K E , K A , TER, V E , V A with P p , P t = f (K E , K A , TER, V E , V A ), plotted and compared to form conclusions.

Mit den drei weitgehend zeitgleich aufgenommenen Messparametern – dem elektrischen transendothelialen Widerstand TER, den Konzentrationen KE, KA der Marker 23 und der Volumen VE, VA – können unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften der Marker 23 und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm nicht nur zwischen transzellulärer Permeabilität Pt und parazellulärer Permeabilität Pp unterschieden, sondern vorteilhafterweise auch Transportkinetiken präzise erstellt werden.With the three largely simultaneously recorded measurement parameters - the electrical transendothelial resistance TER, the concentrations K E , K A of the markers 23 and the volume V E , V A - can be determined taking into account the biophysical and biochemical properties of the markers 23 and a mass balancing program present in the program-technical means not only differentiates between transcellular permeability P t and paracellular permeability P p , but advantageously also transport kinetics can be created precisely.

Veränderungen, wie z.B. Verstoffwechselung und Spaltung der Marker 23 während des Messvorgangs können durch Proteinfällung oder mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie – HPLC – bestimmt werden. Für die Proteinfällung werden Standardverfahren eingesetzt. Das abgespaltene TRITC oder das abgespaltene FITC sind nicht fällbar und können dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich in zuverlässiger Weise gemessen werden.Changes, such as metabolism and cleavage of the markers 23 during the measurement process can be determined by protein precipitation or by high performance liquid chromatography - HPLC. Standard procedures are used for protein precipitation. The split-off TRITC or the cleaved FITC can not be precipitated and can then be reliably measured in the supernatant after centrifuging off the precipitated protein and adjusting the pH.

Aus der Kenntnis und Anzeige des Unterschiedes zumindest der beiden genannten Permeabilitäten Pt, Pp in Diagrammen können Schlussfolgerungen über Transportweg und deren Störungen in der Zellkultur 16 abgeleitet werden.From the knowledge and display of the difference of at least the two permeabilities P t , P p in diagrams, conclusions can be drawn about the transport route and its disturbances in the cell culture 16 be derived.

11
EinrichtungFacility
22
Filtereinrichtungfiltering device
33
FluoreszenzphotometerFluorescence Photometer
44
Füllstandsmesserlevel meter
55
Pumpepump
66
FlüssigkeitskreislaufLiquid circuit
77
Impedanzspektrometerimpedance spectrometer
88th
Erste VerbindungsleitungFirst connecting line
99
Computersystemcomputer system
1010
Erste LeitungenFirst cables
1111
Zweite LeitungenSecond cables
1212
Dritte Leitungenthird cables
1313
Vierte LeitungenFourth cables
1414
Kammerchamber
1515
Filterinsertfilter insert
1616
Zellkulturcell culture
1717
Erste FlüssigkeitssäuleFirst liquid column
1818
Ringelektrodering electrode
1919
Elektrodenplatteelectrode plate
2020
Oberes Kompartimentupper compartment
2121
Unteres Kompartimentlower compartment
2222
Zuführungsleitungfeed pipe
2323
Markermarker
2424
VolumenkapillareVolumenkapillare
2525
Flüssigkeitliquid
2626
Erster Drucksensorfirst pressure sensor
2727
Zweiter Drucksensorsecond pressure sensor
2828
Fünfte LeitungFifth lead
2929
Erste Diffusions-VorgängeFirst Diffusion processes
3030
Zweite Diffusions-VorgängeSecond Diffusion processes
3131
Zweite FlüssigkeitssäuleSecond liquid column
3232
Zweite VerbindungsleitungSecond connecting line
3333
Abflussoutflow
3434
DurchflussküvetteFlow Cell
3535
Haltevorrichtungholder
351351
Drehvorrichtungrotator
3636
EnergieversorgungseinheitPower supply unit
3737
Lichtquellelight source
3838
erste Optikfirst optics
3939
Anregungsfilterexcitation filter
4040
Anregungsanordnungexcitation system
401401
Anregungsanordnungexcitation system
402402
Anregungsanordnungexcitation system
403403
Anregungsanordnungexcitation system
4141
KüvettenzuflussKüvettenzufluss
4242
KüvettenabflussKüvettenabfluss
4343
Detektoranordnungdetector array
431431
Detektoranordnungdetector array
432432
Detektoranordnungdetector array
433433
Detektoranordnungdetector array
4444
zweite Optiksecond optics
4545
Detektionsfilterdetection filters
4646
dritte Optikthird optics
4747
Detektordetector
4848
Auswerteeinrichtungevaluation
4949
Anschlusskabelconnection cable
5050
Anschlusskabelconnection cable
5151
Fluoreszenzphotometer-MehrfachanordnungFluorescence Photometer multiple arrangement
5252
Bodenground
531531
Trennwandpartition wall
532532
Trennwandpartition wall
533533
Trennwandpartition wall
534534
Trennwandpartition wall
535535
Trennwandpartition wall
536536
Trennwandpartition wall
5454
DrehhalterungseinrichtungRotary support mechanism
5555
Messsektormeasuring sector
5656
Detektionseinheitdetection unit
5757
Detektionseinheitdetection unit
5858
Detektionseinheitdetection unit
5959
AnregungswellenlängeExcitation wavelength
6666
BeobachtungswellenlängeObservation wavelength
6161
Pfeilrichtungarrow
6262
Verschiebetischtranslation stage
6363
Strahlengangbeam path
6464
Semigermeabler SpiegelSemigermeabler mirror
VE V E
Eingangsvolumeninput volume
VA V A
Ausgangsvolumenoutput volume
TERTER
transendothelialer elektrischer Widerstandtransendothelial electrical resistance
KE K E
Eingangskonzentration des Markersinlet concentration of the marker
KA K A
Ausgangskonzentration des Markersinitial concentration of the marker
Pp P p
parazelluläre Permeabilitätparacellular permeability
Pt P t
transzelluläre Permeabilitättranscellular permeability

Claims (30)

Einrichtung zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass ihr folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes (6) zugeordnet sind: – mindestens eine die Zellkultur (16) enthaltende Filtereinrichtung (2) zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur (16) mittels einer Messung der jeweiligen Eingangskonzentration KE und des Eingangsvolumens VE mindestens eines fluoreszierenden Markers (23) in einer, die Zellkultur (16) mit hydrostatischem Druck belastenden Flüssigkeitssäule (17) sowie mit einem ersten Drucksensor (27) zur Regelung der Flüssigkeitssäule (17), – mindestens ein Fluoreszenzphotometer (3) zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration KA des durch die Zellkultur (16) der Filtereinrichtung (2) diffundierenden Markers (23), – mindestens ein Füllstandsmesser (4) mit einem zweiten Drucksensor (26) zur Messung von durch die Zellkultur (16) hindurch tretenden Flüssigkeitsmenge mittels einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens VA der Flüssigkeit (25) mit dem darin befindlichen Marker (23), – mindestens eine Pumpe (5) zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes (6), die mit der Filtereinrichtung (2) in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung (2), das Fluoreszenzphotometer (3), der Füllstandsmesser (4) und die Pumpe (5) sich im Flüssigkeitskreislauf (6) befinden sowie – ein Impedanzspektrometer (7) zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur (16) und – ein Computersystem (9) zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Größen KE, KA, TER, VE, VA mittels einer programmtechnischen Massenbilanzierung.Device for determining paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures, characterized in that it comprises the following apparatus components within an open fluid circuit ( 6 ): at least one cell culture ( 16 ) containing filter device ( 2 ) for the analysis of transcytosis processes in cell culture ( 16 ) by means of a measurement of the respective input concentration K E and the input volume V E of at least one fluorescent marker ( 23 ) in one, the cell culture ( 16 ) hydrostatic pressure-bearing liquid column ( 17 ) as well as with a first pressure sensor ( 27 ) for controlling the liquid column ( 17 ), - at least one fluorescence photometer ( 3 ) for detecting a respective initial concentration K A of the cell culture ( 16 ) of the filter device ( 2 ) diffusing marker ( 23 ), - at least one level gauge ( 4 ) with a second pressure sensor ( 26 ) for measuring by cell culture ( 16 ) passing through amount of liquid by means of a second liquid column ( 31 ) and for determining an initial volume V A of the liquid ( 25 ) with the marker ( 23 ), - at least one pump ( 5 ) for maintaining the fluid circuit ( 6 ) connected to the filter device ( 2 ), the filter device ( 2 ), the fluorescence photometer ( 3 ), the level gauge ( 4 ) and the pump ( 5 ) in the fluid circuit ( 6 ) and - an impedance spectrometer ( 7 ) for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture ( 16 ) and - a computer system ( 9 ) for measuring control and evaluation as well as for displaying the permeabilities P p , P t as functions of the quantities K E , K A , TER, V E , V A by means of a program-specific mass balancing. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtereinrichtung (2) eine Transwellfiltereinrichtung darstellt und im Wesentlichen ein oberes Kompartiment (20) und ein unteres Kompartiment (21) aufweist, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten (20, 21) eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer (14) mit einem darin einsetzbaren Filterinsert (15) befindet, in dem zumindest die Zellkultur (16) in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist.Device according to claim 1, characterized in that the filter device ( 2 ) represents a transwell filter device and essentially an upper compartment ( 20 ) and a lower compartment ( 21 ), whereby between the two compartments ( 20 . 21 ) a downwardly porous small volume chamber ( 14 ) with a filter insert ( 15 ) in which at least the cell culture ( 16 ) is in the form of a layer of contiguous cells. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der nach oben freien Kammer (14) auf der Zellkultur (16) eine erste Flüssigkeitssäule (17) von vorzugsweise 10 cm lastet, wobei die Kammer (14) zur ersten Flüssigkeitssäule (17) gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment (20) zugeordneten Ringelektrode (18) sowie von der ersten Flüssigkeitssäule (17) abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment (21) zugeordneten Elektrodenplatte (19) zur Messung des transendothelialen Widerstandes TER mit Hilfe des Impedanzspektrometers (7) in Verbindung steht und die Kammer (14) in das obere Kompartiment (20) einsetzbar ist und mit dem unteren Kompartiment (21) über den Flüssigkeitskreislauf (6) in Verbindung steht.Device according to claim 2, characterized in that in the upwardly free chamber ( 14 ) on the cell culture ( 16 ) a first liquid column ( 17 ) of preferably 10 cm, the chamber ( 14 ) to the first liquid column ( 17 ) directed with one of the upper compartment ( 20 ) associated ring electrode ( 18 ) as well as from the first liquid column ( 17 ) averted with a lower compartment ( 21 ) associated electrode plate ( 19 ) for measuring the transendothelial resistance TER by means of the impedance spectrometer ( 7 ) and the chamber ( 14 ) into the upper compartment ( 20 ) and with the lower compartment ( 21 ) via the fluid circuit ( 6 ). Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das obere Kompartiment (20) im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule (17) mindestens eine Zuführungsleitung (22) zur gesteuerten Zugabe des Markers (23) besitzt, der gemischt mit Wasser auf der Zellkultur (16) lastet und oberhalb der Zellkultur (16) und des Filterinserts (15) der Flüssigkeit (25) des Kreislaufs (6) zuführbar ist.Device according to claim 2, characterized in that the upper compartment ( 20 ) in the region of the first liquid column ( 17 ) at least one supply line ( 22 ) for the controlled addition of the marker ( 23 ) mixed with water on the cell culture ( 16 ) and above the cell culture ( 16 ) and the filter insert ( 15 ) of the liquid ( 25 ) of the cycle ( 6 ) can be fed. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Drucksensor (27) über eine fünfte Leitung (28) mit dem Computersystem (9) in Verbindung steht, der die erste Flüssigkeitssäule (17) ständig höhenmäßig und signaltechnisch überprüft.Device according to claim 4, characterized in that the first pressure sensor ( 27 ) above a fifth line ( 28 ) with the computer system ( 9 ) communicating the first liquid column ( 17 ) constantly in terms of height and signal technology checked. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzphotometer (3) als Detektionseinheit folgende Bauelemente/Baugruppen aufweist: – eine Energieversorgungseinheit (36), an die – eine Lichtquelle (37) angeschlossen ist, – eine erste Optik (38), der – ein Anregungsfilter (39) nachgeordnet ist, die allesamt eine Anregungsanordnung (40) bilden, – eine auf der Haltevorrichtung (35) angeordnete Durchflussküvette (34) mit einem Küvettenzufluss (41) und einem Küvettenabfluss (42), wobei sich in der Durchflussküvette (34) die Flüssigkeit (25) mit einem vorgesehenen Marker (23) befindet, – eine zweite Optik (44), – ein Detektionsfilter (45), – eine dritte Optik (46) sowie – ein Detektor (47), – eine Auswerteeinrichtung (48), die in das Computersystem (9) integriert ist, wobei die zweite Optik (44), das De tektionsfilter (45), die dritte Optik (46) und der Detektor (47) mit Auswerteeinerichtung (48) eine Detektoranordnung (43) darstellen.Device according to claim 1, characterized in that the fluorescence photometer ( 3 ) as a detection unit comprises the following components / assemblies: - a power supply unit ( 36 ), to which - a light source ( 37 ), - a first optic ( 38 ), which - an excitation filter ( 39 ), all of which are an invitation order ( 40 ), - one on the holding device ( 35 ) arranged flow cuvette ( 34 ) with a cuvette influx ( 41 ) and a cuvette effluent ( 42 ), whereby in the flow cuvette ( 34 ) the liquid ( 25 ) with a designated marker ( 23 ), - a second optic ( 44 ), - a detection filter ( 45 ), - a third optic ( 46 ) as well as - a detector ( 47 ), - an evaluation device ( 48 ) inserted in the computer system ( 9 ), the second optic ( 44 ), the detection filter ( 45 ), the third optic ( 46 ) and the detector ( 47 ) with evaluation device ( 48 ) a detector arrangement ( 43 ). Einrichtung nach Anspruch b, dadurch gekennzeichnet, dass Anschlusskabel (49, 50) – Versorgungs- und Signalempfangsleitungen – für den Anschluss der Lichtquelle (37) und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung (48) das Flureszenzphotometer (3) vervollständigen.Device according to claim b, characterized in that connecting cable ( 49 . 50 ) - supply and signal receiving lines - for the connection of the light source ( 37 ) and for the connection of the evaluation device ( 48 ) the fluorescence photometer ( 3 ) to complete. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzphotometer (51) mit mehreren Detektionseinheiten (56, 57, 58) und einer Haltevorrichtung (351) für mehrere Durchflussküvetten (341, 342, 343, 344) in zentralsymmetrischer Anordnung versehen ist, wobei zur Haltevorrichtung (351) ein Boden (52) zur Halterung der Durchflussküvetten (341, 342, 343, 344) sowie zugehörige Trennwände (531, 532, 533, 534, 535, 536) gehören, wobei die drei Detektionseinheiten (56, 57, 58), jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung und Detektionsanordnung, einer Drehhalterungseinrichtung (54) zugeordnet sind, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem verbunden ist, das vom Computersystem (9) aus steuerbar ist.Device according to claim 1, characterized in that the fluorescence photometer ( 51 ) with several detection units ( 56 . 57 . 58 ) and a holding device ( 351 ) for several flow cells ( 341 . 342 . 343 . 344 ) is provided in centrally symmetrical arrangement, wherein the holding device ( 351 ) a floor ( 52 ) for holding the flow cells ( 341 . 342 . 343 . 344 ) and associated partitions ( 531 . 532 . 533 . 534 . 535 . 536 ), the three detection units ( 56 . 57 . 58 ), each consisting of an excitation arrangement and detection arrangement, a rotary support device ( 54 ) associated with a rotationally switchable drive system that is controlled by the computer system ( 9 ) is controllable. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass durch Trennwände (531, 532) und eine dazwischen befindliche Durchflüssküvette (351) zu einem Messsektor (55) gehören.Device according to claim 8, characterized in that by partition walls ( 531 . 532 ) and a Durchflüssküvette in between ( 351 ) to a measuring sector ( 55 ) belong. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Flureszenzphotometer (3) mit einer Halterungsvorrichtung (352) für die Durchflussküvetten (341, 342, 343) in Verbindung steht, wobei die Durchflussküvetten (341, 342, 343) ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sind und das Fluoreszenzphotometer (3) relativ linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durchflussküvetten (341, 342, 343) verschiebbar angeordnet und zur Halterungsvorrichtung (352) angeordnet ist.Device according to claim 1, characterized in that the fluorescence photometer ( 3 ) with a holding device ( 352 ) for the flow cells ( 341 . 342 . 343 ), whereby the flow cells ( 341 . 342 . 343 ) are held stationary and aligned in series next to each other and the fluorescence photometer ( 3 ) relatively linear and parallel to the series arrangement of the flow cells ( 341 . 342 . 343 ) arranged displaceably and to the mounting device ( 352 ) is arranged. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in einem vorgegebenen Strahlengang (63) sich die Lichtquelle (37), die erste Optik (38), das Anregungsfilter (39), die zweite Optik (44), das Detektionsfilter (45), die dritte Optik (46) und der Detektor (47), der über das Anschlusskabel (50) mit der Auswerteeinrichtung (48) verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel (64), der sich zwischen dem Anregungsfilter (39) und der zweiten Optik (46) befindet und der die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette (342) zur dritten Optik (46) und dem Detektor (47) gerichtet umlenkt, befinden.Device according to claim 10, characterized in that in a predetermined beam path ( 63 ) the light source ( 37 ), the first appearance ( 38 ), the excitation filter ( 39 ), the second optic ( 44 ), the detection filter ( 45 ), the third optic ( 46 ) and the detector ( 47 ), which is connected via the connecting cable ( 50 ) with the evaluation device ( 48 ) and a semipermeable mirror ( 64 ) located between the excitation filter ( 39 ) and the second optics ( 46 ) and the fluorescence to be detected in the flow-through cuvette ( 342 ) to the third optics ( 46 ) and the detector ( 47 ) directed. Einrichtung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in den Fluoreszenzphotometern (3, 51) Blenden in die Strahlengänge eingefügt sind, die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw, zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses eingesetzt sind.Device according to claim 8 to 11, characterized in that in the fluorescence photometers ( 3 . 51 ) Are inserted into the beam paths, the deflection angle is optimally adjusted and flow cuvettes are colored black to substantially reduce the scattered light or to improve the wavelength-dependent fluorescence signal / noise ratio are used. Einrichtung nach Anspruch 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchflussküvetten aus Quarzglas sind, mit denen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreichbar ist.Device according to claim 6 to 12, characterized in that the flow cells made of quartz glass, with which a high signal-to-noise ratio can be achieved is. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Füllstandsmesser (4) eine Volumenmesskapillare (24) mit einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) zugeordnet ist, wobei die Volumenmesskapillare (24) mit einem Abfluss (33) verbunden ist, der ventilmäßig betätigbar ist, wobei das abfließende Volumen VA als Messgröße an das Computersystem (9) übermittelt wird.Device according to claim 1, characterized in that the level gauge ( 4 ) a volume measuring capillary ( 24 ) with a second liquid column ( 31 ), wherein the volume measuring capillary ( 24 ) with a drain ( 33 ), which is valve-actuated, wherein the outflowing volume V A as a measured variable to the computer system ( 9 ) is transmitted. Einrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenmesskapillare (24) der Quantifizierung des durch die Zellkultur (16) hindurch diffundierenden Flüssigkeitsvolumens VA dient.Device according to claim 14, characterized in that the volume measuring capillary ( 24 ) quantification of the cell culture ( 16 ) through diffusing liquid volume V A serves. Einrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenquantifizierung über den zweiten Drucksensor (26) erfolgt, der mit der Volumenmesskapillare (24) gekoppelt ist.Device according to claim 13 or 14, characterized in that the volume quantification via the second pressure sensor ( 26 ), which is connected to the volume measuring capillary ( 24 ) is coupled. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Impedanzspektrometer (7) an die Transwellfiltereinrichtung (2) über elektrische Verbindungsleitungen (8, 32) angeschlossen ist.Device according to Claim 1, characterized in that the impedance spectrometer ( 7 ) to the transwell filter device ( 2 ) via electrical connection lines ( 8th . 32 ) connected. Einrichtung nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Computersystem (9) über erste Leitungen (10) mit dem Impedanzspektrometer (7), über zweite Leitungen (11) mit dem Fluoreszenzphotometer (3), über dritte Zeitungen (12) mit dem Füllstandsmesser (4) einschließlich des zweiten Drucksensors (26) und über vierte Leitungen (13) mit einer Pumpe (5) in elektrischer und signaltechnischer Verbindung steht.Device according to Claims 1 to 17, characterized in that the computer system ( 9 ) via first lines ( 10 ) with the impedance spectrometer ( 7 ), via second lines ( 11 ) with the fluorescence photometer ( 3 ), third newspapers ( 12 ) with the level gauge ( 4 ) including the second pressure sensor ( 26 ) and fourth lines ( 13 ) with a pump ( 5 ) is in electrical and signaling connection. Einrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Computersystem (9) derart ausgebildet ist, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist.Device according to claim 18, characterized in that the computer system ( 9 ) is designed such that it itself represents a control / regulating device or is integrated into such a main component. Einrichtung nach Ansprüchen 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass Mehrfachvorgänge in parallelen Flüssigkeitskreisläufen (6) durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden, wobei – die Filtereinrichtung (2) mehrfach, – das Fluoreszenzphotometer (3, 51) für mehrere Detektionseinheiten (56, 57, 58), – der Füllstandsmesser (4) mehrfach, – die jeweils in einzelne Flüssigkeitskreisläufe (6) integriert sind, und während die Pumpe (5) als Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache Messkammern ausgebildet ist, wobei jede Messkammer einem der Flüssigkeitskreisläufe (6) zugeordnet ist und das Impedanzspektrometer (7) und das Computersystem (9) in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.Device according to claims 1 to 19, characterized in that multiple operations in parallel fluid circuits ( 6 ) are performed by a corresponding number of the apparatus components, wherein - the filter device ( 2 ) several times, - the fluorescence photometer ( 3 . 51 ) for several detection units ( 56 . 57 . 58 ), - the level gauge ( 4 ), in each case in individual fluid circuits ( 6 ) and while the pump ( 5 ) is designed as a multi-channel roller pump for multiple measuring chambers, each measuring chamber one of the fluid circuits ( 6 ) and the impedance spectrometer ( 7 ) and the computer system ( 9 ) are provided in a simple training. Einrichtung nach einem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgesehenen, durch die Zellkultur (16) diffundierenden fluoreszierenden Marker (23) ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran sind, wobei sich die zuführbaren Marker (23) im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.Device according to any preceding claim, characterized in that the cells provided by the cell culture ( 16 ) diffusing fluorescent markers ( 23 ) are a FITC-albumin or a TRITC-dextran, whereby the deliverable markers ( 23 ) differ in molecular weight or in quality from each other. Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen mittels einer Einrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21, durch folgende Schritte gekennzeichnet, – Messen des Eingangsvolumens VE der Flüssigkeit (25) einschließlich des Markers (23) und dessen Eingangskonzentration KE mittels einer Filtereinrichtung (2), – Messen des Ausgangsvolumens VA der Flüssigkeit (25) einschließlich des Markers (23) mittels eines Füllstandsmessers (4), – Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers (7), – Messung der Ausgangskonzentration KA des vorgegebenen Markers 23 mittels eines Fluoreszenzphotometers (3, 51), – Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems (9), – Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER, VE, VA). – Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform und – Vergleich der Permeabilitäts-Kurven.Method for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures by means of a device according to claims 1 to 21, characterized by the following steps, - measuring the input volume V E of the liquid ( 25 ) including the marker ( 23 ) and its input concentration K E by means of a filter device ( 2 ), - measuring the initial volume V A of the liquid ( 25 ) including the marker ( 23 ) by means of a level gauge ( 4 ), - measuring the electrical transendothelial resistance TER by means of an impedance spectrometer ( 7 ), - Measurement of the initial concentration K A of the given marker 23 by means of a fluorescence photometer ( 3 . 51 ), - storing the measured quantities K E , K A , TER, V E , V A in the memory of the computer system ( 9 ), - calculation of the permeabilities P p , P t as functions of the measured values of the quantities K E , K A , TER, V E , V A with P p , P t = f (K E , K A , TER, V E , V A ). - Representation of the permeabilities P p , P t in waveform and - Comparison of the permeability curves. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: – die Zellkultur (16) wird je nach Bedarf auf Filterinserts (15) von 6,5 mm, 12 mm oder 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer (14) eingesetzt, – danach wird durch die beiden Elektroden (18, 19) der transendotheliale Widerstand TER mit dem Impedanzspektrometer (7) gemessen, – die im unteren Kompartiment (21) strömende Flüssigkeit (25) wird mit Hilfe der Pumpe (5) ständig in dem Flüssigkeitskreislauf (6), der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen (17, 31) halboffen ist, gepumpt und – in den Flüssigkeitskreislauf (6) ist das Fluoreszenzphotometer (3) eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare (24) mit der zweiten Flüssigkeitssäule (31) des Füllstandsmessers (4) angeordnet.A method according to claim 22, characterized in that the following steps are carried out: - the cell culture ( 16 ) is applied to filter inserts (as required) ( 15 ) of 6.5 mm, 12 mm or 24 mm or other diameter and into the small-volume chamber ( 14 ), then the two electrodes ( 18 . 19 ) the transendothelial resistance TER with the impedance spectrometer ( 7 ), - those in the lower compartment ( 21 ) flowing liquid ( 25 ) with the help of the pump ( 5 ) constantly in the fluid circuit ( 6 ) caused by the two open liquid columns ( 17 . 31 ) is semi-open, pumped and - into the fluid circuit ( 6 ) is the fluorescence photometer ( 3 ) and in series the volume measuring capillary ( 24 ) with the second liquid column ( 31 ) of the level gauge ( 4 ) arranged. Verfahren nach Anspruch 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass mit der die zweiten Flüssigkeitssäule (31) enthaltende Volumenmesskapillare (24) das durch die Zellkultur (16) diffundierte, mindestens einen Marker (23) enthaltende Flüssigkeitsvolumen VA über den zweiten Drucksensor (26) gemessen und überwacht wird.A method according to claim 22 and 23, characterized in that the second liquid column ( 31 ) volume measuring capillary ( 24 ) that through the cell culture ( 16 ) diffused, at least one marker ( 23 ) containing liquid volume V A via the second pressure sensor ( 26 ) is measured and monitored. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Vergleichswerte für die Permeabilitäten Pp, Pt im Bereich der Zellkultur (16) die Permeabilität Pw des als Flüssigkeit (25) verwendeten Wassers ermittelt wird.Method according to one of claims 22 to 24, characterized in that as comparison values for the permeabilities P p , P t in the region of the cell culture ( 16 ) the permeability P w of the liquid ( 25 ) is used. Verfahren nach Anspruch 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass mit der mehrkanaligen Einrichtung mehrere in Molekulargewicht und Qualität verschiedene Marker (23) weitgehend zeitgleich angeboten und im unteren Kompartiment (21) detektiert werden.A method according to claim 22 to 25, characterized in that with the multi-channel device several markers different in molecular weight and quality ( 23 ) are widely available at the same time and in the lower compartment ( 21 ) are detected. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Zellkultur (16) während des Messvorgangs in der Filtereinrichtung (2) einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeitssäule (17) ausgesetzt werden.Method according to one of claims 22 to 26, characterized in that the cells of the cell culture ( 16 ) during the measuring process in the filter device ( 2 ) a hydrostatic pressure of 10 cm liquid column ( 17 ) get abandoned. Verfahren nach Ansprüchen 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass mit den drei weitgehend zeitgleich aufgenommenen Messgrößen – des Widerstandes TER, der Konzentrationen KE, KA des Markers (23) und der Volumen VE, VA – unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften des Markers (23) und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm sowohl die tranzytotische Permeabilität Pt und parazelluläre Permeabilität Pp als auch Transportkinetiken erstellt werden.Method according to claims 22 to 27, characterized in that with the three largely simultaneously recorded measured variables - the Wi TER, the concentrations K E , K A of the marker ( 23 ) and the volumes V E , V A - taking into account the biophysical and biochemical properties of the marker ( 23 ) and a mass balancing program present in the program engineering means, both the trancytotic permeability P t and paracellular permeability P p and transport kinetics are created. Verfahren nach Anspruch 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass Veränderungen, wie z.B. Verstoffwechselung und Spaltung, der Marker (23) während des Messvorgangs durch Proteinfällung oder mittels HPLC bestimmt werden, wobei für die Proteinfällung bekannte Verfahren eingesetzt werden und wobei das abgespaltene TRITC oder das abgespaltene FITC nicht gefällt werden und dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich gemessen werden.A method according to claim 22 to 28, characterized in that changes, such as metabolism and cleavage, the marker ( 23 ) are determined during the measuring process by protein precipitation or by HPLC, using methods known for protein precipitation and wherein the split-off TRITC or the cleaved FITC are not precipitated and then measured in the supernatant after centrifuging off the precipitated protein and adjusting the pH. Verfahren nach Anspruch 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA mittels eines Gesamtprogramms im Computersystem (9) aufgenommen, gespeichert, ausgewertet und angezeigt werden, wobei die Werte aus den einzelnen Messgrößen KE, KA, TER, VE, VA gemäß eines Auswerteprogramms zu zugehörigen Permeabilitätsdiagrammen ausgewertet werden.A method according to claim 22 to 29, characterized in that the measured quantities K E , K A , TER, V E , V A by means of an overall program in the computer system ( 9 ), stored, evaluated and displayed, wherein the values from the individual measured variables K E , K A , TER, V E , V A are evaluated according to an evaluation program for the corresponding permeability diagrams.
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