DE10125258A1 - Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden LigandenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch an mindestens einer Bindungsstelle bindenden Liganden mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Herstellen einer ersten Mischphase, in welcher die Liganden in einer Konzentration K1 mit an die Ziel-Moleküle spezifisch bindenden Markern in einer Konzentration K2 und den Ziel-Molekülen in einer Konzentration K3 in Kontakt gebracht werden und einer zweiten Mischphase, in welcher die Marker mit den Ziel-Molekülen in Kontakt gebracht werden, wobei die erste und die zweite Mischphase nach dem Inkontaktbringen unter identischen, eine Bindung der Liganden und der Marker an die Ziel-Moleküle erlaubenden Bedingungen inkubiert werden, DOLLAR A b) Absondern der in der ersten Mischphase enthaltenen gebundenen Marker GM1 von der ersten und der in der zweiten Mischphase enthaltenen gebundenen Marker GM2 von der zweiten Mischphase und DOLLAR A c1) Ermitteln einer Konzentration K4 der ungebundenen Marker in der ersten und einer Konzentration K5 der ungebundenen Marker in der zweiten Mischphase, wobei aus der Konzentration K5 eine Konzentration K6 ermittelt wird, welche der Konzentration der ungebundenen Marker in der zweiten Mischphase unter der Annahme entspricht, daß darin die Marker in der Konzentration K2 mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt gebracht worden sind, sowie Bestimmen des Bindeverhaltens der Liganden aus dem Verhältnis zwischen den Konzentrationen K6 und K4 DOLLAR A oder DOLLAR A c2) ...
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch an mindestens einer Bindungsstelle bindenden Liganden.
- Aus der US 5,891,742 A ist ein Verfahren zum schnellen und einfachen Auffinden von Liganden aus einer Mischung von Testsubstanzen bekannt. Dabei wird die Mischung mit einer Zielstruktur inkubiert. Die Zielstruktur kann sowohl in Lösung als auch immobilisiert vorliegen. Nach der Inkubation werden die Zielstrukturen mit gebundenen Testsubstanzen abgetrennt. Die gebundenen Testsubstanzen können direkt massenspektrometisch analysiert und identifiziert werden. Dazu können sie von den Zielstrukturen eluiert werden. Das Eluieren kann z. B. durch Kompetition mit einem spezifischen Liganden erfolgen.
- Die DE 198 14 775 A1 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Bindungskonstanten gelöster Stoffe und Substanzen an Oberflächen aus amphiphilen Molekülen. Dabei werden Schichten amphiphiler Moleküle an einen festen Träger gebunden, so daß sich eine festkörperunterstützte Membran ausbildet. Eine definierte Menge dieser festkörperunterstützten Membran wird mit einer mobilen Phase in Kontakt gebracht. Die mobile Phase enthält eine definierte Menge von auf Lipidbindung zu untersuchenden Substanzen. Nach einer Inkubation werden die festkörperunterstützten Membranen von der mobilen Phase abgetrennt. Die Konzentrationen der Substanzen in der mobilen Phase oder der festkörperunterstützten Membran werden ermittelt. Das Verfahren kann mit in unterschiedlichen Mengenverhältnissen vorliegenden festkörperunterstützten Membranen und Substanzen durchgeführt werden. Aus den dabei ermittelten Konzentrationen kann die Bindungskonstante berechnet werden.
- Weiterhin ist es im Stand der Technik allgemein bekannt mittels mit einer Markierungsubstanz markierter Liganden, die Bindung nicht markierter Liganden an ein Ziel-Molekül indirekt zu bestimmen. Dabei werden die nicht markierten Liganden zusammen mit einem definierten Anteil markierter Liganden mit den Ziel-Molekülen inkubiert. Die anschließende Bestimmung der Menge der über die markierten Liganden an die Ziel- Moleküle gebundenen Markierungssubstanz ermöglicht die Ermittlung des Bindeverhaltens der an die Ziel-Moleküle gebundenen Liganden.
- Bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren ist es erforderlich, entweder die gebundenen oder nicht gebundenen Liganden direkt oder indirekt zu quantifizieren. Beim direkten Quantifizieren kann das je nach Ligand mit einem erheblichen Aufwand verbunden sein. Zur Quantifizierung muß das jeweils verwendete Detektionssystem für jeden zu quantifizierenden Liganden kalibriert werden. Das ist auch für Liganden erforderlich, von denen nicht bekannt ist, ob sie eine Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweisen. Auch das indirekte Quantifizieren mittels markierter Liganden ist aufwendig. Es ist zunächst erforderlich die Liganden mit einer Markierungssubstanz so zu markieren, daß die markierten Liganden noch eine ausreichende Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweisen. Häufig müssen dazu verschiedene Markierungsmethoden mit verschiedenen Markierungssubstanzen erprobt werden. Oftmals erweisen sich nur radioaktive Markierungssubstanzen als geeignet. Das Handhaben dieser Markierungssubstanzen und der damit markierten Liganden ist gefährlich und wegen der erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen aufwendig. Weiterhin ist nicht jeder Ligand dazu geeignet, mit einer bestimmten gewünschten Methode markiert zu werden. Dadurch kann eine Suche nach geeigneten Liganden erforderlich sein.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein Verfahren bereitgestellt werden, das es mit geringem Aufwand ermöglicht, das Bindeverhalten beliebiger von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden zu ermitteln, ohne dabei durch die direkte Quantifizierbarkeit der Liganden beschränkt zu sein und ohne, daß dazu mit einer Markierungssubstanz versehene Substanzen erforderlich sind.
- Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 23.
- Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch an mindestens einer Bindungsstelle bindenden Liganden mit folgenden Schritten vorgesehen:
- a) Herstellen einer ersten Mischphase, in welcher die Liganden in einer Konzentration K1 mit an die Ziel-Moleküle spezifisch bindenden Markern in einer Konzentration K2 und den Ziel-Molekülen in einer Konzentration K3 in Kontakt gebracht werden und einer zweiten Mischphase, in welcher die Marker mit den Ziel-Molekülen in Kontakt gebracht werden, wobei die erste und die zweite Mischphase nach dem Inkontaktbringen unter identischen eine Bindung der Liganden und der Marker an die Ziel-Moleküle erlaubenden Bedingungen inkubiert werden,
- b) Absondern der in der ersten Mischphase enthaltenen gebundenen Marker GM1 von der ersten und der in der zweiten Mischphase enthaltenen gebundenen Marker GM2 von der zweiten Mischphase und
- c) Ermitteln einer Konzentration K4 der ungebundenen Marker in der ersten und einer Konzentration K5 der ungebundenen Marker in der zweiten Mischphase, wobei aus der Konzentration K5 eine Konzentration K6 ermittelt wird, welche der Konzentration der ungebundenen Marker in der zweiten Mischphase unter der Annahme entspricht, daß darin die Marker in der Konzentration K2 mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt gebracht worden sind, sowie Bestimmen des Bindeverhaltens der Liganden aus dem Verhältnis zwischen den Konzentrationen K6 und K4
- 1. Ermitteln einer Menge M1 der gebundenen Marker GM1 und einer Menge M2 der gebundenen Marker GM2, wobei aus der Menge M2 eine Menge M3 ermittelt wird, welche der Menge der gebundenen Marker in der zweiten Mischphase unter der Annahme entspricht, daß darin die Marker in der Konzentration K2 mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt gebracht worden sind, sowie Bestimmen des Bindeverhaltens der Liganden aus dem Verhältnis zwischen den Mengen M3 und M1,
- Unter dem Bindeverhalten soll jede das spezifische Binden der Liganden an die Ziel-Moleküle an mindestens einer Bindungsstelle charakterisierende Verhalten verstanden werden. Es kann sich um ein relatives Bindeverhalten handeln. Dabei gibt das Bindeverhalten an, ob die Liganden besser oder schlechter als die Marker an die Ziel-Moleküle binden, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß sie daran binden. Es kann sich auch um ein absolutes Bindeverhalten handeln. Dabei wird die Affinität der Liganden zu den Ziel-Molekülen oder die Menge der an die Ziel-Moleküle gebundenen Liganden bestimmt. Die Bestimmung des Bindeverhaltens kann auch in einer bloßen Abschätzung des Bindeverhaltens bestehen.
- Der Begriff Mischphase umfaßt sowohl eine reine Lösung als auch eine Suspension. Die Mischphase kann Membranstrukturen, wie z. B. Vesikel, enthalten. Die Ziel-Moleküle können in Lösung, in Suspension, immobilisiert oder in Membranstrukturen, insbesondere Vesikeln, eingebettet vorliegen. Anstatt der Ziel-Moleküle können auch die Liganden immobilisiert sein. Die Ziel-Moleküle oder die Liganden können z. B. an einer Wand eines Gefäßes oder an Partikeln immobilisiert vorliegen. Bei in Vesikeln eingebetteten Ziel-Molekülen können auch die Vesikel, z. B. durch Bindung an eine feste Phase, immobilisiert sein. Die Bedingungen gemäß lit. a sind, insbesondere hinsichtlich Temperatur und Dauer der Inkubation, so gewählt, daß eine Bindung der Liganden und der Marker an die Ziel- Moleküle stattfinden kann.
- Unter Marker werden vorbekannte quantifizierbare Stoffe verstanden, die bei den eingesetzten Konzentrationen K2 und K3 und unter den Bedingungen gemäß lit. a spezifisch an die Ziel-Moleküle binden. Die Bindung der Marker an die Ziel- Moleküle wird durch die Bindung der Liganden inhibiert. Das kann z. B. durch eine allosterische Inhibition der Bindung oder dadurch erfolgen, daß die Marker und die Liganden um die Bindung an die Bindungsstelle der Liganden an den Ziel- Molekülen konkurrieren. Aus den Bindungseigenschaften der Marker und der Konzentration K5 bzw. der Menge M2 kann die Konzentration K6 bzw. die Menge M3 rechnerisch oder graphisch ermittelt werden. Die Konzentration K6 ist diejenige Konzentration ungebundenen Markers und die Menge M3 diejenige Menge gebundenen Markers, die in der zweiten Mischphase nach dem Inkubieren vorliegen würde, wenn darin die Marker in der Konzentration K2 mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt gebracht worden wären. Aus dem Verhältnis zwischen den Konzentrationen K6 und K4 bzw. den Mengen M3 und M1 läßt sich die Menge der Marker, deren Bindung an die Ziel-Moleküle inhibiert wird, und daraus das Bindeverhalten der Liganden bestimmen. Bei dem Verhältnis im Sinne der Erfindung kann es sich sowohl um eine Relation als auch um eine Differenz handeln. Die Marker können ebenso wie die Liganden und die Ziel- Moleküle von einheitlicher Art sein oder sich voneinander unterscheiden.
- Das Absondern gemäß Schritt lit. b kann z. B. mittels Zentrifugation gebildeter Komplexe erfolgen. Die Komplexe können Ziel-Moleküle und Liganden, Ziel-Moleküle und Marker oder Ziel-Moleküle, Liganden und Marker enthalten. Es versteht sich, daß statt einer Menge auch eine Konzentration und statt einer Konzentration auch eine Menge ermittelt werden kann.
- "Native Form" bedeutet, daß die Marker keine für den Nachweis, die Quantifizierung oder die Identifizierung erforderlichen Modifikationen aufweisen. Solche Modifikationen können bspw. in einer Markierung mit einem Markierungsstoff bestehen.
- Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß auch bei Liganden, welche schwierig direkt zu quantifizieren sind, nur die Marker quantifiziert werden müssen. Das Verfahren unterliegt somit keinen Beschränkungen, die in der Natur der Liganden liegen und Probleme bei der Quantifizierung bereiten. Hinsichtlich der Marker besteht der Vorteil, daß eine Entwicklung von Markern aus an die Ziel-Moleküle spezifisch bindenden Stoffen entfällt, weil die Marker nicht markiert sein müssen. Somit ist eine Suche nach für eine Markierung mit einem bestimmten Markierungsverfahren geeigneten an die Ziel- Moleküle spezifisch bindenden Stoffen nicht erforderlich. Ebensowenig ist eine Suche nach an die Ziel-Moleküle spezifisch bindenden Stoffen, welche nach der Markierung noch eine ausreichende Affinität aufweisen, notwendig. Weiterhin entfällt der durch die Handhabung der verwendeten Markierungssubstanzen erforderliche Aufwand, der insbesondere bei radioaktiven Markierungssubstanzen sehr hoch sein kann. Auch eine mit der Verwendung radioaktiver Markierungssubstanzen verbundene gesundheitliche Gefährdung findet nicht statt.
- Der Einsatz der Massenspektrometrie hat den Vorteil, daß in nativer Form vorliegende Marker nachgewiesen, quantifiziert und beim gleichzeitigen Einsatz verschiedener Marker identifiziert werden können.
- Beim erfindungsgemäßen Verfahren kommt es für die Bestimmung des Bindeverhaltens nur auf die Affinität der Marker und nicht auf die Affinität der zu untersuchenden Liganden zu den Ziel-Molekülen an. Weisen die Marker eine ausreichende Affinität zu den Ziel-Molekülen auf, läßt sich auch das Bindeverhalten von Liganden mit sehr niedrigen Affinitäten zu den Ziel-Molekülen bestimmen, indem die Konzentration K1 entsprechend hoch gewählt wird. Die verwendeten Marker können so gewählt werden, daß sie auch noch in niedrigen Konzentrationen nachweisbar sind. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß sich eine unspezifische Bindung der zu untersuchenden Liganden kaum auf das Meßergebnis auswirkt. Im wesentlichen muß nur die unspezifische Bindung der Marker berücksichtigt werden.
- Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung werden die Marker in der zweiten Mischphase beim Schritt lit. a in der Konzentration K2 mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt gebracht. Dadurch vereinfacht sich das Ermitteln der Konzentration K6 beim Schritt lit. c1 oder der Menge M3 beim Schritt lit. c2, denn unter dieser Bedingung ist die Konzentration K6 identisch mit der Konzentration K5 und die Menge M3 identisch mit der Menge M2.
- Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung werden von den gebundenen Markern GM1 die spezifisch gebundenen Marker SGM1 und von den gebundenen Markern GM2 die spezifisch gebundenen Marker SGM2 nach dem Schritt lit. b freigesetzt. Beim Schritt lit. c2 treten die freigesetzten spezifisch gebundenen Marker SGM1 anstelle der gebundenen Marker GM1 und die freigesetzten spezifisch gebundenen Marker SGM2 anstelle der gebundenen Marker GM2. Das Freisetzen kann z. B. durch das Zusetzen eines Überschusses von die Bindung der Marker spezifisch inhibierenden Molekülen erfolgen. Solche Moleküle können z. B. Kompetitoren sein, welche die spezifisch gebundenen Marker von der Bindungsstelle verdrängen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, durch einen Waschschritt nicht spezifisch gebundene Marker von den Ziel-Molekülen zu entfernen, so daß nur spezifisch gebundene Marker gebunden bleiben. Die spezifisch gebundenen Marker können dann auch mittels unspezifischer Verfahren freigesetzt werden. Durch das Freisetzen der spezifisch gebundenen Marker kann der Anteil der nicht spezifisch gebundenen Marker berücksichtigt werden.
- Zur Berücksichtigung einer unspezifischen Bindung der Marker an die Ziel-Moleküle können die Schritte lit. a bis c1 oder c2 auch ein weiteres mal durchgeführt werden, wobei der ersten und/oder der zweiten Mischphase beim Schritt lit. a ein mit den Markern um die spezifische Bindung an den Ziel- Molekülen konkurrierender Stoff in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß eine spezifische Bindung der Marker an den Ziel-Molekülen weitgehend verhindert oder aufgehoben wird. Die dabei bei den Schritten lit. c1 oder c2 ermittelte Konzentration K4 wird als K4', K5 als K5' und K6 als K6' und die Menge M1 als M1', M2 als M2' und M3 als M3' bezeichnet. Die ohne den Stoff ermittelten Werte werden weiterhin als K4, K5, K6, M1, M2 und M3 bezeichnet. Die Differenz zwischen K4' und K4, K5' und K5 sowie K6' und K6 ist jeweils die Konzentration der spezifisch gebundenen Marker. M1', M2' und M3' sind die jeweiligen Mengen der unspezifisch gebundenen Marker. Die Differenz zwischen M1 und M1', M2 und M2' sowie M3 und M3' ist die Menge der spezifisch gebundenen Marker.
- Bei einer bevorzugten Ausgestaltung werden zur Bestimmung der Affinität der Liganden zu den Ziel-Molekülen die Schritte lit. a bis c1 oder c2 zumindest zweimal mit einem voneinander abweichenden Verhältnis der Konzentrationen K1 zu K3 durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt dabei das Inkubieren gemäß Schritt lit. a zumindest nahezu bis zum Erreichen eines Bindungsgleichgewichts. Aus den Mengen der Marker, deren Bindung bei dem voneinander abweichenden Verhältnis der Konzentrationen inhibiert worden ist, kann die Affinität ermittelt werden. Das kann mittels einer nicht linearen Regressionsanalyse der Kompetitions- bzw. Verdrängungskurve erfolgen. Die Kompetitions- bzw. Verdrängungskurve stellt die Inhibition der Bindung der Marker durch Liganden in Abhängigkeit von der Konzentration ungebundener Liganden dar.
- Vorzugsweise erfolgt das Absondern gemäß lit. b durch Dialyse, Präzipitation, Adsorption, Bindung an immobilisierte Moleküle mit einer Affinität zu den Ziel-Molekülen oder zu gebildeten Komplexen aus den Ziel-Molekülen und den Markern und/oder den Liganden, Zentrifugation, Chromatographie oder Filtration, insbesondere Ultrafiltration. Das Absondern gemäß lit. b wird vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt, unter denen die Konzentration der ungebundenen Marker in der ersten und der zweiten Mischphase und/oder die Menge der gebundenen Marker GM1 und GM2 konstant bleibt. Dazu ist jedes beliebige Verfahren geeignet, bei welchem das Absondern gebundener Liganden unter Bedingungen erfolgt, unter denen die Anteile der gebundenen und der ungebundenen Marker und Liganden konstant bleiben. Als ein solches Verfahren kommt ein Absondern gebildeter Komplexe aus Ziel-Molekülen und Markern und/oder Liganden unter Bindungsbedingungen, z. B. mittels Zentrifugieren oder Filtrieren, in Betracht. Der Vorteil des Absonderns unter den genannten Bedingungen besteht darin, daß ein durch das Absondern bewirktes Aufheben eines Bindungsgleichgewichts, beispielsweise bei einem Waschschritt, vermieden wird. Eine durch die Aufhebung des Bindungsgleichgewichts bewirkte Dissoziation von aus den Ziel-Molekülen und den Markern und/oder den Liganden gebildeten Komplexen findet nicht statt. Ein daraus resultierender Fehler bei der Quantifizierung der gebundenen Liganden wird vermieden. Ein weiterer Vorteil des Absonderns unter den genannten Bedingungen besteht darin, daß die erste und die zweite Mischphase nicht quantitativ von den gebundenen Markern GM1 und GM2 abgesondert werden müssen. Es genügt, wenn jeweils ein definierter Anteil der ersten und der zweiten Mischphase abgesondert wird. Aus dem Anteil und der beim Schritt lit. c1 ermittelten Konzentrationen K4 und K5 läßt sich die Menge des Markers ermitteln, dessen Bindung durch die Liganden inhibiert worden ist.
- Vorteilhafterweise wird die Massenspektrometrie im MS-, MS/MS- oder MSn-Modus durchgeführt. Im MS-Modus werden vom Analyten in der Ionenquelle eines Massenspektrometers gebildete Ionen, im MS/MS-Modus selektiv Tochterionen der vom Analyten gebildeten Ionen und im MSn-Modus selektiv weitere Tochterionen der vom Analyten gebildeten Ionen quantifiziert. Der Massenspektrometrie kann eine Kapillarelektrophorese oder Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, insbesondere unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie, vorgeschaltet werden. Dadurch kann ein Auftrennen von in der Massenspektrometrie nur schwer unterscheidbaren Molekülen erreicht werden. Die Moleküle können dann in der Massenspektrometrie getrennt analysiert werden.
- Vorzugsweise wird vor der Massenspektrometrie eine Probenvorbereitung mittels Extraktion, vorzugsweise Festphasen- oder Flüssig-Flüssig-Extraktion, Filtration, insbesondere Ultrafiltration, Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, FPLC®, Umkehrphasenchromatographie, Größenausschlußchromatographie und/oder Affinitätschromatographie, durchgeführt. Unter der Probenvorbereitung wird eine Aufarbeitung einer Probe, aus welcher die Konzentrationen K4 und K5 oder die Mengen M2 und M1 ermittelt werden sollen, verstanden. Das kann z. B. erforderlich sein, wenn aus der Probe bestimmte Bestandteile entfernt werden müssen. Das können Bestandteile sein, welche für ein Massenspektrometer schädlich sind, etwa weil sie Zuführleitungen verstopfen oder angreifen würden, oder welche die Empfindlichkeit einer massenspektrometrischen Messung herabsetzen, z. B. weil sie das Signal des zu analysierenden Markers vermindern. Weiterhin kann es sich um Bestandteile handeln, welche ein der Massenspektrometrie vorgeschaltetes Verfahren stören würden.
- Die erste und die zweite Mischphase gemäß Schritt lit. a können, vorzugsweise mehr als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Ziel-Moleküle und/oder Marker enthalten. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung enthält die erste und die zweite Mischphase gemäß Schritt lit. a einen für verschiedene Ziel-Moleküle spezifischen gemeinsamen Marker. Beim Einsatz verschiedener Marker bindet jeder Marker spezifisch an mindestens eine Bindungsstelle eines vorgegebenen Ziel-Moleküls. Bevorzugt unterscheiden sich die verschiedenen Marker wenigstens hinsichtlich der molaren Masse, der Bildung von Ionen oder Tochterionen bei der Massenspektrometrie oder des chromatographischen oder elektrophoretischen Verhaltens voneinander. Vorteilhafterweise enthält die erste Mischphase gemäß Schritt lit. a, vorzugsweise mehr als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Liganden. Die Liganden können durch Methoden der kombinatorischen Chemie erzeugt sein. Solche Methoden sind z. B. aus Felder, E. R., Chimia 48 (1994), 521-541, Gallop et al., J. Med. Chem. 37 (1994), 1233-1251, Houghten, R. A., Trends Genet. 9 (1993), 235-239, Houghten et al., Nature 354 (1991), 84-86, Lam et al., Nature 354 (1991), 82-84, Carell et al., Chem. Biol. 3 (1995), 171-183, Madden et al., Perspectives in Drug Discovery and Design 2 (1994), 269-285, Cwirla et al., Biochemistry 87 (1990), 6378-6382, Brenner, S. und Lerner, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5381-5383, Gordon et al., J. Medicinal Chemistry 37 (1994), 1385-1401 und Lebl et al., Biopolymers 37 (1995), 177-198 bekannt.
- Durch den Einsatz mehrerer verschiedener Liganden, Ziel- Moleküle und/oder Marker kann die Effizienz des Verfahrens deutlich gesteigert werden. Bei Durchführung des Verfahrens mit verschiedenen Liganden müssen jeweils nur die Marker quantifiziert werden, um festzustellen, ob Liganden mit einer Affinität zu den Ziel-Molekülen in der ersten Mischphase enthalten waren. Das Verfahren ist somit für ein Hochdurchsatz- Screening geeignet. Um herauszufinden, welche der Liganden eine Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweisen, kann eine Dekonvolutionsstrategie verfolgt werden. Dabei wird das Verfahren mit einer verringerten Zahl oder einer anderen Kombination zu untersuchender Liganden erneut durchgeführt. Durch Vergleich der Ergebnisse kann dann ermittelt werden, welcher der Liganden in welcher Menge an die Ziel-Moleküle gebunden hat. Die verschiedenen Marker können auch unterschiedliche abgestufte Affinitäten zu den Ziel-Molekülen aufweisen. Aus der Bestimmung oder Abschätzung der Menge derjenigen Marker, deren Bindung an die Ziel-Moleküle durch die Liganden inhibiert worden ist, kann die Affinität der Liganden zu den Ziel- Molekülen ermittelt oder zumindest abgeschätzt werden.
- Bei einem Ausführungsbeispiel werden nach Schritt lit. c1 oder c2 die gebundenen Liganden mittels Massenspektrometrie identifiziert und/oder es wird die Menge der gebundenen Liganden mittels Massenspektrometrie bestimmt. Dazu können die gebundenen Liganden vor der Massenspektrometrie spezifisch von den Ziel-Molekülen, beispielsweise durch Zugabe spezifischer Kompetitoren, freigesetzt werden. Ein solches Verfahren ist bei einem Hochdurchsatz-Screening, bei dem viele überwiegend nicht an die Ziel-Moleküle bindende Substanzen gleichzeitig auf ihr Bindeverhalten untersucht werden, sehr effizient. Das Identifizieren der gebundenen Liganden bzw. das Bestimmen der Menge der gebundenen Liganden ist nur erforderlich, wenn sich aus dem Schritt lit. c1 oder c2 ergibt, daß überhaupt gebundene Liganden vorliegen.
- Zum Ermitteln der Konzentrationen K4 und K5 oder der Mengen M1 und M2 können die Marker als externer Standard verwendet werden. Es ist auch möglich, der ersten und/oder der zweiten Mischphase nach dem Schritt lit. b mindestens einen eine Markierungssubstanz aufweisenden Marker als internen Standard zuzusetzen. Ein solcher interner Standard vereinfacht das Ermitteln der Konzentrationen K4 und K5, weil er in gleichem Maße beeinflußt wird, wie der Marker selbst. Somit lassen sich Verluste bei der Probenvorbereitung oder einer gegebenenfalls erforderlichen Aufkonzentrierung der Probe ebenso einfach berücksichtigen wie die massenspektrometrische Messung beeinflussende Störfaktoren.
- Die Ziel-Moleküle können in Membranstrukturen eingebettet vorliegen. Das kann z. B. bei Ziel-Molekülen vorteilhaft sein, die natürlicherweise in Membranstrukturen eingebettet vorliegen und deren Bindungseigenschaften verändert sind, wenn sie nicht in Membranstrukturen eingebettet sind. Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung sind die Ziel-Moleküle nicht an einen festen Träger gebunden. Dadurch wird vermieden, daß das Bindeverhalten der Ziel-Moleküle durch die Bindung an einen festen Träger verändert und/oder die Kinetik der Bindung beeinflußt wird.
- Es ist möglich, die Ziel-Moleküle nach Durchführung des Schritts lit. b oder c2 zu regenerieren. Das ermöglicht deren Wiederverwendung. Das ist besonders bei kostbaren Ziel- Molekülen sinnvoll, z. B. bei Ziel-Molekülen auf Zellen, an denen mehrere Untersuchungen durchgeführt werden sollen. Die Ziel-Moleküle, Marker oder Liganden können aus folgender Gruppe ausgewählt sein: Peptide, Proteine, insbesondere Rezeptoren, Prionen, Enzyme, Transportproteine, Ionenkanäle oder Antikörper, Hormone, Nukleinsäuren, Zucker, Polymere, niedermolekulare Verbindungen natürlichen oder synthetischen Ursprungs und Strukturen auf oder in Zellen, Zellfragmenten, Zellhomogenaten, Synaptosomen, Liposomen, Vesikeln, insbesondere synaptischen Plasmamembran-Vesikeln und in Zellen vorkommenden Vesikeln, Gewebeschnitten, Viren, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile, Kapsiden, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile und Naturstoffgemischen.
- Nachfolgend wird die Erfindung durch die Zeichnung und anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
- Fig. 1 Das Ergebnis eines erfindungsgemäß durchgeführten Verfahrens, bei dem µ-opioid-Rezeptoren als Ziel- Moleküle, Morphin als Marker und Naloxon als Ligand in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt worden ist und
- Fig. 2 das Ergebnis eines Kontrollversuchs, bei dem, µ- opioid-Rezeptoren als Ziel-Moleküle, [3H]DAMGO als Marker und Naloxon als Ligand eingesetzt worden ist.
- Bei allen Ausführungsbeispielen dienten humane µ-opioid Rezeptoren in den Bindungsansätzen als Ziel-Moleküle. Die Ziel- Moleküle wurden mittels einer Membranpräparation transfizierter humane µ-opioid Rezeptoren exprimierender CHO-K1 Zellen der Fa. Biotrend, Köln bereitgestellt.
- Ein Ansatz B0 enthielt die µ-opioid Rezeptoren in einer Konzentration von 5,5 nM, 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 µl. Der Ansatz B0 wurde 150 Minuten bei 25°C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Anschließend wurden die Membranpartikel bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Vom resultierenden Überstand Ü0 wurden 200 µl abgenommen. Folgende Bindungsansätze wurden wie B0 behandelt:
- - Ein wie B0 zusammengesetzter Bindungsansatz B1, der zusätzlich 10 nM Morphin als Marker enthielt.
- - Ein wie B1 zusammengesetzter Bindungsansatz B2, der zusätzlich (±)-Methadon in einer Konzentration von 50 µM enthielt.
- - Ein wie B1 zusammengesetzter Bindungsansatz B3, der zusätzlich die Substanzen einer Bibliothek 1, bestehend aus 4-Chloranilin, 2,3-Dichloranilin, Methylbenzoat, Acetanilid, Amitryptilin, (+)-Bicuculin, Phenol, Naloxon, Benzoesäure und Tramadol, jeweils in einer Konzentration von 1 µM enthielt.
- - Ein wie B1 zusammengesetzter Bindungsansatz B4, der zusätzlich die Substanzen einer Bibliothek 2 jeweils in einer Konzentration von 1 µM enthielt. Die Bibliothek 2 besteht abgesehen von Naloxon aus den Substanzen der Bibliothek 1.
- Aus B1-B4 wurden Überstände Ü1-Ü4 gewonnen.
- Zur Quantifizierung wurde eine massenspektrometrische Bestimmung an einem Applied Biosystems API 2000 mit TurboIonSpray- Quelle im MRM-Modus, an das ein Hewlett Packard HP1100 LC- System gekoppelt war, unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: Superspher 60 RP select B 4 µm 125 × 2 mm
Laufmittel: 0,1% HCOOH in Wasser/Acetonitril (80/20)
Fluß: 0,4 ml/Minute (isokratisch)
Probenvolumen: 20 µl (injiziert mittels Autosampler) - Morphin wurde in den Überständen Ü1-Ü4 direkt bei den Massenübergängen 286,1/115,1 und 286,1/128,1 gemessen. Es wurde gegenüber in Ü0 in Konzentrationen von 2 nM bis 10 nM gelöstem Morphin als externem Standard quantifiziert. Mit jeder Probe wurden zwei Messungen durchgeführt.
- In Ü1-Ü4 wurden folgende Konzentrationen an ungebundenem Morphin als Mittelwerte der zwei Messungen ermittelt:
Ü1: 2,25 nM
Ü2: 7,66 nM
Ü3: 7,92 nM
Ü4: 2,03 nM - Aus der jeweiligen Differenz der eingesetzten Konzentration an Morphin und der für Ü1-Ü4 ermittelten Konzentrationen an nicht gebundenem Morphin wurden die folgenden Konzentrationen an gebundenem Morphin für B1-B4 ermittelt:
B1: 7,75 nM
B2: 2,34 nM
B3: 2,08 nM
B4: 7,97 nM - In B1 wurde die Morphinbindung ohne zusätzlichen Kompetitor als Gesamtbindung gemessen. In B2 wurde dagegen die Morphinbindung in Gegenwart von 50 µM Methadon unter Bedingungen ermittelt, die eine annähernd vollständige Besetzung der Ziel- Moleküle durch Methadon erwarten läßt. Morphin hat dabei nur noch nicht spezifisch gebunden. Da in B3 die Konzentration von gebundenem Morphin lediglich in einer Größenordnung der nicht spezifischen Bindung liegt, befindet sich in der Bibliothek 1 mindestens eine Substanz, die in einer Konzentration von 1 µM eine deutliche Affinität zu den Ziel-Molekülen besitzt. Da in B4 die Konzentration von gebundenem Morphin in der Größenordnung der Gesamtbindung liegt, befindet sich in der Bibliothek 2 keine Substanz, die in einer Konzentration von 1 µM eine deutliche Affinität zu den Ziel-Molekülen besitzt. Da sich die Bibliotheken 1 und 2 nur dadurch unterscheiden, daß Naloxon in Bibliothek 1 enthalten ist, nicht aber in Bibliothek 2, kann es sich bei der affinen Substanz nur um Naloxon handeln.
- Ein erster Bindungsansatz B1 enthielt µ-opioid Rezeptoren in einer Konzentration von 5,5 nM, 10 nM Morphin als Marker, 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 µl. Der Bindungsansatz B1 wurde 150 Minuten bei 25°C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Anschließend wurden die Membranpartikel bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Vom resultierenden Überstand Ü1 wurden 200 µl abgenommen. Folgende Bindungsansätze wurden wie B1 behandelt:
- - Ein wie B1 zusammengesetzter zweiter Bindungsansatz B2, der zusätzlich (±)-Methadon in einer Konzentration von 50 µM enthielt.
- - Fünf weitere wie B1 zusammengesetzte Bindungsansätze B3-B7, die zusätzlich Naloxon in folgenden Konzentrationen enthielten: B3: 1 nM Naloxon, B4: 10 nM Naloxon, B5: 30 nM Naloxon, B6: 100 nM Naloxon, B7: 1 µM Naloxon.
- In einer zweiten auf identische Weise durchgeführten Versuchsreihe wurden die Bindungsansätze B1-B7 durch die identisch zusammengesetzten Bindungsansätze B1*-B7* ersetzt. Aus B1-B7 wurden die Überstände Ü1-Ü7 und aus B1*-B7* die Überstände Ü1*-Ü7* gewonnen.
- Die massenspektrometrische Bestimmung wurde wie unter 1.2. beschrieben durchgeführt. Zusätzlich wurde Naloxon beim Massenübergang 328,1/310,1 quantifiziert. Mit jeder Probe wurden zwei Messungen durchgeführt.
- In Ü1-Ü7 und Ü1*-Ü7* wurden folgende Konzentrationen an ungebundenem Morphin und Naloxon als Mittelwerte der zwei Messungen ermittelt:
Morphin Naloxon Ü1: 2,25 nM - Ü2: 7,66 nM - Ü3: 2,78 nM 0,35 nM Ü4: 4,15 nM 4,54 nM Ü5: 4,75 nM 15,2 nM Ü6: 7,00 nM 77,2 nM Ü7: 8,23 nM 858 nM Ü1*: 2,24 nM - Ü2*: 6,29 nM - Ü3*: 2,18 nM 0,14 nM Ü4*: 3,16 nM 2,96 nM Ü5*: 4,43 nM 13,0 nM Ü6*: 5,50 nM 61,7 nM Ü7*: 5,86 nM 668 nM - Aus der jeweiligen Differenz der eingesetzten Konzentration an Morphin und der für Ü1-Ü7 sowie Ü1*-Ü7* ermittelten Konzentrationen an nicht gebundenem Morphin wurden die folgenden Konzentrationen an gebundenem Morphin für B1-B7 sowie B1*-B7* ermittelt:
B1: 7,75 nM B1*: 7,76 nM B2: 2,34 nM B2*: 3,71 nM B3: 7,22 nM B3*: 7,82 nM B4: 5,85 nM B4*: 6,84 nM B5: 5,15 nM B5*: 5,57 nM B6: 3,00 nM B6*: 4,50 nM B7: 1,77 nM B7*: 4,14 nM - In B1 und in B1* wurde die Morphinbindung ohne zusätzlichen Kompetitor als Gesamtbindung gemessen. In B2 und in B2* wurde dagegen die Morphinbindung in Gegenwart von 50 µM Methadon unter Bedingungen ermittelt, die eine annähernd vollständige Besetzung der Ziel-Moleküle durch Methadon erwarten läßt. Morphin hat dabei nur noch nicht spezifisch gebunden. Die spezifische Bindung ergibt sich aus der Differenz der für B1 und B2 bzw. B1* und B2* ermittelten Konzentrationen. In Fig. 1 ist die Konzentration des gebundenen Morphins in Abhängigkeit von der Konzentration des ungebundenen, d. h. freien Naloxons dargestellt.
- Mittels einer mit dem Programm Prism 2.01 Graph Pad, San Diego, USA durchgeführten nicht linearen Regressionsanalyse wurde die Konzentration an freiem Naloxon ermittelt, bei der 50 % des Morphins spezifisch gebunden sind. Dieser Wert wird als IC50-Wert bezeichnet. Für die Bindungsansätze B1-B7 wurde ein IC50-Wert von 11,9 nM und für die Bindungsansätze B1* -B7* ein IC50-Wert von 11,6 nM ermittelt.
- Der Ki-Wert als Maß für die Affinität von Naloxon zu den Ziel-Molekülen läßt sich gemäß Hulme, E. C. und Birdsall, N. J. M., Strategy and tactics in receptor-binding studies in Receptor-Ligand-Interactions, ed. Hulme, E. C., Oxford University Press, Oxford (1992), 63-176 in Bindungsexperimenten, bei denen die Konzentration des freien Markers gegenüber der Marker-Ausgangskonzentration in nicht zu vernachlässigendem Ausmaß verschieden ist, folgendermaßen berechnen:
- Dabei bedeutet
L*: Konzentration des Markers beim IC50-Wert,
L0*: Konzentration des freien Markers in Abwesenheit des Kompetitors und
Kd: Affinität des Markers zu den Ziel-Molekülen. - Aus Raynor, K., Kong, H., Mestek, A., Bye, L. S., Tian, M., Liu, J., Yu, L. und Reisine, T., Characterisation of the cloned Mu opioid Receptor, J. Pharmacol. Exp. Ther. 272 (1995), 423-428 ist es bekannt, daß der Kd-Wert für Morphin 2,0 nM beträgt. Für B1-B7 ergibt sich daraus bei
IC50 = 11,9 nM
L* = 4,8 nM
L0*= 2,25 nM
ein Ki für Naloxon von 1,4 nM gegenüber den humanen µ-opioid- Rezeptoren. - Für B1*-B7* ergibt sich bei
IC50 = 11,6 nM
L* = 4,2 nM
L0*= 2,24 nM
ein Ki für Naloxon von 1,7 nM gegenüber den humanen µ-opioid- Rezeptoren. - Bei [3H]DAMGO handelt es sich um den mit 3H markierten µ- opioid Rezeptor Agonisten Tyr-D-Ala-Gly-N-Methyl-Phe-Gly(ol)- Enkephalin. 22 µg Protein einer 30 fmol humane µ-opioid Rezeptoren enthaltenden Membranpräparation transfizierter CHO- K1 Zellen der Fa. Biotrend, Köln wurden, wie bei Wanner, K. T., Praschak, I., Höfner, G. und Beer, H., Asymmetric Synthesis and Enantiospecificity of Binding of 2-(1,2,3,4- Tetrahydro-1-isoquinolinyl)-ethanol derivatives to µ- and κ- receptors, Arch. Pharm. 329 (1996), 11-22 beschrieben, jeweils mit 4,5 nM [3H]DAMGO und 0 nM, 1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM bzw. 1 µM Naloxon 60 Minuten bei 25°C in einem Gesamtvolumen von 250 µl inkubiert. Die nicht spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 50 µM (±)-Methadon ermittelt. Es wurden 2 Versuchsreihen jeweils in Form von Triplikaten durchgeführt. In Fig. 2 ist die Konzentration des gebundenen [3H]DAMGO in Abhängigkeit von der Konzentration des eingesetzten Naloxons dargestellt. Mittels einer mit dem Programm Prism 2.01 Graph Pad, San Diego, USA durchgeführten nicht linearen Regressionsanalyse wurde der IC50-Wert, d. h. die Konzentration an Naloxon ermittelt, bei der 50% des [3H]DAMGO spezifisch gebunden sind. Aus Raynor, K., Kong, H., Mestek, A., Bye, L. S., Tian, M., Liu, J., Yu, L. und Reisine, T., Characterisation of the cloned Mu opioid Receptor, J. Pharmacol. Exp. Ther. 272 (1995), 423-428 ist es bekannt, daß der Kd-Wert für DAMGO 1,4 nM beträgt. Gemäß Cheng, Y. C. und Prusoff, W. H., Relationship between the inhibition constant Ki and the concentrationn of inhibitor which causes 50 cent inhibition IC50 of an enzymatic reaction, Biochem. Pharmacol. 22 (1973), 3099-3108 wurden aus dem Kd-Wert für DAMGO und den IC50-Werten von 18 nM bzw. 17 nM aus der 1. bzw. 2. Versuchsreihe folgende Ki-Werte für Naloxon gegenüber humanen µ- opioid-Rezeptoren berechnet:
1. Versuchsreihe Ki = 4,2 nM
2. Versuchsreihe Ki = 4,1 nM - Es wurden die im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Bindungsansätze B1-B4 verwendet und wie unter 1.1. beschrieben behandelt. Nach der Zentrifugation aus B1-B4 erhaltene Pellets P1-P4 wurden folgendermaßen behandelt: P1-P4 wurden je dreimal mit 200 µl 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 gewaschen. Anschließend wurden P1-P4 in jeweils 200 µl 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 resuspendiert, 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Schüttelwasserbad inkubiert und bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden verworfen und die erhaltenen Pellets P1'-P4' mit je 200 µl 50 µM (±)-Methadon in 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 resuspendiert und nochmals 15 Minuten wie zuvor inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend wie zuvor zentrifugiert, wodurch die Überstände F1-F4 gewonnen wurden.
- Das in F1-F4 enthaltene Morphin wurde wie unter 1.2. beschrieben quantifiziert.
- In F1-F4 wurden folgende Konzentrationen an ungebundenem, d. h. freigesetztem Morphin als Mittelwerte der zwei Messungen ermittelt:
F1: 4,84 nM
F4: 4,80 nM
F2/F3: Morphin nicht nachweisbar - In B1 wurde die Morphinbindung ohne zusätzlichen Kompetitor als Gesamtbindung gemessen. In B2 wurde dagegen die Morphinbindung in Gegenwart von 50 µM Methadon unter Bedingungen ermittelt, die eine annähernd vollständige Besetzung der Ziel- Moleküle durch Methadon erwarten läßt. Morphin hat dabei nur noch nicht spezifisch gebunden. Aus P2' konnte offensichtlich kein Morphin freigesetzt werden, da Morphin in F2 nicht nachweisbar war. Dementsprechend kann angenommen werden, daß das aus P1' freigesetzte und in F1 nachgewiesene Morphin spezifisch gebunden war. Da aus P4' annähernd genauso viel Morphin in F4 freigesetzt wurde wie aus P1' in F1, enthält die Bibliothek 2 offensichtlich keinen Liganden mit ausgeprägter Affinität zu den Ziel-Molekülen. Aus P3' konnte offensichtlich kein Morphin freigesetzt werden, da Morphin in F3 nicht nachweisbar war. Demnach enthält die Bibliothek 1 offensichtlich mindestens eine Substanz, die in einer Konzentration von 1 µM eine deutliche Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweist. Da sich die Bibliotheken 1 und 2 nur dadurch unterscheiden, daß Naloxon in Bibliothek 1 enthalten ist, nicht aber in Bibliothek 2, kann es sich bei der affinen Substanz nur um Naloxon handeln.
- Die Bindungsansätze B1#-B4# waren abgesehen davon, daß die Substanzen der Bibliothek 1 und der Bibliothek 2 jeweils in einer Konzentration von 10 nM statt 1 µM vorlagen, identisch mit den Bindungsansätzen B1-B4 in Ausführungsbeispiel 1. Die Bindungsansätze wurden wie unter 1.1. beschrieben behandelt. Durch die Zentrifugation wurden aus den Bindungsansätzen B1#-B4# Überstände Ü1#-Ü4# und Pellets P1#-P4# erhalten. P4# wurde verworfen. P1#-P3# wurden je dreimal mit 200 µl 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 gewaschen. Anschließend wurden P1#-P3# in jeweils 200 µl 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 resuspendiert, 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Schüttelwasserbad inkubiert und bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden verworfen und die erhaltenen Pellets P1# '-P3#' mit je 200 µl 50 µM (±)-Methadon in 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 resuspendiert und nochmals 15 Minuten wie zuvor inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend wie zuvor zentrifugiert, wodurch die Überstände F1#-F3# gewonnen wurden.
- In Ü1#-Ü4# und in F1#-F3# wurde ungebundenes bzw. freigesetztes Morphin wie unter 1.2. beschrieben quantifiziert. In F3# wurden zusätzlich auch die einzelnen Substanzen der Bibliothek 1 bei den jeweils spezifischen Massenübergängen quantifiziert. Außer Naloxon war jedoch keine der Substanzen in F3# nachweisbar. Das freigesetzte Naloxon wurde beim Massenübergang 328,1/310,1 quantifiziert. Mit jeder Probe wurden 2 Messungen durchgeführt.
- In Ü1#-Ü4# wurden folgende Konzentrationen an ungebundenem Morphin als Mittelwerte ermittelt:
Ü1#: 2,39 nM
Ü2#: 7,80 nM
Ü3#: 5,02 nM
Ü4#: 2,76 nM - Da in B4# aus der Bibliothek 2 offensichtlich kein Ligand mit deutlicher Affinität zu den Ziel-Molekülen enthalten war, wurde P4# verworfen.
- In F1#-F3# wurden die folgenden durchschnittlichen Konzentrationen an freigesetztem Morphin und Naloxon ermittelt:
- In F3# konnte Naloxon und Morphin in annähernd gleichen Konzentrationen nachgewiesen werden. Offensichtlich besitzt von den Substanzen in Bibliothek 1 nur Naloxon hohe Affinität zum Ziel-Molekül, während die übrigen Substanzen eine deutlich niedrigere Affinität besitzen. Da der identifizierte Ligand Naloxon und der Marker Morphin in gleichen Konzentrationen im Bindungsansatz B3# enthalten waren, kann geschlossen werden, daß der freigesetzte identifizierte Ligand Naloxon eine Affinität zu Ziel-Molekülen besitzt, die im Bereich der Affinität des Markers Morphin liegt.
Claims (23)
1. Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an
Ziel-Molekülen spezifisch an mindestens einer Bindungsstelle
bindenden Liganden mit folgenden Schritten:
oder
a) Herstellen einer ersten Mischphase, in welcher die
Liganden in einer Konzentration K1 mit an die Ziel-Moleküle
spezifisch bindenden Markern in einer Konzentration K2 und
den Ziel-Molekülen in einer Konzentration K3 in Kontakt
gebracht werden und einer zweiten Mischphase, in welcher die
Marker mit den Ziel-Molekülen in Kontakt gebracht werden,
wobei die erste und die zweite Mischphase nach dem
Inkontaktbringen unter identischen eine Bindung der Liganden und der
Marker an die Ziel-Moleküle erlaubenden Bedingungen inkubiert
werden,
b) Absondern der in der ersten Mischphase enthaltenen
gebundenen Marker GM1 von der ersten und der in der zweiten
Mischphase enthaltenen gebundenen Marker GM2 von der zweiten
Mischphase und
c) Ermitteln einer Konzentration K4 der ungebundenen Marker
in der ersten und einer Konzentration K5 der ungebundenen
Marker in der zweiten Mischphase, wobei aus der Konzentration
K5 eine Konzentration K6 ermittelt wird, welche der
Konzentration der ungebundenen Marker in der zweiten Mischphase
unter der Annahme entspricht, daß darin die Marker in der
Konzentration K2 mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3
in Kontakt gebracht worden sind, sowie Bestimmen des
Bindeverhaltens der Liganden aus dem Verhältnis zwischen den
Konzentrationen K6 und K4
1. Ermitteln einer Menge M1 der gebundenen Marker GM1 und
einer Menge M2 der gebundenen Marker GM2, wobei aus der Menge
M2 eine Menge M3 ermittelt wird, welche der Menge der
gebundenen Marker in der zweiten Mischphase unter der Annahme
entspricht, daß darin die Marker in der Konzentration K2 mit den
Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt gebracht
worden sind, sowie Bestimmen des Bindeverhaltens der Liganden
aus dem Verhältnis zwischen den Mengen M3 und M1,
wobei die Marker in nativer Form vorliegen und das Ermitteln der Konzentrationen K4 und K5 oder der Mengen M2 und M1 mittels Massenspektrometrie erfolgt.
wobei die Marker in nativer Form vorliegen und das Ermitteln der Konzentrationen K4 und K5 oder der Mengen M2 und M1 mittels Massenspektrometrie erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Marker in der
zweiten Mischphase beim Schritt lit. a in der Konzentration K2
mit den Ziel-Molekülen in der Konzentration K3 in Kontakt
gebracht werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei von den
gebundenen Markern GM1 die spezifisch gebundenen Marker SGM1 und von
den gebundenen Markern GM2 die spezifisch gebundenen Marker
SGM2 nach dem Schritt lit. b freigesetzt werden und wobei
beim Schritt lit. c2 die freigesetzten spezifisch gebundenen
Marker SGM1 anstelle der gebundenen Marker GM1 und die
freigesetzten spezifisch gebundenen Marker SGM2 anstelle der
gebundenen Marker GM2 treten.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schritte
lit. a bis c1 oder c2 ein weiteres mal durchgeführt werden,
wobei der ersten und/oder der zweiten Mischphase beim Schritt
lit. a ein mit den Markern um die spezifische Bindung an den
Ziel-Molekülen konkurrierender Stoff in einer solchen Menge
zugesetzt wird, daß eine spezifische Bindung der Marker an
den Ziel-Molekülen weitgehend verhindert oder aufgehoben
wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
zur Bestimmung der Affinität der Liganden zu den Ziel-
Molekülen die Schritte lit. a bis c1 oder c2 zumindest
zweimal mit einem voneinander abweichenden Verhältnis der
Konzentrationen K1 zu K3 durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Absondern gemäß lit. b durch Dialyse, Präzipitation,
Adsorption, Bindung an immobilisierte Moleküle mit einer
Affinität zu den Ziel-Molekülen oder zu gebildeten Komplexen aus
den Ziel-Molekülen und den Markern und/oder den Liganden,
Zentrifugation, Chromatographie oder Filtration, insbesondere
Ultrafiltration, erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Absondern gemäß lit. b unter Bedingungen durchgeführt
wird, unter denen die Konzentration der ungebundenen Marker
in der ersten und der zweiten Mischphase und/oder die Menge
der gebundenen Marker GM1 und GM2 konstant bleibt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Massenspektrometrie im MS-, MS/MS- oder MSn-Modus
durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der Massenspektrometrie eine Kapillarelektrophorese oder Gas-
oder Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, insbesondere
unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie,
vorgeschaltet wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
vor der Massenspektrometrie eine Probenvorbereitung mittels
Extraktion, vorzugsweise Festphasen- oder Flüssig-Flüssig-
Extraktion, Filtration, insbesondere Ultrafiltration,
Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese,
Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, FPLC®,
Umkehrphasenchromatographie, Größenausschlußchromatographie und/oder
Affinitätschromatographie, durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die erste und die zweite Mischphase gemäß Schritt lit. a,
vorzugsweise mehr als 10, insbesondere mehr als 100,
verschiedene Ziel-Moleküle und/oder Marker enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die erste und die
zweite Mischphase gemäß Schritt lit. a einen für verschiedene
Ziel-Moleküle spezifischen gemeinsamen Marker enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei sich die
verschiedenen Marker wenigstens hinsichtlich der molaren Masse,
der Bildung von Ionen oder Tochterionen bei der
Massenspektrometrie oder des chromatographischen oder
elektrophoretischen Verhaltens voneinander unterscheiden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die erste Mischphase gemäß Schritt lit. a, vorzugsweise mehr
als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Liganden
enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Liganden durch
Methoden der kombinatorischen Chemie erzeugt sind.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
nach Schritt lit. c1 oder c2 die gebundenen Liganden mittels
Massenspektrometrie identifiziert werden und/oder die Menge
der gebundenen Liganden mittels Massenspektrometrie bestimmt
wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die gebundenen
Liganden vor der Massenspektrometrie spezifisch von den Ziel-
Molekülen freigesetzt werden.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
zum Ermitteln der Konzentrationen K4 und K5 oder der Mengen
M1 und M2 die Marker als externer Standard verwendet werden.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der ersten und/oder der zweiten Mischphase nach dem Schritt
lit. b mindestens ein eine Markierungssubstanz aufweisender
Marker als interner Standard zugesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Ziel-Moleküle in Membranstrukturen eingebettet vorliegen.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Ziel-Moleküle nicht an einen festen Träger gebunden sind.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Ziel-Moleküle nach Durchführung des Schritts lit. b oder
c2 regeneriert werden.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Ziel-Moleküle, Marker oder Liganden aus folgender Gruppe
ausgewählt sind: Peptide, Proteine, insbesondere Rezeptoren,
Prionen, Enzyme, Transportproteine, Ionenkanäle oder
Antikörper, Hormone, Nukleinsäuren, Zucker, Polymere,
niedermolekulare Verbindungen natürlichen oder synthetischen Ursprungs
und Strukturen auf oder in Zellen, Zellfragmenten,
Zellhomogenaten, Synaptosomen, Liposomen, Vesikeln, insbesondere
synaptischen Plasmamembran-Vesikeln und in Zellen
vorkommenden Vesikeln, Gewebeschnitten, Viren, deren Bestandteilen
oder Fragmenten dieser Bestandteile, Kapsiden, deren
Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile und
Naturstoffgemischen.
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