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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE10042023 C2
Publication typeGrant
Application numberDE2000142023
Publication date10 Apr 2003
Filing date8 Aug 2000
Priority date8 Aug 2000
Also published asCA2417714A1, DE10042023A1, DE60123806D1, EP1309867A2, EP1309867B1, US20040014073, WO2002012888A2, WO2002012888A3
Publication number00142023, 2000142023, DE 10042023 C2, DE 10042023C2, DE-C2-10042023, DE00142023, DE10042023 C2, DE10042023C2, DE2000142023
InventorsDieter Trau, Reinhard Renneberg, Frank Caruso
ApplicantBiognostic Ag
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet
Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln, und deren Verwendung bei Bioassays zum Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe Capsules encapsulating solid particles of signal-generating organic substances, and their use in bioassays for detection of target molecules in a sample translated from German
DE 10042023 C2
Abstract  available in
Claims(25)  translated from German
1. Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substan zen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und an ihrer äußeren Oberfläche Affinitäts moleküle tragen, um Zielmoleküle spezifisch zu erkennen und daran zu binden. 1. capsules, the solid particles of signal-generating Substan zen encapsulate that can be released and dissolved, and carry on their outer surface affinity molecules to specifically recognize and bind to target molecules.
2. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe der Peptide oder Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhy drate, Liganden mit niedrigem Molekulargewicht und mo lekular aufgedruckten Polymeren (MIPs) oder Mischungen derselben. 2. Capsules according to Claim 1, characterized in that the affinity molecules are selected from the group of peptides or proteins, nucleic acids, hydrates Kohlenhy, ligands with low molecular weight and Mo lekular imprinted polymers (MIPs) or mixtures thereof.
3. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide oder Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe der Antikörper, Rezeptoren, Antigene, Lektine, Avidine, Oligopeptide, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptidhormone und Allergene oder Teilen derselben. 3. Capsules according to claim 2, characterized in that the peptides or proteins are selected from the group of antibodies, receptors, antigens, lectins, avidins, oligopeptides, lipoproteins, glycoproteins, peptide hormones and allergens or parts thereof.
4. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe der einzel- oder doppelsträngigen DNAs, RNAs, Oligonucleo tide, Ribozyme, Aptamere und Teilen derselben. 4. Capsules according to claim 2, characterized in that the nucleic acids are selected from the group of single or double stranded DNAs, RNAs, Oligonucleo tide, ribozymes, aptamers and parts thereof.
5. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenhydrate ausgewählt sind aus der Gruppe der Mono-, Oligo- und Polysaccharide, Glycolipide, Proteo polysaccharide und Teilen derselben. 5. Capsules according to claim 2, characterized in that the carbohydrates are selected from the group of the mono-, oligo- and polysaccharides, glycolipids, proteo polysaccharides and parts thereof.
6. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mit niedrigem Molekulargewicht Biotin oder ein Biotin-Derivat, ein Steroid oder Hormon, ein Cofak tor oder Coenzym, ein Aktivator, Inhibitor, Pseudosub strat oder eine prosthetische Gruppe eines Enzyms, ein Arzneimittel, ein Pestizid, ein Allergen oder Digoxin oder ein Hapten ist. 6. Capsules according to claim 2, characterized in that the low molecular weight ligand is biotin or a biotin derivative, a steroid or hormone, a Cofak gate or coenzyme, an activator, inhibitor, Pseudosub strate or a prosthetic group of an enzyme, a drug , a pesticide, an allergen or digoxin or a hapten.
7. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle an die äußere Oberfläche der Kapseln konjugiert oder direkt oder über Linker-Mole küle daran gebunden sind. 7. Capsules according to claim 2, characterized in that the affinity molecules are conjugated to the outer surface of the capsules or directly or via linker molecules moles are bound thereto.
8. Kapseln nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Linker-Molekül ein Biomolekül ist, vorzugsweise Avidin, Streptavidin, Neutravidin, Protein A, Protein G, Lektin oder ein niedermolekularer Vernetzer. 8. Capsules according to claim 6, characterized in that the linker molecule is a biomolecule, preferably avidin, streptavidin, neutravidin, protein A, protein G, lectin or a low molecular weight crosslinker.
9. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen signalerzeugender Substanzen Kristalle, amorphe oder lyophilisierte Teil chen, sprühgetrocknete Teilchen, gemahlene Teilchen oder Mischungen derselben sind. 9. Capsules according to claim 1, characterized in that the encapsulated solid particle of signal-generating substances Chen crystals, amorphous or lyophilized part, spray-dried particles are ground particles, or mixtures thereof.
10. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen eine Teilchengröße von 10 nm bis 10 µm, vorzugsweise etwa 100 nm aufwei sen. 10. Capsules according to claim 1, characterized in that the encapsulated solid particle has a particle size of 10 nm to 10 microns, preferably about 100 nm sen aufwei.
11. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen signalerzeugender Substanzen niedermolekulare Substanzen sind, ausgewählt aus der Gruppe der Fluorophore, Luminophore, Chromo phore, Enzymsubstrate, prosthetischen Gruppen, oder re doxaktive Substanzen, ausgewählt aus Redoxvermittlern, elektrodenaktiven Substanzen, Metallsalzen. 11. Capsules according to claim 1, characterized in that the encapsulated solid particle of signal-generating agents are low molecular weight substances selected from the group of fluorophores, luminophores, chromo phore, enzyme substrates, prosthetic groups, or re doxaktive substances selected from redox mediators, electrode active substances, metal salts.
12. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen signalerzeugender Substanzen hochmolekulare Substanzen sind, ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme und ihrer Vorläufer, bio luminogenen und fluorogenen Proteine, Nucleinsäuren, Ribozyme und Aptamere. 12 capsules according to claim 1, characterized in that the encapsulated solid particles of signal-generating substances are high molecular weight substances selected from the group of enzymes and their precursors, organic luminogenic and fluorogenic proteins, nucleic acids, aptamers, ribozymes and.
13. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapselwandungen aus einer oder mehreren Polyelek trolyt-Schichten bestehen. 13. Capsules according to claim 1, characterized in that the capsule walls consist of one or more Polyelek trolyte layers.
14. Kapseln nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyelektrolyte in einer Schicht und/oder zwischen den Schichten vernetzt sind. 14. Capsules according to claim 13, characterized in that the polyelectrolytes are crosslinked in a layer and / or between the layers.
15. Kapseln nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyelektrolyte aus organischen Polymeren, Biopoly meren und Mischungen derselben ausgewählt sind. 15. Capsules according to claim 13, characterized in that the polyelectrolytes of organic polymers, biopolymers and mixtures thereof mers are selected.
16. Kapseln nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Polymer ein aus Polyamin (PAH), Polysul fonsäure (PSS), Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyamiden, Poly-2-hydroxybutyrat (PHB), Polyca prolacton (PCL), fluoreszenzmarkierten Polymeren und ihren Copolymeren und/oder Mischungen derselben ausge wähltes Polymer ist. 16. Capsules according to claim 15, characterized in that the organic polymer is a sulfonic acid selected from polyamine (PAH), polysulfide (PSS), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polyamides, poly-2-hydroxybutyrate (PHB), Polyca prolacton (PCL), fluorescent labeled polymers and their copolymers and / or mixtures thereof be selective polymer.
17. Kapseln nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Biopolymer ausgewählt ist aus Polyaminosäuren, ins besondere Peptiden, Polylysin, aus Polykohlenhydraten, insbesondere Dextrin, Pektin, Alginat, Glycogen, Amylo se, Chitin, Chondroitin, Hyaluronsäure, aus Polynucleo tiden, insbesondere DNA, RNA, Oligonucleotide, sowie aus modifizierten Biopolymeren, insbesondere Carboxy methylcellulose, Carboxymethyldextran oder Ligninsul fonate. 17. Capsules according to claim 15, characterized in that the biopolymer is selected from polyamino acids, in particular peptides, polylysine, from Polykohlenhydraten, especially dextrin, pectin, alginate, glycogen, Amylo se, chitin, chondroitin, hyaluronic acid, tiden from Polynucleo, in particular DNA, RNA, oligonucleotides, and from modified biopolymers, especially carboxy methyl cellulose, carboxymethyl dextran or Ligninsul sulfonates.
18. Verfahren zum optischen, elektrochemischen oder chemi schen Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in ei ner Probe unter Nutzung der auf Affinität beruhenden Wechselwirkungen zwischen dem Zielmolekül und einem Af finitätsmolekül für die spezifische Erkennung des Ziel moleküls, umfassend die Schritte: 18. A method for optical, electrochemical or chemical detection of a rule or more target molecules in egg ner sample by using the affinity-based interactions between the target molecule and an Af finitätsmolekül molecule for the specific detection of the target, comprising the steps of:
  • a) Inkubieren der Zielmoleküle mit Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und an ihrer, äußeren Oberfläche die entsprechenden Affinitätsmoleküle tragen, a) incubating the target molecules with capsules encapsulating solid particles of signal-generating substances that may be released and dissolved, and its outer surface bearing the corresponding affinity molecules,
  • b) Abtrennen des resultierenden Komplexes aus Ziel- und Affinitätsmolekül von den Kapseln mit unumgesetzten Affinitätsmolekülen auf deren Oberfläche, b) separating the resulting complex of target and affinity molecule, from the capsules with unreacted affinity molecules on their surface
  • c) Freisetzen und Lösen der eingekapselten festen Teilchen der signalerzeugenden Substanzen durch Behandeln des erhaltenen Ziel/Affinitäts-Kom plexes mit physikalischen Mitteln ausgewählt aus Ultraschall-Zermahlung oder elektrischem Impuls oder chemischen Mitteln ausgewählt aus Behandeln mit einem organischen Lösungsmittel oder mit einem Enzym, Ribozym oder Aptamer oder durch Ändern des pH-Werts c) releasing and release of the encapsulated solid particles of signal-generating substances by treating the resulting target / affinity com plex by physical means selected from ultrasonic grinding of or electric pulse or chemical means selected from treatment with an organic solvent or with an enzyme, ribozyme or aptamer or by changing the pH
  • d) Nachweisen oder Quantifizieren des Signals, das durch die freigesetzten und gelösten signaler zeugenden Substanzen erzeugt wird und das in direkter oder indirekter Beziehung zur Menge der Zielmoleküle steht. d) detecting or quantifying the signal generated by the released and dissolved signaler-forming substances and which is directly or indirectly related to the amount of target molecules.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe der Alkohole, insbesondere Ethanol und Methanol, Ketone, insbesondere Aceton, Ester, insbesondere Ethyl ester, Aromaten, insbesondere Toluol, Sulfoxide, ins besondere DMSO, sowie Ether, besonders Dimethylether, oder aus Mischungen organischer Lösungsmittel mit Was ser. 19. The method according to claim 18, characterized in that the organic solvent is selected from the group of alcohols, especially ethanol and methanol, ketones, especially acetone, esters, especially ethyl esters, aromatics, especially toluene, sulfoxides, in particular DMSO and ethers, particularly dimethyl ether, or mixtures of organic solvents with water What.
20. Kit für den optischen, elektrochemischen oder chemi schen Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe, umfas send Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Sub stanzen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und an ihrer äußeren Oberfläche Affinitäts moleküle zum spezifischen Erkennen und Binden an ein Zielmolekül tragen. Encapsulating 20. Kit for optical, electrochemical or chemical's detection of target molecules in a sample, comprehensive transmitting capsules, solid particles punching signal-generating sub, which can be released and dissolved, and at its outer surface affinity molecules for specific recognition and binding a target molecule wear.
21. Kit nach Anspruch 20, umfassend einen Eintauchstreifen. 21. The kit of claim 20 comprising a dipstick.
22. Kit für den optischen, elektrochemischen oder chemi schen Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe, umfas send 22. Kit for optical, electrochemical or chemical detection of target molecules's in a sample, sending compre
  • a) Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Sub stanzen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und Affinitätsmoleküle binden sollen; to bind a) capsules encapsulating solid particles of signal-generating sub stances, which can be released and dissolved, and affinity molecules;
  • b) Agenzien zur Modifizierung von Affinitätsmolekülen, so daß sie zur Bindung an die Oberfläche der Kap seln geeignet sind; b) agents for the modification of affinity molecules to make them suitable to bind to the surface of the Cape islands;
  • c) Agenzien zur Durchführung der Bindungsreaktion zwi schen den Kapseln und Affinitätsmolekülen. c) agents for performing the binding reaction between the capsules and the affinity molecules rule.
23. Kit nach Anspruch 22, umfassend einen Eintauchstreifen. 23. The kit of claim 22 comprising a dipstick.
24. Verwendung der Kapseln nach den Ansprüchen 1 bis 17 in Bioassays für den optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen. 24. Use of the capsules according to claims 1 to 17 in bioassays for optical, electrochemical or chemical detection of target molecules.
25. Verwendung nach Anspruch 24 zusammen mit einem Ein tauchstreifen. 25. Use according to claim 24 dip strips together with a one.
Description  translated from German

Die vorliegende Erfindung betrifft Kapseln, die feste Teil chen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle tragen, die Zielmole küle in einer Probe spezifisch erkennen und daran binden. The present invention relates to capsules encapsulating solid part chen signal-generating substances and carrying on its outer surface affinity molecules Zielmole molecules in a sample specifically recognize and bind to it. Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung dieser Kapseln zur Signalerzeugung beim optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen. The invention relates to the use of such capsules for signal generation in the optical, electrochemical or chemical detection of target molecules. Es wird ein Nach weisverfahren und ein Kit bereitgestellt. It is a process-oriented and After a kit provided.

Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, nach denen jeder beliebige Verbindungstyp in Mikrokapseln eingeschlossen werden kann. There are a variety of methods by which any desired connection type can be encapsulated in microcapsules. In der Regel werden dabei die den Mikrokapseln einzuverleibenden Substanzen in einem Lösungsmittel gelöst. As a rule, the microcapsules to be incorporated substances are dissolved in a solvent. So wird z. B. in DE 31 36 606 C2 ein Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden Mikrokapseln beschrieben. Thus, for. Example, in DE 31 36 606 C2 describes a process for the preparation of a drug-containing microcapsules.

Es ist weiterhin bekannt, nanokristalline magnetische Partikel, die aus einem Eisenoxidkern und einer an diesen Kern chemisorbierten Hülle bestehen, zur in-vivo-Therapie und - Diagnostik (Radiotherapie, Hyperthermie, Chemotherapie, MR- Diagnostik, biomagnetische Sonde) zu verwenden (vgl. EP 0 516 252 A2). It is also known, nanocrystalline magnetic particles consisting of an iron oxide core and a chemisorbed at these nuclear envelope, for in vivo therapy and - diagnostics (radiotherapy, hyperthermia, chemotherapy, MR diagnostics, biomagnetic probe) should be used (see FIG. EP 0516252 A2).

Bioassays wie Festphasen-Enzym-Immungssays (ELISA), Radio immungssays (RIA), Fluoreszenz-Immungssays (FIA) oder Im munagglutinationsassays sind in der Fachwelt bekannt und spielen eine wichtige Rolle beim Nachweis von Analyten in der medizinischen Diagnose, bei Umweltanalysen und Lebens mittelanalysen. Bioassays such as solid phase enzyme immunoassay (ELISA), radio immunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA) or in munagglutinationsassays are in the professional world and play an important role in the detection of analytes in medical diagnosis, medium analyzes in environmental analysis and life , Bioassays beruhen auf der Wechselwirkung eines markierten Biomoleküls mit einem nachzuweisenden Ana lyten. Bioassays based on the interaction of a labeled biomolecule with a detected Ana electrolytes. Die Markierung fungiert als Hilfsmittel, um die Wechselwirkung sichtbar zu machen. The label acts as a tool to make the interaction visible. Es sind verschiedene Ar ten von Markierungen bekannt: Enzyme bei ELISAs, Radioiso tope bei RIAs, Fluorophore bei FIAs, Liposomen, Latex-Teil chen bei Immunagglutinationsassays, sowie Farbstoffe, Ver mittler, Gold-Teilchen und DNA. Various Ar th of markers known: enzymes in ELISAs, RIAs in Radioiso tope, fluorophores at FIAs, liposomes, latex-chen part in immuno agglutination assays, as well as dyes, United medium, gold particles and DNA.

Die wichtigsten Anforderungen an Bioassays sind Spezifität und Empfindlichkeit. The most important requirements for bioassays are specificity and sensitivity. Die Spezifität wird durch das Bioer kennungsmolekül bestimmt, z. B. das Zusammenpassen der Bindungsstelle eines Antikörpers mit seinem Antigen (Analyt) oder die Hybridisierung zweier komplementärer Nucleinsäure- Stränge. The specificity is determined by the identifier molecule Bioer, for. Example, the mating of the binding site of an antibody with its antigen (analyte) or the hybridization of two complementary nucleic acid strands. Die Empfindlichkeit eines Bioassays wird ebenfalls durch das Bioerkennungsmolekül aufgrund der Affinitätskon stante seiner biologischen Wechselwirkung beeinflußt. The sensitivity of a bioassay is also affected by the biorecognition molecule due to the constant Affinitätskon its biological interaction. Die Markierung fungiert als Marker für das Biomolekül und läßt sich mit verschiedenen Techniken messen: i) optisch durch Messung der Absorption eines Farbstoffs oder des durch Fluorophore angeregten Fluoreszenzlichts, oder turbidi metrisch durch die Lichtstreuung agglutinierter Latex-Teil chen, ii) auf radioaktivem Wege durch Messen von Radio isotopen, iii) elektrochemisch durch Messen von Vermittlern oder elektroaktiven Substanzen. The label acts as a marker for the biomolecule and can be measured by various techniques: i) optical surfaces by measuring the absorbance of the dye or the excited fluorophores fluorescent light, or turbidi metric agglutinated by the light scattering latex part ii) of radioactive routes isotopic measurement of radio, iii) electrochemically by measuring mediators or electroactive substances.

Die Empfindlichkeit von Bioassays wird in erheblichem Maße durch die Beschaffenheit der Markierung und die zur Messung der Konzentration der Markierung eingesetzte Nachweistech nik bestimmt. The sensitivity of the bioassay is largely determined by the nature of the label and the Nachweistech used for measuring the concentration of the marker technology. Die RIA-Technologie, bei der Radioisotope verwendet werden, ist nach wie vor die empfindlichste Me thode. The RIA technology may be used in radioisotope is still the most sensitive method Me. Diese überaus leistungsfähige Technik wurde 1959 von Yalow und Berson eingeführt und wurde zu einem neuen Gebiet in der analytischen Chemie sowie in der Diagnostik und Me dizin. This extremely powerful technique was introduced by Yalow and Berson in 1959 and was cine to a new field in analytical chemistry as well as in the diagnosis and Me. Allerdings besteht bei dieser Technik der Nachteil, daß sich das Risiko gefährlicher Kontaminationen von Menschen und Umwelt aufgrund der verwendeten radioaktiven Isotope nicht auf Null reduzieren läßt. However, with this technique, the disadvantage that the risk of dangerous contamination of people and the environment due to the used radioactive isotopes can not be reduced to zero.

Daher wurden nicht-radioaktive Methoden mit dem Ziel ent wickelt und verbessert, eine vergleichbare Empfindlichkeit zu erreichen. Therefore, non-radioactive methods with the goal developed and improved, to achieve a comparable sensitivity. Die Bedeutung der auf Fluoreszenz, Lumi neszenz und Absorptionsspektroskopie beruhenden optischen Verfahren nahm mit der Zeit zu und ist noch immer im Ansteigen begriffen. The importance of fluorescence-based, Luminescence and optical absorption spectroscopy method increased with time and is still rising.

Bei der ELISA-Technologie werden Enzyme als Marker zur Si gnalverstärkung verwendet. In the ELISA technology enzymes are used as markers for Si gnalverstärkung. Nach Durchführung des Bioassays wird die biologische Wechselwirkung von Analyt und Sonde durch die Produktion einer großen Zahl von Farbstoffmolekü len durch ein einziges Enzym-Markermolekül verstärkt. After carrying out the bioassay, the biological interaction of the analyte and the probe by the production of a large number of Farbstoffmolekü len by a single-enzyme marker molecule is amplified. Es werden Enzyme wie Glucoseoxidase (GOD, EG 1.1.3.4.), al kalische Phosphatase (AP, EG 3.1.3.1) oder Peroxidase (POD, EG 1.11.1.7) mit Umsatzzahlen von 2000 Substratmolekülen pro Sekunde (s -1 ), 5000 s -1 beziehungsweise 10000 s -1 verwen det. There are enzymes such as glucose oxidase (GOD, EC 1.1.3.4.), Al-alkaline phosphatase (AP, EC 3.1.3.1) or peroxidase (POD, EC 1.11.1.7) with turnover of 2,000 substrate molecules per second (s -1), 5000 s -1 s -1, respectively 10000 verwen det. Verstärkungsraten von etwa 10000 bis eine Million sind mit Substratinkubationszeiten von 10 bis 60 Minuten möglich. Amplification rates of about 10,000 to one million are possible with Substratinkubationszeiten of 10 to 60 minutes. Ein Nachteil der ELISA-Technik ist die große Zahl der Schritte bei diesem Verfahren und die zusätzliche Zeit, die für die Substratinkubation erforderlich ist. A disadvantage of the ELISA technique is the large number of steps in this method, and the extra time required for the substrate incubation.

Auch Fluoreszenzverfahren werden in der Bioanalytik seit Jahren eingesetzt und sind von hohem Interesse. And fluorescence methods are used in bioanalysis for years and are of high interest. Mit allen auf Fluoreszenz beruhenden Techniken sind eine gute Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen von 10 -8 bis 10 -18 M sichergestellt. With all fluorescence-based techniques are ensured good sensitivity and low detection limits of 10 -8 to 10 -18 M. Mit speziellen Techniken, z. B. "zeitaufgelöster Fluoreszenz", Chemi- und Biolumineszenz oder Techniken, die auf der Energieübertragung zwischen ei nem Farbstoff- und einem Fluorophor-Molekül beruhen, lassen sich Nachweisgrenzen von 10 -15 bis 10 -18 M erreichen. Using special techniques, eg. As "time-resolved fluorescence," Chemical and bioluminescence or techniques that are based on the energy transfer between egg nem dye and a fluorophore molecule detection limits of 10 -15 to 10 -18 M can reach.

Bei den im Stand der Technik bekannten Fluoreszenz-Immungs says werden niedermolekulare Fluoreszenz-Markierungen mit reaktiven funktionellen Linker-Gruppen (Southwick PL et al., Cytometry, 11, S. 418-430, 1990; Mujumdar RB et al., Bioconjugate Chemistry 4, S. 105-111; 1993, Mujumder RB et al., Cytometry 10, S. 11-19, 1989), fluoreszierende und mit Farbstoff gefärbte Teilchen (US 4 837 168; US 6 013 531; WO 95/08772) oder mit Fluorophoren durchsetzte Dendrimere (DE 197 03 718) verwendet. In the known in the prior art fluorescence says Immungs low molecular weight fluorescent labels are linker having reactive functional groups (PL Southwick et al, Cytometry, 11, pp 418-430, 1990;.. Mujumdar RB et al, Bioconjugate Chemistry 4 , pp 105-111; 1993 Mujumder RB et al, Cytometry 10, pp 11-19, 1989), fluorescent and dyed with dye particles (US 4,837,168;. US 6,013,531; WO 95/08772) or He connects with fluorophores dendrimers (DE 197 03 718) is used.

DE 36 18 100 A1 beschreibt z. B. in Beispiel 1 ein Fluoreszenz- Immunoassayverfahren, bei dem Mikrokapseln, die mit Antikörpern auf der Oberfläche markiert sind und fluoreszierendes Eosin beinhalten, zum Nachweis dienen. DE 36 18 100 A1 describes, for. Example, in Example 1, a fluorescence immunoassay, in which microcapsules are used which are labeled with antibodies on the surface and contain fluorescent eosin for detection. Zum Aufbrechen der Membran der Mikrokapseln dient ein Metallionen freisetzendes Metallsalz. For rupturing the membrane of the microcapsules is a metal ion releasing metal salt.

Bekannt aus dem Stand der Technik ist auch die Verwendung Marker tragender Liposomen zur Signalverstärkung bei Immun gssays (US 5 756 362, 4 874 710, 4 703 017). Known from the prior art is the use of marker-carrying liposomes for signal amplification in immune gssays (US 5756362, 4874710, 4703017). Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist insofern begrenzt, als die Menge an Marker-Substanzen, die in die Liposomen in löslich gemachter Form eingebracht werden kann, begrenzt ist. The sensitivity of these methods is limited in that the amount of label substances that can be incorporated into the liposomes in solubilized form is limited. Ein weiterer Nachteil bei der Verwendung von markierten Liposo men ist die begrenzte Stabilität der Liposomen. Another disadvantage in the use of labeled Liposo men is the limited stability of the liposomes.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens für Zielmoleküle in einer Probe, das im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Ver fahren eine sehr gute Empfindlichkeit, niedrige Nachweisgrenzen und eine Verstärkung des Nachweissignals bezogen auf die Menge an Zielmolekül sicherstellt. Object of the present invention to provide a method for detecting target molecules in a sample, the drive compared to the United known in the prior art, a very good sensitivity, low detection limits and a gain of the detection signal based on the amount ensures to the target molecule.

Vorzugsweise sollte das erfindungsgemäße Verfahren für op tische Nachweise, insbesondere bei Fluoreszenz-Immungssays geeignet sein. Preferably, the method according to the invention for op tables certificates, particularly in fluorescence immunoassays should be suitable.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung eines Kits für den optischen, elektrochemischen oder chemi schen Nachweis von Zielmolekülen. A further object of the invention to provide a kit for the optical, electrochemical or chemical rule detection of target molecules.

Ebenfalls Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung mar kierter Biomoleküle, die sich leicht herstellen lassen und bei den erfindungsgemäßen Bioassays, vorzugsweise bei Fluo reszenz-Immungssays anwendbar sind. Also an object of the invention to provide mar kierter biomolecules that are easy to prepare and are applicable to the novel bioassays, preferably with Fluo rescence immunoassays.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem wird gelöst durch ein Verfahren zum optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in ei ner Probe unter Nutzung der auf Affinität beruhenden Wech selwirkungen zwischen dem Zielmolekül und einem Affinitäts molekül für die spezifische Erkennung des Zielmoleküls, um fassend die Schritte: The object underlying the invention problem is solved by a method for optical, electrochemical or chemical detection of one or more target molecules in egg ner sample by using the affinity-based Wech interactions between the target molecule and an affinity molecule for the specific recognition of the target molecule to collectively the steps:

  • a) Inkubieren der Zielmoleküle mit Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äußeren Oberfläche die entsprechenden Affinitätsmoleküle tragen, a) incubating the target molecules with encapsulating solid particles of signal-generating substances and carrying the corresponding affinity molecules on their outer surface,
  • b) Abtrennen des resultierenden Komplexes aus Ziel- und Affinitätsmolekül von den Kapseln mit unumge setzten Affinitätsmolekülen auf deren Oberfläche, b) separating the resulting complex of target and affinity molecule translated from the capsules with unumge affinity molecules on their surface,
  • c) Freisetzen und Lösen der eingekapselten festen Teilchen der signalerzeugenden Substanzen durch Be handeln des erhaltenen Ziel/Affinitäts-Komplexes mit physikalischen oder chemischen Mitteln, c) releasing and release of the encapsulated solid particles of signal-generating substances act by loading the resulting target / affinity complex with physical or chemical means,
  • d) Nachweisen oder Quantifizieren des Signals, das durch die freigesetzten und gelösten signalerzeu genden Substanzen erzeugt wird und in direkter oder indirekter Beziehung zur Menge an Zielmolekülen steht. d) detecting or quantifying the signal generated by the released and dissolved signalerzeu lowing substances and is directly or indirectly related to the amount of target molecules.

Durch die verwendeten Kapseln, die feste signalerzeugende Substanzen in hohen Mengen einkapseln, die während des Nachweisvorgangs freigesetzt und gelöst werden, wird eine Signalverstärkung erreicht. By the used capsules encapsulating solid signal generating substances in high amounts, which are released and dissolved during the detection process, signal amplification is achieved.

Gegenstand der Erfindung sind auch die Kapseln nach den An sprüchen 1 bis 17. The invention relates also to the capsules according of spells 1 to 17.

Erfindungsgemäß tragen die verwendeten Kapseln auf ihrer äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle, die Zielmoleküle spezifisch erkennen und daran binden. According to carry the capsules used on its outer surface affinity molecules that recognize specific target molecules and bind to it. Mit "Zielmolekül" ist der nachzuweisende Analyt gemeint bzw. ein Analyt, der mit einem Molekül verknüpft ist, das an die Affinitätsmoleküle an der Oberfläche der Kapsel binden kann. By "target molecule" is meant the analyte to be detected or an analyte, which is linked to a molecule that can bind to the affinity molecules on the surface of the capsule.

Je nach den nachzuweisenden Zielmolekülen sind die Affini tätsmoleküle ausgewählt aus der Gruppe der Peptide oder Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, Liganden mit nied rigem Molekulargewicht und molekular aufgedruckten Polyme ren (MIPs) oder Mischungen derselben. Depending on the detected targets the Affini tätsmoleküle are selected from the group of peptides or proteins, nucleic acids, carbohydrates, ligands with nied rigem molecular weight and molecular imprinted polyme ren (MIPs) or mixtures thereof. Als Peptide oder Pro teine können Antikörper, Rezeptoren, Antigene, Lektine, Avidine, Oligopeptide, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptid hormone und Allergene oder Teile derselben verwendet wer den. As the peptides or proteins can Pro antibodies, receptors, antigens, lectins, avidins, oligopeptides, lipoproteins, glycoproteins, peptide hormones and allergens or parts thereof are used to who. Die Nucleinsäuren, die ebenfalls Affinitätsmoleküle auf der Kapseloberfläche sein können, sind ausgewählt aus der Gruppe der einzel- oder doppelsträngigen DNAs, RNAs, Oligonucleotide, Ribozyme, Aptamere und Teilen derselben. The nucleic acids may also be on the capsule surface affinity molecules are selected from the group of single or double stranded DNAs, RNAs, oligonucleotides, ribozymes, aptamers and parts thereof. Auch Kohlenhydrate, ausgewählt aus der Gruppe der Mono-, Oligo- und Polysaccharide, Glycolipide, Proteopolysaccha ride und Teilen derselben können Affinitätsmoleküle sein. Carbohydrates selected from the group consisting of mono-, oligo- and polysaccharides, glycolipids, Proteopolysaccha ride and parts thereof may be affinity molecules. Erfindungsgemäß sind Liganden mit niedrigem Molekularge wicht Biotin oder ein Biotin-Derivat, ein Steroid oder Hor mon, ein Cofaktor oder Coenzym, ein Aktivator, Inhibitor, Pseudosubstrat oder eine prosthetische Gruppe eines Enzyms, ein Arzneimittel, ein Pestizid, ein Allergen oder Digoxin oder ein Hapten. According to the invention are ligands with low Molekularge weight biotin or a biotin derivative, a steroid or Hor mon, a cofactor or coenzyme, an activator, inhibitor, pseudosubstrate or prosthetic group of an enzyme, a drug, a pesticide, an allergen or digoxin or a hapten.

Die Affinitätsmoleküle sind z. B. durch Van-der-Waals- Kräfte, Wasserstoff-Bindungen oder elektrostatische Wech selwirkungen an die äußere Oberfläche der Kapseln konju giert, oder sie sind direkt oder über Linker-Moleküle cova lent an die äußere Oberfläche der Kapseln gebunden, wobei das Linker-Molekül normalerweise ein Biomolekül, vorzugs weise Avidin, Streptavidin, Neutravidin, Protein A, Protein G, Lektin oder ein niedermolekularer Vernetzer ist. The affinity molecules are such. As by van der Waals forces, hydrogen bonds and electrostatic interactions Wech to the outer surface of the capsules Konju alternates, or they are bonded directly or via linker molecules cova lent to the outer surface of the capsules wherein the linker molecule usually a biomolecule, preferably as avidin, streptavidin, neutravidin, protein A, protein G, lectin or a low molecular weight crosslinker.

Die Kapseln, welche die festen signalerzeugenden Substanzen einkapseln, die beim erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendet werden, werden hergestellt durch Behandeln von wenig wasserlöslichen oder wasserunlöslichen ungeladenen festen signalerzeugenden Substanzen mit einer wäßrigen Lösung eines ionischen Detergens, wobei die amphiphile Sub stanz an der Oberfläche der festen signalerzeugenden Sub stanzen angeordnet wird und diese empfänglich gemacht werden für die anschließende Beschichtung mit einer Schicht eines geladenen Polyelektrolyten oder mit einer Mehrfachschicht, umfassend abwechselnde Schichten entgegengesetzt geladener Polyelektrolyten. The capsules encapsulating the fixed signal-generating substances which are used in the detection methods of the invention are prepared by the treatment of poorly water-soluble or water-insoluble uncharged solid signal generating substances with an aqueous solution of an ionic detergent, wherein the amphiphilic Sub substance on the surface of the fixed signal-generating sub is arranged punch and they are made receptive to the subsequent coating with a layer of a charged polyelectrolyte or with a multilayer comprising alternating layers of oppositely charged polyelectrolytes.

Die feste signalerzeugende Substanz wird vor Gebrauch zu feinen Teilchen vermahlen, oder Teilchen geeigneter Größe werden mit Hilfe anderer Methoden erzeugt, z. B. durch Sprühtrocknung. The fixed signal-generating substance is ground before use to fine particles, or particles of suitable size can be produced by other methods, eg. As by spray drying.

Beim ersten Schritt des Verfahrens werden die ungeladenen festen signalerzeugenden Teilchen mit einer amphiphilen Substanz behandelt, die die Oberfläche der Teilchenmateria lien mit einer elektrischen Ladung versieht. In the first step of the process the uncharged solid signal producing particles are treated with an amphiphilic substance which provides the surface of the Teilchenmateria materials with an electric charge. Die Behandlung der festen signalerzeugenden Teilchen mit dem Tensid ist auch im Laufe eines Naßmahlverfahrens möglich. The treatment of the solid particles of signal-generating surfactant is also possible in the course of a wet milling process.

Beim zweiten Schritt werden die mit amphiphiler Substanz beschichteten Teilchen mit einem Polyelektrolyt beschich tet, der eine zur Oberfläche der Teilchenmaterialien entge gengesetzte Ladung aufweist. In the second step, the coated with amphiphilic substance particles with a polyelectrolyte are beschich Tet having a entge posite particulates to the surface of charge. Zur Bildung von Mehrfach schichten werden die signalerzeugenden Teilchen anschlie ßend mit entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten behan delt, dh, abwechselnd mit kationischen und anionischen Polyelektrolyten. For the formation of multiple layers of the signal producing particles are subsequently punched ßend behan with oppositely charged polyelectrolytes, ie alternately with cationic and anionic polyelectrolytes. Die Polymerschichten fügen sich auf den vorher geladenen festen Matrizen durch elektrostatische schichtweise Abscheidung von selbst zusammen und bilden so eine mehrschichtige polymere Hülle um die festen Kerne. The polymer layers add up to the pre-loaded solid matrices by electrostatic layer by layer deposition of themselves and so form a multilayered polymeric shell around the solid cores.

In einem letzten Schritt wird die Oberfläche der erhaltenen Polyelektrolyt-Kapseln gemäß dem nachzuweisenden Zielmole kül mit Affinitätsmolekülen modifiziert (vgl. Fig. 1). In a final step, the surface of the obtained polyelectrolyte capsules according to the detected Zielmole molecule is modified with affinity molecules (see. FIG. 1). Er findungsgemäß werden die Polyelektrolyt-Kapseln mit den Af finitätsmolekülen, z. B. mit Immunglobulinen, inkubiert. He is inventively finitätsmolekülen the polyelectrolyte capsules with Af, z. B. with immunoglobulins incubated. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Af finitätsmoleküle durch chemische Reaktion covalent an die Polyelektrolyt-Kapseln gebunden, z. B. nach EDC/NHS-Aktivierung der Teilchen mit einer äußersten Schicht des Polyelek trolyten Polyacrylsäure. In another embodiment of the invention, the Af finitätsmoleküle by chemical reaction are covalently bound to the polyelectrolyte capsules, for. Example, after EDC / NHS activation of the particles lyte with an outermost layer of the Polyelek polyacrylic acid.

Es ist auch möglich, die Affinitätsmoleküle mit Linker-Mo lekülen umzusetzen, die zwei funktionelle Gruppen aufweisen und an die Polyelektrolyt-Kapsel und das Affinitätsmolekül binden können, z. B. durch Verwendung eines homo- oder he terobifunktionellen Vernetzers wie DSS, DTSSP oder SMCC bzw. MBS. It is also possible, with the affinity molecules linker molecules implement Mo, which have two functional groups, and can bind to the polyelectrolyte capsule and the affinity molecule, for. Example, by using a homo- or He terobifunktionellen crosslinking agent such as DSS, DTSSP or SMCC or MBS.

Das beschriebene Einkapselungsverfahren ermöglicht den Ein schluß einer breiten Auswahl und hoher Mengen an signaler zeugenden Substanzen (10 7 bis 10 9 Moleküle pro Teilchen, je nach Größe und Dichte des Teilchens und Molekulargewicht der Substanz). The encapsulation described allows the A-circuit a wide selection and high amounts of signaler-forming substances (10 7 to 10 9 molecules per particle, depending on the size and density of the particle and molecular weight of the substance). Je nach gewünschtem Nachweisverfahren können niedermolekulare Substanzen, ausgewählt aus Fluorophoren, Luminophoren, Chromophoren, Enzymsubstraten, prosthetischen Gruppen, oder redoxaktive Substanzen, ausgewählt aus Redox vermittlern, elektrodenaktiven Substanzen und Metallsalzen eingekapselt werden. Depending on the desired detection method electrode active substances and metal salts, low molecular weight substances selected from fluorophores, luminophores, chromophores, enzyme substrates, prosthetic groups, or redox-active substances selected from redox intermediaries are encapsulated. Auch hochmolekulare Substanzen, ausge wählt aus der Gruppe der Enzyme und ihrer Vorläufer, biolu minogene und fluorogene Proteine, Nucleinsäuren, Ribozyme und Aptamere können die signalerzeugenden Substanzen sein, die eingekapselt werden. High molecular weight substances, be selected from the group of enzymes and their precursors, biolu minogene and fluorogenic proteins, nucleic acids, aptamers, ribozymes and can be the signal-generating substances that are encapsulated.

Erfindungsgemäß sind die eingekapselten festen Teilchen aus signalerzeugenden Substanzen Kristalle, amorphe oder lyo philisierte Teilchen, sprühgetrocknete Teilchen, gemahlene Teilchen oder Mischungen derselben. According to the invention, the encapsulated solid particles of signal-generating substances crystals, amorphous particles or lyo philisierte, spray dried particles, crushed particles, or mixtures thereof. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben die eingekapselten fe sten Teilchen eine Teilchengröße von 10 nm bis 10 µm, vor zugsweise etwa 100 nm. In a preferred embodiment of the invention the encapsulated particles most Fe having a particle size of 10 nm to 10 microns, preferably before about 100 nm.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln kann als am phiphile Substanz jede Substanz verwendet werden, die ioni sche hydrophile und hydrophobe Gruppen aufweist. For the preparation of the capsules according to the invention can be used as the amphiphiles substance any substance having hydrophilic and hydrophobic ioni-specific groups. Vorzugsweise werden ionische Tenside, Phospholipide und/oder am phiphile Polyelektrolyte verwendet. Preferably, ionic surfactants, phospholipids and / or on the amphiphiles polyelectrolytes may be used. Amphiphile Polyelek trolyte beispielsweise sind Polyelektrolyte, die eine gela dene Gruppe als hydrophile Gruppe und eine hydrophobe Gruppe, z. B. eine aromatische Gruppe umfassen. Amphiphilic Polyelek-electrolytes example polyelectrolytes, including a gela ous group as a hydrophilic group and a hydrophobic group, eg. As an aromatic group. Bevorzugt ist die Verwendung eines kationischen oder/und anionischen Tensids. Preferred is the use of a cationic or / and anionic surfactant. Beispiele für geeignete kationische Tenside sind quartäre Ammonium-Salze (R 4 N + X - , insbesondere Didodecyldi methylammoniumbromid (DDDAB), Alkyltrimethylammoniumbromid, insbesondere Dodecyltrimethylammoniumbromid oder Palmityl trimethylammoniumbromid oder N-Alkylpyridinium-Salze oder tertiäre Amine (R 3 NH + X - , insbesondere Cholesteryl-3β-N-(di methylaminoethyl)carbamat oder Mischungen derselben, wobei X - ein Gegenanion wie z. B. ein Halogenid bedeutet. Beispiele für geeignete anionische Tenside sind Alkylsulfonate (R-SO 3 M), insbesondere Dodecylsulfat, z. B. Natriumdodecyl sulfat (SDS), Laurylsulfat oder Olefinsulfonate (R-SO 3 M), insbesondere Natrium-n-dodecylbenzolsulfonat oder Alkylsul fate (R-OSO 3 M) oder Fettsäuren (R-COOM), insbesondere Dode cansäure-Natriumsalz, oder phosphorige Säure oder Cholsäu ren oder fluororganische Verbindungen, insbesondere Lithi um-3-[2-(perfluoralkyl)ethylthio]propionat oder Mischungen derselben. Besonders bevorzugt sind Tenside mit 6 bis 30 Kohlenstoffen in ihren Alkyl- oder Olefin-Gruppen. Examples of suitable cationic surfactants are quaternary ammonium salts (R 4 N + X -, in particular Didodecyldi methylammoniumbromid (DDDAB), alkyltrimethylammonium bromide, especially dodecyltrimethylammonium bromide or palmityl trimethylammonium bromide or N-alkylpyridinium salts or tertiary amines (R 3 NH + X -, in particular cholesteryl-3β-N- (di methylaminoethyl) carbamate or mixtures thereof, wherein X -.. a counter anion is a halide, such as examples of suitable anionic surfactants are alkylsulfonates (R-SO 3 M), especially dodecyl sulfate, eg. . sodium dodecyl sulfate (SDS), lauryl sulfate or olefinsulfonates (R-SO 3 M), especially sodium n-dodecylbenzenesulfonate or Alkylsul sulfates (R-OSO 3 M) or fatty acids (R-COOM), especially Dode cansäure sodium salt, or phosphorous Cholsäu acid or acids or organofluorine compounds, and in particular to Lithi-3- [2- (perfluoroalkyl) ethylthio] propionate or mixtures thereof. Particularly preferred are surfactants having from 6 to 30 carbons in their alkyl or olefin group.

Bevorzugt ist weiterhin, eine polymere Substanz als amphi phile Substanz zu verwenden, die geladene Gruppen und hy drophobe Stellen bereitstellt. It is also preferable to use a polymeric substance as amphi hydrophilic substance, the charged groups and hy providing phobic sites. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform wird Polystyrolsulfonat (PSS) verwendet. In a preferred form Ausfüh approximately polystyrene sulfonate (PSS) is used.

Unter Polyelektrolyten sind im allgemeinen Polymere mit io nisch dissoziierbaren Gruppen zu verstehen, die eine Kompo nente oder ein Substituent der Polymerkette sein können. Polyelectrolytes are generally polymers with io cally dissociable groups to understand, which can be a substituent of the polymer chain component or a com. Normalerweise ist die Zahl dieser ionisch dissoziierbaren Gruppen in Polyelektrolyten so groß, daß die Polymere in dissoziierter Form (auch Polyionen genannt) wasserlöslich sind. Normally, the number of these ionically dissociable groups in polyelectrolytes is so large that the polymers are present in dissociated form (also called polyions) water-soluble. Der Begriff Polyelektrolyte soll in diesem Zusammen hang auch Ionomere abdecken, bei denen die Konzentration an ionischen Gruppen zur Wasserlöslichkeit nicht ausreicht, die aber genügend Ladungen zum Selbstzusammenfügen aufwei sen. The term polyelectrolytes is in this connexion also cover ionomers in which the concentration of ionic groups to the water solubility is insufficient, but aufwei sufficient charges to be joining sen. Vorzugsweise umfaßt die Hülle allerdings "echte" Po lyelektrolyte, dh, wasserlösliche Polyelektrolyte. Preferably, the cover includes but "real" Po lyelektrolyte, ie, water-soluble polyelectrolytes. Je nach Art der dissoziierbaren Gruppe werden Polyelektrolyte in Polysäuren und Polybasen eingeteilt. Depending on the type of dissociable groups polyelectrolytes are divided into polyacids and polybases.

Dissoziierte Polysäuren bilden unter Abspaltung von Proto nen Polyanionen, die anorganische, organische und Biopoly mere sein können. Dissociated polyacids form with elimination of Proto nen polyanions can be inorganic, organic and biopolymers mers. Beispiele für Polysäuren sind Polyphos phorsäure, Polyvinylschwefelsäure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphonsäure und Polyacrylsäure. Examples of polyacids are Polyphos phoric acid, polyvinylsulfuric, polyvinyl, polyvinyl and polyacrylic acid. Beispiele für die entsprechenden Salze, die auch Polysalze genannt wer den, sind Polyphosphat, Polysulfat, Polysulfonat, Polyphos phonat und Polyacrylat. Examples of the corresponding salts, also known polysalts who the are polyphosphate, polysulfate, polysulfonate, Polyphos phosphonate and polyacrylate.

Polybasen enthalten Gruppen, die z. B. durch Reaktion mit Säuren Protonen aufnehmen können, wobei ein Salz gebildet wird. Polybases contain groups that z. B. accommodation by reaction with acids protons to form a salt is formed. Beispiele für Polybasen mit dissoziierbaren Gruppen in ihrem Gerüst und/oder ihren Seitengruppen sind Polyal lylamin, Polyethylimin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin. Examples of polybases having dissociable groups within their backbone and / or their side groups are polyalkylene lylamin, polyethylimine, polyvinylamine and polyvinylpyridine. Durch die Aufnahme von Protonen bilden Polybasen Polykatio nen. By accepting protons polybases Polykatio form nen.

Geeignete erfindungsgemäße Polyelektrolyte sind auch Biopo lymere wie etwa Alginsäure, Gummi arabicum, Nucleinsäuren, Pektine, Proteine und andere, sowie chemisch modifizierte Biopolymere wie etwa Carboxymethylcellulose und Ligninsul fonate, sowie synthetische Polymere wie z. B. Polymethacryl säure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphonsäure und Po lyethylenimin. Suitable polyelectrolytes according to the invention are also Biopo mers such as alginic acid, gum arabic, sulfonates nucleic acids, pectins, proteins and others, and chemically modified biopolymers such as carboxymethyl cellulose and Ligninsul, as well as synthetic polymers such. Polymethacrylic acid B., polyvinyl, polyvinyl Po and polyethylenimine ,

Es können lineare oder verzweigte Polyelektrolyte verwendet werden. It can be used linear or branched polyelectrolytes. Die Verwendung von verzweigten Polyelektrolyten führt zu weniger kompakten Polyelektrolyt-Mehrfachschich ten, die höhere Wandporosität aufweisen. The use of branched polyelectrolytes leads to less compact polyelectrolyte Mehrfachschich TEN having higher wall porosity. Zur Erhöhung der Kapselstabilität können Polyelektrolyt-Moleküle innerhalb oder/und zwischen den einzelnen Schichten vernetzt sein, z. B. durch Vernetzen von Amino-Gruppen mit Aldehyden. To increase capsule stability polyelectrolyte molecules can be crosslinked, for. Example, by crosslinking amino groups with aldehydes within or / and between the individual layers.

Im Grunde bestehen keine Einschränkungen hinsichtlich der zu verwendenden Polyelektrolyte bzw. Ionomere so lange die eingesetzten Moleküle ausreichend hohe Ladung aufweisen oder/und an die Schicht darunter über eine andere Art Wech selwirkung binden können, z. B. durch Wasserstoff-Bindung und/oder hydrophobe Wechselwirkungen. Basically, there are no restrictions on the polyelectrolytes or ionomers to be used as long as the molecules used have sufficiently high charge and / or can bind teraction of the layer underneath a different kind Wech, z. B. by hydrogen bonding and / or hydrophobic interactions.

Geeignete Polyelektrolyte sind somit sowohl niedermolekula re Polyelektrolyte als auch Polyionen, die z. B. Molekular gewichte von einigen hundert Dalton aufweisen, bis hin zu makromolekularen Polyelektrolyten, z. B. Polyelektrolyten biologischen Ursprungs, die Molekulargewichte von mehreren tausend bis Millionen Dalton aufweisen. Suitable polyelectrolytes, thus, both niedermolekula re polyelectrolytes and polyions, z. B. molecular weights of a few hundred Daltons, up to macromolecular polyelectrolytes, z. B. polyelectrolytes of biological origin, which have molecular weights of several thousand to millions of Dalton.

Weitere Beispiele für ein organisches Polymer als Bioelek trolyt sind biologisch abbaubare Polymere wie etwa Polygly colsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyamide, Poly-2-hy droxybutyrat (PHB), Polycaprolacton (PCL), Polymilch-co glycolsäure (PLGA), fluoreszenzmarkierte Polymere, leitende Polymere, Flüssigkristall-Polymere, photoleitende Polymere, photochrome Polymere und deren Copolymere und/oder Mischun gen derselben. Further examples of an organic polymer are trolyte as Bioelek biodegradable polymers such as Polygly colsäure (PGA), polylactic acid (PLA), polyamides, poly-2-hy droxybutyrat (PHB), polycaprolactone (PCL), polylactic-co glycolic acid (PLGA) , fluorescently labeled polymers, conducting polymers, liquid crystal polymers, photo conducting polymers, photochromic polymers and their copolymers and / or gene Mix thereof. Beispiele für Biopolymere, die als Polyelek trolyt bevorzugt sind, sind Polyaminosäuren, insbesondere Peptide, S-Schichtproteine, Polykohlenhydrate wie etwa Dex trin, Pektin, Alginat, Glycogen, Amylose, Chitin, Chondro itin, Hyaluronsäure, Polynucleotide wie etwa DNA, RNA, Oli gonucleotide oder/und modifizierte Biopolymere wie etwa Carboxymethylcellulose, Carboxymethyldextran oder Lignin sulfonate. Examples of biopolymers which trolyte as Polyelek are preferable are polyamino acids, especially peptides, S-layer proteins, polycarbohydrates such as Dex trin, pectin, alginate, glycogen, amylose, chitin, Chondro itin, hyaluronic acid, polynucleotides, such as DNA, RNA, Oli gonucleotide or / and modified biopolymers such as carboxymethyl cellulose, carboxymethyl dextran or lignin sulfonates. Bevorzugte Beispiele für anorganische Polymere als Polyelektrolyt sind Polysilane, Polysilanole, Polyphos phazene, Polysulfazene, Polysulfide und/oder Polyphosphate. Preferred examples of inorganic polymers as polyelectrolyte are polysilanes, Polysilanols, Polyphos phazene, polysulfazenes, polysulfides and / or polyphosphates.

Möglich ist auch die Abscheidung geladener Nanoteilchen oder Biomoleküle als Kapselmaterial. It is also possible the deposition of charged nanoparticles or biomolecules as capsule material.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln wird vorzugs weise so durchgeführt, daß überschüssiges Material der bei den einzelnen Schritten verwendeten Ausgangssubstanzen nach jedem Behandlungsschritt abgetrennt wird. The preparation of the capsules of the invention is carried out in such preference as that excess material of the starting materials used in each step is separated after each treatment step. Zum Beispiel wird zunächst eine wäßrige Dispersion der Matrizenteilchen ge bildet, die mit einer wäßrigen Lösung der amphiphilen Sub stanz versetzt wird. For example, an aqueous dispersion of the template particles is formed first ge which is mixed with an aqueous solution of the amphiphilic substance Sub. Nach Abtrennung etwaiger überschüssi ger amphiphiler Moleküle wird eine erste Polyelektrolyt- Spezies zugesetzt, um die erste Polyelektrolyt-Hülle aufzu bauen. After separating any überschüssi ger amphiphilic molecules a first polyelectrolyte species is added to aufzu the first polyelectrolyte shell build. Nach Abtrennung etwaiger überschüssiger Polyelektro lyt-Moleküle wird die entgegengesetzt geladene Polyelektro lyt-Spezies, die zum Aufbau der nächsten Schicht verwendet wird, zugesetzt. After separating any excess Polyelektro lyt molecules the oppositely charged Polyelektro Lyt-species used for building up the next layer is added. Anschließend werden entgegengesetzt gela dene Schichten aus Polyelektrolyt-Molekülen nacheinander aufgebracht, wobei für jede Schicht gleicher Ladung identi sche oder unterschiedliche Polyelektrolyt-Spezies oder Mi schungen aus Polyelektrolyt-Spezies ausgewählt werden kön nen und zwischen jedem Inkubationsschritt ein Reinigungs schritt durchgeführt wird. Subsequently opposite gela ferent layers of polyelectrolyte molecules are applied sequentially, with the same for each layer charge identi cal or different polyelectrolyte species or mixtures Wed Kings are selected from polyelectrolyte species nen and between each incubation step, a cleaning step is performed. Die Vorgehensweise beim Be schichten der Kapseln mit Affinitätsmolekülen ist in Bei spiel 4 beschrieben. The procedure for loading layers of the capsules with affinity molecules is described in the case of game 4. Techniken, die auf direkter Adsorption oder covalenter Verknüpfung mit niedermolekularen Vernet zern beruhen, sind versierten Fachleuten wohlbekannt. Techniques based on direct adsorption or covalent linkage with low molecular weight Vernet Group are experienced professionals well known. Er findungsgemäß wird in bevorzugter Weise das Binden biotiny lierter Moleküle an Avidin-vorbeschichtete Kapseln ange wandt. He is in accordance with the invention preferably binding to avidin molecules biotiny profiled pre-coated capsules be applied.

Erfindungsgemäß sind die wie vorstehend beschrieben herge stellten Kapseln bei Bioassays zum optischen, elektrochemi schen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen vorzüglich einsetzbar. According to the invention as described above Herge presented capsules are especially used in bioassays for optical, elektrochemi or chemical detection of target molecules. In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden die Zielmoleküle mit den erfin dungsgemäßen Kapseln, die an ihrer äußeren Oberfläche Ziel moleküle spezifisch erkennende Affinitätsmoleküle tragen, über einen hinreichenden Zeitraum inkubiert, um einen Kom plex aus Ziel- und Affinitätsmolekül zu ergeben. In a first step of the detection method according to the invention, the target molecules with the inventions to the invention capsules molecules on their outer surface target will bear specific cognitive affinity molecules incubated for a period of time sufficient plex from Target and affinity molecule to give a Kom. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Zielmo leküle direkt oder über ein anderes Affinitätsmolekül an eine feste Phase gebunden, z. B. an eine Mikrotiterplatte oder eine Nitrocellulose-Unterlage. In a preferred embodiment of the invention, the Zielmo are molecules directly or via another affinity molecule to a solid phase, eg. As a microtiter plate or a nitrocellulose base.

Beim zweiten Schritt des Nachweisverfahrens wird der resul tierende Ziel-/Affinitätsmolekül-Kapsel-Komplex von den un umgesetzten Affinitätsmolekülen, dh, von den Kapseln mit unumgesetzten Affinitätsmolekülen auf ihrer Oberfläche abgetrennt. In the second step of the detection method, the target end resul animal / affinity molecule-complex from un capsule unreacted affinity molecules, ie, separated from the capsules with unreacted affinity molecules on their surface.

Im nächsten Verfahrensschritt werden die eingekapselten fe sten Teilchen der signalerzeugenden Substanzen mit Hilfe physikalischer oder chemischer Mittel aus den Kapseln in ein Medium freigesetzt. In the next process step, the encapsulated particles most of the Fe signal producing substances to be released by physical or chemical means from the capsules in a medium. Bei einer Ausführungsform der Er findung wird die Freisetzung durch Zugabe von Reagenzien erreicht, die zum Lösen der ungeladenen festen Kernsubstan zen geeignet sind, z. B. ein organisches Lösungsmittel, in dem das Material löslich ist, oder ein saures oder alkali sches Lösungsmittel, in dem das Material ein lösliches Salz bildet. In one embodiment of he invention, the release is achieved by addition of reagents, the Zen for dissolving the uncharged solid Kernsubstan are suitable, for. Example, an organic solvent in which the material is soluble or an acid or alkaline solvent in which the material forms a soluble salt. Erfindungsgemäß kann das Auflösen der Matrizenteil chen in milder Weise im Laufe einer kurzen Inkubationszeit vorgenommen werden, z. B. 1 min bis 1 h bei Raumtemperatur. According to the invention the dissolution of the female mold surfaces in a mild manner to be made during a short incubation period, for. Example 1 min to 1 h at room temperature. Die Matrizen zerfallen fast vollständig, da kein Rückstand an Teilchen mehr nachweisbar ist, selbst wenn man die ver bleibenden Hüllen mit einem Elektronenmikroskop untersucht. The matrices decompose almost completely, because there is no residue of particles is detectable even when one examines the remain- ing cases with an electron microscope. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kapseln mit einem organischen Lösungsmittel oder mit einem Enzym oder Ribozym oder durch Ändern des pH-Werts oder des Werts für die Ionenstärke behandelt. In a preferred embodiment the capsules with an organic solvent or with an enzyme, or ribozyme, or by changing the pH or the value will be treated for the ionic strength. Die bevorzugten einsetzbaren organischen Lösungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe der Alkohole, insbesondere Ethanol und Methanol, Ketone, insbe sondere Aceton, Ester, insbesondere Ethylester, Aromaten, insbesondere Toluol, Sulfoxide, insbesondere DMSO, sowie Ether, besonders Dimethylether oder aus Mischungen organi scher Lösungsmittel mit Wasser. The preferred organic solvent that can be used are selected from the group of alcohols, especially ethanol and methanol, ketones, in particular special acetone, esters, especially ethylester, aromates, especially toluene, sulfoxides, especially DMSO and ethers, especially dimethyl ether or from mixtures of organic solvents shear with water.

Das Zerfallen der eingekapselten festen signalerzeugenden Substanzen läßt sich auch durch physikalische Mittel errei chen, vorzugsweise durch Ultraschall-Zermahlung, elektri schen Impuls oder osmotischen Schock. The disintegration of the encapsulated solid signal-generating substances can be Errei surfaces by physical means, preferably, by ultrasonic grinding of, electrical pulse rule or osmotic shock

Der letzte Schritt des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens umfaßt den Nachweis oder die Messung des Signals, das durch die freigesetzten und gelösten signalerzeugenden Substanzen generiert wird und in direkter oder indirekter Beziehung zur Menge an Zielmolekülen steht. The last step of the detection method according to the invention comprises the detection or measurement of the signal that is generated by the released and dissolved signal-generating substances and which is directly or indirectly related to the amount of target molecules.

In einer Ausführungsform der Erfindung läßt sich der Nach weis eines oder mehrerer Zielmoleküle in einer Probe in ei nem Fluoreszenz-Immungssay durchführen. In one embodiment of the invention, the post may be facing one or more target molecules in a sample perform in egg nem fluorescence immunoassay. In diesem Fall sind die eingekapselten signalerzeugenden Substanzen Fluoro phore, z. B. fluoreszierende Substanzen auf der Grundlage von Cyanin-, Carbocyanin-, Rhodamin-, Xanthen- und Diazo- Farbstoffen. In this case, the signal-generating substances encapsulated Fluoro phore, z. B. fluorescent substances based on cyanine, carbocyanine, rhodamine, xanthene and diazo dyes. Eine komprimierte Beschreibung von mehr als 500 Farbstoffen, darunter Fluorophoren, findet sich in: The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators; A brief description of more than 500 dyes, including fluorophores can be found in: The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators; Floyd J. Green; Floyd J. Green; Aldrich Chemical Company, Inc., 1991. Aldrich Chemical Company, Inc.., 1991

Der Fluoreszenz-Immungssay ist eine bevorzugte Ausführungs form der vorliegenden Erfindung. The fluorescence immunoassay is a preferred embodiment of the present invention. Da es möglich ist, große Mengen an festen Fluorophor-Teilchen einzukapseln, wird ein hohes Fluorophor/Affinitätsmolekül-Verhältnis erreicht. Since it is possible to encapsulate large amounts of solid particles fluorophore, a high fluorophore / affinity molecule-ratio is achieved. Aufgrund des Lösens in einem Lösungsmittelvolumen wird eine hohe Quantenausbeute erhalten. Because of dissolving in a solvent volume of a high quantum yield is obtained. Löschungseffekte treten nicht auf. Cancellation effects do not occur. Wie z. B. aus Beispiel 3 und Fig. 5 der vorliegenden Beschreibung ersichtlich, ist nach Freisetzung und Lösen der Fluorophor-Teilchen aus den erfindungsgemäßen Kapseln eine bemerkenswerte Verstärkung des Fluoreszenzsi gnals nachweisbar. Such as. For example, from Example 3 and Fig. 5 of the present description can be seen, after release and releasing the fluorophore particles from the capsules according to the invention is a remarkable enhancement of the Fluoreszenzsi gnals detectable.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in einer Probe auch mit einem sichtbaren Farbstoff durchgeführt werden, der in den erfindungsgemäßen Polyelektrolyt-Kapseln einge kapselt ist, vorzugsweise mit Cyanin-, Pyrazolon-, Anthra chinon-, Anthroloin-, Carbocyanin-, Rhodamin-, Xanthen-, Carotinoid-, Diazo- und Monoazo-, Oxazin-, indigoiden und Riboflavin-basierten Farbstoff-Substanzen. In a further embodiment of the invention the detection of one or more target molecules in a sample can also be carried out with a visible dye which is encapsulated in the polyelectrolyte capsules according to the invention is, preferably with cyanine, pyrazolone, anthra quinone, Anthroloin-, carbocyanine, rhodamine, xanthene, carotenoid, diazo and monoazo, oxazine, indigoid and riboflavin-based dye substances.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis ähnlich wie ein ELISA durchgeführt werden, wobei ein Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase oder Glucoseoxidase die eingekapselte signalerzeugende Substanz ist. In a further embodiment of the invention, the detection as an ELISA can be carried out similarly, with an enzyme, for. Example, horseradish peroxidase or glucose oxidase is the encapsulated signal-generating substance. Das ent sprechende Substrat kann im Aufbrechpuffer enthalten sein, der für die Zerstörung der Kapseln und zur Freisetzung des Enzyms verwendet wird. This corresponds speaking substrate may be included in breaking buffer used for the destruction of the capsules and release of the enzyme.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Ra dioimmungssays durchgeführt werden. In a further embodiment of the invention Ra dioimmungssays can be performed. Die Kapseln tragen eine radioaktive Substanz, die nach Freisetzung aus den Kapseln in einem Szintillationszähler gemessen wird. The capsules carrying a radioactive substance is measured after release from the capsules in a scintillation counter.

Erfindungsgemäß ist die Immunagglutination der Kapseln eine geeignete Möglichkeit, die an einen Analyten gebundenen Kapseln auszufällen und sie von unumgesetzten Kapseln abzu trennen, dh, von Kapseln, die nicht an ein Zielmolekül oder einen Analyt gebunden sind. According to the invention the immune agglutination of the capsules is an appropriate way to precipitate the bound analyte capsules and separate ERS of unreacted capsules, ie capsules, which are not bound to a target molecule or analyte.

Die vorliegende Erfindung macht auch ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines (oder mehrerer) Analy ten verfügbar, wobei eine elektroaktive Substanz, ein elektroinaktives Enzymsubstrat oder ein Enzym als signalerzeu gende Substanz elektrochemisch nachgewiesen wird. The present invention also provides a method for detecting or quantifying one (or more) Analy th available, wherein an electro-active substance, a elektroinaktives enzyme substrate or an enzyme is detected as signalerzeu constricting substance electrochemically.

Die elektrochemische Messung wird mit einem Sensorsystem durchgeführt, umfassend eine Arbeits-, Bezugs- und Gegen elektrode sowie eine Elektrolytlösung. The electrochemical measurement is performed with a sensor system comprising a working, reference and counter electrode, and an electrolyte solution. Es können Mikro- oder Makrodickfilm-, Dünnfilm-Elektroden oder herkömmliche Stabelektroden sein. It can be micro or Makrodickfilm-, thin-film electrodes or conventional rod electrodes. Beim amperometrischen Ansatz wird ein Potential angelegt, so daß die elektroaktive Substanz redu ziert oder oxidiert werden kann. When amperometric approach a potential is applied, so that the electroactive substance can be redu ed or oxidized. Beim potentiometrischen Ansatz wird die vorstehend beschriebene elektrochemische Vorrichtung verwendet, mit der Ausnahme, daß diese eine In dikator- und Bezugselektrode kombiniert aufweist und die durch eine elektroaktive Substanz (z. B. Ionen) verursachte Potentialänderung mißt. When the above-described approach potentiometric electrochemical device is used, measures with the exception that it comprises an in dikator- and reference electrode are combined and represented by an electro-active substance (eg. B. ions) caused change in potential.

In der Amperometrie können bekannte Vermittler als elektro aktive Substanzen eingesetzt werden, die bei niedrigem Po tential oxidiert werden. In amperometry known promoters can be used as electroactive substances that are oxidized potential at low Po. Je nach Beschaffenheit des Analy ten trägt die Arbeitselektrode Antikörper oder Antigene, die mit Hilfe verschiedener Methoden auf der Elektro denoberfläche oder auf einer Membran immobilisiert sind, die die Oberfläche der Arbeitselektrode bedeckt. Depending on the nature of the Analy th carries the working electrode antibodies or antigens, the denoberfläche by various methods on the electric or are immobilized on a membrane which covers the surface of the working electrode.

Beim Nachweis eines hochmolekularen Antigens (zum Beispiel des Frühinfarkt-Markers fettsäurebindendes Protein, FABP) sind Fänger-Antikörper gegen das Antigen (FABP) auf der Ar beitselektrode immobilisiert. In the detection of a high molecular weight antigen (eg, the early infarction marker fatty acid-binding protein FABP) are capture antibody to the antigen (FABP) are immobilized on the beitselektrode Ar. Eine Blut- oder Plasmaprobe (enthaltend das Antigen FABP) wird der Elektrode zusammen mit Kapseln zugesetzt, die eingekapselte feste elektroak tive Substanzen enthalten und Detektor-Antikörper gegen das Antigen (FABP) auf der Kapseloberfläche aufweisen. A blood or plasma sample (containing the antigen FABP) of the electrode is added together with capsules containing encapsulated solid elektroak tive substances and having detector antibody against the antigen (FABP) on the capsule surface. Die Sub stanzen bilden ein "Sandwich" auf der Arbeitselektrode: Fänger-Antikörper/Antigen(FABP)-Detektor-Antikörper/einge kapselte elektroaktive Substanz. Punch the sub form a "sandwich" on the working electrode: capture antibody / antigen (FABP) detector antibody / is encapsulated electroactive substance. Danach wird das Elektro densystem mit neutralem Puffer gewaschen, um nichtgebundene Substanzen und Probenbestandteile auszuwaschen, und es werden organische Lösungsmittel (z. B. DMSO oder Ethanol) zuge setzt, um die Freisetzung und Auflösung der elektroaktiven Substanz in der Nähe der Elektrodenoberfläche zu erleich tern. Thereafter, the electric is densystem washed with a neutral buffer to wash unbound substances, and components of the sample, and there are organic solvents (eg. As DMSO or ethanol) is applied to the release and dissolution of the electro-active substance in the vicinity of the electrode surface to erleich tern , Es wird ein starker Oxidationsstrom erzeugt, der zur Menge der erzeugten elektroaktiven Substanz proportional ist. There is produced a strong oxidation current that is proportional to the amount of the generated electro-active substance. Das Sensorsystem läßt sich vor dem Einsatz mit Hilfe unterschiedlicher Mengen Antigen und gleichen Mengen eingekapselter elektroaktiver Substanzen kalibrieren. The sensor system can be calibrated encapsulated electroactive substances prior to use using different amounts of antigen and equal amounts.

Die Empfindlichkeit des Assays läßt sich noch weiter stei gern, wenn ein Enzym in festem Zustand (zum Beispiel alka lische Phosphatase, AP) zur Signalerzeugung eingekapselt ist und ein elektrodeninaktives Substrat (wie etwa p-Amino phenylphosphat, pAPP) in hoher Konzentration zusammen mit dem Aufbrechreagens zur Freisetzung des Enzyms zugegeben wird. The sensitivity of the assay can be further stei like it when an enzyme in the solid state (for example, alka metallic phosphatase AP) is encapsulated for signal generation and a elektrodeninaktives substrate (such as p-amino phenyl phosphate, pAPP) in high concentration together with the Aufbrechreagens is added to the release of the enzyme. Das Produkt (p-Aminophenol) wird enzymatisch gebildet und anschließend an der Arbeitselektrode oxidiert. The product (p-aminophenol) is formed enzymatically and then oxidized at the working electrode.

Für niedermolekulare Antigene (Haptene), die keine Bildung von Sandwich-Anordnungen gestatten, sind die beschriebenen Systeme anwendbar, sofern ein Konkurrenzprinzip Anwendung findet. For low molecular weight antigens (haptens), which does not permit the formation of sandwich arrangements, the systems described are applicable if a competition principle applies. In diesem Fall müssen entweder die Kapseln durch das Antigen (oder Antigen-Analogon) markiert werden und müssen um den Analyten konkurrieren, oder das gleiche Anti gen (oder Antigen-Analogon) wie der nachzuweisende Analyt muß an die Oberfläche der Arbeitselektrode gebunden sein. In this case, either the capsules by the antigen (or antigen analogue) must be marked and the analyte to compete, or the same anti-gene (or antigen analogue) as the analyte to be detected should be bound to the surface of the working electrode. Die Antikörper-markierten Kapseln konkurrieren dann um den freien (nachzuweisenden) Analyten und das an die Oberfläche gebundene Antigen. The antibody-labeled capsules then compete for the free (detected) and the analyte bound to the surface antigen. In beiden Fällen ist das Elektrodensi gnal indirekt proportional zur Analyt-Konzentration (ähn lich wie bei ELISA und RIA). In both cases, the Elektrodensi signal inversely proportional to the analyte concentration (sim i lar as in ELISA and RIA).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung tragen die Kapseln eine chemische Substanz, die als Katalysator fun gieren kann (z. B. Dibenzoylperoxid zur Einleitung einer Po lymerisationsreaktion eines Monomers, z. B. Acrylsäure), oder ein Edukt für eine chemische Reaktion (z. B. ein Kupp lungsreagens für Diazonium-Salzbildung, das geeignet ist, in einer Diazonium-Reaktion unter Bildung eines Farbstoffs oder eines fluoreszierenden Produkts zu reagieren). In a further embodiment of the invention the capsules carry a chemical substance that can delegate as a catalyst fun (z. B. dibenzoyl initiating a Po lymerisationsreaktion a monomer such. As acrylic acid), or a reactant for a chemical reaction (eg. B. a Kupp to react for lungsreagens diazonium salt formation, that is suitable for a diazonium reaction to form a dye or a fluorescent product).

Weiterhin macht die Erfindung ein immunchromatographisches Verfahren (Seitenfließtest) zum Nachweisen oder Quantifi zieren eines Analyten verfügbar. Furthermore, the invention provides an immunochromatographic method (page flow test) for the detection or quantification of an analyte adorn available. Als Beispiel wird ein hochmolekulares Antigen wie FABP ausgewählt, das in einer Plasmaprobe nachzuweisen ist. As an example, a high molecular weight antigen as FABP is selected, as evidenced in a plasma sample.

Die Probe wird an einem Ende eines absorbierenden Materials (zum Beispiel Nitrocellulose) der Testvorrichtung aufgetra gen. Die Flüssigkeit wandert aufgrund der Kapillarkräfte zum anderen Ende, die durch ein am anderen Ende befindli ches Saugkissen verstärkt werden. The sample is gene aufgetra at one end of an absorbent material (for example nitrocellulose) of the test device. The liquid will move by capillary forces towards the other end, which are reinforced by a suction pad at the other end befindli Ches. Die mit Kapseln (enthal tend die feste signalerzeugende Substanz) markierten Detek tor-Antikörper sind vorzugsweise in nicht diffusionsfähiger Form im Überschuß im Kontaktbereich gebunden. The capsules with (contained tend fixed signal-generating substance) labeled detec tor antibodies are preferably bound in non-diffusible form in excess of contact. Die signaler zeugende Substanz kann ein fluoreszierender Farbstoff, ein sichtbarer Farbstoff, ein biolumineszierendes oder chemilu mineszierendes Material sein. The signaler forming substance can be a fluorescent dye, a visible dye, a bioluminescent or chemilu mine decorative material.

Das Antigen (FABP) aus der Probe tritt mit den Detektor-An tikörpern in Wechselwirkung und wandert zum anderen Ende der Vorrichtung, wobei es die Kapseln mit sich führt. The antigen (FABP) from the sample interacts with the detector at tikörpern interact and walk to the other end of the device, it executes the capsules with it. Im Indikatorbereich (Punkt oder Streifen) in der Nähe des Saugkissens wird ein Sandwich mit Fänger-Antikörpern gebil det. In the indicator area (dot or stripe) near the suction pad a sandwich with capture antibodies is gebil det. Hier sind die Fänger-Antikörper mehr oder weniger fest an das absorbierende Material gebunden und können daher nicht wandern. Here the capture antibodies are more or less tightly bound to the absorbent material and therefore can not migrate. Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist, desto mehr Sandwich-Strukturen werden gebildet und desto mehr Kapseln werden im Indikatorbereich gebunden. The more analyte is present in the sample, the more sandwich structures are formed and the more capsules are bound in the indicator area. Die si gnalerzeugende Substanz kann durch Eintauchen der gesamten Vorrichtung in ein Lösungsmittel (z. B. Ethanol) oder durch Auftropfen eines Lösungsmitteltropfens auf den Indikatorbereich oder durch Einbringen eines die Kapsel lysierenden Lösungsmittels in die Vorrichtung freigesetzt werden. The si gnalerzeugende substance may be released into the apparatus by immersing the entire device in a solvent (e.g., ethanol) or by dropping of a solvent droplet on the indicator area or by introducing a lysing the capsule solvent. Das Signal kann sofort mit bloßem Auge oder zur Quantifizierung mit einem optischen Lesegerät erfaßt werden. The signal can be detected immediately with the naked eye or to quantify with an optical reader.

Hinter dem Indikatorbereich ist ein Kontrollbereich ange ordnet. Behind the indicator area is a control area is assigned. Er zeigt an, ob der Eintauchstreifen richtig arbei tet und enthält Antikörper (Punkt oder Streifen), die fest an das absorbierende Material gebunden und gegen die Detek tor-Antikörper gerichtet sind. It indicates whether the dipstick correctly processing tet and contains antibodies (dot or stripe) that are tied to the absorbent material and directed against the detec tor antibody. In jedem Fall ist ein Teil der Detektor-Antikörper (die mit Kapseln markiert sind) nicht im Indikatorbereich gebunden und wandert weiter. In each case, is part of the detector antibody (labeled with capsules) are not bound in the indicator area and moves on. Das Kontrollsignal wird zur gleichen Zeit wie im Indikatorbe reich erzeugt. The control signal is generated rich at the same time as in Indikatorbe. Anstelle der Anti-Detektor-Antikörper kann auch das fest gebundene Antigen (oder Antigen-Analogon) zur Schaffung der Kontrolle verwendet werden. Instead of the anti-detector antibody can be used to create the control and the tightly bound antigen (or antigen analogue).

Unter Anwendung des Konkurrenzprinzips kann der Eintauch streifen für niedermolekulare Substanzen modifiziert wer den. Using the principle of competition immersion can strip for small molecules modifies the who. Statt des seitlichen Fließens läßt sich auch eine Vor richtung mit senkrechtem Fluß konstruieren. Instead of the lateral flow can be a construct ago direction vertical flow. Sollen mehrere Antigene gemessen werden, so sind die geeigneten Antikörper einzusetzen und dementsprechend müssen unterschiedliche si gnalerzeugende Substanzen für die verschiedenen Analyten verwendet werden. If several antigens are measured, the appropriate antibodies are to be used and, accordingly, different si gnalerzeugende substances for the various analytes must be used.

Die Erfindung betrifft auch ein Kit für den optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekü len in einer Probe, umfassend Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äuße ren Oberfläche Affinitätsmoleküle zum spezifischen Erkennen und Binden an ein Zielmolekül tragen. The invention also relates to a kit for optical, electrochemical or chemical detection of Zielmolekü len in a sample comprising capsules encapsulating solid particles of signal-generating substances and carrying on their äuße ren surface affinity molecules for specific recognition and binding to a target molecule. Die Kapseln können auch in lyophilisierter Form enthalten sein, deren Wieder herstellung durch den Anwender mit Wasser problemlos mög lich ist. The capsules can also be included in lyophilized form, their re-production by the user with water is easily possible, please include. Gegebenenfalls kann das Kit auch einen wie vor stehend beschriebenen Eintauchstreifen enthalten. Optionally, the kit may also contain a dipstick described as above.

In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das erfindungsge mäße Kit In a further embodiment, the kit erfindungsge Permitted

  • a) Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substan zen einkapseln und Affinitätsmoleküle binden sollen; to encapsulate a) capsules, the zen solid particles of signal-generating Substan and binding affinity molecules;
  • b) Agenzien zur Modifizierung von Affinitätsmolekülen, so daß sie zur Bindung an die Oberfläche der Kapseln ge eignet sind; b) agents for the modification of affinity molecules, such that they are suitable for binding to the surface of the capsules gt;
  • c) Agenzien zur Durchführung der Bindungsreaktion zwischen den Kapseln und Affinitätsmolekülen. c) agents for performing the binding reaction between the capsules and the affinity molecules.

In einer besonders bevorzugten Variante dieser Ausführungs form können die Kapseln a) einen Farbstoff enthalten und sind chemisch präaktiviert, indem sie z. B. N-Succinimid-ak tivierte Ester an ihrer Oberfläche zur covalenten Bindung an ein Affinitätsmolekül wie z. B. ein Immunglobulin tragen. In a particularly preferred variant of this embodiment, the capsules form a) can contain a dye and are chemically pre-activated by z. B. N-succinimide ester ak vated at their surface for covalent binding to an affinity molecule, such. As an immunoglobulin wear. Als Agenzien b) kann das Kit z. B. Biotinylierungsreagenzien (3-Sulfo-N-hydroxysuccinimidylbiotin) zur Biotinylierung eines Affinitätsmoleküls enthalten, so daß dieses zur Bin dung an Avidin-vorbeschichtete Kapseln geeignet ist. As agents b), the kit may, for example, (3-sulfo-N-hydroxysuccinimidyl) included. Biotinylation reagents for biotinylation of an affinity molecule, so that this is suitable for manure bin to avidin-precoated capsules. Als Agenzien c) kann das Kit zum Beispiel homo- oder bifunktio nelle Vernetzer enthalten. As agents c), the kit may for example homo- or bifunktio tional crosslinking agents. Das Kit kann auch einen wie vor stehend beschrieben Eintauchstreifen enthalten. The kit may also include a still standing described dipstick.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figu ren näher erläutert. The invention is illustrated further by the following examples Ren and Figu.

Fig. 1 zeigt schematisch die Einkapselung der signalerzeu genden festen Teilchen in Polyelektrolyt-Schichten. Fig. 1 schematically shows the encapsulation of the signalerzeu ing solid particles in polyelectrolyte layers. In Schritt 1 werden die ungeladenen Teilchen durch das Selbst zusammenfügen geladener Tensidmoleküle beschichtet, so daß sie wasserdispergierbar werden und somit zugänglich für die nachfolgende Beschichtung mit Polyelektrolyt-Schichten sind (Schritt 2). In step 1, the uncharged particles are charged surfactant molecules self-assemble coated so that they are water dispersible and thus accessible for subsequent coating with polyelectrolyte layers (Step 2). Jede abgeschiedene Polyelektrolyt-Schicht hat eine zu der bereits adsorbierten entgegengesetzte Ladung. Each polyelectrolyte layer deposited has already adsorbed to the opposite charge. In Schritt 3 wird ein Affinitätsmolekül, das ein Zielmolekül spezifisch erkennt, an die äußere Oberfläche der Polye lektrolyt-Kapsel konjugiert bzw. gebunden. In Step 3, an affinity molecule which recognizes a specific target molecule conjugated or bound to the outer surface of the Polye lektrolyt capsule.

Fig. 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Verwen dung der erfindungsgemäß hergestellten Kapseln bei einem Bioassay zum Nachweis eines Zielmoleküls (Analyt). Fig. 2 shows schematically an embodiment of the use according to the invention formation of the capsules with a bioassay for the detection of a target molecule (analyte). In einem ersten Schritt wird der Analyt über einen Fänger-Antikörper auf einer festen Phase immobilisiert. In a first step, the analyte is immobilized by a capture antibody on a solid phase. Im zweiten Schritt wird der Analyt mit den erfindungsgemäß hergestellten Kap seln inkubiert. In the second step, the analyte is incubated with the cape islands according to the invention. Der resultierende Komplex wird mit physika lischen oder chemischen Mitteln behandelt (Schritt 3), so daß die signalerzeugenden Teilchen in die Lösung freige setzt und gelöst und im letzten Schritt nachgewiesen wer den. The resultant complex is treated with physika metallic or chemical means (step 3), so that the signal-generating particles into the solution freige prepared and dissolved in the last step and the detected who.

Fig. 3 zeigt die elektrophoretische Mobilitätsmessung von FDA/DPPC/(PSS/PAH) 4 -Kapseln mit ζ-Potentialen als Funktion der Polyelektrolyt-Schichtzahl der FDA/DPPC/(PSS/PAH) 4 -Kap seln. Fig. 3 shows the electrophoretic mobility measurement of FDA / DPPC / (PSS / PAH) 4 capsules with ζ-potentials as a function of polyelectrolyte layer number of FDA / DPPC / (PSS / PAH) 4 cape islands. Die FDA-Teilchen wurden vor der ersten PSS-Abschei dung mit einer DPPC-Schicht vorbeschichtet. The FDA particles were before the first PSS coating's deposition precoated with a DPPC layer. Die geraden Schichtzahlen entsprechen der PSS-Adsorption und die unge raden Schichtzahlen (außer der ersten) der PAH-Adsorption. The even layer numbers correspond to the PSS adsorption and unge straight line layer numbers (except the first) of PAH adsorption.

Fig. 4 zeigt das SEM-Bild der FDA/DPPC/(PSS/PAH) 4 -Kapseln. Fig. 4 shows the SEM image of the FDA / DPPC / (PSS / PAH) 4 capsules. Die Größe der gemahlenen und in DPPC-Lösung suspendierten FDA-Teilchen lag im Bereich von 1~3 µm. The size of the ground and suspended in DPPC solution FDA particles was in the range of 1 ~ 3 microns. Nach Zusammenfügen mit 4 Doppelschichten PSS/PAH zeigen die Teilchen wenig Ag gregation. After merging with 4 bilayers of PSS / PAH particles show little Ag aggregation.

Fig. 5 zeigt den Fluoreszenz-Immungssay für den Nachweis von Ziege-Antimaus-IgG unter Verwendung von Maus-IgG-konju gierten FDA/DPPC/(PSS/PAH) 4 -Kapseln als Markierung. Fig. 5 shows the fluorescence immunoassay for the detection of goat anti-mouse IgG using mouse IgG Konju alloyed FDA / DPPC / (PSS / PAH) 4 capsules as a marker. Vor der Zugabe von DMSO/NaOH waren die Fluoreszenz-Signale vernach lässigbar. Before the addition of DMSO / NaOH, the fluorescence signals were vernach lässigbar. Nach der Zugabe von DMSO/NaOH waren die Fluores zenzsignale auf mehr als das 200fache verstärkt. After the addition of DMSO / NaOH, the fluorescence were zenzsignale to more than 200-fold enhanced.

Beispiele Examples Beispiel 1 Example 1 Herstellung von Polyelektrolyt-Kapseln, die feste FDA-Teil chen als signalerzeugende Substanz einkapseln Encapsulate the preparation of polyelectrolyte capsules chen fixed FDA as part of signal-generating substance

Fluoresceindiacetat-Teilchen (FDA; von Sigma) wurden wie folgt eingekapselt: 50 mg fein gemahlenes FDA wurden gründ lich mit 12 ml einer 0.4% Lösung von DL-α-Dipalmitoylphos phatidylcholin (DPPC, von Sigma) oder Natriumdodecylsulfat (SDS) gemischt. Fluorescein particles (FDA; Sigma) were encapsulated as follows: 50 mg of finely ground FDA were mixed with 12 ml of a Thoroughly 0.4% solution of DL-α-phosphatidylcholine Dipalmitoylphos (DPPC, Sigma) or sodium dodecyl sulfate (SDS). Die Suspension wurde 15 min lang stehenge lassen, um die großen Teilchen abzusetzen. The suspension was stirred for 15 min stand abandoned in order to sell the large particles. Der trübe weiße Überstand wurde extrahiert, durch Zentrifugieren auf 2 ml eingeengt und einmal mit Wasser gewaschen. The turbid white supernatant was extracted, concentrated by centrifugation to 2 ml and washed once with water. Die resultieren den FDA-Teilchen durchliefen dann den Prozeß des schicht weisen Zusammenfügens wechselweise mit den Polyelektrolyten PSS und PAH. The resulting FDA particles then went through the process of assembling layered alternately with the polyelectrolyte PSS and PAH. Das Polykation, Poly(allylamin-hydrochlorid) (PAH), MG 15000, wie auch das Polyanion, Poly(natrium-4- styrolsulfonat) (PSS), MG 70000, wurden von Aldrich käuflich erworben. The polycation, poly (allylamine hydrochloride) (PAH), MG 15000, as well as the polyanion, poly (sodium 4- styrene sulfonate) (PSS), Mw 70000, were purchased from Aldrich. Das PSS wurde vor Gebrauch gegen Milli- Q-Wasser (MG-Schnitt 14000) dialysiert und lyophili siert. The PSS was dialyzed before use against milli Q water (MG-section 14000) and lyophilised Siert. Das bei allen Experimenten verwendete Wasser wurde in einem Reinigungssystem Millipore Milli-Q Plus 185 vorbe reitet und hatte einen spezifischen Widerstand von mehr als 18,2 MΩ.cm. The water used in all experiments was a cleaning system in Millipore Milli-Q Plus 185 rides vorbe and had a resistivity of more than 18.2 MΩ.cm. Alle verwendeten Reagenzien (außer PSS) wurden wie vom Hersteller erhalten eingesetzt. All reagents used (except PSS) were used as received from the manufacturer.

Typischerweise wurde 1 ml PSS-Lösung (enthaltend 5 mg/ml PSS und 0,5 M NaCl) zu 0,5 ml einer DPPC-vorbehandelten FDA-Teilchensuspension gegeben. Typically 1 ml PSS solution was added (containing 5 mg / ml PSS and 0.5 M NaCl) to 0.5 ml of DPPC pretreated FDA-particle suspension. Die Suspension wurde in re gelmäßigen Abständen geschüttelt. The suspension was shaken in re regular intervals. Nach 15 min Belassen zur maximalen Adsorption wurde die Suspension 3 min lang bei 5000 U/min zentrifugiert. After 15 minutes, leaving to the maximum adsorption, the suspension was centrifuged for 3 min at 5000 rev / min. Dann wurde der Überstand abge trennt und der Niederschlag mit Wasser gewaschen, um über schüssigen, nicht adsorbierten Polyelektrolyt zu entfernen. Then, the supernatant was separated abge and the precipitate was washed with water to remove excess schüssigen not adsorbed polyelectrolyte. Dann wurde 1 ml PAH-Lösung (enthaltend 5 mg/ml PAH und 0,5 M NaCl) zugesetzt, um eine nachfolgende Schicht auf der Kapseloberfläche zu bilden. Then, 1 ml PAH solution (containing 5 mg / ml PAH and 0.5 M NaCl) was added to form a subsequent layer on the capsule surface. Die Zentrifugations-/Wasch schritte und die daraus folgende Adsorption entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte wurden wiederholt. The centrifugation / washing steps and the subsequent adsorption of oppositely charged polyelectrolytes were repeated. Die erhaltenen Kapseln wurden dann als FDA/DPPC/(PSS/PAH) n bezeichnet, ins besondere mit n = 4. The capsules were then as FDA / DPPC / (PSS / PAH) n denotes, in particular with n =. 4

Die elektrophoretische Mobilität beschichteter FDA-Kri stalle wurde mit einem Malvern Zetasizer 4 gemessen, wobei der Durchschnitt aus 5 Messungen im stationären Zustand ge nommen wurde. The electrophoretic mobility of coated FDA-Kri crystals was measured with a Malvern Zetasizer 4, with an average of 5 measurements at steady state was assumed ge. Die ζ-Potentiale wurden erhalten aus der Be ziehung ζ = uη/ε, worin η und ε die Viskosität bzw. die Di elektrizitätskonstante der Testlösung sind (vgl. Fig. 3). The ζ-potentials were obtained from the relationship Be ζ = uη / ε, where η and ε the viscosity or the di electricity constant of the test solution (cf. Fig.. 3).

Die Rasterelektronenmikroskopie(SEM)-Messungen wurden mit einem Instrument durchgeführt, das mit einer Beschleuni gungsspannung von 5 kV betrieben wurde. Scanning electron microscopy (SEM) measurements were carried out with an instrument, the supply voltage with an acceleration of 5 kV was operated. Die SEM-Proben (auf Deckglas-Objektträgern) wurden mit etwa 20 nm Au zerstäu bungsbeschichtet (vgl. Fig. 4). The SEM samples (on cover glass-slides) were coated with about 20 nm Au coated zerstäu environment (see. FIG. 4).

Beispiel 2 Example 2 Antikörper-Konjugation an die äußere Oberfläche der in Bei spiel 1 erhaltenen Kapseln Antibody conjugated to the outer surface of the obtained in the case of game 1 capsules

Die covalente Konjugation von Maus-IgG an die Kapseln von Beispiel 1 wurde wie folgt durchgeführt: 1 mg Maus-Immun globulin G (mIgG, von Sigma-Aldrich) wurde durch Reaktion mit 2-Iminothiolan (von Pierce) in 0,1 M PBS-Puffer (ent haltend 10 mM EDTA) aktiviert. The covalent conjugation of murine IgG to the capsules of Example 1 was carried out as follows: 1 mg mouse immune globulin G (mIgG, from Sigma-Aldrich) was prepared by reaction with 2-iminothiolane (Pierce) in 0.1 M PBS buffer (ent holding 10 mM EDTA) enabled. Der Komplex wurde durch Gel filtration an einer Sephadex G 25-Säule gereinigt. The complex was purified by gel filtration 25 column purified on a Sephadex G. Die FDA/DPPC/(PSS/PAH) n -Kapseln wurden durch Reaktion mit Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) von Pierce in 0,05 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5, aktiviert und durch Zentrifugation und wiederholtes Waschen aus dem überschüssigen SMCC ausgewaschen. The FDA / DPPC / (PSS / PAH) n capsules were prepared by reaction with succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) from Pierce in 0.05 M sodium carbonate buffer, pH 9.5, activated and washed by centrifugation and repeated washing out the excess SMCC. Der 2-Iminothio lan-modifizierte Antikörper und die Maleinimid-aktivierten FDA-Kapseln wurden dann gemischt und 1 h lang bei 37°C inkubiert. The 2-Iminothio lan-modified antibody and maleimide-activated FDA capsules were then mixed and incubated at 37 ° C for 1 h. Überschüssiger, nicht konjugierter Antikörper wurde durch Zentrifugation und Waschen mit PBS-Puffer in mehreren Durchgängen ausgewaschen. Excess, non-conjugated antibody was washed by centrifugation and washing with PBS buffer in multiple passes.

Beispiel 3 Example 3 Fluoreszenz-Immungssay zum Nachweis von Ziege-Antimaus-IgG mit den Antikörper-konjugierten Kapseln von Beispiel 2 Fluorescence immunoassay for the detection of goat anti-mouse IgG antibody conjugated with the capsules of Example 2

Eine Polystyrol-Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Nung) wurde mit Ziege-Antimaus-IgG (gaMIgG, von Sigma-Aldrich)) in Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, bei 4°C über Nacht beschichtet. A polystyrene microplate having 96 wells (Nunc) was coated with goat anti-mouse IgG (gaMIgG, from Sigma-Aldrich)) in carbonate / bicarbonate buffer, pH 9.6, at 4 ° C overnight. Die Konzentration an gaMIgG variierte von 12 ng/ml bis 5 µg/ml. The concentration of gaMIgG varied from 12 ng / ml to 5 ug / ml. Nach dem Waschen wurde die Platte mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) (Fraktion V, erhalten von Sigma-Aldrich) bei 37°C 1 h lang blockiert. After washing, the plate was incubated with 1% bovine serum albumin (BSA) (fraction V, obtained from Sigma-Aldrich) at 37 ° C for 1 h blocks long. Die Platte wurde dreimal gewaschen, und es wurde eine 1 : 300-Verdünnung der Suspension aus Antikörper-konjugierten Kapseln zugesetzt. The plate was washed three times, and it was a 1: 300 dilution was added to the suspension of antibody-conjugated capsules. Nach 1stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Platte dreimal gewaschen und mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroplattenle sers (Bio-Rad) untersucht. After incubation at 37 ° C 1stündiger the plate was washed three times and analyzed using a fluorescence Mikroplattenle sers (Bio-Rad). Es wurden keine signifikanten Fluoreszenzsignale gemessen. There were no significant measured fluorescence signals.

Dann wurden einer jeden Vertiefung 50 µl DMSO und 50 µl 0,5 M NaOH zugesetzt, und die Platte wurde wieder mit Hilfe des Fluoreszenz-Mikroplattenlesers untersucht. Then each well 50 ul DMSO and 50 .mu.l of 0.5 M NaOH was added, and the plate was again examined by fluorescence microplate reader. Die Fluores zenzsignale wurden auf mehr als das 200fache verstärkt (vgl. Fig. 5). The fluorescence zenzsignale were more than 200-fold enhanced (see. FIG. 5).

Beispiel 4 Example 4 Alternative Konjugationsstrategien zur Bindung biointerak tiver Moleküle, z. B. Immunglobulin G an die Kapseloberflä che Alternative conjugation of binding biointerak tive molecules, eg. As immunoglobulin G at the surface Kapseloberflä 4.1 Direkte Adsorption von IgG 4.1 Direct adsorption of IgG

1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.) wurde mit 100 µl monoklonalen Anti-FABP-Antikörpern (2 mg/ml) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur und 12 Stunden lang bei 4°C inkubiert. 1 ml of the fluorophore particle suspension (5% wt. / Vol.) Was mixed with 100 ul monoclonal anti-FABP antibody (ml 2 mg /) incubated for 2 hours at room temperature and for 12 hours at 4 ° C. Der Überschuß an Antikörpern wurde durch wieder holte Zentrifugations- und Waschdurchgänge entfernt, und die Markierung wurde schließlich in PBS wieder suspendiert. Excess antibody was removed by centrifugation and washing-repeated passages, and the label was finally resuspended in PBS.

4.2 Beschichten von IgG über Neutravidin - ein Verfahren, das bei Verwendung der Kapseln in einem Kit anwendbar ist 4.2 Coating of IgG on neutravidin - a method which is applicable to use of the capsules in a kit a) Biotinylierung des Antikörpers a) Biotinylation of the antibody

0,2 mg Biotin-X-NHS (Pierce, USA) in 100 µl Beschich tungspuffer wurden einer Lösung von 1 mg monoklonalem Anti-hCG-beta-Antikörper (Clone ME 106, Dunn Labortech nik, Asbach) in 1 ml Beschichtungspuffer zugesetzt. 0.2 mg Biotin-X-NHS (Pierce, USA) of a solution of 1 mg monoclonal anti-hCG-beta antibody (clone ME 106, Dunn Labortech nik, Asbach) were added in 1 ml of coating buffer device buffers in 100 ul Beschich. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inku biert. The mixture was for 3 hours at room temperature biert INKU. Unumgesetztes Biotin wurde durch wiederholte Zentrifugationsschritte in einer Centricon-Trenneinheit (30 kd, Centricon, USA) vom Antikörper abgetrennt. Unreacted biotin was removed by repeated centrifugation in a Centricon-separation unit (30 kd, Centricon, USA) from the antibody. Der Puffer wurde zu 1 ml PBS geändert, 1% BSA wurde zur La gerung zugesetzt. The buffer was changed to 1 ml of PBS, 1% BSA was added to the La delay.

b) Beschichten der Fluorophor-Teilchen mit Neutravidin b) coating the fluorophore particles with neutravidin

1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol., mit einer äußeren Schicht aus Polyacrylsäure, PAA) wurde in PBS-Puffer, enthaltend 10 mM N-Hydroxysuccin imid (NHS) und 20 mM 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]- carbodiimid-hydrochlorid (EDC), resuspendiert, und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inku biert. 1 ml of the fluorophore particle suspension (5%, w / v., With an outer layer of polyacrylic acid, PAA) was dissolved in PBS buffer containing 10 mM N-Hydroxysuccin imide (NHS) and 20 mM 1-ethyl-3- [ 3-dimethylaminopropyl] - carbodiimide hydrochloride (EDC), resuspended, and the mixture was 2 hours biert INKU at room temperature. Unumgesetztes EDC/NHS wurde durch einen Zentri fugations- und Waschdurchgang entfernt. Unreacted EDC / NHS was fugations- by a Zentri and wash cycle away. Es wurde 1 ml einer Lösung von 2 mg Neutravidin (Pierce, USA) in Carbonat-Puffer (pH 8,5) verwendet, um die Teilchen wieder zu suspendieren. There was added 1 ml of a solution of 2 mg of neutravidin (Pierce, USA) in carbonate buffer (pH 8.5) used to suspend the particles again. Die Suspension wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. The suspension was incubated for 3 hours at room temperature. Nicht aufbeschich tetes Neutravidin wurde durch einen Zentrifugations- und Waschdurchgang entfernt, und die Teilchen wurden schließlich in 1 ml PBS mit 1% BSA resuspendiert. Not aufbeschich tetes neutravidin was removed by centrifugation and wash cycle, and the particles were finally resuspended in 1 ml of PBS containing 1% BSA.

c) Beschichten von Fluorophor-Teilchen mit biotinyliertem Antikörper c) coating of fluorophor particles with biotinylated antibodies

1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.) wurde mit 100 µl des biotinylierten Antikörpers Anti- hCG-b-Antikörper (1 mg/ml) 2 Stunden lang bei Raumtem peratur inkubiert. Was added 1 mL of the fluorophore suspension (5% wt. / Vol.) With 100 ul of biotinylated anti-hCG antibody-b-incubated antibody (1 mg / ml) for 2 hours at room temperature. Der Überschuß an Antikörper wurde durch wiederholte Zentrifugations- und Waschdurchgänge entfernt, und die beschichteten Kapseln wurden schließ lich in PBS resuspendiert. The excess antibody was removed by repeated centrifugation and wash cycles, and the capsules were coated closing Lich resuspended in PBS. Nach Zugabe von 1% BSA sind die Kapseln gebrauchs- bzw. lagerfähig. After addition of 1% BSA, the capsules are immediate use for storage.

Beispiel 5 Example 5 Verwendung der mit Affinitätsmolekülen beschichteten Kap seln in Bioassays Using the coated with affinity molecules Cape clauses in bioassays 1) Festphasen-Immungssay auf Humanchoriongonadotropin (hCG) 1) solid-phase immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG) a) Beschichten a) coating

100 µl einer Lösung von 25 µg/ml Anti-hCG- Antikörper (Clone ME 107, Dunn Labortechnik, Asbach) in Carbonat-Puffer (100 mM, pH 9,6) pro Vertiefung wurden in einer Multititerplatte mit 96 Vertiefungen (Costar Maxi Sorb Polystyrol-Platte) 3 Stunden lang inkubiert. 100 .mu.l of a solution of 25 g / ml anti-hCG antibody (clone ME 107, Dunn Labortechnik, Asbach) in carbonate buffer (100 mM, pH 9.6) per well were in a multiwell with 96 wells (Costar Maxi Sorb polystyrene plate) were incubated for 3 hours. Die Platte wurde mit Wasser gewaschen und mit 300 µl einer 1% BSA-Lösung in PBS pro Vertiefung 1 Stunde lang blockiert. The plate was washed with water and blocked with 300 mL of a 1% BSA solution in PBS per well for 1 hour.

b) Probeninkubation b) Sample incubation

200 µl der hCG-Proben (Sigma) mit Verdünnungen von 0,1 µE bis 100 µE pro ml wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul of the hCG samples (Sigma) at dilutions of 0.1 μE to 100 μE per ml were incubated for 2 hours at room temperature. Die Platte wurde zweimal mit Wasser gewaschen. The plate was washed twice with water.

c) Markierungsinkubation c) Label incubation

Die Fluorophorteilchen-Suspen sion (5% Gew./Vol.) mit dem über Neutravidin konjugier ten, biotinylierten Anti-hCG-b-Antikörper wurde mit ei nem 1% BSA enthaltenden PBS-Puffer auf 1 : 1000 verdünnt. The fluorophore suspen sion (5% wt. / Vol.) With the ten konjugier on neutravidin, biotinylated anti-hCG-b antibody was with egg nem containing 1% BSA PBS buffer diluted 1: 1000. 200 µl Verdünnung pro Vertiefung wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul per well dilution were incubated for 2 hours at room temperature. Die Platte wurde zweimal mit Wasser gewaschen, 300 µl Ethanol (96%) wurden zuge setzt, und es wurde unter Schütteln 2 Minuten lang in kubiert. The plate was washed twice with water, 300 ul of ethanol (96%) were added sets, and it was incubated with shaking for 2 minutes in.

d) Fluoreszenzmessung d) Fluorescence measurement

Der Gehalt an freigesetztem Fluoro phor aus den Markierungskapseln wurde mit einem Fluo reszenz-ELISA-Plattenlesegerät gemessen. The content of released fluoro phorus from the label capsules was measured with a fluo rescence ELISA plate reader. Die Werte der Proben (B) wurden mit den ohne Probe gemessen Werten (B 0 ) in Beziehung gesetzt. The values of the samples (B) were correlated with the values measured without sample (B 0) in relationship.

2) Reagensglastest auf fettsäurebindendes Protein (FABP) 2) Reagensglastest on fatty acid binding protein (FABP) a) Beschichten a) coating

400 µl einer Lösung von 1 mg/ml Anti-FABP- Antikörper in Carbonat-Puffer (100 mM, pH 9,6) wurden in einem Costar Maxi Sorb 5 ml-Polystyrol-Röhrchen 3 Stunden lang inkubiert (nur der erste Zentimeter des unteren Teils stand in Kontakt mit der Lösung). 400 .mu.l of a solution of 1 mg / ml anti-FABP antibody in carbonate buffer (100 mM, pH 9.6) were mixed in a 5 ml Costar Maxi Sorb-polystyrene tubes incubated for 3 hours (only the first centimeter of the lower part was in contact with the solution). Das Reagensglas wurde mit Wasser gewaschen und mit 2 ml ei ner 1% BSA-Lösung in PBS 1 Stunde lang blockiert (die gesamte Innenwandung des Röhrchens wurde blockiert). The test tube was washed with water and blocked with 2 ml egg ner 1% BSA solution in PBS for 1 hour (the entire inner wall of the tube was blocked).

b) Probeninkubation b) Sample incubation

200 µl der FABP-Proben mit Verdünnun gen von 0,1 µg bis 50 µg pro ml wurden 2 Stunden lang im Reagensglas bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul of the samples with Verdünnun FABP gene from 0.1 micrograms to 50 micrograms per ml were incubated for 2 hours in a test tube at room temperature. Die Röhr chen wurden zweimal mit Wasser gewaschen. The Rohr surfaces were washed twice with water.

c) Markierungsinkubation c) Label incubation

Die Fluorophorteilchen-Suspen sion (5% Gew./Vol.) mit dem direkt adsorbierten mono klonalen Anti-FABP-Antikörper wurde mit einem 1% BSA enthaltenden PBS-Puffer auf 1 : 1000 verdünnt. The fluorophore suspen sion (5% wt. / Vol.) With the adsorbed directly mono clonal anti-FABP antibody containing a 1% BSA PBS buffer diluted 1: 1000. 300 µl Verdünnung wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Reagensglas inkubiert. 300 ul dilution were incubated for 2 hours at room temperature in the test tube. Das Reagensglas wurde zweimal mit Wasser gewaschen, 500 µl Ethanol (96%) wurden zuge setzt, und es wurde unter Schütteln 2 Minuten lang in kubiert. The test tube was washed twice with water, 500 ul of ethanol (96%) were added sets, and it was incubated with shaking for 2 minutes in.

d) Fluoreszenzmessung d) Fluorescence measurement

Der Gehalt an freigesetztem Fluoro phor aus den Markierungskapseln wurde mit einem Spek trofluorimeter gemessen. The content of released fluoro phorus from the label capsules was measured trofluorimeter with a spec. Die Werte der Proben (B) wur den mit den ohne Probe gemessen Werten (B 0 ) in Beziehung gesetzt. The values of the samples (B) the WUR with the values measured without sample (B 0) correlated.

Patent Citations
Cited PatentFiling datePublication dateApplicantTitle
DE3136606C2 *15 Sep 198120 Jan 1994Stolle Res & Dev"Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden Mikrokapseln und die danach erhältlichen Mikrokapseln
DE3618100A1 *30 May 19864 Dec 1986Hitachi LtdImmunoassay method and reagent for carrying it out
EP0516252A2 *13 Apr 19922 Dec 1992INSTITUT FÜR DIAGNOSTIKFORSCHUNG GmbH AN DER FREIEN UNIVERSITÄT BERLINMonocrystalline particles of iron-oxide for application in medical diagnosis and therapy
Referenced by
Citing PatentFiling datePublication dateApplicantTitle
DE102013002575A1 *11 Feb 201314 Aug 2014Max RennebergVerfahren zum visualisierten Ausschluss akuter Erkrankungen mittels farbmarkierter Proteine
DE102014113688A122 Sep 201424 Mar 2016Jacobs University Bremen GgmbhAntigenspezifische immunfärbung von t-zellen
WO2016045660A12 Sep 201531 Mar 2016Jacobs University Bremen GgmbhAntigen-specific immunostaining of t cells
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Cooperative ClassificationG01N33/587
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